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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se amplificó el gen completo de la NA (1427 pb) de las 14 muestras y
solamente se logró obtener la secuencia completa de HA (1678 pb) para una de
las muestras; sin embargo, se obtuvo la secuencia parcial de 1203 pb para las
13 muestras restantes.
En la figura 6 se muestra un ejemplo de los amplicones que se obtuvieron para
una de las muestras para el gen de la HA y la diferencia de tamaño entre ellos.
El resultado obtenido de la secuencia de nucleótidos del gen NA de las 14
muestras, se tradujo a aminoácidos para su alineación con la secuencia de un
virus susceptible a oseltamivir y con la de un virus resistente a este antiviral,
realizada con el programa Geneious. Este análisis demostró que ninguna de las
muestras presentó la mutación H275Y que es la mutación en NA mayormente
asociada a la resistencia, la posición de la mutación se esquematiza en la
Figura 7. Entre 417 (carril 2) y 825 pb (carril 4). En el carril 1 muestra el
marcador de peso molecular de 100 pb.
A pesar de que no se encontró la mutación H275Y en los virus analizados, la
figura 8 muestra otras mutaciones que se encontraron en la proteína NA de los
virus resistentes.
En la figura 9 se muestras las mutaciones que se encontraron para la proteína
HA de los virus estudiados.
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Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1%, de los Productos de PCR
correspondientes al gen HA. El tamaño de los fragmentos amplificados varía
1 2 3 4 5
1000
800
600
500
300
100
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Figura 7. Alineación de aminoácidos de NA, con un virus resistente y un virus
susceptible con las muestras analizadas. La posición 275 está marcada con un
círculo rojo.
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Figura 8. Alineación de aminoácidos de NA, con un virus resistente y un virus
susceptible con las muestras analizadas. Otras mutaciones encontradas se
encuentran en las posiciones S31P, N386K y P431S.
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Figura 9. Alineación de aminoácidos de HA, con un virus resistente y un virus
susceptible con las muestras analizadas.
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Existen otras mutaciones que se asocian con la resistencia a los inhibidores de
la NA, como las que Le y col. en 2008, reportaron en la posición 117 en la que
se cambia una isoleucina por una valina (I117V), y que confiere una reducción
en la susceptibilidad al oseltamivir. Otros investigadores también han reportado
la presencia de mutaciones en la posición Q313R y I427T relacionadas con la
resistencia a oseltamivir en ausencia de la mutación H275Y (Gubareva y col.,
2010). Así mismo, Rousset y col. en 2010 reportaron la presencia de un cambio
de una isoleucina por una arginina en la posición 223 de la proteína NA (I223R),
confiriendo resistencia tanto a oseltamivir como a zanamivir. De igual manera,
otras dos mutaciones reportadas que han sido asociadas a la resistencia a
oseltamivir son la D151V y la D197E (Okomo y col., 2010).
A pesar de que al analizar las secuencias de aminoácidos de NA, no se detectó
en ninguna de las muestras la mutación H275Y; sin embargo, se detectaron las
mutaciones que se muestran en la tabla III, las mutaciones encontradas al
analizar las secuencias de aminoácidos de HA aparecen en la Tabla IV.
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Tabla III. Mutaciones detectadas en el gen de la NA de las muestras
analizadas.
Muestra S31P V106I N248D H275Y N386K P431S I443V
Susceptible - - - - - - -
2438 - + + - + + -
2439 - + + - - - +
2440 + + + - + + -
2441 - + + - + + -
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Tabla IV. Mutaciones detectadas en el gen de la HA de las muestras
analizadas.
Muestra K39R N101S N146D S220T V410I N498D
Susceptible - - - - - -
2438 - - - + - +
2439 + + - + - +
2440 - - - + - +
2441 - - + + + +
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Es importante mencionar que el análisis fenotípico utilizando el sustrato MU-
NANA o el ensayo quimioluminiscente, que se realizó previamente en las
muestras, indicó que aquellas identificadas como 2438, 2440 y 2441 tenían
valores de concentración inhibitoria del 50% (IC50) hasta 4 veces el valor del
IC50 del virus susceptible. Considerándolas así como virus con susceptibilidad
reducida al antiviral, mientras que la muestra 2439 no presento susceptibilidad
reducida al antiviral, esta muestra fue incluida en el estudio ya que pertenece a
un individuo, que forma parte de una familia en la que los otros 3 miembros
presentaron muestras resistentes.
En el análisis del gen completo de NA de todas las muestras, no se encontró
ninguna de las mutaciones previamente reportadas que se han asociado con la
resistencia a oseltamivir; sin embargo se logró identificar otras mutaciones
como la N386K, que se encuentra solo en las muestras resistentes. Así mismo,
la mutación P431S, en la cavidad 430, que es una región altamente conservada
de la NA de los virus influenza A, y que aunque no forma parte del sitio activo,
entra en contacto con el sitio activo modificando el tamaño de la cavidad en la
que se inserta el carboxilato de oseltamivir, estas dos mutaciones son las que
consideramos como principales candidatas a ser responsables de la resistencia
al antiviral.
Otros autores (Rousset y col., 2010; Gubareva y col., 2010), han reportado que
algunas muestras presentan el cambio de una isoleucina por algún otro
aminoácido en las posiciones 117, 223 y 427, esto se pudo observar al analizar
el gen de NA. Lo que pareciese indicar que el aminoácido isoleucina es
fácilmente intercambiable en la secuencia de aminoácidos del gen de la NA.
Para resumir lo antes descrito, en la tabla V se señalan las mutaciones
diferentes a H275Y que se han reportado en otros trabajos asociadas a la
resistencia y las mutaciones que se encontraron en este análisis.
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Tabla V. Listado de mutaciones asociadas a la resistencia que se detectaron en
este estudio y los reportados previamente.
Mutaciones encontradas en la NA, en el presente análisis que podrían estar
relacionadas con la resistencia.
S31P
V106I
N248D
N386 K
P431S
I443V
Mutaciones reportadas que se han asociado a la resistencia
I117V (Le y col., 2008)
I223R (Okomo y col., 2010)
Q313R (Rousset y col., 2010)
I427T (Rousset y col., 2010)
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En la Tabla VI, se presentan las mutaciones encontradas al analizar las
secuencias de HA, al igual que las mutaciones asociadas con el cambio de
afinidad de la hemaglutinina por el receptor de ácido siálico encontradas en
otros trabajos, es de interés la mutación S220T, ya que se encuentra formando
parte de la cavidad 220, una cavidad que se encuentra en el sitio activo de esta
enzima, por lo que la mutación S220T podría ser una mutación compensatoria
que se esté presentando en estas cepas resistentes.
El sitio catalítico de la enzima neuraminidasa está conformado por los residuos
R118, D151, R152, R224, E276, R292, R371, Y406, y la interacción con el
sustrato está determinado por los residuos E119, R156, W178, S179, D/N198,
I222, E227, H274, E277, N294, E425, como se muestra en la Figura 10, por lo
que algunas de las mutaciones encontradas como la mutación P431S presente
solo en los virus con susceptibilidad reducida, aunque no se encuentran en el
sitio activo se encuentran en las cercanías de este pudiendo ser responsables
de un cambio conformacional (Yen y col., 2006).
El sitio catalítico de la enzima hemaglutinina está conformado por los residuos
Y95, G134, N185, E189, Q225, G227 (Blessia y col., 2010). La especificidad por
el tipo de receptor que contiene ácido siálico se determina por tres regiones de
la proteina, que son la región 130, 190 y 220, esto se observa en la Figura 11,
por lo que probablemente la mutación encontrada en la posición 220 de una
serina por una treonina puede estar siendo responsable de un cambio en la
afinidad de la HA por los receptores que contienen ácido siálico, esto por leves
cambios en la estructura de los aminoácidos(Bradley y col., 2011).
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Tabla VI. Listado de mutaciones que se asocian al cambio de afinidad por el
receptor de ácido siálico, que se detectaron en este estudio y las reportadas
previamente.
Mutaciones encontradas en la HA, en el presente estudio que podrían estar
asociadas con un cambio de afinidad.
K39R
N101S
N146D
S220T
V410I
N498D
Mutaciones reportadas que se han asociado al cambio de afinidad por el
receptor de ácido siálico
L226Q (Suzuki, 2005)
S228G (Suzuki, 2005)
R229S (Abed y col., 2002)
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Figura 10. Sitio activo de la neuraminidasa (NA). En esta imagen se observan
los aminoácidos que se encuentran en el sitio activo interaccionando con el
sustrato.
Fuente: Yen y col., 2006.
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Figura 11. Sitio activo de la hemaglutinina (HA). En esta imagen se observan
los aminoácidos que se encuentran en el sitio activo interaccionando con el
sustrato.
Fuente: Bradley y col., 2011.
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Mediante el ensayo de hemaglutinación se logro determinar el porcentaje de
unión de HA a los receptores que contienen ácido siálico tanto en conformación
α2,6 Gal como α2,3 Gal de cada uno de los cuatro aislamientos virales, así
como de los controles de susceptibilidad y resistencia. En la Figura 12a
podemos ver el comportamiento de los virus al utilizar la conformación α2,6 Gal
del ácido siálico, en esa grafica podemos observar que el virus susceptible tiene
una mayor afinidad por el ácido siálico que el virus resistente, y que tanto los
aislamientos virales 2438, y 2439 tienen un comportamiento similar al que se
presenta en el virus susceptible, mientras que 2440 y 2441 tienen un
comportamiento más semejante al presentado por el virus resistente.
Se realizó un análisis en el cual se comprobó si la unión a los receptores que
contienen ácido siálico en conformación α2,3 Gal se veía afectada en estos
virus con susceptibilidad reducida al oseltamivir, los resultados se muestran en
la Figura 12b, en la cual se muestra que el virus susceptible presenta una
afinidad del 100% por el receptor aun en la cuarta dilución, mientras que el virus
resistente solo tiene afinidad en las primeras dos diluciones, en esta gráfica se
logra observar que la capacidad de unirse a este tipo de receptores se ve
afectada en cada uno de los cuatro virus analizados, pero en el caso de 2440 y
2441 esta tendencia llega a ser mayor incluso que la presentada por el virus
resistente.
En las Figura 13 se muestra una comparación entre la unión a los receptores
que contienen ácido siálico en conformación α2,6 Gal y α2,3 Gal, para cada uno
de los virus.
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A)
B)
Figura 12. Comparación del porcentaje de unión al receptor que contiene ácido
siálico en su conformación (A) α2, 6 Gal y (B) α2, 3 Gal por parte de HA,
utilizando un virus susceptible, un virus resistente y los aislados clínicos 2438,
2439, 2440 y 2441, las mediciones se realizaron a diferentes diluciones virales.
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Figura 13. Comparación del porcentaje de unión de HA al receptor que contiene ácido siálico en su conformación α2, 3 Gal y α2, 6 Gal por parte de los virus analizados en este estudio.
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Los aislamientos virales a excepción del virus susceptible presentan una
preferente afinidad por la conformación α2, 6 Gal del ácido siálico, aunque esta
no llega a ser tan buena como la que presenta el virus susceptible y podemos
observar una baja afinidad por la conformación α2, 3 Gal del ácido siálico, tanto
en el virus resistente como en los virus que presentan una susceptibilidad
reducida al oseltamivir, Xu y colaboradores en 2012, determinaron la afinidad
de el virus influenza A pandémico surgido en 2009, y comentaron que este
inicialmente presentaba una baja afinidad por el receptor, pero que esto fue
cambiando a medida que estuvo en circulación incrementando su afinidad
principalmente por la conformación α2, 6 Gal del ácido siálico del receptor, y
esto fue un mecanismo de adaptación, que consideramos podría jugar un rol
importante en el desplazamiento del virus de influenza estacional que se
encontraba en circulación antes del surgimiento de este virus pandémico.
Se analizó la actividad enzimática de NA para determinar si la resistencia a
oseltamivir conlleva a un cambio en la actividad, en la tabla VII, se muestra que
el valor de Km es menor en el virus susceptible que en el resistente, debido a
que la afinidad del virus susceptible al ser mayor, requiere una menor
concentración de sustrato para alcanzar la velocidad máxima, mientras que en
el caso del virus resistente se requiere una mayor concentración de sustrato
debido a que su actividad se encuentra comprometida, el valor de Km del
aislamiento viral 2439 es similar al del virus susceptible, este virus no presenta
una susceptibilidad reducida a oseltamivir, los valores de Km de los
aislamientos virales 2438, 2440 y 2441 son similares al del virus resistente,
estos virus presentan una susceptibilidad reducida al oseltamivir.
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Tabla VII. Valores de Km y Vmax de los aislamientos virales 2438, 2439, 2440 y
2441 obtenidos del ensayo de actividad enzimática, así como de un virus
susceptible y un virus resistente.
Muestras Valor de Km (µM) Valor de Vmax (µM/S)
Susceptible 9,42 85,87
Resistente 47,55 101,67
2438 21,16 110,012
2439 6,7 96,54
2440 26,33 87,69
2441 39,22 80,75
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Para determinar si existe una relación entre la actividad enzimática de la NA
como en la capacidad de unión de la HA por los receptores que contienen ácido
siálico se hizo una grafica en donde se compararon los valores de ambos
parámetros para establecer si existe una compensación entre la actividad de la
NA y la capacidad de unión de la HA, ya que se requiere del balance de estas
dos proteínas para la correcta generación y propagación del virus influenza,
estas graficas podemos observarlas en la Figura 14, en donde se muestra la
comparación de la Km con el porcentaje de unión por los receptores que
contienen ácido sialico en conformación α2, 6 Gal y en la Figura 15, se muestra
la comparación de la Km con el porcentaje de unión al receptor que contiene
ácido siálico en α2, 3 Gal.
Las Figuras 14 y 15 muestran claramente que existe una relación en la que se
observa que a mayor Km, es decir que la actividad enzimática de la NA se
encuentra comprometida, la afinidad por el receptor en la HA, y que la afinidad
es mucho menor cuando el ácido siálico se encuentra en conformación α2, 3
Gal que cuando está en conformación α2, 6 Gal esto nos indica el grado de
compromiso de la HA que debe tener una baja afinidad por su receptor para
poder permitir que se liberen correctamente los nuevos viriones, este balance
entre HA y NA ha sido descrito por muchos investigadores, entre estos esta Xu
y colaboradores quienes aseguran que este balance debe de existir ya que si
ocurren cambios en la NA que comprometan la actividad enzimática y estos
cambios no son compensados por cambios en la afinidad por el receptor la
unión entre HA y el receptor será tan fuerte que la NA no podrá romperla y de
esta manera no podrán generarse viriones con la capacidad de infectar mas
células.
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Figura 14. Determinación del balance entre la NA y la HA evaluando Km y porcentaje de unión al receptor SAα2, 6 Gal.
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Figura 15. Determinación del balance entre la NA y la HA evaluando Km y porcentaje de unión al receptor SAα2, 3 Gal.