Review:The real-time polymerase chain

reaction

Kubista et al., Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 95–125.

Daniela NunesJuliano Bertinato Luciene LimaClóvis Paniz

Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Universidade de São PauloBiologia Molecular Aplicada as Análises Clínicas

Avaliação da expressão gênica

Vantagens:

se cDNA for clonado;

Mais eficiente e menos dependente da temperatura

Desvantagens:

se RNAm estiver degradado, a transcrição pode não alcançar a sequencia alvo da PCR.

Viés para amplicon localizado próximo a 3’ terminal do RNAm

Não transcreve RNAm sem cauda poliA – genes de histonas na maioria dos eucariotos e na maioria dos procariotos

Tipos de primers

Vantagens:

Para amostras degradadas , procariotos e RNAr é a melhor escolha

Copiam todos os tipos RNAs

Nanômeros se ligam mais fortemente ao RNA e são melhores para altas temperaturas

Desvantagem:

rendimento depende da conformação do RNAm - conformação primária.

Tipos de primers

Necessita de temperaturas elevadas- regiões mais acessíveis;

Vantagem:

Para poucas quantidades de RNA.

Desvantagem:

Dependente da sequencia – dobramento do RNA

Proteínas de ligação: amostra sem purificação

Desenhando um primer específico o rendimento pode não ser tão bom

Tipos de primers

One-step : menos sensível mas menos contaminação cruzada

Two-step

Existem diversos tipos de transcriptases que se diferem no tamanho e na T°C

Contaminação com DNA genômico

Solução: usar o No-RT control: amostra normal sem a enzima transcriptase

Problemas na RT PCR

Normalização: compensar diferenças nas amostras

Procedimentos de normalização baseavam-se em métodos físicos: volume , massa, tamanho e n° de céls.

Heterogeneidade das amostras:

Normalização com:

Add de RNA padrão ou,

Avaliação de gene de referência

Cada tecido: perfil diferente

Expressão gênica relativa

Painel de genes de referência

Painel de genes de referência

Software

Correção para propagação de erros em amostras independentes deve ser aplicado:

A fórmula delta-Ct transforma os valores de Ct em quantidades relativas de expressão:

valor maior de expressão é igual a 1

 

Expressão= 2-ΔCT

onde: ΔCT = CT gene de interesse - CT gene de referência

Cálculo da expressão:

Amostra 1

Média CT gene ABCG2: 29,2028551101684

Média CT gene GAPDH: 23,5415296554565

Cálculo:

Expressão= 2-(29,2028551101684-23,5415296554565)

Expressão= 0,0145200460052491

Exemplo:

MÉTODO COMPARATIVO:

A pergunta é: QUANTAS VEZES A EXPRESSÃO GÊNICA DE UM DETERMINADO GENE , NUMA DETERMINADA CONDIÇÃO É DIFERENTE DE OUTRA CONDIÇÃO?

Exemplo 1: cultura celular- cél tratada e não tratada

2-(Ct,Target - Ct,endog)Time x - (Ct,Target -Ct, endog)Time 0

Exemplo 2: célula HPV+ tratada versus HPV-tratada

2-(Ct,Target - Ct, endog) HPV+ - (Ct,Target -Ct, endog) HPV-

Quando usar 2-ΔΔCT?

LIVAK, K.J.; SCHIMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta

Delta C(T)) method. Methods, v25, n.4, p.402-8, 2001.