* Comunicación presentada en el XIV Congreso de la Sociedad Española de Estrabología (Valencia, 1998).1 Hospital Universitario «San Juan». Alicante.2 Doctor en Medicina y Cirugía.3 Licenciado en Medicina y Cirugía.

ACTA ESTRABOLÓGICA, 1999; 28: 39-42

MENGUAL VERDÚ E2, HUESO ABANCÉNS JR2, BARCELÓ MENDIGUCHÍA A2, GARCÍA SÁNCHEZ J3

MIOPATÍA RESTRICTIVA: DISEÑO EXPERIMENTAL*,1

RESUMEN

Objetivos: Presentar un estudio experimental, realizado en conejos albinos, de «Miopatía res-trictiva».Método: Los tóxicos inyectados en el músculo recto superior, han sido: el Etanol al 99% («Pan-reac»), el 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate («TPA») y la Dexametasona fosfato («Celestonesoluble»).Resultados: Tanto con el Etanol como con el TPA se produce a las 72 horas una importante reac-ción inflamatoria, que da paso a una degeneración fibrosa a las 6 semanas.Conclusión: Es posible el inducir un modelo experimental de miopatía restrictiva tanto con elTPA como con el Etanol.

PALABRAS CLAVE: Miopatía restrictiva, estudio experimental, TPA, Etanol, fibrosis.

RESTRICTIVE MYOPATHY: EXPERIMENTAL DESIGN

SUMMARY

Purpose: An experimental study of restrictive myopathy done in albinos rabbits is presented.Methods: The injected toxics in the restrictive myopathy has been etanol at 99%, TPA and Dexa-metasona fosfate.Results: Both Etanol and TPA have generate at the 72 hours an important inflammatory reactionwhich becomes in a fibrosis degeneration in 6 weeks.Conclusion: It’s possible to introduce an experimental pattern of restrictive myopathy with bothEtanol and TPA.

KEY WORDS: Restrictive myopathy, experimental study, TPA, Etanol, fibrosis.

INTRODUCCIÓN

La «Miopatía Restrictiva» se caracteriza por lainfiltración del tejido retroorbitario de células T ymacrófagos, con la liberación de citocinas que esti-mulan la síntesis de colágeno por los fibroblastos,condicionando no sólo una degeneración fibrosade las células musculares, sino también una seriede alteraciones a nivel de los septos del tejido con-juntivo fibroso intraorbitario (1).

La resistencia palpable a la elevación mecáni-ca, es decir, la prueba de ducción pasiva positiva,sirve para comprobar que el globo ocular se hallaaprisionado por un músculo en tensión.

Presentamos distintos tipos de miopatías expe-rimentales, simulantes de lo que ocurre en lospacientes con miopatía restrictiva (enfermedad deGraves) (2).

MATERIAL Y MÉTODOS

Los animales de experimentación utilizados hansido conejos blancos albinos, de cualquier sexo yde un peso aproximado de 2’5 kg. Escogimosdichos animales por su carácter genético homoci-gótico. El número total de animales utilizados hasido de 30.

Para el manejo de dichos animales, se siguieronmétodos humanitarios, usando varios tipos deanestesia. Uno de ellos fue la anestesia generalcon Clorhidrato de Ketamina («Ketolar»), a razónde 1 cc/kg. de peso y a una concentración de 5mg/cc También fue empleada anestesia retrobul-bar con Bupivacaína («Scandinabsa») al 2% endosis de 0’5 cc, para conseguir una aquinesiaocular al principio del estudio; y también, se utilizóanestesia tópica con un compuesto de Clorhidratode Oxibuprocaína 4 mg. más Clorhidrato de Tetra-caína 1 mg en 1 ml de vehículo acuoso («Colircu-sí Anestésico Doble»).

A lo largo de todo el estudio, durante la mani-pulación de los animales de experimentación, sehan seguido las normas de la C.E.E. y la normati-va española que la recoge (B.O.E. del 18 deMarzo de 1988. Orden 7026 y B.O.E. del 25 deOctubre de 1990. Orden 25805).

Para la inyección de los músculos extraocularescon toxina, se prepararon unas soluciones con dis-tintas sustancias: Etanol al 99% («Panreac»), 12-0-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA. «SigmaCo») y Dexametasona fosfato 2 mg («CelestoneSoluble»).

El TPA es una sustancia difícil de conseguir y demanipular; ésta se realizó con guantes (doble par)por ser el TPA un producto cancerígeno para lapiel, a largo plazo.

Para la inyección de la toxina, procedimos a ais-lar en cada uno de los animales el músculo rectosuperior. Para ello, realizamos una incisión conjun-tival a nivel limbar superior. Una vez realizadaésta, disecamos cuidadosamente la zona, evitan-do lesionar tanto el cuerpo muscular como lasestructuras adyacentes, e introducimos un ganchode estrabismos. Desplazamos éste en sentido

horizontal hasta conseguir alcanzar el músculorecto superior (Fig. 1).

La inyección de las sustancias tóxicas la realiza-mos a 3 milímetros (medida tomada con un compásde estrabismos) de la inserción muscular superior.

Los animales fueron sacrificados con una dosisletal de Pentobarbital («Eutalender») administradamediante inyección intraperitoneal.

Los 30 ojos (30 conejos) fueron distribuidos en 4grupos, dependiendo del tóxico inyectado (Tabla I).

Bajo visualización microscópica, y previa anes-tesia del animal, se procedió a disecar la conjunti-va y a aislar cuidadosamente el músculo rectosuperior , liberándolo de sus adherencias y evitan-do dañar los tejidos circundantes, como la vainaperimuscular o la cápsula de Tenon.

La inyección del tóxico se realizó a unos 3 mmde la inserción posterior del músculo recto supe-rior, utilizando para ello una jeringa Hamilton de 10microlitros.

Tras la inyección se aplicó en todos los casosun antibiótico tópico («Tobrex, Colirio oftálmico»).

En el Grupo I se administró Etanol al 99% (0’01ml); en otros 8 conejos (Grupo II) se inyectó 1microgramo de TPA.

En el Grupo III (Tabla I) al TPA se añadieron 0’5cc de Dexametasona Fosfato («Celestone Solu-ble»), en inyección orbitaria perimuscular.

En 6 de los animales se procedió a inyectar, enlos mismos músculos, sólo 10 microlitros de suerofisiológico sirviéndonos éstos como Grupo Control.

Los animales fueron sacrificados, en dos gru-pos, a las 72 horas y a las 6 semanas. Los ojosfueron enucleados, fijados en una solución de for-maldehido al 10%, deshidratados con alcohol,embebidos en parafina y seccionados con unmicrotomo. Las secciones musculares, de aproxi-madamente unos 2-4 ml fueron obtenidas del teji-do muscular próximos al lugar de la inyección. Setiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaronbajo microscopia óptica.

RESULTADOS

• Estudio Histológico (Tabla II).La inyección de Etanol produce una marcada

inflamación en el tejido muscular; a las 72 horas sepuede apreciar cómo el músculo recto superiorconsigue doblar y hasta triplicar su espesor; amicroscopia óptica puede observarse la presenciade importante infiltración inflamatoria, de las fibrasmusculares, con signos de desestructuración tales

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FIG. 1. Aislamiento muscular, para la inyección del tóxico.

como, centralización nuclear, fibras de tamañoirregular y de intensa coloración eosinófila (signode necrosis tisular). A las 6 semanas, se observa,a nivel microscópico, que la infiltración inflamato-ria es mucho menor y que hay un predominio defibrosis y neovascularización, infiltrando las fibrasmusculares (necrosis hialina de Zenckel) sobre elresto de hallazgos histopatológicos (Fig. 2).

Cuando la sustancia inyectada, fue el TPA, alexaminar las muestras obtenidas a las 72 horas,observamos como a nivel muscular se ha produci-do una reacción inflamatoria ligeramente másacentuada que en el Grupo I (Tabla II). Asimismo,en las muestras obtenidas a las 6 semanas, a nivelmicroscópico, se observan también fenómenos decentralización nuclear, fibras de tamaño diferentese irregular y coloración eosinófila. En algunos cor-tes se observa además cierta infiltración grasa, dedifícil interpretación. Comparativamente, con res-pecto al Grupo I, no existen diferencias inflamato-rias significativas; únicamente hemos encontradouna degeneración fibrosa e invasión neovascular,ligeramente más marcada (Fig. 3).

Las muestras examinadas del Grupo III (TablaII) (inyección de TPA más CTS) presentaron ya alas 72 horas una reacción inflamatoria mucho másintensa, proporcionalmente, que el Grupo I y II;con intensa infiltración celular, que llegaba aborrar la histología muscular por digestión y necro-sis asociada del tejido (Fig. 4).

No se objetivaron lesiones a nivel del tejido mus-cular, en las muestras histológicas de los casos enlos que se procedió a la inyección sólo de suerofisiológico, presentando las fibras musculares, alas 72 horas, un aspecto normal (Fig. 5).

DISCUSIÓN

La Miopatía Restrictiva, que aparece en la enfer-medad de Graves puede presentarse con unagama variada de signos y síntomas, que no siem-pre, en el momento del diagnóstico, se asocian aesta patología.

Histológicamente se ha demostrado, que lacélula diana principal de todo este proceso anato-mo-patológico es el fibroblasto del tejido retrobul-bar (3).

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Tabla I. Distribución de los animales de experimentaciónsegún el tóxico inyectado.

Sustancia inyectada N.º de ojos

Grupo I ETANOL 99% (10 microlitros) 8Grupo II TPA (1 microgramo en 10 microlitros) 8Grupo III TPA (1 microgramo) + CTS (0,5 ml) 8Grupo IV SUERO FISIOLÓGICO (10 microlitros) 6

Tabla II. Resultados del estudio histológico.

Grupo Nº de ojos 72 horas 6 semanas

Grupo I (ETANOL) 4 Infiltración leucocitaria ++4 Fibrosis y atrofia muscular

Grupo II (TPA) 3 Infiltración leucocitaria +++5 Fibrosis y atrofia muscular

Grupo III (TPA + CTS) 8 Infiltración leucocitaria +++++Necrosis

Grupo IV «control» (SUERO FISIOLÓGICO) 6 Normal Normal

FIG. 2. Fibrosis (Etanol, a las 6 semanas).

FIG. 3.Degeneración fibrosa por TPA.

Experimentos iniciales mostraron que la produc-ción de glucosaminglicanos por fibroblastos retro-oculares aumentaba cuando éstos se cultivabancon linfocitos; y éstos alcanzaban mayores valo-res, si las células T eran estimuladas por mitóge-nos (4); tales aseveraciones, coinciden con losefectos, hoy bien reconocidos, que ejercen lascitosinas derivadas de las células T y de losmacrófagos.

Y dentro del complejo espacio retrobulbar, lasestructuras «claves» de esta patología, la consti-tuyen los M.O.E. Son en ellos donde se manifies-tan las alteraciones derivadas de los cambios his-tológicos, evolutivamente. Esto se puede com-

prender, si se tiene en cuenta que, en compara-ción con el músculo esquelético, la musculaturaextraocular presenta más husos, más tejido con-juntivo intersticial y un importante riego sanguíneo;éste último presenta variaciones inter-individualese inter-musculares, lo que explicaría la asimetríaen la presentación clínica de esta patología.

Experimentalmente, comprobamos que es posi-ble el inducir un modelo de inflamación en laM.O.E., que semeja histológica y evolutivamente alprovocado por el TPA (único tóxico descrito parainducir este tipo de patología orbitaria experimen-tal), con el Etanol.

Las miositis inducidas por TPA y Etanol son his-tológicamente casi semejantes. Ambas pasan poruna fase de inflamación seguida de hialinización yfibrosis, hechos semejantes a la miositis de Gra-ves. Sin embargo, la mayor necrosis inducida porlos CTS perimusculares apuntan hacia un meca-nismo etiopatogénico tóxico y por tanto lo descali-fican como modelo experimentalmente útil para elensayo de terapéuticas extrapolables a lospacientes oftalmo-tiroideos.

BIBLIOGRAFÍA

1. KROLL AJ, KUWOBARA T: Dysthyroid ocular myo-pathy: anatomy, Hystology, and electeron micros-copy. Arch. Ophthalmol. 1986; 76: 244-257.

2. FELLS P: Oftalmopatía tiroidea: maneja clínico. TheLancet. 1991; 338: 29-32.

5. CAMPBELL RJ: Inmunology of Graves: retrobulbarhistology and histochemistry. Acta Endocrinol.1989; 121: 9-16.

6. JACOBSON DH, GORMAN CA: Endocrine ophtalmo-pathy: current ideas concerning a etiology, pato-genesis and treatment. Endoc Rv. 1994; 5: 200-220.

Dra. Dña.Encarna Mengual VerdúAvda. Costa Blanca, 80 Bq. II 2.º F.03540-Playa de San JuanAlicanteE-Mail: juan.llopis@ua.es

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FIG. 5. Fibras musculares normales.

FIG. 4. Vascularización, fibrosis e infiltración inflamatoria (TPA+Celestone).