RESUMENES DEL SIMPOSIO DE VERANO 2007

¿Qué   podemos   aprender   desde   una   perspectiva   de   genómica   comparativa   sobre   laevolución de la función enzimática?Francisco (Paco) Barona Gómez

Recientemente, y a consecuencia de los avances en genómica y bioinformática, una nueva visiónsobre las leyes que regulan la aparición de una nueva función enzimática ha comenzado a delinearse.Más  allá   de   la   fijación  de  mutaciones  posteriores  a  un  evento  de  duplicación  génica  que   impactannotoriamente sobre la estructura y función de una proteína, como lo dicta el modelo original, parecieraque  varias   funciones  pueden   residir   en  una  misma  proteína.  En  particular,   se  ha  postulado  que   lapromiscuidad catalítica, definida ésta como la capacidad de una enzima de aceptar un sustrato distinto al“natural” y convertirlo, aunque de forma ineficiente pero normalmente siguiendo el mismo mecanismode reacción, es un rasgo que se ha seleccionado durante el curso de la evolución. Esto ha dado lugar a laaceptación   de   un   nuevo   corolario   en   la   forma   de  función   precede   duplicación.   Sin   embargo,   sedesconoce   que   tan   representado   se   encuentra   dicho   fenómeno   en   la   naturaleza   (la   mayoría   de   laevidencia proviene de experimentos de evolución dirigida in vitro), y más importante aún, cuales son laspresiones   selectivas   que   pudieran   dictar   su   evolución   y   la   subsiguiente   aparición   divergente   de   ladiversidad funcional de las enzimas. De hecho, modelos de evolución natural de enzimas que confirmeneste corolario  resultan,  en el  mejor de los  casos,  escasos  y poco fundamentados.  En esta plática,  unejemplo de evolución natural  de la función enzimática identificado usando genómica comparativa,  elcual hemos validado experimentalmente, será presentado. La caracterización funcional y estructural dehomólogos   selectos  miembros  de   la   familia   de   enzimas   en   cuestión  es   consistente   con  un  modeloevolutivo que procede vía intermediarios promiscuos pero que rápidamente vuelven a especializarse sinnecesidad de un evento de duplicación génica. Más aún, pareciera que las constricciones funcionales quedictan las distintas historias evolutivas descritas,  es decir,  la evolución de la promiscuidad catalítica,operan a nivel de sistema como lo son la estructura y función de toda la red metabólica, así como elcontenido y dinámica de los genomas comparados.

Ambos tipos de adenilil ciclasas las transmembranales y la soluble participan en la fisiología delespermatozoide de erizo de mar.C. Beltrán, A. Loza, P. Sánchez y A. Darszon.

El   AMPc,   segundo   mensajero   sintetizado   por   la   adenilil   ciclasa   (AC)   importante   en   latransducción   de   señales   de   las   células,   es   fundamental   en   la   fisiología   del   esperma­tozoide.   Elespermatozoide   debe   nadar,   encontrar   el   óvulo   y     llevar   a   cabo   la   reacción   acrosomal   (RA)   parafecundarlo.   Los niveles de AMPc influencian los flujos iónicos del espermatozoide, la movilidad y laRA. 

Dos tipos de ACs se expresan en mamíferos, las transmembranales (ACtms) y la soluble (sAC),identificada molecularmente en el testículo de rata y  en el espermatozoide.

Las ACtms localizadas en la membrana plasmática, se regulan por proteínas G heterotriméricas y seestimulan por forskolina. Por el contrario la sAC se estimula por Ca2+ y por bicarbonato. Además de lasAC el espermatozoide de ratón y de humano aparentemente también contiene ACtms.

En este trabajo utilizando ensayos funcionales y técnicas de inmuno­fluorescencia y de westernblot, demos­tramos que además de la sAC, en el espermatozoide de erizo de mar también están presentesmúltiple isoformas de ACtms. Nuestros resultados utilizando inhibidores selectivos para  los dos tipos deACs,  indican  que ambas,   la sAC y  las  ACtms participan  tanto en  la RA como en  la  movilidad delespermatozoide de erizo de mar.  Además el uso del  Rp­AMPc, inhibidor especifico para la proteínacinasa  dependiente  de  AMPc   (PKA),  mostró   que  dicha   enzima  participa   en   los  diferentes   tipos  demovimiento del espermatozoide.

Nuevos enfoques para la visualización de calcio y ERO en pelos radicales de leguminosas  ysu respuesta a los factores de nodulación de Rhizobium etli.L. Cárdenas, L. Martínez Lara, y C. Quinto.

Nuestro   modelo   de   trabajo   consiste   en   estudiar   la   interacción   simbiótica  Rhizobium   etli­Phaseolus   vulgaris,   y   estamos   interesados   en   determinar   los   mecanismos   celulares   y   molecularesinvolucrados en esta  interacción.  Los FNs de  R. etli  son molé­culas  señales  de naturaleza lipoquito­oligosacarídica. Los pelos radicales de frijol responden a los FNs deformándose y en presencia de labacteria  se forman los hilos  de infección  por donde el  rhizobium penetra  hasta el  cortex de la  raíz.Utilizando técnicas de microinyección de células vivas demostramos que los FNs de R. etli purificados yaplicados a los pelos radicales inducen reorganización de los micro­filamentos de actina y cambios enlos influjos de calcio, así también demostramos que las modificaciones químicas de los FNs juegan unpapel   muy   importante   en   esta   respuesta.  Recientemente   utilizamos   citocalasina   derivatizada   confluoresceína para visualizar los sitios de polimerización de actina en pelos radicales de frijol vivos y surespuesta   en  presencia  de   los  FNs.  Por  otro   lado   también  abordadamos   el   estudio  de   las   especiesreactivas de oxigeno  (ERO)  en la vía de señalización inducida por los FNs, encontrando que hay unarespuesta   temprana,   transiente  y  distinta  a   la   inducida  por  elicitores  de  patógenos   (Cárdenas  et   al.,sometido). Ahora estamos interesados en determinar el papel del calcio y ERO durante la percepción delos   FNs   mediante   enfoques   menos   invasivos   y   más   integrativos.   Para   esto   utilizaremos   nuevasherramientas   moleculares   como   la   expresión   de   nuevas   variantes   mejoradas   de   proteínas   verdesfluorescentes   sensibles   a   calcio   o   a   ERO   utilizando   plantas   de  Lotus   japonicus  transformadasestablemente. Esto nos permitirá determinar simultáneamente los niveles intracelulares de calcio o EROa lo largo del proceso de infección, así como sus fuentes intracelulares, dado que las sondas molecularespueden ser dirigidas a compartimentos celulares específicos, como el núcleo, el retículo endoplasmáticoy las mitocondrias. 

Estudio de la muerte celular asociada al envejecimiento y enfermedades relacionadasJ. Bouzas, R. Rodrígues­Valentín, G. Zárraga, X. Gracida, L. Covarrubias y S. Castro Obregón.

En los últimos 50 años  la expectativa  de vida de los humanos se ha duplicado,  permitiendo

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observar   el   surgimiento   de   enfermedades   asociadas   a   la   vejez   como  el   cáncer  y   las   enfermedadesneurodegenerativas. Dado que la proporción de individuos viejos en la sociedad va en aumento, es deactual relevancia estudiar los mecanismos moleculares del envejecimiento, así como de las enfermedadesasociadas, procesos en los que la muerte celular juega un papel central. Es por eso que nuestra línea deinvestigación busca entender los mecanismos moleculares de las diferentes formas en que las célulaspueden morir. Inicialmente descubrimos que el neurotransmisor conocido como la sustancia P (SP), alactivar a su receptor (NK1R), induce una forma de muerte celular programada no apoptótica con unamorfología semejante al tipo de muerte 2 o autofágica, y recientemente demostramos que requiere de lamaquinaria  molecular  de   la  autofagia  para  ejecutarse.  Las  características  morfológicas  de  la  muerteinducida por SP/NK1R asemejan la muerte observada durante la neurodegeneración, resultando ser unmodelo para estudiar el mecanismo molecular por el cual se da la muerte neuronal.  Aunque hay quedestacar  que dicho  programa  de  muerte  se  observa   tanto  en  células  neuronales  como en células  noneuronales, sugiriendo ser un proceso general. Identificamos la vía de transducción que se activa parainducir   la  muerte  autofágica desde la membrana plasmática  hasta  el núcleo.  Se encontró  al   receptornuclear Nur77 como esencial para la progresión de la muerte y recientemente encontramos que Nur77modula   la   muerte   autofágica   inducida   por   al   menos   otros   dos   estímulos;   actualmente   estamosinvestigando   el   mecanismo   molecular.   Considerando   además   que   Nur77   es   capaz   de   inducir   otrosprocesos  celulares,  como proliferación,  diferenciación o muerte  apoptótica,  esta  molécula  modula  eldestino celular. Es nuestra meta entender el mecanismo molecular que determina el tipo de proceso quepromueve.

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Antibióticos provenientes del veneno de arácnidosCorzo, G., Belokoneva, O.S., Espino, P., Possani, L.D., Villegas, E.

El   veneno  de   algunos   arácnidos  presentan  péptidos   con   actividad   antibacteriana,   los   cualesademás de tener un carácter anfipático, contienen una cantidad significativa de aminoácidos cargadospositivamente. Varios de estas moléculas con características anfipáticas y actividades antimicrobianashan sido extraídas del veneno de los alacranes Pandinus imperator y Centruroides suffusus suffusus, y dela   araña  Oxyopes   kitabensis.  Dos   péptidos   llamados   Pin1   y   Pin2   fueron   obtenidos   del   alacrán  P.imperator,  y dos moléculas más: Oxki1 y Oxki2 fueron extraídos de la araña  O. kitabensis.  Algunasfracciones con actividad microbicida han sido identificadas en el alacrán C. s. suffusus (datos todavia nopublicados  por  nuestro  grupo).  Sinembargo aún no  se   tiene   la  estructura  primaria  de  las  moléculasresponsables de dicha actividad. Pin2 y Oxki1 tienen 24 y 48 aminoácidos, respectivamente. Ensayos dePin2 u Oxki1 en presencia  de membranas artificiales  sugieren que Pin2 forma polímeros,   los cualesdependen de la concentración de esta molécula. Por otro lado, Oxki1 se inserta monoméricamente a lasmembranas y forma polímeros estables independientemente de su concentración.

Ambas moléculas Pin2 y Oxki1, por sus características químicas, pueden penetrar membranascelulares, lo que resulta en la formación de poros, los cuales permiten el libre paso de iones, de modoque provocan la despolarización de la membrana celular. Moléculas catiónicas y anfipáticas provenientesdel veneno de arácnidos, así como de otras fuentes, como de las glándulas de la epidermis  de ranas, soninteresantes ya que podrían actuar como antibióticos contra microorganismos patógenos. Si bien muchasde  estas  moléculas   tienen   la  desventaja  de   ser  hemolíticas,   su  potencia  microbicida  podría   ser  unaventaja   para   considerarse   como   antibióticos   alternativos   de   aplicación   tópica   en   el   tratamiento   deinfecciones orales asociadas a la caries dental y en el tratamiento de infecciones de la piel.

Papel de múltiples receptores en el reconocimiento celular de toxinas bacterianasI. Gómez, I.  Arenas, M. T. Martínez

El primer paso en el mecanismo de toxicidad de diversas toxinas bacterianas es el contacto deestas proteínas con receptores específicos localizados en las células blanco. Nuestro modelo de trabajopropone   la   participación   secuencial   de   al   menos   2   receptores   para   las   toxinas   Cry.   Primero,   lainteracción   con   el   receptor   Bt­R1  induce   un   corte   proteolítico   en   la   toxina   y   la   formación   de   unoligómero de 4 subunidades, este cambio en la conformación de la toxina está acoplado a un incrementoen la afinidad hacia la APN, que está anclada a la membrana por un puente de glicosilfosfatidilinositolque   lo   localiza   preferencialmente   en   regiones   de   la   membrana   llamadas   “Raft´s”   donde   ocurre   lainserción de la  toxina.  Dado el  amplio uso de las  toxinas  Cry como agente  de control  biológico,  esimportante  entender  el  papel  de  cada   receptor  en  el  mecanismo de  toxicidad,  esto  pudiera   tener  unimpacto en el diseño de toxinas modificadas con mayor actividad, o bien, para contender con la posiblegeneración   de   insectos   resistentes.   Mediante   la   metodología   de   Despliegue   en   fagos,   construimosbibliotecas de anticuerpos que reconocen la toxina Cry1Ab y hemos diseñado estrategias de selecciónpara   dirigir   nuestra   búsqueda   hacia   regiones   de   la   toxina   involucradas   en   la   interacción   con   losreceptores. Logramos seleccionar anticuerpos contra el Dominio II y III, observando la interacción del

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DII con el receptor Bt­R1  y del Domino III con la APN, ambos grupos de anticuerpos son capaces deinhibir  toxicidad “in vivo”. También tenemos anticuerpos anti­oligómero con capacidad de inhibir  lainteracción con vesículas purificadas a partir del intestino medio del lepidóptero Manduca sexta. Por otrolado,  estamos caracterizando péptidos  que  reconocen a   los  receptores  APN y ALP. Estas  moléculasconstituyen herramientas útiles para el estudio de la interacción de las toxinas Cry con los receptoresinvolucrados en su mecanismo de toxidad.

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Ingeniería Metabólica de Escherichia coli y Bacillus subtilis para la obtención de etanol ylactato a partir de residuos agroindustriales.Alfredo Martínez Jiménez.

El futuro de agotamiento de combustibles fósiles, entre otros factores, plantea la necesidad deobtención de combustibles alternos y productos químicos renovables, mediante tecnologías sustentablesy   más   amigables   con   el   medio   ambiente.   En   este   contexto   se   circunscriben   nuestras   líneas   deinvestigación.  Los  planteamientos  parten  de  necesidades   tecnológicas  para  generar  ciencia  básica  yaplicada. La pregunta práctica a contestar es si podemos desarrollar biotecnologías competitivas para laobtención   de   combustibles   alternos   a   los   fósiles   y   materias   primas   para   la   síntesis   de   plásticosbiodegradables.  Y la  básica  es generar  conocimiento del  metabolismo bacteriano,  en condiciones  defermentación, para la canalización eficiente del flujo de carbono a dos modelos de estudio: a) etanolcarburante; y b) L y D lactatos ópticamente puros. En este trabajo se presentará el diseño y construcción,mediante ingeniería de vías metabólicas, de  E. coli   y  B. subtilis, para obtener, en ambos casos, cepashomoetanolgénicas y homolácticas. En los aspectos básicos se hará  énfasis en estrategias metabólicasracionales   y   de   evolución   adaptativa   para   lograr   una   eficiente   conversión   de   xilosa   (segundomonosacárido   más   abundante   en   la   lignocelulosa)   y   mezclas   de   glucosa­xilosa   en   los   productosmencionados.   Se   discutirán   resultados   de   análisis   de   regulación   metabólica,   los   cuales   permitendeterminar   los   pasos   que   controlan   la   formación   de   productos   en   condiciones   de   fermentación.Finalmente, se analizará la aplicación de cepas construidas por ingeniería metabólica en cultivos a nivelfermentador, usando hidrolizados de bagazo de caña, para la obtención de etanol y D­lactato.

Procesamiento proteolítico de las proteínas de Astrovirus.E. Méndez, T. Fernández­Luna, C. Muñoz, R. Baños, M.P.E. Salas, G. Aguirre­Crespo, G. Zavala, C.F.Arias.

Los astrovirus son la segunda causa de gastroenteritis viral en niños menores de cinco años. Sehan encontrado también asociados a gastroenteritis en otros mamíferos y, en aves, causan enfermedadesde alta mortalidad. Son virus no envueltos cuyo genoma esta formado por una sola cadena de RNA depolaridad positiva de 6.8 kb, lo cual  significa que en ausencia de proteínas virales,  éste es capaz deiniciar un ciclo de replicación productivo. El genoma contiene tres marcos de lectura, uno de los cuales(ORF2)   codifica  para   la  proteína  estructural  VP90.  Esta  proteína   sufre  cortes  proteolíticos  que   sonimportantes   en  varios  pasos  del   proceso   infeccioso.  Durante   la  morfogénesis,   la   proteína  VP90   seensambla en partículas asociadas a membranas, en donde parece ocurrir la replicación del RNA viral.Una vez  ensamblada  y disociada  de  membranas,  VP90 se  procesa  en  su  carboxilo   terminal  por   lascaspasas,  proteasas  celulares  asociadas  a la  muerte  celular  por apoptosis,  cuya actividad es inducidadurante la infección. Los cortes sobre VP90 generan partículas formadas por la proteína VP70 y parecenser importantes para que éstas sean liberadas de la célula. Estos virus no son infecciosos por si mismossino que, a su vez, deben procesarse con tripsina (presente en el intestino delgado,  donde infecta demanera natural), para iniciar un nuevo ciclo replicativo. El procesamiento con esta enzima provoca lageneración  de  partículas  con   alta   infectividad,   que   contienen   tres  productos:  VP34,  VP27  y  VP25.

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Aunque no se conoce el mecanismo por el que esto ocurre, se piensa que, en conjunto con el pH ácido delos endosomas (que es necesario para la infección), el tratamiento con tripsina podría inducir cambiosestructurales  que provocan  la  entrada  del  virus.  Ante  una respuesta  celular  a  la   infección,   los  virusdesarrollan estrategias que les permite contrarrestar, y/o aprovechar esta respuesta. La utilización de lasenzimas celulares como las caspasas y la tripsina durante la infección por astrovirus es un ejemplo deesta situación.

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La THI­box,  o  de  como  los  thi  mRNAs  unen  pirofosfato  de   tiamina  y  autoregulan   suexpresión.N.   Ontiveros­Palacios,   A.M.   Smith1,   F.J.   Grundy1,  M.  Soberon,   T.   M.   Henkin1  and   J.   Miranda­Ríos.1Department of Microbiology, The Ohio State University, Columbus, OH, USA

Los riboswitches son elementos de control genético localizados principalmente en la región 5´no   traducida   de   algunos   mRNAs.   Estos   dominios   de   RNA   sufren   cambios   conformacionales   quemodulan   la  expresión  genética  al  unir   señales   regulatorias  que  pueden   ser   vitaminas,   aminoácidos,nucleótidos y tRNA no cargado. El riboswitch que une al pirofosfato de tiamina (PFT), llamado THI­box,  se  encuentra  en  los   tres  reinos  de  la  vida  y regula   la  expresión génica  a  nivel  de   terminaciónprematura de la transcripción, inicio de la traducción y en el “splicing”(1). Se llevó a cabo una análisisde la expresión in vivo de mutantes con substituciones en las bases conservadas presentes en las asas dela THI­box presente en el operón thiMD de  E. coli, obteniéndose dos clases fenotípicas (2). Una claseexhibe una alta expresión durante el crecimiento en presencia o ausencia de tiamina, mientras que lasegunda clase muestra una baja expresión en ambas condiciones. Se monitoreó  la accesibilidad de lasecuencia Shine­Dalgarno después de añadir PFT por medio de ensayosde rompimiento por RNasa H yunión de subunidades ribosomales 30S. Estos estudios muestran que los RNAs mutantes de alta y bajaexpresión están bloqueados en las conformaciones no­represiva y represiva, respectivamente.

Imágenes   de   fluorescencia   y   compuestos  fotoactivables   –   aplicación   a   la   fisiología   delespermatozoideTakuya Nishigaki    Tomar imágenes fluorescentes en células vivas es un método muy importante para observar losprocesos biológicos. La demanda de esta técnica es cada vez mayor debido a la facilidad que se tienepara usar la proteína fluorescente (GFP) como marcador molecular en células sin fijar, también existenotros   indicadores   fluorescentes   muy   útiles   para   observar   parámetros   fisiológicos   como   son   losindicadores de calcio (Ca2+) intracelular.      Durante  mucho  tiempo  hemos   trabajado  en  la   fisiología  del  espermatozoide  y  recientemente  nosenfocamos  a  estudiar  el  papel  de  Ca2+  intracelular  en el  movimiento  del  espermatozoide.  Para  ello,desarrollamos un sistema para tomar imágenes fluorescentes usando luz estroboscópica con LED (light­emitting   diode),  lo   cual  nos   permite   tomar   imágenes   claras   del   flagelo   del   espermatozoide   motil.También,   desarrollamos   compuestos   fotoactivables   para   estimular  las  células   sin   causar   ningunaperturbación  del  medio.  Utilizando   estos   avances  metodológicos,   por  primera  vez,   logramos   tomarimágenes del Ca2+ intracelular en el espermatozoide de erizo de mar durante la quimiotaxis.         El sistema de microscopia con iluminación estroboscópica tiene otras ventajas importantes como:reducir el tiempo total de la excitación a la muestra. Esto ayuda a reducir la fototoxicidad a las células yel   blanqueo  del   fluoroforo.  Además,   la   lámpara  de  LED   requiere  menos   energía  que  una  lámparaconvencional (mercurio o Xenón) y tiene un tiempo de la vida muy largo. Por estas razones, el sistemade   iluminación  que  desarrollamos   podría   ser   a   futuro,   el   sistema   principal  para   microscopia   defluorescencia en el campo de las ciencias biológicas.     En   la   presentación,   explicaré   nuestros   avances   metodológicos   en   detalle   y   mostraré   resultados

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preliminares junto con los de publicados.

Mutaciones que resultan en una sobreproducción de alginato en Azotobacter vinelandii: Elpapel de la NADH­Ubiquinona oxidoreductasa translocadora de Na+.C. E. Núñez López y E. G. Espín Ocampo

Nuestro modelo de investigación comprende el estudio de las redes de regulación molecular dela producción del exo­polisacárido alginato en Azotobacter vinelandii. Todos los genes estructurales, conexcepcion  de  algC,   se   localizan  en  una   región  del  cromosoma  y están  encabezados  por  algD  cuyatranscripción esta positivamente regulada por los factores sigma de estrés AlgU y RpoS, y el sistema dedos componentes GacA/GacS. En contraste,  las proteínas AmpDE necesarias para la integridad de lapared celular y los factores antisigma­AlgU MucAB regulan negativamente la transcripción de  algD.Con el objeto de identificar aún mas reguladores negativos de esta vía, realizamos una mutagénesis alazar de A. vinelandii e identificamos 12 mutantes que sobre­producen alginato. La función de los genesinterrumpidos es muy diversa e incluyen funciones de respiración, metabolismo de carbono, síntesis delsegundo mensajero c­di­GMP etc. Los distintos niveles en la sobreproducción específica de alginato asícomo   en   la   cinética   de   transcripción   del   gen  algD  en   dichas   mutantes   sugiere   la   existencia   demecanismos  de señalización diversos  para   la  activación de  la  síntesis  de  alginato.  La mutante  GG4exhibió los niveles más altos en la producción específica de alginato (60 veces) y  dicha mutante llevainterrumpido   el   operón   que   codifica   para   el   complejo   de   la   NADH­Ubiquinona   oxidoreductasatranslocadora de sodio (NQR) el cual es una bomba ligada a la respiración y que crea un gradiente deNa+. Un estudio mas profundo del complejo NQR nos permitió concluir que este constituye la principalbomba de sodio en  A. vinelandii  y tenemos evidencias que la producción de alginato responde a loscambios en el flujo membranal de este catión. En conjunto nuestros resultados revelan la existencia deuna compleja  red  de regulación que controla   la  síntesis  de  alginato en  A. vinelandii;  el  objetivo defuturos proyectos es investigar los mecanismos moleculares que permiten activar esta ruta biosintética. 

Siguiendo   la   producción   y   las   cinéticas   de   ensamblaje   y   desensamblaje   de   pseudo­partículas virales de rotavirus: Hacia la producción de nanomaterialesL.A. Palomares, J.A. Mena, G. Plascencia­Villa, y  O.T. Ramírez

Las  pseudopartículas  virales  y  otras   estructuras  proteicas  de  dimensiones  nanométricas  hanrecibido creciente interés en bio y nanotecnología, debido a su capacidad para el transporte dirigido yentrega   de   proteínas,   sustancias   o   ácidos   nucléicos,   o   por   sus   propiedades   como   materiales.     Lasproteínas  del   rotavirus  son especialmente   interesantes  para  estas  aplicaciones,  dada  su  capacidad  deensamblaje en estructuras con propiedades distintas.    Primero, la partícula de una sola capa (slRLP),formada por VP2, es hidrofóbica.  Segundo, la partícula de doble capa (dlRLP) formada por P2 y VP6, eshidrofílica y puede desensamblarse en slRLP por cambios en la concentración de calcio.   Finalmente,VP6 es capaz de ensamblarse en tubos de varios micrómetros de largo con diámetros de 45 o 70 nm.  Eneste  trabajo,  presentaremos las  cinéticas  in vitro  de ensamblaje  y desensamblaje  de  tubos de VP6 ydlRLP seguidas por dispersión de luz dinámica y estática y por cromatografía de pereación en gel.  Las

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cinéticas de desensamblaje y ensamblaje de VP6 en tubos o en dlRLP fueron diferentes.  Estos procesosfueron   de   dos   etapas,   con   los   trímeros   de   VP6   como   intermediario.     Las   condiciones   óptimas   deensamblaje de dlRLP y tubos de VP6 serán presentadas.  Además, las cinéticas de producción in vivo deambas estructuras serán discutidas.   Esta información es importante para el diseño de procesos para laproducción de nanomateriales, vacunas, o moléculas transportadoras, basados en dlRLP o nanotubos condiámetros   de   70   o   45   nm.     Para   incrementar   la   utilidad   de   los   nanotubos   de   VP6,   estos   fueronfuncionarizados con plata, paladio y platino.  Se mostrarán las características de la funcionalización.

La regulación de los umbrales de activación del receptor para el antígeno de linfocitos T y

la respuesta inmune.Gustavo Pedraza Alva

La respuesta inmune adaptativa comienza con la activación de los linfocitos T (LT). Esto ocurrecuando el receptor para  el  antígeno (TCR) reconoce al  antígeno unido a las  moléculas del complejomayor   de   histocompatibilidad   en   la   superficie   de   la   célula   presentadora   de   antígeno   (APC).     Sinembargo, para que el linfocito se active requiere no solo de la señales resultantes del reconocimiento delantígeno por el TCR, si no que también de las señales generadas por la interacción de moléculas co­receptoras   con   sus   contra   receptores   presentes   en   la   APC.     Se   ha   propuesto   que   las   señales   co­estimuladoras disminuyen el umbral de activación del TCR inhibiendo los efectos negativos que ejercenligasas  de  ubiquitina  de   la   familia   de  Cbl   sobre   la   vía  de   señalización  del  TCR.    En   este   trabajomostramos   que   la   pre­estimulación   de   LT   a   través   de   la   molécula   co­receptora   CD43   inhibe   lafosforilación de Cbl en tirosinas inducida por el TCR; así como, la interacción de Cbl con la moléculaadaptadora Crk­L.   Adicionalmente, la estimulación de CD43 previa a la activación del TCR tambiénindujo la ubiquitinación y degradación de Cbl­b y retrasó la degradación de la cinasa ZAP­70 y de lacadena  del complejo CD3, resultando en una mayor activación de la vía de ERK y proliferacióncelular.   Estos   resultados   muestran   que   las   señales   generadas   por   CD43   regulan   los   umbrales   deactivación de los LT previniendo el efecto inhibitorio de Cbl y Cbl­b sobre las señales del TCR.   Loanterior sugiere que las señales de CD43 juegan un papel importante en la respuesta inmune mediada porLT.

Desarrollo  del   fenotipo  TRHergico  hipotalamico:  papel  del   factor  4   similar  a  Kruppel(KFL4).Leonor Pérez Martínez

La homeostasis  neuroendócrina es establecida principalmente  por los neuronas  hipotalámicasque regulan la secreción hormonal de la glándula hipófisis. Durante el desarrollo del sistema nerviosocentral (SNC) de murinos, los precursores neurales que originan a los fenotipos hipotalámicos surgenentre los días embrionarios 11 (E11) y E16. Se ha determinado que algunos factores de transcripción tipobHLH   y   de   la   familia   POU   son   cruciales   para   el   surgimiento   de   varios   fenotipos   neuronaleshipotalámicos. En nuestro laboratorio hemos analizado el transcriptoma de las neuronas que sintetizan al

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péptido   hipotalámico   “hormona   liberadora   de   tirotropina”   (TRH),   durante   etapas   tempranas   deldesarrollo. Entre los transcritos enriquecidos en éstas neuronas se encuentran algunos que codifican parafactores   de   transcripción   no   caracterizados   previamente   en   el   SNC.   Específicamente,   el   factor   detranscripción   “4   similar   a   kruppel”   (KLF4)   y   el   factor   KLF10.   En   el   presente   trabajo   nos   hemosenfocado a determinar el papel de KLF4 durante la diferenciación del fenotipo TRHérgico hipotalámico.La expresión de KLF4 durante el desarrollo del hipotálamo coincide con su unión a la región promotoradel gen de TRH (E14­E15) y con el inicio de la expresión del RNAm de TRH.   La unión de KLF4 alpromotor de TRH se da a través de sitios de respuesta a factores tipo KLF (KREs).  Interesantemente, elfactor de transcripción Sp1 forma parte de un complejo KLF4/Sp1 que interactúa con uno de los KRE.De acuerdo con esto, la expresión exógena de KLF4 y Sp1 en cultivos primarios de hipotálamo fetalregula la actividad del promotor de TRH de manera sinérgica.  En conjunto, nuestros datos indican queKLF4 y muy posiblemente Sp1 son capaces de regular directamente la actividad transcripcional del gende TRH en etapas tempranas del desarrollo hipotalámico de la rata.

Análisis   funcional   y   estructural   de   los   factores   transcripcionales   en   procariotes:   Unenfoque GenómicoErnesto Pérez­Rueda

Diversos elementos han sido identificados como responsables de regular la expresión génica enprocariotes,   tales  como   los   factores   sigma,  o   los   factores  de   la   transcripción  (TFs).  En  bacterias  yarqueas, la estructura de unión al DNA más abundante en los TFs es la denominada hélice­vuelta­hélice(HTH).  Basado   en   la   comparación   de   secuencias,   hemos   clasificado   y   evaluado   la   plasticidad(abundancia, distribución) de los TFs en alrededor de 400 genomas de procariotes. Alternativamente,hemos  predicho   la   función  en   alrededor   el   75%  de   los   reguladores   transcripcionales  de   la   familiaAraC/XylS.  Este   enfoque   se   basa   en   el   análisis   del   Dominio   de   unión   al   DNA  (DBD)   utilizandoherramientas evolutivas. Actualmente, estamos evaluando la utilidad de este enfoque en la predicción dela función en las diferentes familias de reguladores que hemos identificado a la fecha. Paralelamente,estamos intentando responder la pregunta de cómo ha evolucionado el repertorio de TFs en las Arqueascomo   preámbulo   de   una   reconstrucción   de   la   red   regulatoria   en  Halobacterium  NRC­1.   Estacaracterización permitirá  comparar esta red regulatoria con las redes regulatorias descritas en  E. coliK12 y B. subtilis y algunos eucariotes. El enfoque utilizado se basa en comparar las familias de TFs entérminos de su abundancia y distribución, así como en sus propiedades funcionales, tales como si losreguladores globales se encuentran en las mismas familias de reguladores. Finalmente, los TFs estánsiendo evaluados en términos evolutivas para determinar cual es el mecanismo de selección que estaactuando en ellos y asi tener un mayor entendimiento en este tipo de proteínas. Estos análisis permitiránplantear como ha evolucionado el repertorio de TFs en procariotes y tener sistemas de predicción tantopara la función de los reguladores como para la predicción de redes regulatorias en organismos con pocao nula información de regulación transcripcional, así como evaluar la diversidad en sus elementos.

microRNAs de frijol en respuesta a estresJosé Luis Reyes Taboada

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La falta de agua se encuentra dentro de los principales factores abióticos que pueden afectar elcrecimiento  de  las  plantas.  El  estrés  hídrico  puede resultar  como consecuencia  de otras  condicionesadversas como sequía, temperaturas extremas, niveles elevados de sales en el suelo, o una combinaciónde las anteriores. En respuesta a estas alteraciones, las plantas han desarrollado distintas estrategias anivel fisiológico, celular y molecular.  Recientemente se han identificado pequeñas moléculas de RNA,denominadas microRNAs (miRNAs), como reguladores de la expresión genética en eucariotes.  En laplanta modelo Arabidopsis thaliana, se ha mostrado que los miRNAs participan durante el desarrollo, enrespuesta a fitohormonas y por limitación de nutrientes. Sin embargo, en otras especies se conoce poco,en particular en respuesta a estrés por falta de agua.Estamos utilizando Frijol (Phaseolus vulgaris), como modelo para estudiar la función de los miRNAs enrespuesta a estrés hídrico. Los retos que este modelo impone son particularmente interesantes debido a lafalta de la secuencia completa de su genoma y a la vez atractivos por la importancia económica del frijolen nuestro país. Este análisis nos ayudará  a entender las diferentes estrategias de adaptación al estréshídrico que las plantas han desarrollado.El estudio de miRNAs en frijol se está llevando a cabo mediante la  identificación de RNAs pequeñospresentes en condiciones de estrés por limitación de agua ó por tratamiento con Acido Abscísico (ABA)y   su   posterior   análisis   tanto   bioinformático   como   experimental.   Asi   mismo,   hemos   desarrolladodiferentes herramientas experimentales que nos permiten estudiar los miRNAs de frijol y su función. Porotra  parte,   la  identificación de los  RNA mensajeros  regulados por miRNAs nos dará  una idea de larelevancia biológica de este mecanismo de regulación genética para la respuesta a estrés, asi como de ladiversidad de procesos regulados por los microRNAs en plantas en general.

¿Cómo se unen ciertos péptidos bacterianos a la fibronectina humana?Enrique Rudiño Piñera

La   fibronectina  humana  es  una  proteína  multi­dominio,   formada  por   tres   tipos  de  módulosrepetidos,  que  se   localiza  en   la  matriz  extracelular  y  el  plasma.  Se  le   involucra  en  varios  procesoscelulares,   incluyendo la adhesión celular  y la migración durante   la  embriogénesis  y  la  cicatrización.Adicionalmente,   presenta   la   característica  de  unirse   específicamente   con  moléculas  provenientes  dediversos  patógenos.  En   el   caso   de  Staphylococcus  aureus  y  Streptococcus  pyogenes,   la   unión   a   lafibronectina se da mediante proteínas bacterianas llamadas FnBPs (por sus siglas en ingles), las cualeshan demostrado no solo tener un papel importante en la adhesión a células huésped, sino también en elproceso de absorción bacteriana en las células humanas. Las FnBPs interactúan específicamente con laregión amino­terminal de la fibronectina humana, en una región rica en módulos llamados F1. A pesar deque existen algunos estudios estructurales de esta región de la fibronectina humana, todas determinadaspor RMN, no existían estructuras determinadas por difracción de rayos X. Con esto en mente iniciamosun proyecto que a la fecha ha producido 4 artículos publicados, en los cuales el componente técnico y dedesarrollo de metodologías tanto para difracción de rayos X, como para RMN, ha sido fundamental. Enla  plática  se  abundara  sobre   la  determinación de 2  formas  cristalinas  de  los  dominios  2F13F1 de  lafibronectina  humana,  otro  más   resultado  de  RMN,  así   como   la   segunda  estructura  de  un  complejofibronectina – FnBPs  y sus posibles implicaciones biológicas.

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Ingeniería de Proteínas en  ­amilasas como biocatalizadores en la producción de alquil­glucósidos.J.Yazmín, D. Almazo, A. Chauvin, M.H. Rivera, E. Mancera, P. Fuentes, A. Ochoa, A. Carrillo, G. SaabRincón. 

Los proyectos en  los que he trabajado se dividen en dos líneas relativamente independientes. Laprimera,   es   el   desarrollo   de   herramientas   para   la   generación   de   variabilidad,   las   cuales   han   sidoimplementadas específicamente en proteínas con un plegamiento de barril TIM y entre las que se puedendestacar  la recombinación  in vivo  de mitades  del  gene de fosforibosil  antranilato  isomerasa [1]  y eldesarrollo de librerías intercambiando las asas catalíticas de barriles TIM, trabajo que se encuentra enproceso y cuyo avance discutiré brevemente. La segunda, en la cual abundaré mas se relaciona con el usode amilasas para la producción de alquil  glucósidos, la cual ha englobado la exploración de diversasamilasas en búsqueda de aquellas que cumplan con las especificaciones que esta reacción requiere. Las alfa­amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de   enlaces  ­1,4 en almidón. Sin embargo,algunas de ellas tienen la capacidad de realizar reacciones alternas como son la transglicosidación y laalcohólisis,  en cuyos casos  el  glicósido unido a  la  enzima es transferido a un aceptor  de naturalezaglicosídica  en el  primer  caso,  o  a  un alcohol,  en  el   segundo  caso.  Nuestro   interés   se  centra  en   lasreacciones de alcohólisis que generan alquil­glicósidos como producto, ya que estos son utilizados comotensoactivos en las industrias alimenticia, farmacéutica y cosmética, y tienen un alto valor agregado. Eldesarrollo de biocatalizadores para la producción de este tipo de compuestos resulta muy atractivo parasustituir   la   síntesis   química   de   estos   compuestos   que   requiere   de   varios   pasos   de   protección   ydesprotección de los diversos grupos hidroxilo en las moléculas de sacárido bajo condiciones extremasde pH, que resultan muy laboriosas, costosas y de bajo rendimiento. La comparación de patrones de secuencias entre amilasas con y sin actividad transglicosídica nos hapermitido identificar residuos que son importantes en esta  actividad y a través  de mutagénesis  sitio­dirigida   hemos   podido   introducir   actividad   transglciosídica   y   alcoholítica   en   amilasas   que   nopresentaban estas actividades [2], así como aumentarla en enzimas que ya las presentaban [3, 4]. El usode evolución dirigida como herramienta para alcanzar este objetivo se ha visto limitado al no contar conun  método  de   selección  que  permita  discriminar   la   actividad   alcoholítica  presente   en  un   fondo  dehidrólisis muy alto. Una de las estrategias propuestas requiere la síntesis de derivados de oligosacáridosque nos permita discriminar entre estas dos reacciones, para ello se están sintetizando compuestos quenos permitan hacer un monitoreo de reacciones de transferencia a metanol, de manera que se pueda hacerun análisis sistematizado de muchas muestras. No obstante, aun con el desarrollo de estos métodos dealta eficiencia, el análisis se limita a unos cuantos miles de variantes, que es una muestra infinitesimal delas variantes que se pueden generar por métodos de mutagénesis aleatoria. Es entonces indispensable,dirigir la mutagénesis hacia residuos que presumiblemente estén involucrados con el mecanismo de lareacción. La identificación de residuos a mutagenizar se ha basado en el modelamiento del sitio activo,así como en la identificación de   patrones de estos residuos en enzimas homólogas con alta actividadtransglicosídica. 

Caracterización   molecular   de   los   canales   TRP   que   participan   en   la   fisiología   del

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espermatozoide de mamíferoClaudia Treviño

La comunicación entre los gametos es la base de la reproducción sexual. La regulación de lapermeabilidad iónica membranal  de los gametos juega un papel crucial  en el intercambio de señalesentre estas celulas. Los canales iónicos participan de manera importante en tres eventos básicos de lafecundación: la motilidad, la capacitación y la reacción acrosomal (RA). La evidencia hasta ahora esconsistente con la propuesta de que durante la RA hay una liberación de Ca2+  de pozas intracelularessensibles a IP3, lo cual activa canales operados por pozas (SOCs) produciendo una elevación sostenidade la [Ca2+]i y finalmente la RA. Sin embargo se sabe poco sobre la identidad molecular de la mayoría deestos canales y sobre su regulación durante estas funciones clave del espermatozoide. En mamíferos lafamilia de los canales TRP (candidatos moleculares para los SOCs) ha ido en aumento y actualmenteesta conformada por más de 30 genes diferentes subdivididos en 7 familias. Recientemente Jungnickel ycolaboradores  demostraron   la   participación  de  TRPC2  durante   los   eventos  que   conducen   a   la  RA.Nosotros,   hemos   explorado   la   expresión   de   la   familia   TRPC,   TRPV   y   TRPM   en   célulasespermatogénicas de ratón y en espermatozoide de ratón y humano. Encontramos que estas proteínas sedistribuyen  heterogéneamente  en  el  espermatozoide   tanto  en  cabeza  como  en  el   flagelo  por   lo  quepodrían participar también en eventos como movilidad y/o capacitación.  Así  mismo hemos utilizadoherramientas   farmacológicas  y  de  medición de  [Ca2+]i  intracelular  con  colorantes  fluorescentes  paracaracterizar funcionalmente a los canales TRP que participan en la fisiología del espermatozoide.  

Ingeniería de metaloenzimas redox.F. Gasteazoro, P. Gil, M. Loza, G. Paredes, D. Ruiz y B. Valderrama.

La mejor fuente de energía biológica es la reducción de O2  a agua mediante la incorporaciónsucesiva de cuatro electrones. Los intermediarios de este proceso se llaman especies de oxígeno reactivas(EORs)   y   su   acumulación   detona   el   daño   oxidativo   subyacente   en   padecimientos   degenerativos   yenvejecimiento. El éxito de la vida aeróbica esta ligada al desarrollo de mecanismos de control en   laemisión  de  EORs por   reclutamiento  de  metales  de   transición   (principalmente  cobre  y   fierro)  comocofactores   enzimáticos.   A   diferencia   de   los   intermediarios   abióticos   de   la   reducción   de   O2,   losbiocatalíticos no son difusibles sino que se asientan en los átomos metálicos, tienen vidas medias máslargas y menor reactividad. Esta táctica permite controlar la extensión del daño oxidativo de las EORs alconfinarlas. Sin embargo, este confinamiento dirige el daño oxidativo a las enzimas mismas, llegando adestruirlas. Las enzimas oxidativas están adquiriendo un papel protagónico en la biotecnología por sucapacidad   de   desarrollar   oxigenaciones   enantioselectivas,   regioselectivas   y   estereoespecíficas.Desgraciadamente, y debido a su baja estabilidad intrínseca, su participación en el mercado es menor al10% a pesar de tener a la más cotizada, la glucosa oxidasa. Nuestra investigación se enfoca a elucidar losmecanismos   moleculares   involucrados   en   el   daño   oxidativo   auto­infligido   de   metaloenzimas   condiferentes sitios metálicos: fierro hémico, fierro no­hémico o cobre. Las metaloenzimas provienen dediferentes   fuentes   naturales   (plantas,   hongos   o   bacterias),   aunque   también   las   producimosrecombinantes. La estrategia que usamos es la caracterización detallada de los mecanismos catalíticos yde desactivación mediante métodos biofísicos como espectroscopías (UV­vis, EPR, DC, DCM, etc.) y la

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resolución  de  su  estructura  cristalográfica.  Todo esto  dirigido  a  generar   las  bases  conceptuales  quepermitan un diseño racional de variantes más estables mediante ingeniería de proteínas basada en redox.

Tub23C  interactúa   genéticamente   con   los   complejos   remodeladores   de   la   cromatinaBrahma en Drosophila melanogaster.M. Vázquez, M. T. Cooper, M. Zurita y J. A. Kennison.

En Drosophila melanogaster los genes del grupo trithorax se requieren para mantener la expresión de losgenes homeóticos que determinan la identidad de los segmentos que conforman el cuerpo de la mosca.En este insecto existen por lo menos dos complejos remodeladores de la cromatina que contienen comosubunidad catalítica a la ATPasa Brahma (Brm). Estos complejos son llamados BAP y PBAP. Varias delas subunidades de estos complejos están codificadas por genes del grupo trithorax. La  ­tubulina forma parte  de los complejos  T uSC y  TuRC, que a su vez forman parte de loscomplejos organizadores de microtúbulos (MTOCs). La función de  TuRC es iniciar la polimerizaciónde   y ­ tubulina para la formación de los microtúbulos, que sirven para el transporte de proteínas yorganelos, para el establecimiento de la polaridad celular y para la formación de los husos mitóticos ymeióticos. La ­ tubulina parece tener también una función regulatoria, independiente de la de iniciar laformación de microtúbulos, pues interactúa con proteínas que regulan el ciclo celular.La ­ tubulina es esencial para la célula, por tanto, sus funciones son difíciles de estudiar genéticamenteya  que muchas  de  las  mutaciones  que  afectan  a   la  proteína  causan   letalidad  y no permiten  que  uneucarionte multicelular alcance etapas de desarrollo avanzadas. En   la   búsqueda   de   genes   que   codifican   para   proteínas   relacionadas   con   la   función   de   Brahmaencontramos uno de los dos genes  que codifican para  la ­ tubulina en  Drosophila,  T ub23C.  Lasmoscas mutantes en T ub23C tienen las alas extendidas, con ampollas y con muescas en los márgenes,así   como  estructuras   en   forma  de  perlas   en   las   venas  de   las  alas.  Algunos  de   estos   fenotipos   sondependientes de la presencia de mutaciones en los complejos BRM.  Por otro lado, encontramos que lasmutaciones   que   afectan   la   proteína  Grip91   que   también   es   una   subunidad  de   T uSC  y  T uRC,suprimen   la   letalidad   recesiva   y   los   fenotipos   de   ala   causados   por   las   mutaciones   en  T ub23C.

Tub23C  también   interactúa  con   los  genes   trithorax,  osa  (subunidad  del   complejo  BAP)  y  tonalli(posible E3 ligasa de SUMO relacionada a la actividad de los complejos BRM).Las interacciones genéticas  de   Tub23C  con algunas  mutaciones que afectan la remodelación de lacromatina, sugieren que la  ­tubulina pueda tener un papel en la regulación de la expresión genética. 

Las acuaporinas como reguladoras del flujo de agua durante la adaptación de las plantas ala sequia y la salinidadRosario Vera Estrella. 

El agua es el principal componente de células y tejidos de todos los organismos, y la manera decómo se regula la entrada y salida de esta en las células debe de ser uno de los aspectos más importanteen el estudio de la fisiología de los organismos en general.  La comprobación de la existencia de lasacuaporinas (AQPs) o canales de agua ha creado un reto para definir su papel en la biología celular y

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fisiología de todos los organismos. Debido a que en las plantas, a diferencia de los demás organismos,las AQPs forman una gran familia génica, se podría inferir que las AQPs juegan un papel primordial enel uso eficiente del agua, como podría ser durante la sequía y la salinidad. En general, la expresión deAQPs en  las  plantas es  muy compleja  ya que se ha comprobado que  intervienen diferentes  factorestranscripcionales   y   pos­transduccionales,   como   la   fosforilación   y   la   glicosilación.   Aunado   a   estosfactores   con   nuestro   trabajo   hemos   agregando   un   componente   más   a   la   lista   de   mecanismos,   laparticipación   del   tráfico   vesicular.   De   estas   evidencias   surgen   algunas   preguntas,   las   cuales   esimprescindible que tratemos de contestar: Si las AQPs se mueven entre los diferentes organelos, ¿cuál esla  función  de  esta  AQP en  estos  organelos  celulares?,  ¿cuál  o  cuáles  son el(los)  mecanismo(s)  queinducen  estos  cambios  en distribución?  y ¿como es  que  estos  mecanismos  están siendo  regulados?,existen otras AQPs que no se localizan en la membrana plasmática (PM) o TP, entonces ¿cual es laubicación  subcelular  de  estas  AQPs  y  ¿cual  es   la   función  de  cada  una  de  estas  en   sus   respectivoscompartimentos subcelulares?. Para poder tratar de contestar estas preguntas hemos estudiado el papelde la  compartimentación en  las  respuestas  de  Mesembryanthemum crystallinum  al  estrés,  además  deidentificar las moléculas reguladoras que participan en la activación del transporte de agua en general.Nuestros   resultados  han  demostrado  que   las  AQPs   se  mueven   entre   los  diferentes   compartimentoscelulares bajo ciertas condiciones ambientales, al mismo tiempo contamos con evidencias de que otrogrupo   de   AQPs   se   expresan   en   la   mitocondria,   el   ER,   el   aparato   de   Golgi,   y   en   compartimentosinvolucrados   en   la   biogénesis   de   vacuolas   y   el   tráfico   vesicular.   Otro   de   los   aspectos   que   hemosestudiado   en   detalle   es   la   función   de   cada   una   de   las   AQPs,   utilizando   el   sistema   de   expresiónheteróloga,   inyectando cRNA de  las  AQPs en ovocitos  de  Xenopus   laevis.  Los  estudios  que se  hanrealizado en este  proyecto han sido esenciales  para poder  asignar  el  papel  fisiológico que las  AQPsrealizan en la tolerancia de las plantas al estrés osmótico y salino.

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