resorbowalne membrany do sterowanej regeneracji tkanek

1

Akademia Górniczo-Hutnicza im. Stanisława Staszica

Wydział Inżynierii Materiałowej i Ceramiki Katedra Biomateriałów

Rozprawa doktorska

RESORBOWALNE MEMBRANY DO STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK

mgr inż. Małgorzata Krok

Promotor: dr hab. inż. Elżbieta Pamuła, Prof. AGH

- Kraków 2012 -

2

I CZĘŚĆ LITERATUROWA ..................................................................................... 7

1. WPROWADZENIE ........................................................................................................... 7

2. CHOROBY PRZYZĘBIA ................................................................................................ 8

3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA ........................................................ 10

3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia ............................................................................ 10

3.2. Chirurgiczne metody leczenia ................................................................................. 11

3.2.1.Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji ......................... 11

3.2.2.Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji ..................... 13

4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR) ....... 15

4.1. Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej

regeneracji tkanek .................................................................................................... 15

4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR ................................................. 17

4.2.1.Membrany nieresorbowane ............................................................................... 17

4.2.2.Membrany resorbowalne .................................................................................. 19

4.2.2.1. Materiały membranowe pochodzenia naturalnego ...................................... 20

4.2.2.2. Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego .................................. 22

4.2.3.Membrany gradientowe .................................................................................... 28

II TEZA I CEL PRACY ...................................................................... 31

III CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA ....................................................... 33 1. MATERIAŁY I METODY ............................................................................................. 33

1.1. Charakterystyka materiału matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu)

(PLGA) ...................................................................................................................... 33

1.2. Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG) ........................... 33

1.3. Otrzymywanie membran ......................................................................................... 34

1.4. Charakterystyka membran ..................................................................................... 35

3

1.4.1.Grubość i udział objętościowy porów ............................................................... 35

1.4.2.Mikrostruktura .................................................................................................. 35

1.4.3.Topografia powierzchni .................................................................................... 36

1.4.4.Zwilżalność powierzchni ................................................................................... 36

1.4.5.Właściwości chemiczne powierzchni ................................................................. 36

1.4.6.Wytrzymałość mechaniczna .............................................................................. 37

1.5. Szybkość odparowania rozpuszczalnika ................................................................ 37

1.6. Badania degradacji ................................................................................................... 38

1.7. Właściwości biologiczne ........................................................................................... 38

1.7.1.Badania na komórkach osteoblastopodobnych MG-63 .................................... 39

1.7.1.1. Żywotność komórek .................................................................................... 40

1.7.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 40

1.7.1.3. Morfologia komórek .................................................................................... 41

1.7.2.Badania z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ludzkich fibroblastów ............................................................ 41

1.7.2.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek ......................... 42


1.7.3.Badania w kokulturach komórkowych .............................................................. 43

1.7.3.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek ......................... 44

1.7.3.2. Morfologia ................................................................................................... 44

1.7.3.3. Hodowla komórek po obu stronach membrany ........................................... 45

2. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW ............................................................................ 46

2.1. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od

stężenia PEG ............................................................................................................. 46

2.1.1.Morfologia membran ........................................................................................ 46

2.1.2.Mikrostruktura .................................................................................................. 47

2.1.3.Właściwości mechaniczne ................................................................................. 49

4

2.1.4.Dyskusja wyników ............................................................................................ 51

2.2. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od

masy cząsteczkowej PEG ......................................................................................... 54

2.2.1.Mikrostruktura .................................................................................................. 54

2.2.2.Grubość membran i procent wypłukania PEG ................................................. 57

2.2.3.Wpływ odparowania rozpuszczalnika na mikrostrukturę membran ................. 57

2.2.4.Badania FTIR-ATR ........................................................................................... 59


2.3. Badania degradacji membran ................................................................................. 64

2.3.1.Ocena makroskopowa ....................................................................................... 64

2.3.2.Zmiany masy ...................................................................................................... 65

2.3.3.Zmiany pH ......................................................................................................... 66

2.3.4.Kąt zwilżania ..................................................................................................... 67

2.3.5.Wytrzymałość .................................................................................................... 69

2.3.6.Mikrostruktura i topografia powierzchni .......................................................... 72

2.3.6.1. SEM ............................................................................................................. 72

2.3.6.2. AFM ............................................................................................................ 76


2.4. Charakterystyka biologiczna membran ................................................................. 80

2.4.1.Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63 ............................................................................................................... 80

2.4.1.1. Żywotności komórek ................................................................................... 80

2.4.1.2. Poziom tlenku azotu .................................................................................... 81


2.4.1.4. Dyskusja wyników ..................................................................................... 84

2.4.2.Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ................................................... 85

2.4.2.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 85

5

2.4.2.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 86



2.4.3.Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste ............................................................... 93

2.4.3.1. Proliferacja komórek ................................................................................... 93

2.4.3.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek ...................................................... 95


2.4.3.4. Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym ...................... 98


3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI ................................................................................. 101

IV STRESZCZENIE ......................................................................... 107 V SUMMARY ................................................................................... 108

Spis Tabel: ........................................................................................................ 109

Spis Rysunków: ............................................................................................... 110

Literatura: ........................................................................................................ 115

6

W tym miejscu chciałam złożyć serdeczne podziękowania:

Prof. dr hab. inż. Elżbiecie Pamule, za nieocenioną pomoc, wiele cennych rad

oraz wiedzę przekazaną w czasie studiów doktoranckich.

Rodzicom, za to, że zawsze mnie wspierają.

„Przyjaźń poznaję po tym, że nic nie może jej zawieść, a prawdziwą miłość po tym, że nic nie może jej zniszczyć.”

- Pauli i Klaudiuszowi

I CZĘŚĆ LITERATUROWA ______________________________________________________________________

7

I CZĘŚĆ LITERATUROWA

1. WPROWADZENIE

Zarówno w Polsce jaki i na świecie rośnie zapotrzebowanie na wszelkiego

rodzaju implanty do leczenia ubytków tkanki kostnej, również w dziedzinie

periodontologii i chirurgii stomatologicznej. Dzieje się tak dlatego, że wydłuża się

średnia długość życia ludzi, ale również przyczyniają się do tego zaniedbania

higieniczne w obrębie jamy ustnej. W konsekwencji prowadzi to do coraz częstszego

występowania różnego rodzaju chorób przyzębia. Obecnie choroby te zostały zaliczone

do grupy chorób społecznych; szacuje się, że co trzecia dorosła osoba w Polsce cierpi

na choroby przyzębia, w tym również na paradontozę [1]. W zależności od stopnia

zaawansowania parodontozy stosuje się różne techniki leczenia, mniej lub bardziej

inwazyjne. Jednakże w przypadku znacznego postępu choroby, największą szansą na

powodzenie charakteryzują się techniki implantacyjne nazywane sterowaną regeneracją

tkanek (GTR, ang. guided tissue regeneration) [2].

Technika GTR opiera się na zastosowaniu materiału w postaci

półprzepuszczalnej membrany. Jak wiadomo z doniesień literaturowych komórki tkanki

nabłonkowej i tkanki miękkiej proliferują szybciej niż komórki tkanki kostnej,

w wyniku czego miejsce ubytku w tkance kostnej zajmuje tkanka miękka, która nie daje

dostatecznego wsparcia dla zębów lub w przypadku bardziej zaawansowanego procesu

chorobowego uniemożliwia zastosowanie implantów zębów [3, 4, 5]. Zadaniem

membrany używanej w GTR, jest stworzenie właściwych warunków poprzez

odizolowanie tkanek dziąsła i zapewnienie odpowiedniego czasu niezbędnego do

odbudowy tkanki kostnej w pożądanym miejscu. Takie podejście wymaga zastosowania

materiału o zdefiniowanej strukturze i właściwościach. Membrana powinna

charakteryzować się asymetryczną budową: jedna strona przeznaczona do kontaktu

z tkanką miękką powinna sprzyjać adhezji fibroblastów i komórek nabłonkowych, zaś

druga strona powinna stymulować adhezję i wnikanie osteoblastów do miejsca ubytku,

co w konsekwencji pozwoli na odbudowę nowej, zdrowej tkanki kostnej [5, 6]. Ponadto

membrana powinna również umożliwiać wymianę płynów, gazów i składników

odżywczych. Jak każdy biomateriał membrana powinna także być nietoksyczna, nie


8

wykazywać właściwości alergizujących, być odporna na zasiedlanie drobnoustrojami

oraz powinna ulegać biodegradacji i bioresorpcji po spełnieniu swojej funkcji, co

wykluczałoby powtórną operację.

Obecnie na rynku dostępnych jest kilka różnych typów membran dla GTR.

Jednakże materiały te mają liczne wady, do których można zaliczyć trudności

w kontrolowaniu ich budowy mikrostrukturalnej, niebiodegradowalność czy

odzwierzęce pochodzenie, co stwarza zagrożenia przeniesienia na pacjenta chorób

i patogenów.

W części literaturowej niniejszej pracy omówiono zagadnienia dotyczące genezy

chorób przyzębia, sposobów ich leczenia jak i materiałów wykorzystywanych

w technice GTR.

2. CHOROBY PRZYZĘBIA

Choroby przyzębia stanowią bardzo poważny problem społeczny. Początkowe

ich objawy, tj. krwawienie dziąseł czy nieprzyjemny zapach z ust są często

lekceważone. Konsekwencją tego jest rozwijający się stan zapalny. W zależności

intensywności stanu zapalnego choroby przyzębia można podzielić na dwie

podstawowe grupy:

choroby dziąseł

zapalenia przyzębia

Zarówno choroby dziąseł jak i zapalenia przyzębia są warunkowane przez dużą liczbę

patogenów chorobotwórczych, co jest główną przyczyną częstego występowania

problemów w obrębie jamy ustnej. Czynniki wywołujące choroby przyzębia można

podzielić na te, które są niezależne od człowieka takie, jak choroby dziąseł i przyzębia

pochodzenia alergicznego czy urazowego lub będące wynikiem zmian hormonalnych

czy obciążeń genetycznych. Częściej jednak obserwuje się zmiany w obrębie przyzębia,

które spowodowane są czynnikami zależnymi od działalności człowieka, a konkretnie

wynikają one z małego stopnia świadomości, jak ważna jest prawidłowa higiena jamy

________________________________

ustnej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia

nazębnego, w którym gromadzą się resztki

bakterii, które są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych

ustnej [7, 8].

Niezależnie od przyczyny występowania chorób przyzębia p

dość podobny. W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez

bakterie znajdujące się w płytce nazębnej.

nazębny zajmują coraz większy obszar,

linii dziąseł w kieszonkach

może doprowadzić do tego, że

kością dziąsła a zębem), w wyniku cz

dziąsła, ale również głębiej położone

zniszczenia tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają

do głęboko umiejscowionej tkanki kostnej

co wywołuje zniszczenie więzadła zębo

się” kości dziąsła (Rys. 1 B

kontaktu dziąsło-ząb co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w

wypadania zębów.

Rys. 1 Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb

z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.).

I CZĘŚĆ LITERATUROWA________________________________________________________________

nej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia

którym gromadzą się resztki pokarmu, co z kolei sprzyja rozwojowi

są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych

Niezależnie od przyczyny występowania chorób przyzębia przebieg każdej choroby jest

W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez

dujące się w płytce nazębnej. Płytka bakteryjna i tworzący się kamień

nazębny zajmują coraz większy obszar, wbudowując się w ząb oraz gromadząc

kieszonkach dziąsłowych. Długotrwałe nieleczone zapalenie dziąseł

może doprowadzić do tego, że bakterie zaatakują ozębną (tkankę znajdu

a zębem), w wyniku czego stan zapalny pogłębia się obejmując

głębiej położone obszary. W kolejnym stadium dochodzi do

tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają

głęboko umiejscowionej tkanki kostnej dziąsła. Zainfekowana kość ulega rozpadowi

nie więzadła zębodołowo-zębowego i powoduje

(Rys. 1 B, 2 B) [9]. W wyniku tego procesu

co prowadzi najpierw do rozchwiania, a w późniejszym etapie

Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb-dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą

z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.).

I CZĘŚĆ LITERATUROWA______________________________________

9

nej. Zaniedbania w tej dziedzinie powodują powstanie płytki bakteryjnej i kamienia

kolei sprzyja rozwojowi

są główną przyczyną powstawania stanów zapalnych w obrębie jamy

rzebieg każdej choroby jest

W pierwszym etapie pojawia się zapalenie dziąseł, wywołane przez

Płytka bakteryjna i tworzący się kamień

wbudowując się w ząb oraz gromadząc poniżej

nieleczone zapalenie dziąseł

ozębną (tkankę znajdująca się między

ę obejmując nie tylko

. W kolejnym stadium dochodzi do

tkanek przyzębia, a bakterie wzdłuż korzenia zębowego, przedostają się aż

dziąsła. Zainfekowana kość ulega rozpadowi,

zębowego i powoduje efekt „cofania

zmniejsza się pole

późniejszym etapie do

dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą


10

Bardzo poważnym problem w przebiegu chorób przyzębia jest fakt, że choroba ta może

przebiegać bezobjawowo, nawet przez kilka lat, aż do momentu kiedy utrata zęba

będzie praktycznie nieunikniona. Dlatego bardzo ważnym zagadnieniem jest

profilaktyka, ale również opracowywanie nowych metod leczenia chorób przyzębia,

które zapobiegną utracie zębów.

3. SPOSOBY LECZENIA CHORÓB PRZYZĘBIA

Leczenie chorób przyzębia zależy od stopnia zaawansowania choroby, jak

również od tego czy mamy do czynienia z zapaleniem dziąseł, czy wystąpiło także

zapalenie przyzębia. Różnica między tymi dwiema jednostkami chorobowymi wynika

z głębokości osadzenia płytki bakteryjnej. W przypadku zapalenia dziąseł płytka

bakteryjna znajduje się nad dziąsłem, natomiast jeśli występuje również zapalenie

przyzębia, płytka bakteryjna sięga głębiej, poniżej linii dziąseł osadzając się

w patologicznej kieszonce dziąsłowej. Doboru metody leczenia dokonuje lekarz na

podstawie stopnia zaawansowania choroby oraz wywiadu ogólnego.

3.1. Niechirurgiczne sposoby leczenia

W przypadku niewielkiego stopnia zaawansowania choroby zadowalające efekty

dają mniej inwazyjne metody leczenia. Podstawowym zabiegiem, mającym działanie

lecznicze, ale również profilaktyczne jest usuwanie złogów płytki nazębnej (skaling

nad- i poddziąsłowy) jak również polerowanie szyjek i korzeni zębów. W niektórych

przypadkach skuteczna jest też farmakoterapia, w której stosuje się np. antybiotyki

o działaniu ogólnym lub miejscowym, sole metali ciężkich, witaminy, środki

dezynfekujące, ściągające lub/i przeciwzapalne [10].


11

3.2. Chirurgiczne metody leczenia

Leczenie chirurgiczne stosuje się w przypadku bardziej zaawansowanych

postaci chorób przyzębia, a ich celem jest:

regeneracja ubytków tkanki kostnej

przywrócenie fizjologicznych konturów dziąsła

odsłonięcie miejsc niedostępnych dla oczyszczenia uzębienia

Pierwszą grupą metod chirurgicznych są zabiegi polegające na poszerzeniu dziąsła

(metody plastyczne), do drugiej grupy zalicza się metody, których efektem jest redukcja

lub eliminacja kieszonek przyzębnych (metody resekcyjne). Jednak najbardziej

interesujące, z punktu widzenia skuteczności oraz inżynierii biomateriałów, wydają się

być metody regeneracyjne.

3.2.1. Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na reperacji

W przypadku rozległych uszkodzeń tkanek procesy naprawcze przebiegają poprzez

wytworzenie tkanki łącznej wypełniającej ubytek, tzw. blizny łącznotkankowej. Proces

ten określany jest mianem reperacji, bo umożliwia zachowanie integralności

uszkodzonych tkanek, ale nie prowadzi on jednak do przywrócenia ich pełnej

funkcjonalności i struktury. Czynnikami sprzyjającymi bliznowaceniu są intensywny

stan zapalny, duża wielkość ubytku oraz czynniki osobnicze (np. wiek pacjenta).

W wyniku bliznowacenia powstaje tkanka niemalże bezkomórkowa, uboga w naczynia

krwionośne zawierająca dużo kolagenu. Powstanie tkanki bliznowatej jest zwykle

procesem nieodwracalnym i niekorzystnym, gdyż w jego wyniku nie zostają

odtworzone naturalne struktury tkankowe.

W przypadku chirurgicznych metod leczenia chorób przyzębia zarówno metody

plastyczne jak i resekcyjne przyczyniają się jedynie do reperacji tkanek przyzębia, tj.

dochodzi do ustąpienia objawów klinicznych choroby (zapalenia), a w miejscu ubytku

powstaje tkanka łączna, wytworzona przez fibroblasty dziąsła. W wyniku tego tworzy

________________________________

się tzw. długi przyczep nabłonkowy, będący efektem szybkiego narastania nabłonka

dziąsła, który może sięgać aż do dna ubytku kostnego. Reparację można więc

zdefiniować jako proces gojenia się rany, w wyni

budowa i funkcje nie są identyczne z tkanką zniszczoną (Rys. 2 A

że reparacja nie zapewnia pełnego odtworzenia struktury, ani funkcji utraconych tkanek

przyzębia.

Rys. 2 Schemat prawidłowego obszaru ząb

z widoczna kieszonką dziąsłową

zębodołowo-zębowego (B.) oraz obszaru po leczeni

i regeneracji (D.) [12].




zdefiniować jako proces gojenia się rany, w wyniku którego powstają tkanki, których

budowa i funkcje nie są identyczne z tkanką zniszczoną (Rys. 2 A – C). Wynika z tego,


Schemat prawidłowego obszaru ząb-dziąsło (A.), obszaru objętego

z widoczna kieszonką dziąsłową i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła

zębowego (B.) oraz obszaru po leczeniu metodą reparacji (C.)


12



ku którego powstają tkanki, których

C). Wynika z tego,


dziąsło (A.), obszaru objętego chorobą

i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła

metodą reparacji (C.)


13

3.2.2. Metody leczenia tkanek przyzębia opierające się na regeneracji

Odzyskanie pełnej funkcji i struktury tkanek przyzębia zapewnia metoda sterowanej

regeneracji tkanek – GTR (Rys. 2 D). Metoda ta opiera się na zastosowaniu

odpowiedniego materiału, w postaci membrany (błony) regeneracyjnej (Rys. 3 A).

Membranę wszczepia się pod płat dziąsłowy, tak aby jeden jej koniec opierał się

o brzeg zachowanego fragmentu wyrostka zębodołowego, a z drugiej strony

przymocowuje do szyjki zęba. Dzięki temu membrana oddziela tkanki dziąsła od

powierzchni korzenia zębowego na okres od kilku tygodni do kilku miesięcy. W tym

czasie możliwe jest zajście procesu regeneracji, ponieważ wszczepiony materiał

uniemożliwia komórkom nabłonka i fibroblastom dziąsła wnikanie do ubytku kostnego

i wytworzenie blizny łącznotkankowej. W wyniku tego, dochodzi do aktywacji

komórek ozębnej, które zaczynają odtwarzać nowy cement korzeniowy wraz

z włóknami kolagenowymi oraz dochodzi do aktywacji komórek osteogennych

odtwarzających kość (Rys. 3 B). Dzięki metodzie GTR możliwe jest odtworzenie

struktur, które mają znacznie większą odporność na uszkodzenia niż tkanki powstające

w trakcie procesu reperacji [11, 12]. GTR jest więc techniką, która umożliwia

odtwarzanie funkcji i struktury uszkodzonych tkanek poprzez wykorzystanie

naturalnych możliwości tkanek do ich regeneracji i przeciwdziałanie powstawaniu

tkanki bliznowatej. Jednakowoż proces regeneracji jest bardzo złożony i aby był

możliwy, czyli aby doszło do pełnej regeneracji tkanki kostnej, oprócz wyżej

wymienionej membrany, spełniającej funkcje nośnika/aktywatora komórek, muszą

zostać spełnione jeszcze dwa warunki. Pierwszym jest obecność komórek osteogennych

– macierzystych, częściowo zróżnicowanych (preosteoblasty) i komórek

zróżnicowanych (osteoblasty), czyli komórek które będą w stanie odtworzyć utracone

struktury kostne. Drugim warunkiem koniecznym do zajścia procesu regeneracji są

cząstki sygnałowe procesu gojenia, tj. czynniki wzrostu, cytokiny, hormony, witaminy

czy białka morfogenetyczne kości (BMP, bone morphogenetic proteins).

Razem te trzy czynniki: materiał będący aktywatorem, komórki kościotwórcze i cząstki

sygnałowe procesu gojenia, stanowią tzw. triadę Lyncha, która jest konieczna, aby

zaszedł proces regeneracji [13, 14, 15].

________________________________

Rys. 3 Schemat umieszczenia membrany

aktywacji osteoblastów (B.)

Rys. 4

Reasumując choroby przyzębia stano

W leczeniu tych chorób ogromną rolę odgrywa profilaktyka, jednakże z uwagi na to, że

choroba w stadium początkowym

dochodzi do znacznego


chemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchnią dziąsła (A.), proces

aktywacji osteoblastów (B.) [12].

4 Schemat przedstawiający triadę Lyncha [13]

Reasumując choroby przyzębia stanowią rozległy problem


w stadium początkowym często jest lekceważona lub przebiega bezobj

dochodzi do znacznego jego postępu. W takim wypadku niezbędne


14

powierzchnią dziąsła (A.), proces

].

rozległy problem społeczny.


lub przebiega bezobjawowo

. W takim wypadku niezbędne jest włączenie


15

w proces leczenia zabiegów chirurgicznych. Przeprowadzone badania dowodzą, że

najlepsze rezultaty osiągane są przy zastosowaniu metod sterowanej regeneracji tkanek

GTR. W metodzie tej wykorzystywane są biomateriały w postaci membran o ściśle

zdefiniowanej budowie i właściwościach.

W dalszej części rozprawy przedstawiono założenia, metody otrzymywania,

charakterystykę właściwości oraz wady i zalety obecnie używanych membran

stosowanych w technice GTR.

4. MEMBRANY WYKORZYSTYWANE DO LECZENIA CHORÓB

PRZYZĘBIA METODĄ STEROWANEJ REGENERACJI TKANEK (GTR)

Membrany są szeroko stosowane – nie tylko w sterowanej regeneracji tkanek,

ale w całej medycynie. Są wykorzystywane m.in. w sztucznych narządach,

bioseparatorach, inżynierii tkankowej, w systemach dostarczania leków czy

urządzeniach diagnostycznych [16]. Z uwagi na tematykę niniejszej pracy poruszane

w tym rozdziale zagadnienia będą dotyczyć membran stosowanych w technice GTR.

4.1. Wymagania stawiane materiałom membranowym do sterowanej regeneracji

tkanek

Membrany stosowane w technice GTR, w pierwszej kolejności powinny

spełniać wymagania stawiane wszystkim biomateriałom. Powinny być biozgodne,

umożliwiając integrację materiału z tkankami gospodarza, nie powinny wywoływać

stanu zapalnego o dużym nasileniu, a także powinien je cechować brak właściwości

alergizujących, kancerogennych i mutagennych [16, 17].

Oprócz tego membranom do GTR stawia się dodatkowe wymagania, które wynikają

ściśle z funkcji jaką tak membrana ma pełnić. Jak już wspomniano membrana do GTR

ma służyć jako bariera pomiędzy tkanką miękką a tkanką kostną. Z tego stwierdzenia

można wnioskować, że materiał taki powinien charakteryzować się odpowiednimi

właściwościami mechanicznymi i sztywnością [17, 18]. Membrana nie powinna ulegać

zapadaniu do wnętrza ubytku, ponieważ w przeciwnym razie nie zapewni odpowiednich

warunków potrzebnych do regeneracji tkanki kostnej. Powierzchnia membrany powinna

________________________________

również umożliwiać aktywację i proli

a z drugiej strony zapobiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej

budowa membrany powinna być asymetryczna

kontaktu z tkanką miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej

Rys. 5 Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany

sterowanej regeneracji tkanek.

Kolejną ważną cechą membrany

z którego jest wytworzona.

z faktu, że w przypadku materiału nie

funkcji musi zostać usunięta

przeprowadzenia kolejnego zabiegu,

oraz podniesieniem kosztów leczenia

biodegradacji czas jego działania po

ponieważ jest to czas, który z powodzeniem umożliwia


również umożliwiać aktywację i proliferację komórek kościotwórczych

obiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej

budowa membrany powinna być asymetryczna – gładsza ze strony

ą miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej

Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany

sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych.

ą membrany jest podatność na degradację i resorpcję materiału,

wytworzona. Nie jest to warunek konieczny, ale pożądany. Wynika to

że w przypadku materiału niedegradowalnego membrana po spełnieniu swojej

i musi zostać usunięta z organizmu. Wiąże się to z koniecznością

przeprowadzenia kolejnego zabiegu, a więc z dodatkowymi obciążeniami dla pacjenta

podniesieniem kosztów leczenia [6, 19]. W przypadku materiału ulegającego

biodegradacji czas jego działania powinien wynosić co najmniej 4

który z powodzeniem umożliwia regenerację periodontologiczną


16

ferację komórek kościotwórczych z jednej strony,

obiegać wnikaniu do ubytku komórek tkanki miękkiej. Stąd

gładsza ze strony przeznaczonej do

ą miękką i bardziej porowata od strony tkanki kostnej (Rys. 5).

Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany przeznaczonej do

Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych.

podatność na degradację i resorpcję materiału,

ale pożądany. Wynika to

po spełnieniu swojej

z organizmu. Wiąże się to z koniecznością

a więc z dodatkowymi obciążeniami dla pacjenta

W przypadku materiału ulegającego

winien wynosić co najmniej 4 – 6 tygodni,

regenerację periodontologiczną


17

[17, 20, 21]. Natomiast produkty degradacji nie mogą być toksyczne, a ich usunięcie

z organizmu powinno być możliwe na drodze metabolicznej [22].

Poza tym, uwzględniając cechy technologiczne, aby możliwe było wprowadzenie do

masowej produkcji nowego biomateriału, membrana powinna spełniać wymagania takie

jak: łatwa i szybka produkcja oraz możliwość dostosowana kształtu i wielkości wyrobu

do zapotrzebowania. Co więcej możliwe musi być przeprowadzenia procesu sterylizacji

materiału, który nie zmieni jego właściwości, a produkt końcowy powinien być

poręczny chirurgicznie i dawać możliwość łatwego zastosowania oraz dopasowania do

potrzeb indywidualnego pacjenta [23].

4.2. Rodzaje membran stosowanych w technice GTR

Membrany stosowane w GTR można podzielić na dwie podstawowe grupy.

Podział ten oparty został na zdolności materiału do degradacji, stąd możemy wyróżnić:

membrany nieresorbowalne

membrany resorbowalne

Jako osobną grupę materiałów wyróżnia się również:

membrany gradientowe (FGM, ang. functional gradient materials)

4.2.1. Membrany nieresorbowane

Pierwszą handlową membraną, która została wykorzystana do leczenia chorób

przyzębia metodą sterowanej regeneracji tkanek była nieresorbowalana membrana

z ekspandowanego politetrafluoroetylenu (e-PTFE, Gore-Tex Membrane®, W.L. Gore

& Assos., Flagstaff, AZ., USA) [5]. Pierwszy raz została ona użyta w 1984 roku, a jej

budowa odzwierciedla założenia stawiane membranom do GTR, gdyż posiada ona

asymetryczną, porowatą mikrostrukturę [24]. Membrana e-PTFE zbudowana jest

z litych węzłów polimerowych połączonych ze sobą włóknami (Rys. 6), a włókna

ułożone są tak, że z jednej strony tworzą strukturę o porowatości 90% i grubości około

1 mm, a z drugiej porowatość wynosi 30%, a grubość około 0,15 mm [17].


18

Rys. 6 Mikrostruktura e-PTFE [25].

Membrany e-PTFE są otrzymywane poprzez kontrolowane rozciąganie foli teflonowej

oraz wprasowanie jej w matrycę polimerową posiadającą określoną strukturę

(np. Dacron® lub Nylon®), dzięki czemu w PTFE dochodzi do samorzutnego tworzenia

się porów.

Obecnie na rynku dostępne są również inne membrany na bazie PTFE np.

politetrafluoroetylen o wysokiej gęstości (d-PTFE, Cytoplast® TXT-200) (Rys. 7) [17].

Membrany te zostały wprowadzone do użycia w 1993 roku. Posiadają inną budową niż

e-PTFE – posiadają pory o wielkości 0,2 m [17]. Badania pokazały, że membrany

z d-PTFE są w mniejszym stopniu zasiedlane przez drobnoustroje i łatwiejsze do

usunięcia po procesie leczenia, niż membrany e-PTFE [17, 26].

Stosowane są również membrany kompozytowe z d-PTFE połączone z siatką tytanową

(Cytoplast® Ti-250). Modyfikacja ta polega na umieszczeniu siatki tytanowej między

dwiema warstwami d-PTFE. Takie rozwiązanie poprawia wytrzymałość membran i ma

na celu zapobieganie ewentualnemu zapadaniu się membrany do wnętrza ubytku tkanki

kostnej, ponieważ ograniczenie obszaru pod membraną wpływa niekorzystnie na

warunki regeneracji [17, 24]. Oprócz siatki wzmacniającej sam tytan w postaci folii jest

również stosowany jako materiał membranowy. Tytan jest wykorzystywany jako

membrana ze względu na to, że posiada wysoką odporność na zakażenia bakteryjne

i w przypadku odsłonięcia implantu w trakcie leczenia, nie wywołuje i nie podtrzymuje

infekcji [27].

________________________________

Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości

(d-PTFE, Cytoplast®TXT

(Cytoplast®Ti-250) przeznaczone do GTR

Zaletą nieresorbowalnych materiałów jest to, że są one

i za biozgodne w kontakcie

barierowe, zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia.

materiałów jest to, że jeśli w czasie procesu regeneracji dojdzie do odsłonięcia

membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, g

nieresorbowanych membran

swojej funkcji membrana musi zostać usunięta z

z koniecznością przeprowadzenie kolejnego

ponownego otworzenia już wygojonej rany.

pacjenta, przedłuża czas

4.2.2. Membrany resorbowalne

Drugą grupą materiałów

enzymatycznej lub hydrolitycznej

pochodzenia naturalnego,

pochodzenia syntetycznego. W obu przypadkach zjawiskiem towarzyszącym w czasie

rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkt


membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości

PTFE, Cytoplast®TXT-200) i z d-PTFE wzmocnionego siatką tytanową

przeznaczone do GTR [28].

Zaletą nieresorbowalnych materiałów jest to, że są one uważane za chemicznie

w kontakcie z żywym organizmem. Posiadają one

zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia.


membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, g

nieresorbowanych membran, jak już wspomniano wcześniej, jest fakt, że po spełnieniu

swojej funkcji membrana musi zostać usunięta z leczonego miejsca

nością przeprowadzenie kolejnego zabiegu, w trakcie którego

ponownego otworzenia już wygojonej rany. Stanowi to dodatkowe obciążenie dla

pacjenta, przedłuża czas leczenia i podnosi jego koszty [6, 19, 29, 30,

Membrany resorbowalne

grupą materiałów używanych w GTR, są materiały ulegające

hydrolitycznej. Degradacji enzymatycznej ulegają materiały

pochodzenia naturalnego, natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach


rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkt


19

membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości

ego siatką tytanową

chemicznie obojętne

dobre właściwości

zapewniając odpowiedni czas dla regeneracji tkanek przyzębia. Wadą tych


membrany zostaje ona zasiedlona przez bakterie. Jednakowoż, główną wadą

jest fakt, że po spełnieniu

leczonego miejsca. Wiąże się do

zabiegu, w trakcie którego dochodzi do

Stanowi to dodatkowe obciążenie dla

, 31, 32].

są materiały ulegające degradacji

enzymatycznej ulegają materiały

natomiast degradacja hydrolityczna zachodzi w polimerach


rozkładu materiału jest powstanie produktów ubocznych. Produkty te mogą być


20

wydzielane poza organizm lub być w nim zatrzymywane. Ważne jest aby produkty

degradacji nie wywierały negatywnego wpływu na organizm żywy [33]. Dzięki

możliwości degradacji po spełnieniu swojej funkcji membrana zanika. Poprzez

zastosowanie membrany z materiału resorbowalnego lub degradowanego można

wyeliminować główną wadę materiałów stabilnych, tj. potrzebę powtórnej operacji

w celu usunięcia biomateriału.

Podział materiałów resorbowalnych na dwie grupy wynika z ich pochodzenia

i mechanizmu ich degradacji.

4.2.2.1. Materiały membranowe pochodzenia naturalnego

Podstawowym materiałem naturalnym, wykorzystywanym do wytworzenia membrany

dla GTR jest kolagen, najczęściej typu I. Może to być kolagen pochodzący z ludzkiej

skóry (Alloderm®, LifeCell, Branchburg, NJ, USA), bądź wyekstrahowany z wołowych

ścięgien Achillesa (Cytoplast® RTM Collagen, City, State, USA) lub świńskiej skóry

(Bio-Gide®, Osteohealth, Shirley, NY, USA) [13]. Pochodzenie kolagenu jest różne,

natomiast jak wiadomo kolagen jest podstawowym składnikiem macierzy

zewnątrzkomórkowej, stąd wynikają jego bardzo dobre właściwości biologiczne, zaś

membrany kolagenowe charakteryzują się bardzo dobrym powinowactwem do komórek

oraz biozgodnością [6, 34, 35].

Na Rys. 8 przedstawiono budowę membrany BioGide®. Jak widać membrana ta ma

asymetryczną budowę, z jednej strony przeznaczonej do kontaktu z tkanką miękką

membrana jest gładsza (Rys. 8 C), a z drugiej bardziej chropowata co sprzyja

proliferacji komórek kostnych (Rys. 8 D). Włóknista budowa membran kolagenowych

(Rys. 8, 9) przyśpiesza formowanie skrzepu i stabilizuje ranę, oprócz tego stymuluje

degranulację płytek krwi, w trakcie której uwalniane są np. czynniki wzrostu, co z kolei

może wpłynąć korzystnie na proces regeneracji [37].

Membrany kolagenowe są otrzymywane kilku etapowo. W pierwszym etapie kolagen

zostaje rozpuszczony, następnie przygotowany roztwór zostaje zamrożony (-20°),

a ostateczną, włóknistą strukturę otrzymuje się poprzez proces suszenia

sublimacyjnego (liofilizacji) i prasowania. Inną metodą może być przędzenie

w środowisku 99,5% alkoholu etylowego. Otrzymany produkt poddaje się procesowi

płukania i suszenia pod obniżonym ciśnieniem. Następnie kolagen sieciuje się

w aldehydzie gluarowym oraz poddaje ponownemu płukaniu i prasowaniu. [36].

________________________________

Rys. 8 Budowa membrany BioGide® A. powiększenie 40x

C. strona gładsza, powiększenie

10000x [37].

Rys. 9 Budowa membrany Cytoplast® RTM Collagen [


rany BioGide® A. powiększenie 40x B. powiększenie 100x,

C. strona gładsza, powiększenie 250x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie

rany Cytoplast® RTM Collagen [28].


21

B. powiększenie 100x,

0x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie


22

Pomimo wielu zalet, stosowanie membran kolagenowych pociąga za sobą również

pewne ograniczenia. Po pierwsze koszty pozyskania surowca kolagenowego są

stosunkowo wysokie, a liczba źródeł ograniczona. Jednakże największym problemem

wydaje się być fakt, że kolagen jako materiał pochodzenia naturalnego charakteryzuje

się zmiennością właściwości oraz budowy, w wyniku czego pojawiają się trudności

w kontrolowaniu właściwości mechanicznych i jak czasu degradacji wyrobów finalnych

[13]. Badania pokazały, że wytrzymałość membran kolagenowych znacznie spada

w momencie, kiedy membrana zaczyna się degradować [6], co może sprzyjać zapadaniu

się membrany do wnętrza ubytku i powodować ograniczenie obszaru regeneracji tkanki

kostnej. Tę wadę można korygować stosując proces sieciowania struktury kolagenu

(cross-linking) za pomocą promieniowania ultrafioletowego czy środków chemicznych

tj. aldechydu glutarowego lub związków pochodzenia naturalnego np. genipiny [13, 38,

39, 40]. Sieciowanie poprawia wytrzymałość oraz wydłuża czas resorpcji membrany

kolagenowej, nie zmieniając przy tym jej mikrostruktury. Oprócz wyżej wymienionych

wad istnieje również ryzyko, że pomimo ostrych wymagań dotyczących przetwarzania

i produkcji membran z materiałów pochodzenia naturalnego, nastąpi przeniesienia

chorób i patogenów pochodzenia zwierzęcego do organizmu ludzkiego. W niektórych

kręgach również względy światopoglądowe (ze względu na pochodzenie kolagenu)

mogą powodować ograniczenia w użyciu membran kolagenowych.

Z uwagi na wymienione ograniczenia membran pochodzenia naturalnego oczywistą

alternatywą wydają się być degradowalne materiały pochodzenia syntetycznego.

4.2.2.2. Materiały membranowe pochodzenia syntetycznego

Większość syntetycznych membran stosowanych w GTR wytwarzana jest z polimerów

należących do grupy poliestrów alifatycznych takich jak: poliglikolid (PGA), polilaktyd

(PLA), poli(-kaprolakton) (PCL) czy ich kopolimery. Poliestry alifatyczne są obecnie

wykorzystywane w medycynie jako resorbowalne materiały implantacyjne w postaci

nici chirurgicznych, śrub czy płytek. Znalazły one również zastosowanie w farmacji

jako nośniki leków w systemach kontrolowanego ich uwalniania [19, 22, 33, 41, 42].

Podstawowymi zaletami syntetycznych poliestrów alifatycznych są biozgodność,

biodegradacja, brak zagrożeń jakie niesie za sobą wykorzystanie materiałów

pochodzenia odzwierzęcego oraz możliwość lepszej kontroli ich struktury

i właściwości mechanicznych. Dzięki lepszej powtarzalności procesu otrzymywania


23

materiałów możliwe jest również kontrolowanie czasu degradacji i ustalenie po jakim

czasie następuje znaczny spadek wytrzymałości, który zagrażałby zapadaniu się

materiału do wnętrza ubytku.

Pierwszą, obecnie niedostępną komercyjnie degradowalną membraną używaną w GTR

była membrana o nazwie handlowej Guidor® [17], która została wytworzona z PLA

i poddana działaniu acetylocytrynianutributylu, w celu nadania jej większej

elastyczności. Membrana ta składa się z dwóch warstw: warstwa zewnętrzna,

przeznaczona do kontaktu z dziąsłem, charakteryzuje się dużymi, prostokątnymi

porami, natomiast warstwa wewnętrzna, małymi okrągłymi porami które mają na celu

opóźnienie penetracji ubytku przez tkankę miękką, przy jednoczesnym umożliwieniu

przepływu substancji odżywczych. Między tymi dwiema warstwami znajdują się

również bariery tworzące szczeliny, aby umożliwić wzrost tkanki kostnej. Producenci

podają, że struktura membrany nie zmienia się przez pierwsze 6 tygodni, mimo

degradacji, a całkowita resorpcja materiału zachodzi po upływie roku [43]. Kolejnym

przykładem membrany z PLA jest Epi-Guide®, która posiada trójwarstwową budowę

i różni się porowatością w zależności od strony oraz utrzymuje swoje właściwości przez

5 miesięcy, a całkowitej resorpcji ulega po roku od implantacji [44, 45]. Innym

rodzajem membran, ale również z PLA jest membrana Atrisorb®. Jest to materiał

w postaci żelu składający się z poli(D,L-laktydu) zawieszonego w N-metylo-2-

pirolidonie. Grubość membrany wynosi 600-750 m, a jej czas degradacji wynosi 6-12

miesięcy [46, 47].

Jednym z kopolimerów, używanych do wytwarzania membran do GTR jest kopolimer

laktydu z glikolidem (PLGA). Duże zainteresowanie tym materiałem wynika z faktu, że

posiada on bardzo dobre właściwości fizyczne, chemiczne i biologiczne. Liczne badania

pokazują, że PLGA jest materiałem biozgodnym [22, 48, 49]. Co więcej, PLGA ulega

degradacji hydrolitycznej, której produktami są nietoksyczne związki naturalnie

występujące w organizmie (kwas mlekowy i glikolowy), które usuwane są z niego

w trakcie przemian metabolicznych (cykl Krebsa) [50]. Kolejną zaletą PLGA jest to, że

dzięki zmianom udziału laktydu i glikolidu możliwe jest sterowanie właściwościami

mechanicznymi oraz kinetyką degradacji [22, 42, 48, 49]. Obecnie na rynku

medycznym dostępne są dwie membrany produkowane z PLGA: Vicryl Periodontal

Mesh® oraz Resolut®. Pierwsza zbudowana jest z włókien poliglaktyny 910 (kopolimer

glikolidu z laktydem w stosunku 9:1). Membranę Vicryl® cechuje brak odpowiedzi


24

antygenowej oraz to, że utrzymuje swoje właściwości mechaniczne przez 3-4 tygodnie

po implantacji [51], aczkolwiek badania na zwierzętach pokazały słabą integrację

membrany z tkankami [44, 52]. Druga komercyjnie dostępna membrana z PLGA –

Resolut®, zbudowana jest z dwóch warstw, bardziej zbitej, która zapobiega wnikaniu

komórek nabłonka do wnętrza ubytku oraz porowatej sieci włókien PGA ułatwiających

integrację z tkankami. Badania biologiczne tych membran pokazały, że ich właściwości

są podobne do właściwości membran nieresorbowanych, a całkowita resorpcja

następuje po upływie 5 – 6 miesięcy [52, 53]. Innym rodzajem kopolimeru testowanego

pod kątem zastosowania w GTR jest kopolimer laktydu i -kaprolaktonu (PLCL).

Kopolimer PLCL charakteryzuje się krótszym czasem degradacji, w porównaniu do

membran z czystego laktydu, dobrą biozgodnością oraz zapewnia odpowiednie miejsce

i wsparcie dla regeneracji tkanki kostnej. Kopolimer PLCL występuje pod handlowa

nazwą Vivosorb® i jest używany jako implant to regeneracji nerwów, ale prowadzone

badania pokazują możliwość wykorzystania go również w sterowanej regeneracji

tkanek przyzębia [54, 55].

Istnieje wiele metod używanych do wytwarzania membran z polimerów syntetycznych.

Ze względu na wymagania jakie stawia się membranom do GTR obecnie wiele

ośrodków badawczych zajmuje się testowaniem elektrospiningu jako metody ich

otrzymywania. Metoda ta daje możliwość otrzymania włóknistych membran o dużym

rozwinięciu powierzchni i jest alternatywą dla tradycyjnych metod, w których uzyskuje

się materiał tkany za pomocą procesu przędzenia z roztworu [13, 56, 57].

Powszechnie używanymi metodami do otrzymywania membran polimerowych są

odlewanie z roztworu połączone z wypłukiwanie porogenu lub inwersja faz (separacja

faz) [13, 58, 59, 60, 61, 62, 63]. W pierwszej metodzie rozpuszczony polimer miesza się

z porogenem, którym najczęściej jest sól nieorganiczna lub inny polimer.

Po zhomogenizowaniu mieszaninę odlewa się na płaską powierzchnię i pozostawia do

odparowania rozpuszczalnika. Ostatnim etapem jest wypłukanie porogenu, dzięki

czemu uzyskuje się porowatą strukturę. W drugiej metodzie otrzymywania separacja

faz zachodzi w układzie polimer-rozpuszczalnik-czynnik strącający (np. temperatura)

i polega na wytrącaniu polimeru z homogenicznego roztworu. Metoda odlewania

z roztworu oraz separacja faz dają możliwość uzyskania niewłóknistej, porowatej

mikrostruktury i przez to lepszej jej kontroli, wynikającej z możliwości zmiany


25

parametrów fizykochemicznych użytych substratów tj. rodzaju i masy cząsteczkowej

porogenu, składu roztworu polimeru, rodzaju rozpuszczalnika oraz stężenia roztworu.

Scharakteryzowane wyżej membrany do sterowanej regeneracji tkanek zarówno

syntetyczne jak i te naturalne posiadają asymetryczną, włóknistą budowę. Budowa taka

stanowi pewną wadę tych materiałów ponieważ, może ona utrudniać kontrolę nad ich

budową mikrostrukturalną (udziałem procentowym i wielkością porów) [5, 29, 30, 64].

Dlatego celowe wydaje się prowadzenie badań nad otrzymaniem membrany, która

będzie spełniać wszystkie najważniejsze wymagania stawiane membranom dla GTR,

ale jej budowa nie będzie włóknista.

W Tabeli 1 zestawiono najważniejsze cechy membran nieresorbowanych

i resorbowalnych, stosowanych w sterowanej regeneracji tkanek. Przedstawiono ich

nazwę handlową, skład oraz wymieniono najważniejsze właściwości fizykochemiczne.

I CZĘŚĆ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________

26

Tabela 1 Charakterystyka porównawcza dostępnych na rynku membran do sterowanej regeneracji tkanek – GTR [13, 17].

Membrana – nazwa handlowa Materiał Charakterystyka

membrany syntetyczne nieresorbowalne

Gore-Tex Membrane® Ekspandowany politetrafluoroetylen (e-PTFE)

długa praktyka kliniczna

dobre właściwości barierowe

budowa włóknista – węzły połączone siecią włókien

stosunkowo sztywny

Cytoplast® TXT-200 Politetrafluoroetylen w wysokiej gęstości

(d-PTFE)

łatwy do usunięcia

włóknista budowa; pory ~ 0,2 m

odporny na infekcje

Cytoplast®Ti-250 d-PTFE wzmocniony siatką tytanową większa sztywność niż Cytoplast® TXT-200

membrany naturalne resorbowalne

AlloDerm® Kolagen typu I z ludzkiej skóry czas degradacji ~ 16 tyg [65], wytrzymałość 9,4 – 21,5 MPa [66]

BioGide® Kolagen typu I i III ze świńskiej skóry


długa praktyka kliniczna

włóknista, asymetryczna budowa

czas degradacji 24 tyg [67], wytrzymałość 7,75 MPa

BioMend Extend® Kolagen typu I ze ścięgna wołowego czas degradacji 18 tyg [69], wytrzymałość 3,5 – 22,5 MPa

Cytoplast® RTM Kolagen typu I ze ścięgna wołowego czas degradacji 26-38 tyg

I CZĘŚĆ LITERATUROWA ____________________________________________________________________________________________________________________

27

cd. Tabela 1

Membrana – nazwa handlowa Materiał Charakterystyka

membrany syntetyczne resorbowalne

Guidor® Poli-D,L-laktyd/Poli-L-laktyd

+ acetylocytryniantributylu

wycofana rynku

warstwowa budowa, pory większe na zewnątrz, mniejsze w środku

Epi-Guide® Poli-D,L-laktyd budowa trójwarstwowa

czas resorpcji 6-12 miesięcy

Atrisorb® Poli-D,L-laktyd z N-metylo-2-pirolidoem możliwość dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku

czas degradacji 6-12 miesięcy [68]

Vicryl® Poliglaktyna 910

Poliglikolid/poliaktyd (w stosunku 9:1)

membrana tkana

miękka

możliwość dostosowania (adaptacji) do miejsca ubytku

czas degradacji: początek 4-12 tyg, całkowity ~ 9 miesięcy [69]

Resolut LT® Poli-D,L-laktyd-co-glikolid

dobra integracja z tkankami


czas degradacji: początek 10 tyg, całkowity 5-6 miesięcy [53], wytrzymałość 11,7 MPa [29]

Vivosorb® Poli(D,L-laktyd--kaprolakton) (PLCL) właściwości mechaniczne utrzymujące się do 8 tyg.

właściwości antyadhezyjne

________________________________

4.2.3. Membrany gradientowe

Badania nad opracowaniem

spełniałyby wszystkie założenia stawiane materiałom

opracowania membran o budowie gradientowej. Taka me

z opisanymi powyżej dostę

właściwości mechaniczne i biologiczne. Obecnie wiele ośrodków badawczych prowadzi

badania nad gradientowymi materiałami funkcjonalnymi (FGM

materials). Zgodnie z najnowszymi doniesieniami materiał

komponent nieorganiczny

bioaktywne oraz komponent organiczny

Komponenty te w pewnyc

a w innych tworzą kompozyt. (Rys. 10).

takie składniki jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki

wspomagające procesy leczenia

nowe możliwości zarówno jeśli chodzi o procesy ot

i łączenia elementów nieorganicznych

(czas degradacji, biozgodność

regeneracji tkanek przyzębia.

Rys. 10 Schemat przedstawiający

Przykładem membrany FGM

glikolidu, -kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty

albo membrana z PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badani

że materiały te mogą stymulować różne procesy biologiczne

wpłynąć korzystnie na syntezę


Membrany gradientowe

pracowaniem coraz to doskonalszych rozwiązań

ie założenia stawiane materiałom do techniki GTR doprowadziły do

membran o budowie gradientowej. Taka membrana powinna, w porównaniu

dostępnymi obecnie rozwiązaniami, posiadać jeszcze lepsze


badania nad gradientowymi materiałami funkcjonalnymi (FGM, ang. functional gradient

Zgodnie z najnowszymi doniesieniami materiał taki powinien zawierać

komponent nieorganiczny np. hydroksyapatyt, fosforan triwapniowy

bioaktywne oraz komponent organiczny, czyli naturalny bądź syntetyczny polimer

pewnych obszarach materiału występują jako niezależne

tworzą kompozyt. (Rys. 10). Oprócz tego materiał może zawierać dodatkowo

jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki

wspomagające procesy leczenia [13]. Dzięki takiej konstrukcji membrany

nowe możliwości zarówno jeśli chodzi o procesy otrzymywania, ułożenia warstw jak

elementów nieorganicznych z organicznymi, tak aby zapewnić optymalne

zgodność, osteokonduktywność czy osteoinduktywność) do pełnej

regeneracji tkanek przyzębia.

Schemat przedstawiający ideę gradientowego materiału funkcjonalnego (FGM).

Przykładem membrany FGM może być membrana składająca się z kopolimeru L

kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty

PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badani

stymulować różne procesy biologiczne, tj. aktywności osteoblastów czy

wpłynąć korzystnie na syntezę kolagenu [71, 72].

I CZĘŚĆ LITERATUROWA__________________________________________

28

materiałowych, które

do techniki GTR doprowadziły do

mbrana powinna, w porównaniu

, posiadać jeszcze lepsze


ang. functional gradient

taki powinien zawierać

wapniowy -TCP lub szkło

syntetyczny polimer [17].

materiału występują jako niezależne elementy,

Oprócz tego materiał może zawierać dodatkowo

jak czynniki wzrostu, środki antybakteryjne czy innego rodzaju leki

]. Dzięki takiej konstrukcji membrany, stworzone zostały

rzymywania, ułożenia warstw jak

, tak aby zapewnić optymalne warunki

tywność czy osteoinduktywność) do pełnej

radientowego materiału funkcjonalnego (FGM).

może być membrana składająca się z kopolimeru L-laktydu,

kaprolaktonu, w której jako wypełniacz nieorganiczny został użyty -TCP [70]

PGA lub PLA z dodatkiem bioaktywnego szkła. Badania in vivo pokazały,

aktywności osteoblastów czy

________________________________

Innym rozwiązaniem może być membran

Zaproponowana przez ten zespół badawczy membrana posia

(CL) oraz dwie zewnętrzne, funkcjonalne, warstwy

(Rys. 11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została

wzbogacona o nano-hydroksyapatyt

nowej tkanki kostnej. Druga warstwa zewnętrzna, przeznaczona do kontaktu z nabłonkiem

została sfunkcjonalizowana poprzez dodatek

przeciwbakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu za

przez drobnoustroje.

Rys. 11 Schemat membrany FGM [64].

Materiały FGM wydają s

różnych materiałów otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak

i biologicznym. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie

jak większość membran do GTR dostępnych na rynku posiadają

uznać za ich wadę, gdyż trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów

oraz ich wielkość (pkt. 4.2.2.2.)


może być membrana FGM zaproponowana przez Bottino i in. [

Zaproponowana przez ten zespół badawczy membrana posiada rdzeń zbudowany z PLCL

(CL) oraz dwie zewnętrzne, funkcjonalne, warstwy oparte na żelatynie

11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została

hydroksyapatyt, co miało na celu przyspieszenie


unkcjonalizowana poprzez dodatek metronidazolu, leku o działaniu

bakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu za

Schemat membrany FGM [64].

Materiały FGM wydają się być obiecującym rozwiązaniem, gdyż

otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak

. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie

jak większość membran do GTR dostępnych na rynku posiadają budowę

trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów

(pkt. 4.2.2.2.).

I CZĘŚĆ LITERATUROWA__________________________________________

29

FGM zaproponowana przez Bottino i in. [17, 73].

da rdzeń zbudowany z PLCL

żelatynie, PLCL i PLA (SL)

11). Warstwa zewnętrzna przeznaczona do kontaktu z tkanką kostną została

przyspieszenie procesu formowania


metronidazolu, leku o działaniu

bakteryjnym i grzybobójczym, aby zapobiegać ewentualnemu zasiedleniu membrany

gdyż możliwości łączenia

otwierają szerokie perspektywy zarówno pod kątem materiałowym jak

. Jednakowoż, jak można wnioskować z literatury, membrany FGM, podobnie

budowę włóknistą, co może

trudno w takich materiałach kontrolować udział objętościowy porów

I CZĘŚĆ LITERATUROWA __________________________________________________________________________

30

Podsumowując, w części literaturowej pracy omówiono zagadnienia dotyczące

zarówno samych chorób przyzębia, przyczyn ich występowania jak i obecnie stosowanych

sposobów leczenia. Jak wskazują doniesienia literaturowe najbardziej obiecującym sposobem

leczenia, szczególnie w bardziej zaawansowanych stadiach choroby, a dającym możliwość

pełnej regeneracji utraconych tkanek przyzębia jest metoda regeneracyjna opierająca się na

technice sterowanej regeneracji tkanek (GTR). Wykorzystywane w tej metodzie materiały,

w postaci membrany, powinny spełniać funkcję bariery między odtwarzającą się tkanką

kostną, a niepożądaną w miejscu ubytku tkanką łączną i nabłonkową. Ważne jest aby ich

właściwości zarówno fizyczne, chemiczne jak i biologiczne można było dostosować w taki

sposób aby zapewnić możliwie jak najlepsze warunki dla regenerującej się tkanki kostnej.

Obecnie na rynku medycznym dostępne są membrany, które umożliwiają zajście procesu

regeneracji tkanek przyzębia. Jednakże z uwagi na to, że materiały te nie są pozbawione wad,

w wielu ośrodkach badawczych prowadzone są badania nad otrzymaniem nowych materiałów

do GTR. Badania skupiają się przede wszystkim na materiałach degradowalnych, ponieważ

eliminuje to jedną z podstawowych wad materiałów biostabilnych, a mianowicie potrzebą

powtórnej operacji w celu usunięcia materiału po spełnieniu jego funkcji. Proponowane

modyfikacje dotyczą zarówno samych materiałów, tj. wykorzystania kopolimerów np. PLCL,

które używane są w innych obszarach medycyny jak i zmian w obrębie dodatków do

używanych już materiałów, w celu polepszenia ich właściwości.

W niniejszej rozprawie przedstawiono odmienne podejście w stosunku do materiałów

dostępnych na rynku, gdyż wprowadzone modyfikacje nie dotyczyły samego surowca

polimerowego czy wypełniaczy, a miały na celu lepsze kontrolowanie mikrostruktury

materiału membranowego. Większość dostępnych membran do GTR, na co wcześniej

zwracano uwagę, ma włóknistą budową, która utrudnia kontrolę parametrów

mikrostrukturalnych takich jak wielkość porów czy ich udział objętościowy. Cechy te mają

wpływ zarówno na właściwości mechaniczne, czas degradacji jak i integrację materiału

z otaczającą je tkanką kostną, a możliwość ich kontroli pozwoliłaby na dostosowywanie cech

materiału do konkretnego zapotrzebowania. Dlatego w tej pracy skupiono się na otrzymaniu

materiału spełniającego wymagania stawiane materiałom do GTR, ale posiadającego

odmienną, niewłóknistą budowę. Cel i teza pracy zostały omówione szczegółowo w części II,

a wyniki przeprowadzonych badań wraz z dokładniejszym opisem metody otrzymywania

i mechanizmu formowania się membrany oraz badań biologicznych przedstawiono w części

III – badawczej.

II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________

31

II TEZA I CEL PRACY

Celem rozprawy jest opracowanie nowego typu materiałów membranowych

z kopolimeru L-laktydu i glikolidu (PLGA), przeznaczonych do leczenia ubytków tkanki

kostnej w chirurgii stomatologicznej i periodontologii zgodnie z metodą sterowanej

regeneracji tkanek (GTR). Postawiony cel będzie realizowany poprzez realizację

następujących zadań cząstkowych:

1. Opracowanie metody otrzymywania membran z wykorzystaniem zjawiska separacji faz,

które zachodzi między polimerem matrycowym PLGA i porogenem poli(glikolem

etylenowym) – PEG.

2. Określenie mechanizmu formowania membran, który umożliwi kontrolowanie

mikrostruktury otrzymywanych materiałów.

3. Dobór odpowiedniego stężenia porogenu PEG, nadającego membranie maksymalną

porowatość przy zachowaniu homogeniczności i odpowiednich parametrów

mechanicznych.

4. Sprawdzenie wpływu masy cząsteczkowej użytego porogenu PEG na mikrostrukturę

membran.

5. Określenie mechanizmu degradacji i zbadanie czasu oraz kinetyki degradacji materiałów

w postaci membran.

6. Przeprowadzenie badań potencjalnej cytotoksyczności wytworzonych membran

w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63.

7. Przeprowadzenie badań in vitro w kontakcie z komórkami interesującymi z punktu

widzenia GTR – ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami

macierzystymi.

8. Przeprowadzenie badań w kokulturach komórkowych: fibroblasty i ludzkie

mezenchymalne komórki macierzyste.

W pracy postawiono tezę, że możliwe jest otrzymanie nowego rodzaju niewłóknistej,

resorbowalnej membrany przeznaczonej do GTR, posiadającej asymetryczną, porowatą

budowę, a dzięki znajomości mechanizmu separacji faz i formowania membrany, w czasie

procesu otrzymywania, możliwa będzie kontrola mikrostruktury otrzymanych materiałów,

II TEZA I CEL PRACY __________________________________________________________________________

32

która w dalszej kolejność pozwoli na dobór optymalnych warunków hodowli komórkowych,

zapewniających możliwość odbudowy tkanki kostnej w miejscu ubytku.

Przeprowadzone badania z wykorzystaniem różnych stężeń porogenu pozwolą na

dobranie takiego stężenia, które zapewni najwyższą porowatość, przy jednoczesnym

zachowaniu ciągłości (homogeniczności) materiału oraz będą stanowić podstawę do dalszych

badań nad określeniem wpływu zmian masy cząsteczkowej porogenu na mikrostrukturę

membran. Testowanie różnych mas cząsteczkowych porogenu daje możliwość dostosowania

parametrów budowy mikrostrukturalnej, tj. wielkości, kształtu porów, ich rozkładu

w objętości (asymetryczność) membrany, do założeń stawianych materiałom do GTR.

Przeprowadzone badania pozwolą również na scharakteryzowanie właściwości

mechanicznych opracowanych membran, tj. wytrzymałość na rozciąganie, moduł Younga czy

wydłużenia materiału oraz właściwości powierzchni, np. kąta zwilżania, topografii

i chropowatości powierzchni. Ocena materiału, pod kątem zachowania w środowisku

organizmu żywego, zostanie przeprowadzona zarówno w czasie badań degradacji

w środowisku wodnym jak i badań w kontakcie z komórkami in vitro. W czasie degradacji

oceniane będą zmiany masy, pH płynu inkubacyjnego, ale również właściwości mechaniczne

i chemiczne membran. Dzięki tak zaplanowanym badaniom określony zostanie czas

degradacji PLGA przetworzonego w postać membran, a także zostanie zaproponowany

mechanizm ich degradacji.

Badania biologiczne in vitro zostały podzielone na trzy etapy. W pierwszym etapie

oceniana będzie potencjalna cytotoksyczność otrzymanych membran w kontakcie

z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63. W kolejnych etapach zostaną wykorzystane

komórki interesujące z punktu widzenia leczenia chorób przyzębia metodą GTR – ludzkie

fibroblasty i ludzkie mezenechymalne komórki macierzyste. Najpierw określony zostanie

wpływ porowatości membran na zachowanie komórek, co pozwoli na zoptymalizowanie

warunków hodowli komórek kostnych i fibroblastów. Ponieważ w organizmie ludzkim oba

typy komórek, w tym samym czasie będą miały kontakt z membraną, w ostatnim etapie

zaplanowano badania komórkowe w kokulturze, aby możliwe najlepiej odwzorować warunki

w jakich znajdzie się otrzymana membrana w czasie praktyki klinicznej.

Tak zaplanowane badania umożliwią zarówno otrzymanie materiału jak i jego

kompleksowe scharakteryzowanie oraz dostosowanie do wymogów jakie stawiane są

materiałom dla sterowanej regeneracji tkanek w periodontologii i chirurgii szczękowo-

twarzowej.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

III CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. MATERIAŁY I METODY

1.1. Charakterystyka materiału matrycowego

Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer

i glikolidu poli(L-laktyd-

laktydowych do glikolowych

a gęstość 1,24 g/cm3. PLGA użyty do badań został otrzymany

polimeryzacji z otwarciem pierścien

acetyloacetonianu cyrkonu Zr(acan)

Rys. 12.

1.2. Charakterystyka porogenu

Jako środek porotwórczy (

Aldrich) o różnych masach cząsteczkowych.

różnymi właściwościami, tj.

topnienia: PEG 300 (Mn = 300

Da, = 1,128 g/cm3, Tm = 4 ÷ 8ºC), PEG 600 (M

25ºC), PEG 1000 (Mn = 1000

= 1,204 g/cm3, Tm = 54 ÷ 58ºC).

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

ATERIAŁY I METODY

Charakterystyka materiału matrycowego poli(L-laktydu-co-glikolidu) (PLGA)

Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer

-co-glikolid) (PLGA), w którym stosunek molowy

laktydowych do glikolowych wynosi 85:15. Masa molowa polimeru wynosi

. PLGA użyty do badań został otrzymany

polimeryzacji z otwarciem pierścienia, z użyciem inicjatora niskotoksycznego

acetyloacetonianu cyrkonu Zr(acan)4 [74]. Wzór półstrukturalny PLGA przedstawiono na

Rys. 12 Wzór półstrukturalny PLGA.

Charakterystyka porogenu poli(glikolidu etylenowego) (PEG)

środek porotwórczy (porogen) zastosowano poli(glikol

) o różnych masach cząsteczkowych. Zastosowane rodzaje PEG charakteryzują się

tj. różnymi wartościami masy cząsteczkowej, gęstości, temperatury

= 300 Da, = 1,125 g/cm3, Tm = -15 ÷ - 8ºC), PEG 400 (M

= 4 ÷ 8ºC), PEG 600 (Mn = 600 Da, = 1,128 g/cm

= 1000 Da, = 1,101 g/cm3, Tm = 39ºC) i PEG 3400 (M

= 54 ÷ 58ºC). Wzór półstrukturalny PEG przedstawiono na Rys. 13

Rys. 13 Wzór półstrukturalny PEG.

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAMATERIAŁY I METODY

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

33

glikolidu) (PLGA)

Materiałem matrycowym, z którego wykonano membrany jest kopolimer L-laktydu

stosunek molowy jednostek

Masa molowa polimeru wynosiła Mn = 100 kDa,

. PLGA użyty do badań został otrzymany w wyniku procesu

toksycznego związku -

alny PLGA przedstawiono na

glikol etylenowy) (PEG,

PEG charakteryzują się

różnymi wartościami masy cząsteczkowej, gęstości, temperatury

8ºC), PEG 400 (Mn = 400

= 1,128 g/cm3, Tm = 20 ÷

i PEG 3400 (Mn = 3400 Da,

lny PEG przedstawiono na Rys. 13.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1.3. Otrzymywanie membran

Membrany zostały wykonane metodą odlewania

W pierwszym etapie PLGA zos

(CH2Cl2, POCh, Gliwice) po 24 h

wagowym, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80%

roztwór został odlany na

odparowania rozpuszczalnika.

blendy polimerowe PLGA-

w próżni. Ostatnim etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.

W tym celu blendy zostały

Elga, UK) i pozostawały w niej przez okres 3

wielokrotnie wymieniana (~ 40 razy)

na Rys. 14, a szczegółowy opis zosta

porównawczy odlano również czyste folie z PLGA.

Rys.


Otrzymywanie membran

Membrany zostały wykonane metodą odlewania z roztworu i wypłukiwania porogenu.

W pierwszym etapie PLGA został rozpuszczony w 10% roztworze chlorku metylenu

po 24 h do roztworu został dodany PEG (w odpowiednim stężeniu

20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% i 80%). Po homogenizacji (około 30 min)

na szklaną szalkę Petriego i pozostawiony, aż do momentu

nika. Odparowanie rozpuszczalnika było prowadzone dwuetapowo,

-PEG były suszone przez 24 h w powietrzu i następnie przez 24 h

etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.

y zostały zanurzone w wodzie o ultra wysokiej czystości

wały w niej przez okres 3 dni; w czasie procesu wypłukiwania

(~ 40 razy). Schemat otrzymywania membran z

, a szczegółowy opis został ujęty w zgłoszeniu patentowym [

odlano również czyste folie z PLGA.

Rys. 14 Schemat otrzymywania membran PLGA


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

34

z roztworu i wypłukiwania porogenu.

w 10% roztworze chlorku metylenu

do roztworu został dodany PEG (w odpowiednim stężeniu

Po homogenizacji (około 30 min)

szalkę Petriego i pozostawiony, aż do momentu

Odparowanie rozpuszczalnika było prowadzone dwuetapowo,

rzu i następnie przez 24 h

etapem otrzymywania membran było wypłukanie porogenu z blend.

zanurzone w wodzie o ultra wysokiej czystości (UHQ, PureLab,

wypłukiwania woda była

Schemat otrzymywania membran został przedstawiony

ł ujęty w zgłoszeniu patentowym [75]. Jako materiał

PLGA.

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA MATERIAŁY I METODY

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

35

1.4. Charakterystyka membran

1.4.1. Grubość i udział objętościowy porów

Grubość membran była mierzona za pomocą śruby mikrometrycznej. Pomiar był

wykonywany w dziesięciu miejscach dla trzech różnych membranach tego samego typu.

Udział objętościowy porów, odpowiadający procentowi wypłukanego PEG, został

wyznaczony na podstawie zmierzonych różnic masy blendy i membrany przed i po procesie

wypłukiwania. Do obliczeń został wykorzystany wzór (1).

%wypł. PEG � 100% � ��

∙ 100% (1)

Gdzie : M0 – oznacza masę blendy przed procesem wypłukiwania, a MP – masę membrany po

procesie płukania. Obliczenia zostały przeprowadzone dla 10 membran.

Wyniki pomiaru grubości membran jak i udziału procentowego porów zostały przedstawione

jako średnie ± błąd standardowy.

1.4.2. Mikrostruktura

Do scharakteryzowania mikrostruktury membran został użyty skaningowy mikroskop

elektronowy (SEM, Nova NanoSEM, FEI, USA). Napięcie przyspieszające wiązkę

elektronów miało wartość 18 kV. Zdjęcia wykonano dla obydwu powierzchni membran

górnej, tj. tej która w trakcie procesu otrzymywania miała kontakt z powietrzem i dolnej, tj.

tej która w trakcie procesu otrzymywania miała kontakt ze szklaną powierzchnią szalki

Petriego. Analizie poddano również przełamy membran, które zostały wykonane po

umieszczaniu fragmentów membran w ciekłym azocie. Wykonano również zdjęcia czystej

folii PLGA. Przed analizą próbki zostały napylone ultracienką warstwą węgla, która

przeciwdziałała gromadzeniu się ładunków w trakcie obserwacji mikroskopowej. Zdjęcia

zostały wykonane przy powiększeniach 2000 i 5000 razy.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

36

1.4.3. Topografia powierzchni

Obraz topografii powierzchni został zarejestrowany przy użyciu mikroskopu sił atomowych

(Explorer, Veeco, USA) w trybie kontaktowym. Dzięki oprogramowaniu (SPMLab6.0.2

Explorer) możliwe również było wyznaczenie średniej chropowatość powierzchni Ra

(zgodnie ze wzorem 2), jak i wyznaczenie wielkość porów.

� �1� �| ��|��

��

�(2)

Gdzie: Ra oznacza średnią arytmetyczną odchyleń profilu od linii średniej, Ir – długość

odcinka elementarnego, Z(x) – funkcja określająca odchylenia od profilu.

Podobnie jak w przypadku badań SEM analizie poddane zostały obie powierzchnie

membrany (górna i dolna) oraz czysta folia PLGA. Dla każdej powierzchni zarejestrowano po

sześć obrazów dla obszaru skanowania 100 m x 100 m z szybkością skanowania 3 linie/s.

Wartości Ra i wielkości porów zostały przedstawione jako średnia ± błąd standardowy.

1.4.4. Zwilżalność powierzchni

Zwilżalność powierzchni została wyznaczona poprzez pomiar kąta zwilżania przy pomocy

goniometru (DSA10, Krüss, Niemcy) wyposażonego w system to analizy kształtu kropli.

Cieczą pomiarową była woda UHQ (PureLab, Elga, UK), a analizowane krople miały

objętość 0,2 l. Pomiary zostały wykonane dla górnej i dolnej powierzchni membrany jak

i dla czystej folii PLGA. Kąt zwilżania został uśredniony z pomiaru dziesięciu kropli dla

każdej serii pomiarowej i przedstawiony jako średnia ± błąd standardowy.

1.4.5. Właściwości chemiczne powierzchni

Badania za pomocą spektroskopii w podczerwieni zostały wykonane techniką całkowitego

wewnętrznego odbicia (FTIR-ATR), w zakresie środkowej podczerwieni (4000 ÷ 550 cm-1)

z rozdzielczością 4 cm-1 na urządzeniu Digilab FTS 60V, Bio-Rad przy wykorzystaniu

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

kryształu ZnSe. Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak

i czystych polimerach: PLGA i PEG.

1.4.6. Wytrzymałość mechaniczna

Membrany oraz czysta folia PLGA zostały po

wyznaczenia wytrzymałości mechanicznej na rozciąganie

maksymalnego oraz odkształcenia przy zerwaniu.

maszynę wytrzymałościową Zwick 1435 (Niemcy).

wartość obciążenia wstępnego 0,1

5 mm. Wykonano po sześć pró

średnią ± błąd standardowy.

1.5. Szybkość odparowania rozpuszczalnika

W celu wyjaśnienia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran

przeprowadzono badania

PLGA/PEG jak i z czystych polimerów: PLGA i PEG.

sposób, że rozpuszczone i zhomogenizowane roztwory (przygotowane tak samo jak

w przypadku odlewania blend) były odlewane

wadze elektronicznej (RADWAG WPX 250, Radom, Polska)

Rys. 15

Zmiany masy były rejestrowan

kolejne 60 minut. Szybkość suszenia została obliczona na postawie krzywych zależności


Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak

i czystych polimerach: PLGA i PEG.

mechaniczna

Membrany oraz czysta folia PLGA zostały poddane jednoosiowemu rozciąganiu w celu

wyznaczenia wytrzymałości mechanicznej na rozciąganie, modułu Younga, odkształcenia

maksymalnego oraz odkształcenia przy zerwaniu. W badaniu tym wykorzystano uniwersalną

maszynę wytrzymałościową Zwick 1435 (Niemcy). Prędkość testu wynosiła 100

ość obciążenia wstępnego 0,1 N, odległość między szczękami 40 mm i s

5 mm. Wykonano po sześć prób dla każdego rodzaju materiału, a wyniki przedstawiono jako

błąd standardowy.

Szybkość odparowania rozpuszczalnika

nia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran

szybkości odparowywania rozpuszczalnika zarówno z blend

PLGA/PEG jak i z czystych polimerów: PLGA i PEG. Doświadczenie przeprowadzono w ten


odlewania blend) były odlewane na szklane szalki Petriego umieszczone na

(RADWAG WPX 250, Radom, Polska) (Rys. 15).

15 Schemat odparowywania rozpuszczalnika

Zmiany masy były rejestrowane co minutę przez 60 minut, a następnie co 5 minut przez



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

37

Badanie zostało wykonane na membranach, blendach PLGA/PEG jak

ddane jednoosiowemu rozciąganiu w celu

, modułu Younga, odkształcenia

W badaniu tym wykorzystano uniwersalną

Prędkość testu wynosiła 100 mm/min,

mm i szerokość próbki

b dla każdego rodzaju materiału, a wyniki przedstawiono jako

nia mechanizmu separacji faz PLGA/PEG i powstania membran

szybkości odparowywania rozpuszczalnika zarówno z blend

Doświadczenie przeprowadzono w ten


szalki Petriego umieszczone na

).

Schemat odparowywania rozpuszczalnika.

co minutę przez 60 minut, a następnie co 5 minut przez



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

38

zmiany masy od czasu trwania procesu. Szybkości odparowania rozpuszczalnika wyliczono

dla trzech różnych zakresów czasu: I okres (2 ÷ 10 min), II okres (30 ÷ 50 min) i III okres

(100 ÷ 120 min) i wyrażono w jednostkach g/cm2·s, uwzględniając powierzchnię szalki

Petriego. W celu wyznaczenia masy pozostałego rozpuszczalnika próbki zostały powtórnie

zważone po upływie 24 h.

1.6. Badania degradacji

Materiały były przygotowane według metody opisanej w punkcie 1.3, a następnie

umieszczono je w buforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS: 137 mM NaCl, 6,64 mM

KH2PO4, 2,67 mM KCl, 8 mM Na2HPO4), aby określić ich podatność na degradację

hydrolityczną. Próbki oceniano po 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 20 i 24 tygodniach inkubacji.

Oceniano wartości: pH PBS, w którym inkubowano próbki (pH-meter CP-411, Elmetron,

Gliwice, Polska), a także zmiany masy (RADWAG WPX 250, Radom, Polska) i parametry

mechaniczne membran (Zwick 1235, Niemcy). Obserwowano także zmiany zachodzące na

powierzchni materiału poprzez badanie kąta zwilżania (DSA10, Krüss, Niemcy) oraz

topografii powierzchni (AFM, Explorer), jak również zmiany mikrostruktury (SEM, FEI).

Przed pomiarami próbki wyciągnięte z PBS zostały wypłukane w wodzie destylowanej

i wysuszone w temperaturze 37°C przez 24 h. Względną zmianę masy membran po inkubacji

wyznaczono ze wzoru (3):

∆m � ��

∙ 100%(3)

gdzie: mi oznacza wyjściową masę membran, a m0 masę membran po degradacji. Badaniu

degradacji poddane zostały zarówno membrany jak i folie PLGA.

1.7. Właściwości biologiczne

Badania biologiczne w warunkach in vitro były wykonywane w Laboratorium Badań

Biologicznych Katedry Biomateriałów Wydziału Inżynierii Materiałowej i Ceramiki (AGH)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

jak również w Max Bergman Center for Biomaterials na

w Dreźnie (staż naukowy w

1.7.1. Badania na komórkach osteobl

Membrany zostały przygotowane według wcześniejszego opisu (

z nich okrągłe próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały

poddane działaniu 70% etanolu, wypłukane w PBS oraz poddane sterylizacji

promieniowaniem UV (każda

zamocowane w specjalnych insertach (

materiału, oraz umieszczone w 24

(Rys. 16).

Rys. 16 Schemat hodowli komórek

Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej)

PLGA i na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu

hodowli komórkowych (TCPS,

jako próby kontrolne. Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa

komórek/próbkę. Do badań wykorzystano o

z Europejskiego Banku Komórek

pozyskane z linii komórek raka kości (

hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO

hodowlanym DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%

antybiotyków (penicylina/streptomycyna) i 2 mM L


Bergman Center for Biomaterials na Uniwersyte

(staż naukowy w ramach Programu LLP Erasmus).

na komórkach osteoblastopodobnych MG-63

przygotowane według wcześniejszego opisu (pkt. 1.3), a następnie wycięto

próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały


em UV (każda strona membrany po 20 min). Sterylne próbki zostały

zamocowane w specjalnych insertach (Scaffdex, Finlandia), które zapobiegały wypływaniu

oraz umieszczone w 24-dołkowych płytkach hodowlanych

Schemat hodowli komórek MG-63 w insertach i dołkach

Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej)

na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu

hodowli komórkowych (TCPS, ang. tissue culture polystyrene), które zostały wykorzystane

Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa

Do badań wykorzystano osteoblastopodobne komórki MG

Komórek – European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK

pozyskane z linii komórek raka kości (kostniakomięsaka, osteosarc

hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO

DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%

antybiotyków (penicylina/streptomycyna) i 2 mM L-glutaminy (PAA, Austria)


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

39

Uniwersytecie Technicznym

pkt. 1.3), a następnie wycięto

próbki o średnicy 20 mm. Przygotowane w ten sposób materiały zostały


strona membrany po 20 min). Sterylne próbki zostały

Scaffdex, Finlandia), które zapobiegały wypływaniu

dołkowych płytkach hodowlanych (Nunclon, Dania)

w insertach i dołkach.

Komórki były hodowane na obydwu stronach membran (górnej i dolnej) jak również na folii

na powierzchni dołka hodowlanego wykonanego z modyfikowanego polistyrenu do

), które zostały wykorzystane

Początkowa gęstość wysiewanych komórek była równa 1,6·104

podobne komórki MG-63 (pochodzące

Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK)

kostniakomięsaka, osteosarcoma). Komórki były

hodowane przez okres 5 dni w temperaturze 37°C i atmosferze 5,0% CO2, w medium

DMEM (PAA, Austria) z 10% dodatkiem surowicy bydlęcej (FBS), 1%

(PAA, Austria).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

40

1.7.1.1. Żywotność komórek

Żywotność komórek oznaczono za pomocą testu MTT. Metoda ta jest oparta na zdolności

enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej do przekształcenia pomarańczowej rozpuszczalnej

soli tetrazolowej (MTT, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) do

fioletowego formazanu. Kolorymetryczne oznaczenie ilości barwnego formazanu jest

skorelowane z liczbą żywych komórek.

Do dołków hodowlanych, w których na badanych materiałach hodowane były komórki,

dodano roztwór MTT (5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Niemcy). Następnie płytki hodowlane

zostały ponownie umieszczone w inkubatorze na 4 h, po tym czasie dodano 100 l

sulfotlenku dimetylu (DMSO, Poch. Gliwice, Polska) do zastopowania reakcji. Kolejno płytki

zostały odwirowane (200 rpm przez 5 min), a roztwór przepipetowano do pojemniczków

Eppendorfa i jeszcze raz odwirowano przy prędkości 13000 rpm przez 2 min (MPW-351R,

Warszawa, Polska). Gęstość optyczną wyekstrahowanego, zabarwionego na kolor granatowo-

fioletowy roztworu, wyznaczono dla długości fali równej 540 nm w spektrofotometrze

Multiscan FC Microplate (Thermo Scientific, USA). Wyniki zostały przedstawione jako

średnia ± błąd standardowy.

1.7.1.2. Poziom tlenku azotu

Poziom tlenku azotu (NO) został wyznaczony za pomocą reakcji Griessa. Zastosowana

technika pomiarowa polega na oznaczeniu stężenie metabolitów NO (azotanów i azotynów),

w nadsączu (supernatancie) pobranym znad hodowli komórkowej. Zachodząca reakcja polega

na dwuazowaniu azotynu z sulfanilamidem (odczynnik Griessa A: 1% sulfanilamidu w 5%

kwasie ortofosforowym) i połączeniu z N-1-naftyloetylenodiaminą (odczynnik Griessa B:

0.1% dichlorowodorek naftylenodiaminy w wodzie destylowanej). W wyniku reakcji

powstaje barwny związek dwuazowy, którego natężenie barwy mierzy się

spektrofotometrycznie.

Do pobranego znad hodowli komórkowej 100 l nadsączu, dodano 100 l mieszaniny

odczynników Griessa (A+B, w stosunku 1:1). Następnie mieszaninę inkubowano przez 5 min,

po czym zmierzono absorbancję dla długości fali 540 nm za pomocą spektrofotometru

Multiscan FC Microplate. Wyniki zostały przedstawione jako średnia ± błąd standardowy.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1.7.1.3. Morfologia komórek

Do obserwacji morfologii komórek został wykorzystany optyczno

Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Nie

paraformaldehydu; tak przygotowane próbki były przechowywane

czasu badania. Przed obserwacją pod mikroskopem materiały zostały wypłukane w PBS,

a następnie wybarwione za pomocą oranżu akrydyny (

Aldrich, Polska) o stężeniu 1 mg/ml. Przy takim stężeniu oranż

monomer i posiada maksimum abso

cytoplazmę komórek na zielono

1.7.2. Badania z wykorzystaniem

i ludzkich fibroblastów

Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i

w poprzednim eksperymencie,

niskotemperaturową plazmą

poddano dwa rodzaje membran, a

podobnie jak w pierwszym eksperymencie

powierzchniach membran (górnej i dolnej).

(hMSC) zostały dostarczone przez Klinikę Uniwersytecką

z Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z

Dermatologii, Wenerologii i Alergologii,

w Lipsku. Schemat przedstawiający hodowle komó

Rys. 17 Schemat hodowli


Morfologia komórek

Do obserwacji morfologii komórek został wykorzystany optyczno-fluorescencyjny mikroskop

Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy). Po 24 h hodowli komórki utrwalono

tak przygotowane próbki były przechowywane w temperaturze 4°C aż do


a następnie wybarwione za pomocą oranżu akrydyny (3,6-dimetylaminoakrydyna

) o stężeniu 1 mg/ml. Przy takim stężeniu oranż akrydyny występuje jako

monomer i posiada maksimum absorpcji przy długości fali 494 nm

na zielono.

z wykorzystaniem ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

i ludzkich fibroblastów

Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i

poprzednim eksperymencie, zamocowane w insertach. Całość został

niskotemperaturową plazmą nadtlenku wodoru (Sterrad, ASP, J&J, USA

wa rodzaje membran, a jako próbę kontrolną zastosowano TCPS. Komórki

podobnie jak w pierwszym eksperymencie in vitro (rozdz. 1.7.1), hodowane były na obydwu

powierzchniach membran (górnej i dolnej). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste

zostały dostarczone przez Klinikę Uniwersytecką

Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z

Dermatologii, Wenerologii i Alergologii, Max-Bürger-Forschungszentrum

przedstawiający hodowle komórkowe został pokazany na Rys. 17

chemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

41

fluorescencyjny mikroskop

komórki utrwalono przy użyciu 4%

w temperaturze 4°C aż do


dimetylaminoakrydyna) (Sigma

akrydyny występuje jako

rpcji przy długości fali 494 nm barwiąc jądra oraz

malnych komórek macierzystych

Przygotowane membrany zostały pocięte na próbki o średnicy 20 mm i podobnie jak

zamocowane w insertach. Całość została poddana sterylizacji

(Sterrad, ASP, J&J, USA). Badaniom

jako próbę kontrolną zastosowano TCPS. Komórki,

hodowane były na obydwu

nchymalne komórki macierzyste

Carl Gustav Carus

Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie zaś ludzkie fibroblasty pochodziły z Kliniki

Forschungszentrum z Uniwersytetu

pokazany na Rys. 17.

w insertach i w dołkach.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

42

Hodowla komórek była prowadzona przez okres 24 h oraz 14 i 21 dni. Komórki znajdowały

się w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7,0% atmosferze CO2; początkowa gęstość

wysianych komórek wynosiła 1·104 komórek/cm2 (8000 komórek/membranę). Przez okresy

czasu 24 h, 14 i 21 dni wszystkie komórki znajdowały się w medium podstawowym

(BM - DMEM, 10% FBS, 1% P/S, 2 mM glutaminy) i dla okresów 14 i 21 dni fibroblasty

hMSC hodowane były również w medium różnicującym w kierunku osteoblastów (DM),

w skład którego obok medium BM wchodził jeszcze kwas askorbinowy 300 mM,

glicerofosforan 10 mM i deksametazon 10nM (Sigma-Aldrich, Niemcy). W czasie trwania

hodowli media były wymieniane co drugi dzień. Na koniec każdego okresu czasowego

medium było odciągane, membrany płukane w ogrzanym PBS, a następnie próbki zamrażane

w temperaturze -80°C aż to czasu wykonania analiz.

1.7.2.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek

W celu oznaczenia liczby komórek wykorzystano badanie poziomu stężenia dehydrogenazy

mleczanowej (LDH). LDH jest enzymem z klasy oksydoreduktaz, który jest uwalniany

z komórek do medium hodowlanego na skutek ich lizy (rozpadu). Podobnie jak test MTT, test

LDH jest testem kolorymetrycznym, w którym zachodzi przemiana soli tetrazolowej do

barwnego formazanu. Badanie polega na spektrofotometrycznym pomiarze ilości LDH

uwolnionego z martwych komórek poprzez pomiar reakcji enzymatycznej konwersji wyżej

wymienionych związków. Zamrożone wcześniej komórki rozmrażano przez 20 min na lodzie,

następnie przeprowadzono lizę komórek w PBS zawierającym 1% Triton X-100, proces trwał

50 min, z tym, że ostatnie 10 min było przeprowadzone w płuczce ultradźwiękowej, w celu

rozbicia agregatów. Kolejno przeniesiono lizaty do 96-dołkowych płytek i dodano roztwór

reakcyjny LDH (LDH Cytotoxicity Detection Kit - Takara, Saint-Germain-en-Laye,

Francja). Po 8 min reakcja była zatrzymana za pomocą 0,5 M HCl. Procedura była zgodna

z instrukcją podaną przez producenta. Absorbancja była mierzona przy długości fali równej

492 nm. Wyznaczono również krzywą kalibracyjną, na podstawie, której przeliczono

otrzymane wyniki na liczbę komórek.

Różnicowanie komórek mezenchemalnych zostało zmierzone poprzez pomiar aktywności

fosfatazy alkalicznej (ALP), enzymu z grupy hydrolaz, którego stężenie wzrasta wraz ze

wzrostem aktywności osteoblastów. Rozmrażanie komórek oraz ich liza przeprowadzone były

tak samo jak w przypadku pomiaru LDH. Lizaty zostały przepipetowane do pojemniczków

Eppendorfa, do których następnie dodano roztwór reakcyjny ALP (1mg/ml p-nitrofenylu,


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

43

0,1M dietanolu-aminy, 0,1% Triton X-100, 1 mM MgCl2·6H2O, pH ~ 9,8), całość była

inkubowana przez 30 min w 37°C. Reakcja została zatrzymana za pomocą 1 M NaOH.

Po inkubacji próbki zostały odwirowane (10 min, 14000 rpm), nadsącz przepipetowany do

płytki 96-dołkowej i zmierzono absorbancję dla długości fali 405 nm. Mineralizacja została

zbadana poprzez pomiar koncentracji jonów wapnia Ca2+, w próbkach przygotowanych w

sposób powyżej opisany. Do badania użyto gotowych zestawów odczynników (Calcium

Liquicolor Kit - Fluitest Ca-CPC, Biocon, Germany). Absorbancja została zmierzona po

5 min inkubacji w temperaturze pokojowej przy długości fali 590 nm.


Po inkubacji próbki zostały utrwalone w 3,7% paraformaldehydzie i umieszczone

w temperaturze 4°C. Morfologia komórek po 1 i 7 dniach była analizowana przy użyciu SEM

(Gemini DSM 982, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) przy powiększeniu 500 razy. Przed

analizą próbki zostały przepłukane w PBS, a następnie poddane procesowi dehydratacji

w szeregu alkoholowym: 30%, 50%, 70%, 80%, 90% i 100% etanolu, oraz suszeniu

w punkcie krytycznym dwutlenku węgla (Critical Point Dryer - BALTEC CPD 030, Witten,

Germany). Ostatnim etapem przygotowań było napylenie na próbki ultracienkiej warstwy

węgla.

1.7.3. Badania w kokulturach komórkowych

Ostatnim etapem badań komórkowych było przeprowadzenie hodowli w warunkach

kokultury komórkowej, z wykorzystaniem obu typów komórek. Fibroblasty i hMSC były

hodowane w jednym dołku hodowlanym, w taki sposób, że jedne komórki były hodowane na

membranie, a drugie na powierzchni płytki hodowlanej (Rys. 18). Do hodowli wykorzystano

tylko jedną powierzchnię membrany (górną), a dla kontroli komórki były hodowane na płytce

hodowlanej TCPS, w separowanych warunkach (osobno fibroblasty i osobno hMSC).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 18 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach

Warunki prowadzenia hodowli były takie same jak podane w pkt. 1.7.2. Komórki były

inkubowane w temperaturze

i DM). Gęstość początkowa komórek była równa

komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 7, 14, 21, i 28 dni.

1.7.3.1. Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek

Liczba komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone

osobno dla komórek znajdujących się na membranach jak i płytce hodowlanej. W podobny

sposób sprawdzono różnicowanie komórek oraz ich mineralizację, wykonując odpowiednio

pomiar aktywności ALP oraz stężenia

1.7.3.2. Morfologia

Obserwacja morfologii komórek była prowadzona po

Axiovert 100M, Carl Zeiss, Germany)

Utrwalone komórki (dokładny opis w pkt. 1.7.2.2.)

2 min, następnie przepłukano w PBS i poddano działan

w PBS. Po tym procesie przystąpiono do barwienia. Jądro komórkowe zostało wybarwione

przy użyciu DAPI (4,6-diamidyno

amina – reagującą z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko

Do wybarwienia struktur komórkowych i


Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach


inkubowane w temperaturze 37°C przy 7,0% stężeniu CO2, w dwóch rodzajach medium (BM

i DM). Gęstość początkowa komórek była równa 1·104


Ocena proliferacji, różnicowania i mineralizacji komórek

komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone



oraz stężenia jonów wapnia Ca+2 (pkt. 1.7.2.1).

Obserwacja morfologii komórek była prowadzona pod mikroskopem fluorescencyjnym

Axiovert 100M, Carl Zeiss, Germany), po uprzednim wybarwieniu struktur komórkowych.

(dokładny opis w pkt. 1.7.2.2.) inkubowano w 0,2% Triton X

rzepłukano w PBS i poddano działaniu 1% surowicy bydlę


diamidyno-2-fenyloindol). DAPI jest to aromatyczna, heterocykliczna

z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko

barwienia struktur komórkowych i białek cytoszkieletu, użyto osteonektyny


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

44

Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach w kokulturze.


, w dwóch rodzajach medium (BM

komórek/cm2 (8000


komórek została wyznaczona poprzez test LDH. Badanie było przeprowadzone



(pkt. 1.7.2.1).

d mikroskopem fluorescencyjnym (Jena

po uprzednim wybarwieniu struktur komórkowych.

w 0,2% Triton X-100 przez

iu 1% surowicy bydlęcej (BSA)


). DAPI jest to aromatyczna, heterocykliczna

z DNA, przy emisji dając zabarwienie niebiesko-fioletowe.

użyto osteonektyny (Sigma

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Aldrich, Niemcy) w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne

Vimentin, PN IM191, Beckman Coulter, Francja) dla fibroblastów.

1.7.3.3. Hodowla komórek po obu stronach membrany

Przeprowadzono również wstępne badania, które w dokła

z jakimi mamy do czynienia w organizmie ludzkim.

ludzkiego komórki będą docierały do obu powierzchni

również próbę osadzenia komórek i ich hodowli w

warunki są najbardziej zbliżone do tych w jakich materiał będzie pracował w organizmie.

Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12

fibroblasty. Poziom medium był tak dobrany aby insert

jednocześnie aby medium

wyschnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę

inkubatorze na okres 4 h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umies

medium w płytce 24-dołk

hMSC. Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono

i scharakteryzowano w punkcie 1.7.2.

komórek/cm2 (8000 komórek/membranę).

tych okresach czasu żywe

wykonane na mikroskopie optycznym

Rys. 19 Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany


w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne

N IM191, Beckman Coulter, Francja) dla fibroblastów.

Hodowla komórek po obu stronach membrany

ż wstępne badania, które w dokładniejszy sposób symulują

z jakimi mamy do czynienia w organizmie ludzkim. Po wszczepieniu materiału do organizmu

docierały do obu powierzchni materiału, dlatego przeprowadzono

również próbę osadzenia komórek i ich hodowli w sposób przedstawiony na Rys.


Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12

fibroblasty. Poziom medium był tak dobrany aby insert był stabilny i nie pływał,

e aby medium nie przesączyło się przez membranę, co spowodowało

schnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę

h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umies

dołkowej. Następnie na drugą stronę membrany wysiano komórki

Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono

w punkcie 1.7.2. Początkowa gęstość komórek wynosiła 1·10

000 komórek/membranę). Hodowla była prowadzona przez 24

żywe komórki zostały wybarwione za pomocą MTT

wykonane na mikroskopie optycznym Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy)

Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

45

w przypadku hMSC oraz wimentyny (przeciwciało monoklonalne IOPath®+

sposób symulują warunki

Po wszczepieniu materiału do organizmu

materiału, dlatego przeprowadzono

rzedstawiony na Rys. 19. Takie


Na obróconym insercie z membraną, umieszczonym w płytce 12-dołkowej, osadzono

stabilny i nie pływał, ale

przez membranę, co spowodowałoby

schnięcie komórek i ich uszkodzenie. Tak zapoczątkowaną hodowlę umieszczono w

h. Po tym czasie inserty zostały obrócone i umieszczone w świeżym

stronę membrany wysiano komórki

Warunki hodowli i komórki użyte w eksperymencie przedstawiono

komórek wynosiła 1·104

prowadzona przez 24 h i 14 dni. Po

komórki zostały wybarwione za pomocą MTT, a ich zdjęcia

Zeiss Axiovert 40 (Carl Zeiss, Niemcy).

Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany.

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

46

2. WYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

2.1. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od stężenia PEG

W tej części pracy skupiono się nad otrzymaniem membran charakteryzujących się

różną porowatością. Jako porogenu użyto PEG o masie cząsteczkowej Mn = 400 Da. Na tym

etapie pracy najważniejszym zadaniem było opracowanie metody otrzymywania membran jak

również uzyskanie i wyselekcjonowanie membrany, której właściwości będą najbardziej

odpowiadały wymaganiom stawianym materiałom do sterowanej regeneracji tkanek, tj.

asymetryczność budowy, parametry wytrzymałościowe czy poręczność chirurgiczna. Bardzo

ważnym zagadnieniem analizowanym na tym etapie było również poznanie mechanizmu

powstawania membran. Umożliwiło to dobranie optymalnych warunków prowadzenia

procesu, co w konsekwencji pozwoliło na kontrolowanie budowy mikrostrukturalnej

otrzymanych membran.

Metoda otrzymywania membran została opisana w pkt. 1.3

2.1.1. Morfologia membran

Używając różnych proporcji PLGA/PEG otrzymano membrany o różnej porowatości. Użyto

pięciu różnych stężeń wagowych PEG 400. Na Rys. 20 przedstawiono morfologię

otrzymanych materiałów.

Z Rys. 20 wynika, że możliwe jest otrzymanie membran o homogenicznej strukturze,

w przypadku kiedy koncentracja PEG nie przekracza 60% wagowych (Rys. 20 A – C).

W przypadku kiedy udział objętościowy PEG był większy 70% (Rys. 20 D) i 80% (wyniki

nie zostały zaprezentowane) otrzymane membrany wykazywały brak homogeniczności.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

47

Rys. 20 Morfologia membran otrzymanych z użyciem porogenu PEG 400 o stężeniu

wagowym A. 20% , B. 40%, C. 60% i D. 70%.


Wyniki obserwacji mikrostruktury pokazują, że udział objętościowy porów w membranie,

zależy od stężenia PEG i jest najwyższy dla stężenia 60% (Rys. 21 G – I). Membrany

charakteryzują się mniejszą porowatością na górnej powierzchni niż na dolnej (Rys. 21 A – B,

D – E, G – H). W przypadku membran otrzymywanych z mniejszym udziałem PEG różnice

między górą, a dołem są mniejsze niż dla membran otrzymanych z większym udziałem PEG.

Można również zauważyć, że pory występują w całej objętości membran (Rys. 21 C, F, I, L),

a wielkość porów rośnie od górnej do dolnej powierzchni. Jest to szczególnie widoczne

w przypadku membran z wyższym stężeniu PEG tj. 60% i 80% (Rys. 21 I, L). Na

powierzchni membrany otrzymanej z 80% udziałem PEG widać sferyczne cząstki

wytrąconego PLGA (Rys. 21 J, K).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 21 Mikrofotografia SEM membran otrz

400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); p

G, J), powierzchnia dolna (B, E, H, K) i przełamy

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Mikrofotografia SEM membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym

400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); powierzchnia

ia dolna (B, E, H, K) i przełamy (C, F, L, L).

I CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNAWYNIKI I DYSKUSJA WYNIKÓW

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

48

ymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG

owierzchnia górna (A, D,

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.1.3. Właściwości mechaniczne

Przykładowe krzywe zależności wytrzymałość

przedstawione na Rys. 22

w procesie otrzymywania membran, maleje wytrzymałość na rozciąganie, ale rośnie

odkształcenie membran.

Uśrednione wyniki badań właśc

zależność, że wytrzymałość na rozciąganie (R

moduł Younga (E) (Rys. 23

(Fmax) (Rys. 23 C; Tabela 2

który został użyty w procesie

wydłużenia w momencie zerwania (

jego wzrost wraz ze wzrostem stężenia PEG

Rys. 22 Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla

reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzyman

wagowym PEG.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Właściwości mechaniczne

Przykładowe krzywe zależności wytrzymałość-odkształcenie folii i membran PLGA

przedstawione na Rys. 22. Pokazują one, że wraz ze wzrostem stężenia


yniki badań właściwości mechanicznych potwierdzają

wytrzymałość na rozciąganie (Rm) (Rys. 23 A; Tabela 2,

(E) (Rys. 23 B; Tabela 2, kolumna 2) i wydłużenie przy maksymalnej sile

abela 2, kolumna 3) membran spadają wraz ze wzrostem stężenia

procesie ich otrzymywania. Natomiast w przypadku całkowitego

wydłużenia w momencie zerwania (Ftotal) (Rys. 23 D; Tabela 2, kolumna 4) obserwujemy

wraz ze wzrostem stężenia PEG.

Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla

reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzymanych przy różnym stężeniu


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

49

odkształcenie folii i membran PLGA zostały

że wraz ze wzrostem stężenia PEG użytego


iwości mechanicznych potwierdzają powyżej opisaną

kolumna 1), ale także

wydłużenie przy maksymalnej sile

ją wraz ze wzrostem stężenia PEG,

przypadku całkowitego

, kolumna 4) obserwujemy

Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla

ych przy różnym stężeniu

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 23 Właściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym

wagowym PEG: A. wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy

maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania.

Tabela 2 Właściwości mechaniczne foliotrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)

PLGA

mPLGA_20% PEG 400

mPLGA_40% PEG 400

mPLGA_60% PEG 400

Wytrzymałość (Rm), moduł Younga (E), maksymalne wydłużenie (

( Ftotal). Wyniki przedstawione

statystyczną, w stosunku do kontroli


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

łaściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym

wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy

maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania.

Właściwości mechaniczne folii PLGA oraz membran PLGA (mPLGAotrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)

Rm [MPa] E [GPa] Fmax [%]

52,1 ± 0,5 1,96 ± 0,14 3,49 ± 0,

mPLGA_20% PEG 400 30,2 ± 2,4*** 1,48 ± 0,15* 3,54 ± 0,

mPLGA_40% PEG 400 19,9 ± 1,9*** 1,10 ± 0,07*** 2,32 ± 0,

mPLGA_60% PEG 400 12,6 ± 0,9*** 0,53 ± 0,03*** 1,97 ± 0,

), moduł Younga (E), maksymalne wydłużenie ( Fmax ), wydłużenie przy zerwaniu

). Wyniki przedstawione jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki o

, w stosunku do kontroli – czystej folii PLGA: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

50

łaściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym stężeniu

wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy

PLGA oraz membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400)

[%] Ftotal [%]

± 0,20 4,2 ± 0,3

± 0,21 9,1 ± 1,2**

± 0,15** 21,1 ± 6,1*

± 0,10*** 56,4 ± 5,0***

), wydłużenie przy zerwaniu

jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność

czystej folii PLGA: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

51

2.1.4. Dyskusja wyników

Otrzymane wyniki, zgodnie z oczekiwaniami pokazują, że wzrost ilości porogenu

PEG w blendzie PLGA/PEG zwiększa porowatość otrzymanych membran, jednakowoż jeśli

użyte stężenie przekracza 70% wagowych, otrzymane membrany są niehomogeniczne na

poziomie makroskopowym. Może to być spowodowane faktem, że faza PEG staje się fazą

ciągłą, a wydzielenia PEG przybierają duże rozmiary (Rys. 20 i Rys. 21 K).

Badania mechaniczne pokazują, że wytrzymałość, moduł Younga oraz odkształcenie

w dużej mierze zależą od stężenia PEG, użytego do otrzymania membran. Ze wzrostem

stężenia PEG obserwuje się wzrost całkowitego odkształcenia (Ftotal) (Rys. 22 i Rys. 23 D;

Tabela 2, kolumna 4), jednocześnie spada wytrzymałość (Rys. 22, Rys. 23 A; Tabela 2

kolumna 1) i moduł Younga (Rys. 23 E; Tabela 2, kolumna 2). Właściwości mechaniczne,

membran otrzymanych z 60% udziałem wagowym PEG, wydają się być najlepsze, biorąc pod

uwagę przyszłe zastosowanie materiałów w medycynie i regeneracji tkanek GTR. Membrany

te posiadają akceptowalną wytrzymałość, a jednocześnie są najmniej kruche i najbardziej

elastyczne ze wszystkich otrzymanych membran. Uzyskane wyniki badań właściwości

mechanicznych są podobne do odnotowanych w literaturze wyników dla membran GTR

stosowanych w medycynie [31, 59, 76, 77, 78, Tabela 1].

Obrazy mikrostruktury membran zostały pokazane na Rys. 21. Na przełamach widać,

że w przypadku 20% i 40% udziału PEG pory są homogenicznie rozłożone w całej objętości

materiału; dla większych stężeń PEG (60% – 80%) wielkość porów wykazuje większą

polidyspersję. Ta zależność może zostać wytłumaczona w następujący sposób: kiedy stężenia

PEG jest niskie, w wyniku spontanicznej separacji faz tworzy on małe, pojedyncze krople,

w ciągłej matrycy PLGA. Spontaniczna separacja faz jest wynikiem tego, że PLGA lepiej

rozpuszcza się w dichlorometanie niż PEG. Dichlorometan jest dobrym rozpuszczalnikiem

zarówno dla PLGA jaki i dla PEG, ale porównując współczynniki rozpuszczalności

Hildebranda dla PLGA ( = 21,7 MPa0,5) [77], CH2Cl2 ( = 20,2 MPa0,5) [77] i PEG 400

( = 23,1 MPa0,5) [77], można zauważyć, że wartości dla PLGA i CH2Cl2 są do siebie bardziej

zbliżone niż w przypadku PEG 400 i CH2Cl2. Kolejną przyczyną występowania spontanicznej

separacji faz w układzie PLGA/PEG może być różnica swobodnych energii

powierzchniowych obydwu polimerów, gdyż wiadome jest, że PEG jest związkiem dużo

bardziej polarnym niż PLGA. W momencie dodania PEG do roztworu PLGA w niepolarnym

rozpuszczalniku, jakim jest CH2Cl2, faza PEG spontanicznie oddziela się, tworząc kuliste


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

52

domeny w matrycy PLGA, gdyż pozwala to na zmniejszenia swobodnej energii

powierzchniowej układu PLGA/PEG. Podobne wyjaśnienia tego zjawiska opisano w procesie

separacji faz w układzie poli--kaprolakton/PEG [59].

Dla dużych stężeń PEG, powyżej 70%, faza PEG staje się fazą ciągłą, a PLGA tworzy

pojedyncze, izolowane wtrącenia, w wyniku czego, po procesie wypłukiwania PEG

otrzymane membrany stają się heterogeniczne. Pojedyncze, kuliste wtrącenia PLGA są

szczególnie widoczne na górnej powierzchni membrany (Rys. 21 K), co potwierdza powyższą

hipotezę.

Zdjęcia mikrostruktury pokazują również, że we wszystkich przypadkach membran

otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG 400, rozmiar porów rośnie od górnej do

dolnej powierzchni membrany. Powstałą zależność można wytłumaczyć niejednorodnym

odparowywaniem rozpuszczalnika z roztworu PLGA/PEG, jak również łączeniem się

obszarów bogatych w PEG i ich sedymentacji w procesie suszenia. Przeprowadzone badania

szybkości odparowywania rozpuszczalnika pokazały, że rozpuszczalnik (CH2Cl2) odparowuje

bardzo szybko z roztworu PLGA; po 120 min zanotowano najniższą masę próbki, która nie

ulegała już zmianom, niezależnie od długości czasu suszenia. W przypadku układu PEG

400/PLGA rozpuszczalnik odparowywał znacznie wolniej (Tabela 4, kolumna 4, paragraf

2.3.1). Badania wykazały, że różnice w szybkości odparowywania wpływają na budowę

membran. Na górnej powierzchni membran obserwuje się efekt tworzenia „skórki” z PLGA,

podczas gdy na dolnej powierzchni dochodzi do gromadzenia się wytrąceń PEG. Kiedy

stężenie PEG przekracza 60%, wytrącenia PEG wykazują tendencję do łączenia się,

w wyniku czego zmniejsza się ich liczba, ale rośnie rozmiar. Zaobserwowana zależność jest

zgodna z teorią Kamide’a, która mówi o wzroście cząstek w czasie tworzenia się membrany

[79]. Oprócz tego domeny bogate w PEG sedymentują, w wyniku czego dochodzi do ich

gromadzenia w pobliżu powierzchni szklanej szalki Petriego.

Na podstawie otrzymanych wyników został zaproponowany mechanizm obrazujący

procesy zachodzące w czasie otrzymywania membran, do których otrzymania użyto różnych

stężeń PEG (Rys. 24) [80]. W przypadku niewielkiego stężenia porogenu liczba domen PEG

jest niewielka, a domeny te są od siebie izolowane. Biorąc pod uwagę, że rozpuszczalnik

odparowuje szybciej z PLGA niż z PEG oraz szybciej z powierzchni blendy, domeny PEG

zostają „uwięzione” we wnętrzu blendy bez możliwości sedymentacji oraz łączenia się ze

sobą. Po procesie wypłukiwania otrzymane membrany mają pory rozłożone homogenicznie

w całej objętości membrany. Obserwacje ponadto wskazują, że wraz ze wzrostem stężenia

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

użytego porogenu rośnie liczba domen PEG, w

łączenia się ich ze sobą. W początkowym okresie suszenia cz

uwięziona przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania

rozpuszczalnika z matrycy. W niższych warstwach odparowywani

utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstają

wewnątrz struktura jest dłużej mobilna i domeny

Zależność ta jest widoczna w pr

40% i jeszcze bardziej zazna

Rys. 24 Schemat otrzymywania membran

Przedstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawar

PEG są homogeniczne w

i asymetryczne. Membrany te posiadają również odpowiednie

Z tego powodu do dalszych badań

właśnie takim stężeniu porogenu


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

użytego porogenu rośnie liczba domen PEG, w wyniku czego rośnie prawdopodobieństwo

ze sobą. W początkowym okresie suszenia część domen PEG

przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania

rozpuszczalnika z matrycy. W niższych warstwach odparowywanie

utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstają

struktura jest dłużej mobilna i domeny PEG mają możliwość sedymentacji.

Zależność ta jest widoczna w przypadku membran otrzymywanych przy

jeszcze bardziej zaznacza się dla wyższych stężeń PEG, tj. 60% i 80% (Rys. 24

Schemat otrzymywania membran PLGA o różnej morfologii w zależności od

stężenia PEG.

dstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawar

w skali makroskopowej, a jednocześnie najbardziej porowate

i asymetryczne. Membrany te posiadają również odpowiednie właściwości mechaniczne.

do dalszych badań postanowiono wykorzystać membrany otrzymane przy

porogenu PEG.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

53

czego rośnie prawdopodobieństwo

ęść domen PEG zostaje

przy górnej powierzchni blendy, co wynika z faktu szybkiego odparowania

e rozpuszczalnika jest

utrudnione, ze względu na skórkę tworzącą się na powierzchni, dzięki czemu powstająca

PEG mają możliwość sedymentacji.

zypadku membran otrzymywanych przy stężeniu porogenu

tj. 60% i 80% (Rys. 24).

PLGA o różnej morfologii w zależności od

dstawione wyniki badań pokazują, że membrany otrzymane z 60% zawartością

, a jednocześnie najbardziej porowate

właściwości mechaniczne.

postanowiono wykorzystać membrany otrzymane przy


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

54

2.2. Mechanizm separacji faz i tworzenia membran PLGA w zależności od masy

cząsteczkowej PEG

Kolejnym etapem pracy było sprawdzenie czy masa cząsteczkowa porogenu ma

wpływ na mikrostrukturę otrzymywanych membran. Badania zostały wykonane dla PEG

o pięciu różnych masach cząsteczkowych: 300 Da, 400 Da, 600 Da, 1000 Da i 3400 Da.

Charakterystyka porogenów znajduje się w punkcie 1.2.


Oceny mikrostruktury dokonano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego

(SEM) i mikroskopu sił atomowych (AFM).

Mikrofotografie SEM pokazują, że otrzymane membrany posiadają asymetryczną budową,

a ich morfologia jak również wielkość porów są zależne od masy cząsteczkowej PEG

(Rys. 25). Na zdjęciach można zaobserwować, że porowatość na górnej stronie membrany

maleje wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG (Rys. 25 A, D, G, J, M). W przypadku

membrany PEG 600, PEG 1000 i PEG 3400 na górnej powierzchni występuje nieporowata

skórka (Rys. 25 G, J, M). Wielkości porów na dolnej powierzchni (Rys. 25 B, E, H, K, N) są

większe niż w przypadku górnej powierzchni. Oprócz tego porowatość na dolnej powierzchni

rośnie wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej porogenu. Kształt porów jest kulisty dla PEG

300 i zmienia się na nieregularny wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG. Przełamy

pokazują, że we wszystkich przypadkach pory znajdują się w całej objętości membrany,

można również zauważyć, że pory są połączone miedzy sobą. Widoczne jest również, że

rozmiar porów na przekroju membrany rośnie w kierunku od górnej do dolnej powierzchni

(Rys. 25 C, F, I, L, O). Membrana otrzymana z PEG 3400 posiada inną mikrostrukturę, jest

niehomogeniczna, pory są niewielkie i nieregularne. Na dolnej powierzchni membrany można

również zauważyć kuliste wytrącenia PLGA.

Obrazy membran uzyskane z AFM (Rys. 26) pokazują podobną mikrostrukturę do tej

zaobserwowanej za pomocą SEM (Rys. 25). Oprócz tego analiza obrazów za pomocą

oprogramowania, umożliwiła wyznaczenie średniej chropowatości powierzchni (Ra) oraz

średnicy porów. Pomiary zostały wykonane zarówno dla górnej jak i dolnej powierzchni,

a wyniki umieszczone w Tabeli 3. Uzyskane wyniki pokazują, że średnica porów

(Tabela 3, kolumna 1) dla membran otrzymanych z PEG 300 i PEG 400 wynosi ~ 3 m,

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

jednocześnie średnica porów na dolnej powierzchni rośnie od ~ 3

wzrostem masy cząsteczkowej PEG z 300

(Tabela 3, kolumna 2) obserwujemy spadek

powierzchni dla zakresu mas

zaobserwować, że chropowatość na dolnej stronie jest zawsze wyższa niż na stronie górnej

w obrębie jednej membrany. Membran

stronach oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do

pozostałych membran.

Rys. 25 Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej

masie cząsteczkowej: PEG 300 (A,

(J, K, L), PEG 3400 (M, N,

(B, E, H, K, N) i przełamy (C,


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

jednocześnie średnica porów na dolnej powierzchni rośnie od ~ 3 m do ~ 20

wzrostem masy cząsteczkowej PEG z 300 Da do 1000 Da. W przypadku

, kolumna 2) obserwujemy spadek Ra z wartości ~ 500 do ~ 180 nm dla górnej

zchni dla zakresu mas cząsteczkowych PEG od 300 Da do 1000 Da. Można również


w obrębie jednej membrany. Membrana otrzymana z PEG 3400 była nie

oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do

Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej

masie cząsteczkowej: PEG 300 (A, B, C), PEG 400 (D, E, F), PEG 600 (G,

N, O); górna powierzchnia (A, D, G, J, M), dolna powierzchnia

N) i przełamy (C, F, I, L, O).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

55

m do ~ 20 m wraz ze

do 1000 Da. W przypadku chropowatości

~ 500 do ~ 180 nm dla górnej

1000 Da. Można również


a otrzymana z PEG 3400 była nieporowata po obu

oraz wykazywała znaczące różnice w budowie mikrostrukturalnej, w porównaniu do

Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej

F), PEG 600 (G, H, I), PEG 1000

M), dolna powierzchnia

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 26 Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300

(A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna

powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300


powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

56

Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

57

2.2.2. Grubość membran i procent wypłukania PEG

Wyniki pomiarów grubości oraz procentowej ilości wypłukanego PEG zaprezentowano

w Tabeli 3, kolumna 3 i 4. Grubość wszystkich membran, zgodnie z założeniem wynosiła

~ 50 m. Ilość wypłukanego PEG wynosiła ~ 59%, za wyjątkiem membran z PEG 3400

i PEG 400. Uzyskane wyniki pokazują, że zarówno grubość jak i procent wypłukiwania

porogenu jest podobny dla wszystkich membran.

Tabela 3 Grubość, procent wypłukania PEG, rozmiar porów i chropowatość membran PLGA

(mPLGA) otrzymanych z 60% udziałem porogenu o różnych masach cząsteczkowych

(średnia ± błąd standardowy)

Membrana średnica porów [µm] Ra [nm] grubość

[µm] wypłukanie PEG [%wt] góra dół góra dół

mPLGA_60% PEG 300 3,5 ± 0,3 3,7 ± 0,4 505 ±

18 733 ±

86 50 ± 1 59, 2 ± 0,2

mPLGA_60% PEG 400 2,6 ± 0,2 12,5 ± 1,9 391 ± 5

457 ± 29

52 ± 2 58,9 ± 0,4

mPLGA_60% PEG 600 nd 15,3 ± 2,8 236 ±

7 575 ± 4 51 ± 1 59,6 ± 0,5

mPLGA_60% PEG 1000 nd 21,1 ± 3,5 184 ± 4

1186 ± 38

50 ± 2 59,0 ± 0,2

mPLGA_60% PEG 3400 nd nd 304 ±

62 877 ± 255

49 ± 2 57,0 ± 0,2

nd – wartość niemierzalna

2.2.3. Wpływ odparowania rozpuszczalnika na mikrostrukturę membran

Badania szybkości odparowania rozpuszczalnika pokazały, że rozpuszczalnik odparowuje

najszybciej z PEG o najwyższej masie cząsteczkowej, tj. 3400 Da, a najwolniej z PEG 300

(Rys. 27 A). Na zdjęciach przedstawiających morfologię PEG na szalce po odparowaniu

rozpuszczalnika (Rys. 27 B) można zaobserwować, że w przypadku PEG o niższych masach

cząsteczkowych (300 Da ÷ 600 Da) polimer ten jest przeźroczysty jak również posiada

półpłynną konsystencję, w przeciwieństwie do PEG o wyższych masach cząsteczkowych

(1000 Da i 3400 Da), które tworzą błony o typowej krystalicznej budowie.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

W Tabeli 4 zaprezentowano wyniki

PLGA/PEG w trzech okresach czasowych oraz pozostałość rozp

upływie 24 h. W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża

i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim o

min) szybkość odparowania malej

różnice pomiędzy blendami. Najwolniej rozpuszczalnik odparowuje z blendy PLGA/PEG

300, a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wr

masy cząsteczkowej PEG, za wyjątkiem blendy PLGA/PEG 3400. Tendencja ta utrzymuje się

również dla ostatniego przedziału czasowego (100 ÷120 min)

mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 30

wzrostem masy cząsteczkowej PEG.

różnica masy blendy suszonej przez 120 min

300 i malała ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG.

Rys. 27 Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych

A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300

PEG 3400 ►, B. obraz makroskopowy


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

zaprezentowano wyniki szybkości odparowania rozpuszczal

PLGA/PEG w trzech okresach czasowych oraz pozostałość rozpuszczalnika w blendzie po

W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża

i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim o

min) szybkość odparowania maleje dla wszystkich blend, z tym że w okresie


a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wr


również dla ostatniego przedziału czasowego (100 ÷120 min), szybkość odparowywania jest

mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 30

wzrostem masy cząsteczkowej PEG. Pozostałość masy rozpuszczalnika, policzona jako

blendy suszonej przez 120 min i 24 h, była najwyższa dla blendy PLGA/PEG

ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG.

Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych

A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300 ■, PEG 400 ●, PEG 600

, B. obraz makroskopowy PEG na szalce po odparowaniu rozpuszc


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

58

szybkości odparowania rozpuszczalnika z blend

uszczalnika w blendzie po

W pierwszym okresie czasowym (2 ÷ 10 min) szybkość odparowania jest duża

i porównywalna dla wszystkich blend, niezależnie od masy PEG. W drugim okresie (30 ÷ 50

okresie tym widoczne są


a najszybciej z PLGA/PEG 1000. Szybkość odparowywania rośnie wraz ze wzrostem


, szybkość odparowywania jest

mniejsza niż w drugim okresie oraz jest najmniejsza dla PLGA/PEG 300 i rośnie wraz ze

Pozostałość masy rozpuszczalnika, policzona jako

dla blendy PLGA/PEG

Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych

, PEG 600 ▲, PEG 1000 ▼,

PEG na szalce po odparowaniu rozpuszczalnika.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

59

Tabela 4 Szybkość odparowania rozpuszczalnika i pozostałość rozpuszczalnika w blendach

PLGA/PEG

Blenda �� ∙ ��

pierwszy okres

�� ∙ �� drugi okres

�� ∙ �� trzeci okres pozostałość

rozpuszczalnika

2 ÷ 10 [min] 30 ÷ 50

[min]

100 ÷ 120

[min]

[mg]a

[%]b

bPLGA_60%PEG 300 9,9 · 10-5 4,8 · 10-7 0,17 · 10-7 55 0,75

bPLGA_60%PEG 400 9,7 · 10-5 6,1 · 10-7 0,31 · 10-7 24 0,32

bPLGA_60%PEG 600 9,5 · 10-5 7,2 · 10-7 0,58 · 10-7 22 0,29

bPLGA_60%PEG 1000 9,9 · 10-5 8,4 · 10-7 0,73 · 10-7 21 0,27

bPLGA_60%PEG 3400 9,8 · 10-5 7,1 · 10-7 0,73 · 10-7 21 0,27 a różnica masy blendy PLGA/PEG po suszeniu przez 120 min i 24 h b różnica mas po suszeniu przez 120 min i 24 h odniesiona do masy początkowej roztworu

PLGA/PEG

2.2.4.Badania FTIR-ATR

Na Rys. 28 przedstawiono widma FTIR-ATR PEG 300 i PEG 1000 oraz odpowiednich blend

i membran jak również czystej folii PLGA. Badania w podczerwieni przeprowadzono dla

wszystkich rodzajów PEG wykorzystanych w pracy, jednak poniżej zaprezentowano wyniki

dla dwóch PEG o skrajnych masach cząsteczkowych, tj. PEG 300 i PEG 1000 (za wyjątkiem

PEG 3400 ponieważ membrany otrzymywane z użyciem tego porogenu wykazują inne cechy

niż pozostałe membrany i były niejednorodne).

Na zaprezentowanych widmach można zauważyć, że widma PEG zawierają

charakterystyczne pasma pochodzące od drgań rozciągających grup hydroksylowych (~ 3400

cm-1), drgań rozciągających (~ 2860 cm-1) i deformacyjnych (w zakresie 1450 ÷ 1240 cm-1)

grup –CH2, jak również drgania rozciągające grup C-O i C-O-C (w zakresie 1000 ÷ 1200

cm-1). Ponadto, w zakresie 840 ÷ 940 cm-1, można zauważyć pasma charakterystyczne dla

drgań zginających grup –CH2 [81]. Na widmach czystej folii PLGA i membran widoczne są

charakterystyczne pasma w 1746 cm-1 od drgań rozciągających grup C=O oraz grup –CH3,

gdzie obserwujemy drgania rozciągające (~ 2860 cm-1) i deformujące (w zakresie 1450 ÷

1240 cm-1), widoczne są również drgania rozciągające z grup C-O i C-O-C

(w zakresie 1000 ÷ 1200 cm-1) [82]. Podobnie jak w przypadku czystego PEG

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

w zakresie 840 ÷ 940 cm-1, można zauważyć pasm

pochodzących od węglowodorów z

zdecydowanie mniejsza niż ta obserwowana w przypadku PEG. Widma przedstawiające

blendy PLGA/PEG zawierają te same pasma, które są obserwowane dla czystego PEG oraz

próbek PLGA, co wskazuje na brak

Rys. 28 Widma FTIR-ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,

membran oraz folii PLGA.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

, można zauważyć pasma charakterystyczne dla drgań zginających

węglowodorów z grup –CH3 i –CH2, ale ich intensywność



próbek PLGA, co wskazuje na brak oddziaływania chemicznego pomiędzy PLGA i PEG.

ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

60

charakterystyczne dla drgań zginających

, ale ich intensywność jest



hemicznego pomiędzy PLGA i PEG.

ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend,


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

61


W punktach 2.2.1 – 2.2.4 przedstawiono wyniki badań dotyczących wpływu masy

cząsteczkowej porogenu PEG na mikrostrukturę otrzymanych membran. Badania te miały na

celu określenie oddziaływań pomiędzy PLGA, PEG i rozpuszczalnikiem, co pozwoliło na

zaproponowanie mechanizmu tworzenia się membran.

Przedstawione w Tabeli 3 wyniki pomiaru grubości membran pokazują, że grubość ta

jest zgodna z początkowymi założeniami i we wszystkich wypadkach wynosi około 50 m.

Również stopień wypłukania PEG we wszystkich membranach jest zbliżony do 60%, co

świadczy o całkowitym wypłukaniu porogenu z blend. Na podstawie badania FTIR również

możemy stwierdzić, że porogen uległ całkowitemu wypłukaniu ponieważ nie zaobserwowano

pasm charakterystycznych dla PEG w widmach membran. Można również zauważyć, że

widmo membrany jest podobne do widma czystej folii PLGA, co wskazuje, że nie występują

oddziaływania chemiczne pomiędzy PLGA a PEG.

Zaprezentowane w punkcie 2.2.1 i 2.2.2 wyniki dowodzą, że membrany otrzymane

z PEG o różnej masie cząsteczkowej (300 Da ÷ 1000 Da) posiadają asymetryczną budowę:

powierzchnia dolna membrany, która w czasie suszenia miała kontakt ze szklaną szalką, jest

zawsze bardziej chropowata i posiada więcej porów niż powierzchnia górna membrany, tj. ta,

która w czasie procesu suszenia miała kontakt z powietrzem. Można zauważyć również, że

porowatość i rozmiar porów na dolnej powierzchni rosną wraz ze wzrostem masy

cząsteczkowej PEG. Odwrotną zależność można zaobserwować w przypadku górnej

powierzchni membrany: ze wzrostem masy cząsteczkowej PEG porowatość maleje, zaś

w przypadku PEG o masie cząsteczkowej 600 Da i większej na powierzchni tworzy się

nieporowata skórka (Rys. 25 G, J, M). Membrana, do której otrzymania użyto PEG o masie

cząsteczkowej 3400 Da jest niejednorodna i charakteryzuje się inną budową

mikrostrukturalną niż pozostałe membrany; jest poza tym niejednorodna

w skali makroskopowej, co wyklucza jej potencjalne zastosowanie w medycynie.

Różnice w budowie mikrostrukturalnej poszczególnych membran mogą być

wyjaśnione w następujący sposób: jeśli do otrzymania membrany użyto porogenu o niskiej

masie cząsteczkowej, tj. PEG 300, występuje dużo kulistych wydzieleń PEG w matrycy

PLGA, ale ich rozmiar jest niewielki. Są one również równomiernie rozłożone w całej

objętości bledy. Badania szybkości odparowania rozpuszczalnika pokazują, że rozpuszczalnik

w pierwszej kolejności odparowuje z fazy PLGA, w wyniku czego domeny PEG zostają


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

62

unieruchomione. Wyniki potwierdzające tę zależność zostały przedstawione na Rys. 27 oraz

w Tabeli 4, wiersz 1. Można zauważyć że najniższa szybkość odparowania rozpuszczalnika

jest obserwowana dla PEG 300 jak również w przypadku blendy PLGA/PEG 300, przy

jednoczesnej najwyższej pozostałości rozpuszczalnika po 24 h. Membrany otrzymane z tym

porogenem mają stosunkowo małe pory rozłożone homogenicznie na obu powierzchniach

(górnej i dolnej) jak również w całej objętości membrany.

W przypadku kiedy masa cząsteczkowa PEG wynosi 400 Da, 600 Da i 1000 Da, a stężenie

porogenu jest takie same tj. 60%, rozmiar domen PEG w blendach rośnie przy jednoczesnym

spadku ich liczby. Takie zjawisko może być wytłumaczone tym, że rozpuszczalność

polimerów maleje wraz ze wzrostem ich masy cząsteczkowej, ale wielość skłębionych

łańcuchów polimerowych rośnie [83]. W porównaniu do PEG 300, w tych próbkach

obserwujemy wyższą szybkość odparowania rozpuszczalnika oraz mniejszą pozostałość

rozpuszczalnika w blendach po upływnie 24 h (Tabela 4, wiersze 2 – 4). Tak samo jak przy

blendzie PLGA/PEG 300, rozpuszczalnik w pierwszej kolejności odparowuje z fazy PLGA,

ale ponieważ liczba domen PEG była niższa; na górnej powierzchni blendy dochodzi do

utworzenia nieporowatej skórki. Większy rozmiar domen PEG skutkuje łączeniem się domen

w agregaty oraz ich sedymentacją i akumulacją przy dolnej powierzchni blendy. Największy

rozmiar osiągają domeny PEG 1000, co może wynikać z faktu, że PEG 1000, w temperaturze

pokojowej, jest ciałem stałym (Rys. 27 B) i bardziej krystalicznym [84] niż pozostałe użyte

PEG o niższej masie cząsteczkowej. Schemat powstawania membran otrzymanych z 60%

stężeniem PEG o różnych masach cząsteczkowych został przedstawiony na Rys. 29 [80].

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 29 Schemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych

masach cząsteczkowych.

Membrany otrzymane z użyciem PEG 3400

powierzchni, natomiast na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.

Zaobserwowano ponadto, że

się dużych zakumulowanych domen

otrzymywania. Takie zachowanie może być wytłumaczone

krystaliczności PEG 3400,

Membrany te posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych

badaniach nie były brane pod

medycznych.

Podsumowując uzyskane rezultaty można stwierdzić, że

otrzymywania membran za pomocą separacji faz daje powtarzalne wyniki, a otrzymane

materiały spełniają założenia stawiane materiałom do GTR.

porowatą asymetryczną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki

zastosowaniu porogenu o różnych masach cząsteczkowych możliwa jest kontrola wielkości

porów i chropowatości uzyskanych membran.

Na podstawie otrzyma

i badania biologiczne, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem

porogenu PEG 400 i PEG 1000.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

chemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych

Membrany otrzymane z użyciem PEG 3400 posiadają nieporowatą skórkę na górnej

na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.

Zaobserwowano ponadto, że dolna powierzchnia uległa rozwarstwieniu na skutek tworzenia

ię dużych zakumulowanych domen PEG, które uległy wypłukaniu w czasie procesu

otrzymywania. Takie zachowanie może być wytłumaczone

w porównaniu do pozostałych PEG wykorzystanych w tej pracy.

posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych

badaniach nie były brane pod uwagę, ze względu na ich nieprzydatność do zastosowań

uzyskane rezultaty można stwierdzić, że zaproponowany sposób


materiały spełniają założenia stawiane materiałom do GTR. Uzyskane membrany mają

ną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki


porów i chropowatości uzyskanych membran.

Na podstawie otrzymanych wyników do dalszych badań – obejmujących deg

, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem

porogenu PEG 400 i PEG 1000. Głównym kryterium wyboru była mikros


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

63

chemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych

posiadają nieporowatą skórkę na górnej

na dolnej powierzchni można zauważyć małe nieregularne pory.

dolna powierzchnia uległa rozwarstwieniu na skutek tworzenia

PEG, które uległy wypłukaniu w czasie procesu

wyższym stopniem

w porównaniu do pozostałych PEG wykorzystanych w tej pracy.

posiadają inne właściwości niż pozostałe otrzymane materiały i w dalszych

uwagę, ze względu na ich nieprzydatność do zastosowań

zaproponowany sposób


Uzyskane membrany mają

ną budowę i akceptowalne właściwości mechaniczne. Dzięki


obejmujących degradację

, zostały wytypowane dwie membrany otrzymane z 60% udziałem

Głównym kryterium wyboru była mikrostruktura


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

64

otrzymanych materiałów: obie membrany posiadają porowatą, asymetryczną budowę i zostały

wybrane jako materiały najbardziej różniące się chropowatością. Membrana PLGA/PEG 400

jest porowata zarówno na górnej jak i na dolnej stronie, natomiast membrana PLGA/PEG

1000 posiada nieporowatą skórkę na górnej powierzchni i bardziej porowatą dolną

powierzchnię. Dzięki tym różnicom możliwe będzie sprawdzenie wpływu porowatości

materiałów na ich zachowanie w warunkach symulowanego środowiska biologicznego oraz

oddziaływań komórka/materiał w warunkach in vitro.

2.3. Badania degradacji membran

Badania degradacji były prowadzone w buforowanym płynie fizjologicznym PBS

(szczegółowy opis eksperymentu w pkt. 1.6) przez okres 24 tygodni. W kolejnych okresach

czasu ocenie były poddawane masa membran oraz pH płynu inkubacyjnego. Ocenie poddano

również parametry mechaniczne badanych membran oraz ich mikrostrukturę, topografię

i zwilżalność powierzchni.

2.3.1. Ocena makroskopowa

Ocena makroskopowa pokazała, że po upływie 9 i 6 tygodni dla membran, próbki stają się

bardzo kruche i ulegają rozpadowi (Rys. 30). Na zaprezentowanym zdjęciu zarejestrowanym

za pomocą aparatu cyfrowego (Rys. 30) można również zauważyć, że folia PLGA w miarę

upływu czasu zmienia kolor z przeźroczystego (próbka wyjściowa) na mlecznobiały (1 – 9

tydzień), aż do całkowicie białego (od 12 tygodnia). We wszystkich przypadkach po upływie

20 tygodni materiał przypominał wiórki i nie dało się uzyskać kawałka większego niż kilka

milimetrów.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

65

Rys. 30 Makroskopowy obraz foli PLGA (A), membrany PEG 400 (B) oraz membrany

PEG 1000 (C) przed i po inkubacji w PBS przez czas od 1 do 24 tygodni.

2.3.2. Zmiany masy

Na rysunku 31 umieszczono wykresy zależności ubytku masy od czasu inkubacji w PBS folii

PLGA oraz dwóch membran: uzyskanych za pomocą PEG 400 i PEG 1000.

Badania te wykazały, że we wszystkich przypadkach nastąpił spadek masy. Początkowe masy

wszystkich próbek były zbliżone do siebie, po okresie pierwszych sześciu tygodni spadek

masy dla wszystkich próbek wynosił około 4%. W następnych okresach różnice w spadku

masy stały się bardziej widoczne. Po 24 tygodniach największy spadek masy odnotowano dla

membrany PEG 400 (~ 67%), a najmniejszy dla czystej folii PLGA (~ 44%). W przypadku

folii PLGA najszybszy spadek masy obserwujemy od 15 tyg. (Rys. 31); dla membran ten

punkt jest przesunięty do 18 tyg. Jednakże, w przypadku membrany PEG 400 można również

zauważyć, że pierwszy duży spadek masy zaobserwowano już po 9 tygodniach.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 31 Zależność zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG

1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg.

2.3.3. Zmiany pH

Oprócz masy próbek, w czasie degradacji

w którym inkubowano folię i membrany PLGA

i po upływie tygodnia spadło do wartości ~ 6,5. Następnie zaczęło rosnąć i po 4 tygodniach

osiągnęło wartość ~ 7,0 dla wszystkich próbek.

(~ 6,7 dla membran i ~ 6,6

tygodnia można zauważyć różnice w wartościach pH dla poszczególnych próbek. Po 24

tygodniach najniższą wartość pH

PEG 400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy

Odpowiednio dla folii PLGA, dla której spadek ma

najwyższe pH (~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podob

jak w przypadku spadku masy

PEG 400.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG

1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg.

, w czasie degradacji zmianie ulegało również pH

inkubowano folię i membrany PLGA (Rys. 32). Początkowe pH wynosiło ~ 6,8


osiągnęło wartość ~ 7,0 dla wszystkich próbek. Po upływie 6 tygodni

,6 dla folii PLGA) i malało nieprzerwanie aż do 24 tygodnia.


wartość pH (~ 5,7) osiągnął PBS, w którym inkubowano membranę

400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy

Odpowiednio dla folii PLGA, dla której spadek masy był najmniejszy,

(~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podob

w przypadku spadku masy jest to wartość pośrednia pomiędzy


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

66

zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG

również pH roztworu PBS,

Początkowe pH wynosiło ~ 6,8


pH ponownie zmalało

dla folii PLGA) i malało nieprzerwanie aż do 24 tygodnia. Od 9


osiągnął PBS, w którym inkubowano membranę

400, czyli tą dla której odnotowano również największy spadek masy (patrz pkt 2.3.2).

sy był najmniejszy, odnotowano

(~ 6,3). Wartość pH dla membrany PEG 1000 wyniosła ~ 5,9, czyli podobnie

pomiędzy PLGA i membraną

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 32 Zależność pH PBS w funkcji cza

2.3.4. Kąt zwilżania

Zmiany wartości kąta zwilżani

wyniki pokazują, że w przyp

membrany wydaje się być

się dla membran (Rys. 33 B, C).

PEG 1000, a najniższym folia PLGA. Z

procesu degradacji, zarówno

niewielkie i nie przekraczają

zwilżania nieznacznie spada dla wszystkich

są niewielkie i nieistotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa

znacząco na zwilżalność badanych materiałów


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ależność pH PBS w funkcji czasu inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg.

Zmiany wartości kąta zwilżania w czasie degradacji przedstawiono na Rys. 33

w przypadku czystej folii PLGA (Rys. 33 A) powierzchna górna

bardziej hydrofobowa niż dolna, odwrotnie sytuacja prze

B, C). Najwyższym kątem zwilżania charakteryzuje się membrana

PEG 1000, a najniższym folia PLGA. Zaobserwowane zmiany kątów zwilżania,

zarówno dla czystej folii PLGA jak i membran PEG 400 i PEG 1000, są

e przekraczają 4% . Można jednak zauważyć, że w czasie inkubacji w PBS, kąt

zwilżania nieznacznie spada dla wszystkich materiałów. Jednak biorąc pod uwagę, że zmiany

istotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa

badanych materiałów.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

67

u inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg.

radacji przedstawiono na Rys. 33. Uzyskane

A) powierzchna górna

bardziej hydrofobowa niż dolna, odwrotnie sytuacja przedstawia

Najwyższym kątem zwilżania charakteryzuje się membrana

aobserwowane zmiany kątów zwilżania, w czasie

dla czystej folii PLGA jak i membran PEG 400 i PEG 1000, są

Można jednak zauważyć, że w czasie inkubacji w PBS, kąt

materiałów. Jednak biorąc pod uwagę, że zmiany

istotne statystycznie można twierdzić, że inkubacja w PBS nie wpływa

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 33 Wartość kąta zwil

i membrany PEG 1000 (C) w funkcji czasu degradacji.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Wartość kąta zwilżania dla czystej folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B

) w funkcji czasu degradacji.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

68

, membrany PEG 400 (B)


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

69

2.3.5. Wytrzymałość

Badania wytrzymałościowe zostały przeprowadzone na próbkach wyjściowych oraz po 1, 2, 4

i 6 tygodniu inkubacji w PBS. Wynikało to z faktu, że po dłuższym okresie degradacji

przebadanie próbek było niewykonalne, ponieważ membrany były tak kruche, że rozpadały

się w czasie próby zamontowania ich w szczękach maszyny wytrzymałościowej.

W przypadku membran PEG 400 już po upływie 4 tygodni nastąpił tak znaczny spadek

wytrzymałości, że w 6 tygodniu przeprowadzenie badań było możliwe.

Uśrednione wyniki badań właściwości mechanicznych folii PLGA i membran przedstawione

na Rys. 34 pokazują, że w czasie degradacji następuje obniżenie wytrzymałości

(Rm, Rys. 34 A) oraz modułu Younga (E, Rys. 34 B). W czasie degradacji zmienia się

również podatność folii i membran PLGA na odkształcenie maleje: zarówno odkształcenie

maksymalne, jak i odkształcenie przy zerwaniu. Na Rys. 35 przedstawiono charakterystyczne

krzywe zależności wytrzymałości od odkształcenia dla wybranych próbek. W przypadku folii

PLGA (Rys. 35 A) widać, że wyjściowy materiał charakteryzuje się większą kruchością, jest

mniej elastyczny niż membrany, a kruchość ta rośnie w miarę wydłużenia czasu inkubacji

w PBS. Wyjściowe próbki membran PEG 400 i PEG 1000 można określić jako

odkształcające się plastyczne. W przypadku wyjściowej membrany PEG 400 (Rys. 35 B)

odkształcenie przy zerwaniu wynosi ~ 50%, a po pierwszym tygodniu inkubacji spada do

około 15%. Po 2 i 4 tygodniu przetrzymywania w PBS próbki zachowują się jak materiały

kruche. Podobnie zachowuje się membrana PEG 1000 (Rys. 35 C): próbka wyjściowa ulega

~ 32% odkształceniu, zaś po pierwszym tygodniu wartość ta maleje do ~ 29%. W tym

przypadku znaczy spadek odkształcalności obserwujemy po 2 i 4 tygodniach degradacji

(~ 5%), a po upływie 6 tygodni próbka wykazuje brak plastyczności.

Duże wartość błędu standardowego (Rys. 34) pokazują, że w czasie degradacji próbki i stają

się niejednorodne.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 34 Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG

przed i po inkubacji w PBS w

Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG

przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni A. wytrzymałość

Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (Fmax) i D. wydłużenie całkowite (


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

70

Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG 400 i 1000

A. wytrzymałość (Rm), B. moduł

) i D. wydłużenie całkowite (FTotal).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 35 Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia

w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni

PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia

w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni dla wybranych próbek folii PLGA (A), membrany

PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

71

Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia przed i po inkubacji

wybranych próbek folii PLGA (A), membrany

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.3.6. Mikrostruktura i topografia powierzchni

2.3.6.1. SEM

Analiza SEM pokazała, że nie

powierzchni folii PLGA w czasie procesu degradacji

dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie

(Rys. 31 D).

Rys. 36 Mikrofotografie SEM czystej folii

(wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni.

W przypadku membrany PEG 400 zauważalne różnice w

już po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją

powierzchniach (górnej i dolnej); pory były

z tym, że na dolnej powier

przełamie widać, że pory występują w całej objętości (R

inkubacji w PBS można dostrzec, że

(Rys. 37 D). Z kolei na dolnej powierzchni widzimy znaczny

w porównaniu do membrany wyjściowej

po 2 tygodniach inkubacji w PBS (R

niejednorodne można zauważyć

tj. 4 i 6, górna powierzchnia

po 2 tygodniach (Rys. 37 D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne

a powierzchnia stała się bardziej chropowata (R

w miarę upływu czasu stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej

porowatości i chropowatości, a pory stały się większe, zaś ich śc

(Rys. 37 H, K, N). Zmiany te były


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

i topografia powierzchni

pokazała, że nie obserwuje się istotnych zmian w budowie mikrostrukturalnej

w czasie procesu degradacji (Rys. 36). Powierzchnia

dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie

Mikrofotografie SEM czystej folii PLGA: A. próbka przed inkubacją w PBS


W przypadku membrany PEG 400 zauważalne różnice w budowie mikrostrukturalnej widać

ż po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją

órnej i dolnej); pory były niewielkie, okrągłe i podobnych rozmiarów,

że na dolnej powierzchni ich liczba była większa (Rys. 37 A, B). Oprócz tego na

y występują w całej objętości (Rys. 37 C). Po dwóch tygodniach

można dostrzec, że na górnej powierzchni pory stały się większe

D). Z kolei na dolnej powierzchni widzimy znaczny wzrost liczby

porównaniu do membrany wyjściowej jak i do górnej powierzchni membrany

inkubacji w PBS (Rys. 37 B i D, E). To, że pory stały się większe i

zauważyć również na przełamie (Rys. 37 F). W kolejnych tygodniach

górna powierzchnia membrany wyglądała podobnie to tej jaką

D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne

stała się bardziej chropowata (Rys. 37 M). Natomiast dolna powierzchnia

stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej

porowatości i chropowatości, a pory stały się większe, zaś ich ścianki uległy ścienieniu

H, K, N). Zmiany te były również zauważalne na przełamach


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

72

zmian w budowie mikrostrukturalnej

). Powierzchnia folii jest gładka,

dopiero po 20 tygodniach na powierzchni można dostrzec niewielkie i nieliczne pory

A. próbka przed inkubacją w PBS


budowie mikrostrukturalnej widać

ż po dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Membrana przed inkubacją była porowata na obu

i podobnych rozmiarów,

A, B). Oprócz tego na

C). Po dwóch tygodniach

na górnej powierzchni pory stały się większe

wzrost liczby porów,

i do górnej powierzchni membrany

ory stały się większe i bardziej

W kolejnych tygodniach

ła podobnie to tej jaką zaobserwowano

D, G, J). Dopiero po 9 tygodniach pory stały się bardziej widoczne,

Natomiast dolna powierzchnia

stawała się coraz bardziej ażurowa, zaobserwowano wzrost jej

ianki uległy ścienieniu

również zauważalne na przełamach (Rys. 37 I, L, O),


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

73

szczególnie po 9 tygodniach widać, że struktura ulega stopniowemu niszczeniu, brzegi

membrany stają się nierówne, zauważyć można obszary zawierające lity polimer bez porów

(Rys. 37 O). Po 9 tygodniach mikrostruktura membrany ulegała kolejnym zmianom. Górna

i dolna powierzchnia stały się ponownie do siebie podobne (Rys. 37 P, R). Na obydwu

powierzchniach występowały kuliste pory o różnych rozmiarach, ale w dalszym ciągu na

dolnej powierzchni liczba porów była większa. Od 12 tygodnia wykonanie zdjęć przełamów

było niemożliwe ze względu na znaczą kruchość próbek. Po 15 tygodniach na powierzchniach

próbek pojawiły się kuliste fragmenty zdegradowanego polimeru (Rys. 37 S, T), a ich liczba

rosła w 18 tygodniu (Rys. 37 U, W). Po 18 tygodniach próbki miały niejednorodną strukturę,

powierzchnia ich była mocno zdegradowana, uwidaczniały się są pory znajdujące się w głębi

membrany. Po 20 i 24 tygodniach przeprowadzenie badań było niemożliwe ze względu na

kruchość próbek.

Membrana PEG 1000 wyjściowo charakteryzowała się inną budową niż membrana PEG 400

(pkt. 2.2.1, Rys. 37 A – C, Rys. 38 A – C). Membrana PEG 1000 posiadała nieporowatą

skórkę na górnej stronie oraz porowatą dolną powierzchnię. Na Rys. 38 przedstawiono

zmiany w mikrostrukturze membrany PEG 1000 w czasie procesu degradacji. Pierwsze

różnice, podobnie jak w przypadku membrany PEG 400, były widoczne już po pierwszych

dwóch tygodniach inkubacji w PBS. Na górnej powierzchni pojawiły się pory (Rys. 38 D),

natomiast na dolnej zwiększyła się ich wielkość, a kształt stał się bardziej niejednorodny

(Rys. 38 E). Obserwacje przełamów wykazały, że brzegi membrany były postrzępione, a pory

bardziej płaskie (Rys. 38 F). W kolejnych tygodniach zmiany te jeszcze bardziej się

uwidoczniły. Pory na górnych powierzchniach stawały się coraz większe i lepiej widoczne

(Rys. 38 G, J), a po 9 tygodniach zaczynały łączyć się ze sobą (Rys. 38 M). Podobnie na

dolnej powierzchni zwiększał się rozmiar porów, powodując powstanie dużych, pustych

obszarów, w wyniku czego uwidaczniały się głębsze warstwy membrany (Rys. 38 H, K, N).

Zwiększały się również rozmiary porów w środku, a nie tylko na powierzchni membrany

(Rys. 38 I, L), aż stopniowo struktura przestrzenna membrany ulegała zniszczeniu

(Rys. 38 O). W kolejnych tygodniach na górnych powierzchniach pojawiły się kuliste

wytrącenia degradującego się polimeru (Rys. 38 S, U), a na dolnych powierzchniach

w dalszym ciągu zwiększała się niejednorodność powierzchni (Rys. 38 R, T, W). Podobnie

jak w przypadku membrany PEG 400 wykonanie preparatów mikroskopowych przełamów po

12 tygodniu inkubacji okazało się niemożliwe ze względu na kruchość próbek.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 37 Mikrofotografie SEM membrany PEG 400

D – F po 2 tygodniach, G

tygodniach, P – R po 12 tygodn

degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,

T, W; przełamy C, F, I, L, O.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Mikrofotografie SEM membrany PEG 400: A – C przed degradacją (wyjściowe),

po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M

po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U –

rna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

74

C przed degradacją (wyjściowe),

L po 6 tygodniach, M – O po 9

W po 18 tygodniach

rna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R,

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 38 Mikrofotografie SEM membrany PEG 10

D – F po 2 tygodniach, G

tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

SEM membrany PEG 1000: A – C przed degradacją (wyjściowe),

po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M

R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U –


przełamy C, F, I, L, O.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

75

C przed degradacją (wyjściowe),

L po 6 tygodniach, M – O po 9

W po 18 tygodniach


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.3.6.2. AFM

Na Rys. 39, 40 i 41 zaprezentowano obrazy

i membran PEG 400 i 1000

obrazach nie były widoczne

(Rys. 39), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej

powierzchni wartość Ra ulega zwiększeniu (T

membran widać, że w czasie degradacji

ta jest również widoczna na

degradacją widoczne były

wzrosła. Widoczne było również, że wielkość

w PBS. Struktura dolnej powierzchni była

SEM (Rys. 37 K i Rys. 40

na górnej powierzchni i porowatą dolną

widoczne na obydwu stronach membrany (R

Analiza topografii powierzchni

zależności do tych obserwowanych za pomocą

Rys. 39 Obrazy topograficzne

(przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

zaprezentowano obrazy przedstawiające powierzchnię

i membran PEG 400 i 1000 przed i po 6 tygodniach inkubacji w PBS. W przypadku foli

nie były widoczne zmiany topografii, powierzchnia była gładka i jednorodna

), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej

ulega zwiększeniu (Tabela. 5, wiersz 1). Również w przypadku

membran widać, że w czasie degradacji wartość Ra rośnie (Tabela. 5 wiersz 2 i 3), zależność

widoczna na obrazach AFM. Na obrazach membrany PEG 400 (R

pory na dolnej i górnej powierzchni, a po degradacji liczba porów

wzrosła. Widoczne było również, że wielkość porów była większa, niż przed inkubacją

truktura dolnej powierzchni była podobna do tej, jaką zaobserwowano za pomocą

ys. 40 D). Membrana PEG 1000 charakteryzuje się nieporowatą skórką

ni i porowatą dolną stroną (Rys. 41 A i B), po 6 tygodniach pory są

idoczne na obydwu stronach membrany (Rys. 41 C i D).

Analiza topografii powierzchni membrany w funkcji czasu degradacji pokazała podobne

bserwowanych za pomocą SEM.

Obrazy topograficzne powierzchni foli PLGA: A. próba wyjściowa

inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

76

powierzchnię folii PLGA

. W przypadku folii na

hnia była gładka i jednorodna

), ale analiza chropowatości pokazała, że zarówno na górnej jak i na dolnej

Również w przypadku

wiersz 2 i 3), zależność

membrany PEG 400 (Rys. 40) przed

a po degradacji liczba porów

większa, niż przed inkubacją

serwowano za pomocą

się nieporowatą skórką

A i B), po 6 tygodniach pory są

degradacji pokazała podobne

A. próba wyjściowa

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 40 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400


Rys. 41 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400:


Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000:



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

77




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

78

Tabela 5 Wartości chropowatości (Ra) folii i membran przed i po inkubacji w PBS

(średnia ± błąd standardowy, n = 3)

Ra [nm] przed degradacja po 6 tygodniach degradacji

góra dół góra dół

PLGA 20 ± 11 17 ± 2 103 ± 5 162 ± 60

PEG 400 307 ± 99 620 ± 108 440 ± 71 934 ± 485

PEG 1000 208 ± 80 989 ± 110 549 ± 75 1227 ± 524


PLGA należy do grupy poliestrów alifatycznych i ulega degradacji hydrolitycznej,

której produktami końcowymi są kwas mlekowy i glikolowy. Produkty te są naturalnie

usuwane z organizmu na drodze metabolicznej [85]. Jednak mechanizm degradacji jest różny

i zależy między innymi od składu chemicznego polimeru, jego masy cząsteczkowej czy

struktury łańcucha; przeprowadzone badania pokazują również, że istotna jest wielkość oraz

kształt wyrobu [22, 49]. Na proces degradacji mają również wpływ czynniki środowiskowe

takie jak pH, temperatura czy obecność jonów [49]. Wykorzystywany w tej pracy polimer

został otrzymany przy użyciu biozgodnego inicjatora (pkt. 1.1), jego łańcuchy mają budowę

segmentową, w której bloki laktydowe i glikolidowe są dłuższe niż w polimerach

otrzymywanych przy użyciu typowych inicjatorów, np. związków cyny [86]. Ta cecha

również może wpływać na przebieg degradacji otrzymanych materiałów, stąd celowe było

przeprowadzenie kompleksowych badań nad procesem degradacji hydrolitycznej

opracowanych materiałów.

Obserwacje makroskopowe folii PLGA oraz membran pokazały, że materiały te

ulegają stosunkowo szybkiej degradacji: już po upływie 4 tygodni membrany PEG 400,

a po upływie 6 tygodni folie PLGA i membrany PEG 1000 stają się niespoiste i kruszą się.

Oprócz tego folia PLGA już po upływie tygodnia z przeźroczystej staje się mleczna, a po 12

tygodniach biała. Zmiana barwy może być spowodowana absorbcją cząsteczek wody przez

materiał lub/i wzrostem krystaliczności materiału w czasie degradacji [87]. Przeprowadzone

badania wytrzymałości potwierdzają poczynione obserwacje makroskopowe. Po upływie 4 i 6

tygodni wytrzymałość materiałów drastycznie spada (Rys. 34 A), zmieniają się również inne

parametry mechaniczne takie jak moduł Younga i odkształcenie, gdyż z materiałów


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

79

odkształcających się plastycznie membrany stają się materiałami kruchymi (Rys. 35).

W czasie procesu degradacji obserwowano także stopniowy spadek masy próbek. Zauważalne

zmiany pojawiły się już po 2 tygodniach inkubacji (Rys. 31), co może świadczyć o tym, że do

środowiska wodnego zaczęły wydzielać się produkty degradacji PLGA (rozpuszczalne

oligomery lub cząsteczki kwasów mlekowego i glikolowego) [71, 88]. Obniżenie pH

roztworu PBS, w czasie inkubacji w nim badanych materiałów (Rys. 32) również może

świadczyć o tym, że do środowiska wydzielają się produkty ich degradacji. Początkowo

zmiany te są niewielkie i w miarę postępu degradacji wartość pH drastycznie spada. Pierwszy

duży spadek pH został odnotowany po 4 tygodniu inkubacji, czyli w momencie kiedy dla

membrany PEG 400 odnotowano również największy spadek wytrzymałości.

Na wykresie zmian zależności pH od czasu degradacji (Rys. 32) możemy również zauważyć,

że najniższe pH odnotowano dla najbardziej zdegradowanego materiału (masa po degradacji

była najniższa), czyli membrany PEG 400. Badania mikrostruktury (Rys. 38, 39) i topografii

(Rys. 39 – 41, Tabela 5) pokazały, że w czasie degradacji zmienia się porowatość membran

oraz chropowatość powierzchni dla wszystkich próbek. Co więcej, na zdjęciach wykonanych

przełamów można zauważyć, że zmienia się również wnętrze degradującego się materiału.

W ciągu 6 tygodni widać, że pory wewnątrz membrany stają się coraz większe, aż w końcu

dochodzi do częściowego (Rys. 37 O) lub całkowitego (Rys. 38 O) zniszczenia struktury

wewnętrznej membran.

Z literatury wiadomo, że polimery z grupy poliestrów alifatycznych degradują się

w masie w sposób heterogeniczny [89, 90], który wynika z faktu, że krótsze łańcuchy

i oligomery, znajdujące się na powierzchni materiału mają możliwość dyfundowania do

płynów (np. tkankowych) otaczających materiał, w których ulegają neutralizacji. Natomiast

łańcuchy i oligomery znajdujące się we wnętrzu materiału nie mają takiej możliwości,

a w wyniku ich kumulacji, we wnętrzu materiału dochodzi do lokalnego obniżenia pH, które

przyspiesza (katalizuje) hydrolizę pozostałych łańcuchów polimerowych [91].

Podsumowując, przedstawione wyniki badań świadczą o tym, że w przypadku

badanych membran również zachodzi degradacja w masie w sposób heterogeniczny. Oprócz

tego czas degradacji membran i folii jest podobny, a średnia wytrzymałość po 6 tygodniach

dla membrany PEG 1000 wynosi ~ 7,30 MPa (Rys. 34 A) co świadczy o tym, że pomimo

znacznej porowatości i małej grubości będą one zapewniać odpowiednie wsparcie w obszarze

nowo odtwarzającej się tkanki kostnej (Tabela 1).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

80

2.4. Charakterystyka biologiczna membran

Badania biologiczne wybranych materiałów zostały podzielone na kilka etapów.

W pierwszym etapie sprawdzono potencjalną cytotoksyczność otrzymanych membran.

Kolejnym etapem było przebadanie wytworzonych membran w kontakcie z komórkami

ludzkimi interesującymi z punktu widzenia sterowanej regeneracji tkanek tj. fibroblastami

i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC). Zarówno w pierwszym jak i drugim

eksperymencie badania były prowadzone tak, aby określić jaką rolę odgrywa mikrostruktura

membran w zachowaniu się komórek w hodowli. Ostatnim etapem było przetestowanie

membran w kokulturach fibroblastów i hMSC.

2.4.1. Badania membran PLGA w kontakcie z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63

W pierwszych badaniach biologicznych przeprowadzono test żywotności komórek MTT,

oceniono również poziom wydzielonego tlenku azotu (NO) w nadsączu (supernatancie) oraz

obserwowano morfologię komórek. Badania były prowadzone na trzech typach membran,

w których jako porogen został użyty PEG o różnych masach cząsteczkowych 300 Da, 400 Da

i 1000 Da. Taki wybór został podyktowany tym, że chciano również sprawdzić, czy różnice

w mikrostrukturze membran mają wpływ na zachowanie się komórek. Jako próbę kontrolną

wykorzystano czystą folię PLGA oraz powierzchnię płytki hodowlanej, wykonaną

z modyfikowanego polistyrenu – TCPS. Sposób przygotowania próbek do badań oraz

warunki hodowli opisano w pkt. 1.7.1.

2.4.1.1. Żywotności komórek

Wyniki pomiaru żywotności, wyznaczone za pomocą testu MTT (Rys. 42) pokazały, że na

górnych powierzchniach membran poziom żywotności komórek był taki sam lub

statystycznie wyższy niż dla próby kontrolnej TCPS. Z drugiej strony w przypadku dolnych

powierzchni, za wyjątkiem membrany PEG 400, komórki wykazywały niższą żywotność niż

na próbie kontrolnej. Dla wszystkich membran zaobserwowano wyższy poziom żywotności

dla górnej powierzchni. Najniższą różnicę między górną, a dolną powierzchnia widać było

w przypadku membrany PEG 300 (~ 6%), następnie dla membrany PEG 400 (~ 9%),

a największą dla membrany PEG 1000 (~ 12%). Wyniki wskazują, że komórki rosły najlepiej

na górnej stronie membrany PEG 400 oraz na folii PLGA.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.4.1.2. Poziom tlenku azotu

Różnice w stężeniu NO w poszczególnych na

statystycznie (Rys. 43). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność

komórek była wyższa, tam obserwowano

wystąpił dla nasączy, gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany

PEG 1000, natomiast najniższe stężenie NO odnotowano

PEG 400.

Rys. 42 Żywotność komórek MG

1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd

standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statys

TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami

membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA:


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

tlenku azotu

stężeniu NO w poszczególnych nadsączach były niewielk

). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność

tam obserwowano niższy poziom NO. Najwyższy

gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany

najniższe stężenie NO odnotowano dla górnej powierzchni membrany

Żywotność komórek MG-63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG


standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną w odniesieniu

p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami

membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA: ●●p <0,01;


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

81

niewielkie i nieistotne

). Jednakże można zauważyć tendencję, że tam gdzie żywotność

Najwyższy poziom NO

gdzie komórki były hodowane na dolnej powierzchni membrany

dla górnej powierzchni membrany

63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG


tyczną w odniesieniu do grupy kontrolnej

p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami

p <0,01; ●●●p < 0,001.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 43 Poziom tlenku azotu

300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS

próbkami wg. t-testu.


Na Rys. 44 zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych

na membranach, folii PLGA i TCPS. Na wszystkich zdjęciach można zauważyć, że komórki

są dobrze rozpłaszczone, wielokątne i posiadaj

na membranach (Rys. 44 A

kontrolnych: folii PLGA (Rys. 44

powierzchniach membran oraz prób kontrolnych jest

powierzchnia membrany

heterogenicznie. Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek

na górnych powierzchniach membran (R

dolnych powierzchniach (R

zaprezentowanymi wynikami testu MTT i pomiaru poziomu NO.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Poziom tlenku azotu w nadsączu hodowli komórek MG-63 na membranach PEG

300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS. Brak istotności statystycznej pomiędzy

komórek

zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych


są dobrze rozpłaszczone, wielokątne i posiadają wrzecionowaty kształt.

A – F) nie różnią się wyglądem od tych hodowanych na pr

folii PLGA (Rys. 44 G) i TCPS (Rys. 44 H). Rozkład komórek na

powierzchniach membran oraz prób kontrolnych jest jednorodny, wyjątkiem jest dolna

PEG 1000 (Rys. 44 F) gdzie komórki układają się bardziej

Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek

ch membran (Rys. 44 A, C, E) jest nieznacznie większa

dolnych powierzchniach (Rys. 44 B, D, F). Wyniki badań są zgodne z wcześniej

zaprezentowanymi wynikami testu MTT i pomiaru poziomu NO.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

82

63 na membranach PEG

. Brak istotności statystycznej pomiędzy

zaprezentowano zdjęcia pokazujące morfologię i rozkład komórek hodowanych


wrzecionowaty kształt. Komórki hodowane

F) nie różnią się wyglądem od tych hodowanych na próbach

H). Rozkład komórek na

, wyjątkiem jest dolna

F) gdzie komórki układają się bardziej

Na przedstawionych zdjęciach można również zauważyć, że liczba komórek

A, C, E) jest nieznacznie większa niż na

B, D, F). Wyniki badań są zgodne z wcześniej

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 44 Morfologia komórek MG

PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia

(B, D, F) oraz na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Morfologia komórek MG-63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B),


az na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

83

63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B),


az na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

84

2.4.1.4. Dyskusja wyników

Przeprowadzone badania pokazały, że komórki adherują oraz dobrze proliferują na

wszystkich badanych materiałach (Rys. 42). Różnice żywotności komórek na poszczególnych

materiałach są stosunkowo niewielkie, choć statystycznie istotne. Najwyższa żywotność

komórek została zanotowana dla górnej strony membrany PEG 400, natomiast najniższa dla

dolnej powierzchni membrany PEG 1000. Biorąc pod uwagę chropowatość badanych

membran (Ra, Tabela 3, pkt. 2.2.2.) można stwierdzić, że komórki rosły najlepiej

powierzchni, której chropowatość wynosiła ~ 400 nm, a najgorzej na najbardziej chropowatej

powierzchni (~ 1200 nm). Można również zaobserwować, że w miarę jak pojawiają się coraz

większe różnice w chropowatości górnej i dolnej powierzchni membrany zwiększają się

również różnice pomiędzy zmierzoną wartością żywotności komórek. Tlenek azotu jest

bardzo aktywnym związkiem chemicznym regulującym wiele procesów fizjologicznych [92],

między innymi reguluje funkcję neuronów, zmniejsza napięcie ścian naczyń krwionośnych

oraz bierze udział w zabijaniu mikroorganizmów, wielokomórkowych pasożytów i komórek

nowotworowych [93]. Wysoki poziom NO w hodowli komórek in vitro może świadczyć

o pewnych jej nieprawidłowościach wywołanych np. cytotoksycznością materiału, z którym

kontaktują się komórki. Przedstawione na Rys. 43 wyniki pomiaru NO zgadzają się

z wynikami testu MTT. Poziom NO jest niski dla wszystkich próbek, a dla membran

porównywalny do próby kontrolnej PLGA i TCPS. Można było dostrzec tendencję, że

najwyższy poziom NO występował dla próbki, gdzie żywotność komórek była najniższa,

czyli dla membrany PEG 1000, chociaż nie był to wynik istotny statystycznie. Obserwacje

mikroskopowe zdają się potwierdzać wyniki uzyskanych pomiarów. Najmniej komórek

zaobserwowano na dolnej powierzchni membrany PEG 1000, co więcej na zdjęciach jest

widoczne, że w tym wypadku komórki wykazują tendencję do łączenia się w agregaty

(Rys. 44 F). Na pozostałych powierzchniach membran komórki wykazują morfologię

podobną do tej obserwowanej na próbie kontrolnej.

Wyniki badań pokazały, że otrzymane membrany są cytozgodne i mogą być brane pod uwagę

jako materiał do zastosowań medycznych. Co więcej badania wskazują, że różnice w budowie

mikrostrukturalnej membran wpływają na morfologię komórek i ich stopień agregacji. Można

wyciągnąć wniosek, że poprzez kontrolowanie mikrostruktury membran (pkt. 2.2.5) możliwe

jest dobranie optymalnych warunków dla hodowli komórek kostnych.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.4.2. Badania membran w kontakcie z

komórkami macierzystymi

Dalsze badania biologiczne

1000. Oba rodzaje komórek miały

hodowane na górnej i na dolnej powierzchni). Szczegóły prowa

w punkcie 1.7.2.

2.4.2.1. Proliferacja komórek

Potencjał proliferacyjny komórek wyznaczono

badań przedstawiono na Rys.

Rys. 45 Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B

stężenia LDH po 14 dniach

oznacza istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Badania membran w kontakcie z ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi

komórkami macierzystymi

Dalsze badania biologiczne były prowadzone na dwóch rodzajach membran PEG 400 i PEG

Oba rodzaje komórek miały kontakt z obiema powierzchniami membran (komórki były

hodowane na górnej i na dolnej powierzchni). Szczegóły prowadzenia hodowli opisano

Proliferacja komórek

Potencjał proliferacyjny komórek wyznaczono za pomocą pomiaru aktywności

badań przedstawiono na Rys. 45.

Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B) wyznaczona na podstawie pomiaru

LDH po 14 dniach hodowli komórek w dwóch rodzajach medium: BM i DM. Kółko

istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

85

ludzkimi fibroblastami i ludzkimi mezenchymalnymi

ch rodzajach membran PEG 400 i PEG

kontakt z obiema powierzchniami membran (komórki były

dzenia hodowli opisano

aktywności LDH, wyniki

na na podstawie pomiaru

odzajach medium: BM i DM. Kółko


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

86

Przedstawione wyniki pokazują, że proliferacja fibroblastów utrzymuje się na jednakowym

poziomie, niezależnie od rodzaju membrany (PEG 400, PEG 1000) jak i powierzchni

(góra, dół), na której komórki były hodowane (Rys. 45 A). Ponadto widać, że liczba komórek

jest porównywalna do liczby komórek na próbie kontrolnej TCPS. W przypadku komórek

hMSC różnice w proliferacji są bardziej widoczne (Rys. 45 B). Proliferacja komórek

w medium różnicującym (DM) jest wyższa niż w medium podstawowym (BM). W przypadku

BM można zaobserwować, że komórki lepiej rosną na górnych powierzchniach membran.

Podobny wynik, ale już istotny statystycznie, został uzyskany w DM dla membrany PEG

1000. Widać, że w tym wypadku komórki zdecydowanie lepiej rosły na górnej, mniej

chropowatej stronie membrany. Proliferacja hMSC na dolnej powierzchni membrany PEG

400 była nieznacznie wyższa niż na górnej powierzchni. W przypadku DM liczba komórek na

próbce kontrolnej TCPS była wyższa niż na membranach.

2.4.2.2. Różnicowanie i mineralizacja komórek

Różnicowanie komórek zostało wyznaczone poprzez pomiar aktywności ALP, natomiast

mineralizację określono na podstawie pomiaru stężenia jonów Ca2+. Wyniki badań zostały

przedstawione na Rys. 46.

Zgodnie z oczekiwaniem hMSC ulegały w większym stopniu różnicowaniu osteogennemu

w DM niż w BM (Rys. 46 A). W BM poziom zróżnicowania był porównywalny dla

wszystkich próbek oraz podobny to tego obserwowanego na próbie kontrolnej TCPS.

Najwyższy stopień zróżnicowania osiągnęły komórki hodowane w DM na górnej powierzchni

membrany PEG 400, ale poziom zróżnicowanie komórek hodowanych na dolnej powierzchni

tej membrany był tylko nieznacznie niższy. W przypadku membrany PEG 1000 różnice

między górną, a dolną powierzchnią były większe i istotne statystycznie. W tym wypadku

również na górnej powierzchni membrany hMSC różnicowały się lepiej niż na dolnej

powierzchni. Najniższy poziom zróżnicowana osiągnęły hMSC hodowane na najbardziej

chropowatej powierzchni membrany – była to dolna powierzchnia membrany PEG 1000.

Na obydwu powierzchniach membrany PEG 400 hMSC były bardziej zróżnicowane niż na

próbie kontrolnej TCPS, zaś dla obydwu powierzchni membrany PEG 1000 wynik był niższy

niż dla próby kontrolnej.

Wyniki analizy stopnia mineralizacji komórek hMSC (Rys. 46 B) pokazują podobne

zależności jak w przypadku stężenia ALP. HMSC wykazują większą mineralizację w DM niż

BM. W przypadku membrany PEG 400 mineralizacja w BM jest wyższa niż w przypadku

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

próby kontrolnej TCPS. Dla membrany PEG 1000 można

Najwyższy poziom mineralizacji wykazują komórki

membrany PEG 400, zaś w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.

Podobną zależność można zaobserwowa

mineralizacja występuje w przypadku

membran obserwujemy istotną

kontrolnej TCPS.

Badania mineralizacji zostały również przeprowadzone dla membran inkubowanych

w medium bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.

Rys. 46 Różnicowanie – aktywność ALP (A

mierzona po 14 dniach hodowli

istotność statystyczną w stosunku do

oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01.

wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

próby kontrolnej TCPS. Dla membrany PEG 1000 można zaobserwować taką samą tendencję

Najwyższy poziom mineralizacji wykazują komórki hodowane w DM,

w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.

zależność można zaobserwować w przypadku membrany PEG 1000;

mineralizacja występuje w przypadku górnej powierzchni membrany. W przypadku ob

membran obserwujemy istotną statystycznie, wyższą mineralizację komórek niż na próbie


bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.

aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca

hodowli w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają

w stosunku do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05;

oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01.

wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

87

zaobserwować taką samą tendencję.

hodowane w DM, na górnej stronie

w przypadku dolnej powierzchni poziom jest nieznacznie niższy.

ny PEG 1000; wyższa

górnej powierzchni membrany. W przypadku obydwu

komórek niż na próbie


bez kontaktu z komórkami. Czyste membrany nie wykazały mineralizacji.

stężenie Ca+2 (B) hMSC

w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają

p <0,05; **p <0,001. Kółka

oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01. Maksymalne

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Obserwacje morfologii obydwu rodzajów komórek prze

SEM. Zdjęcia zostały wykonane po 24 h (R

(Rys. 49 i 50).

Rys. 47 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych prze

membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).

Po 24 h obecność pojedynczych komórek została

komórki posiadały wielokątne kształty,

powierzchni materiałów za pomocą licznych pseudopodiów

w obydwu membranach fibroblasty (Rys. 47

kształt niż hMSC (Rys. 47

fibroblastów (Rys. 49 A, B; R


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

komórek

Obserwacje morfologii obydwu rodzajów komórek przeprowadzono przy uż

ły wykonane po 24 h (Rys. 47 i 48) oraz po

Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych prze


obecność pojedynczych komórek została potwierdzona na wszystkich

wielokątne kształty, były dobrze rozpłaszczone i przylegały

za pomocą licznych pseudopodiów. Widoczne jest

fibroblasty (Rys. 47 A, B; Rys. 48 A, B) maj

kształt niż hMSC (Rys. 47 C, D; Rys. 48 C, D). Po 7 dniach hodowli, w przypadku

A, B; Rys. 50 A, B) i hMSC hodowanych w DM


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

88

prowadzono przy użyciu mikroskopu

) oraz po 7 dniach hodowli

Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na


na wszystkich materiałach:

obrze rozpłaszczone i przylegały do

Widoczne jest również, że

A, B) mają bardziej wydłużony

C, D). Po 7 dniach hodowli, w przypadku

(Rys. 49 E, F; Rys. 50

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

E, F), widać że całą powierzchnię

szczelną monowarstwę. HMSC hodowane w B

monowarsty, widoczne są przestrzenie między komórkami, ale komórki są wielokątne

i dobrze rozpłaszczone. Te obserwacje znajdują potwi

(Rys. 47 B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych

w BM jest niższa niż w przypadku DM.

Rys. 48 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowa



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

powierzchnię membran pokrywają przylegające komórki

szczelną monowarstwę. HMSC hodowane w BM (Rys. 49 C, D; Rys. 50


i dobrze rozpłaszczone. Te obserwacje znajdują potwierdzenie w wynikach

B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych

w BM jest niższa niż w przypadku DM.

Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowa

00; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

89

komórki, które tworzą

ys. 50 C, D) nie tworzą


erdzenie w wynikach badań LDH

B), gdzie widoczne jest, że nawet po 14 dniach hodowli liczba hMSC hodowanych

Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na

00; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D).

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 49 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych

przez 14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia

(B, D, F).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych

14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

90



________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 50 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych

przez 14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia

(B, D, F).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

91




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

92


Przedstawione powyżej badania biologiczne pokazały, że fibroblasty rosną dobrze na

wszystkich powierzchniach membran, niezależnie od ich chropowatości. Co więcej, liczba

komórek na badanych materiałach była porównywalna do liczby komórek na próbie

kontrolnej TCPS (Rys. 34 A). Uzyskane wyniki nie są zgodne z doniesieniami

literaturowymi, z których wynika, że chropowatość powierzchni ma wpływ na zachowanie

fibroblastów [94, 95]. W przypadku hMSC hodowanych w medium podstawowym (BM)

można zauważyć tendencję, że komórki rosną lepiej na mniej chropowatych stronach

membran (Rys. 34 B). Zależność tą widać również w przypadku komórek hodowanych

w medium różnicującym (DM) w przypadku membrany PEG 1000. Z drugiej strony,

w przypadku membrany PEG 400, liczba komórek była nieznacznie niższa dla mniej

chropowatej powierzchni, jednakże w tym przypadku nie zaobserwowano różnic istotnych

statystycznie pomiędzy wynikami. Z literatury wiadome jest, że na zachowanie komórek mają

wpływ nie tylko warunki hodowli, ale również fizyczne i chemiczne parametry powierzchni

[96], takie jak wielkość porów czy chropowatość powierzchni oraz ich skala (nano-, mikro-)

[97, 98]. Na podstawie wyników przedstawionych na Rys. 45 można wnioskować, że

w przypadku badanych membran chropowatość powierzchni nie wpływa istotnie na

proliferację fibroblastów, natomiast hMSC rosną lepiej na powierzchniach, gdzie

chropowatość jest niższa niż ~1000 nm (Tabela, 3 pkt. 2.2.2). Ponadto, również różnicowanie

i mineralizacja komórek zależą, nie tylko od liczby komórek, ale także od chropowatości

powierzchni. Najmniejszą liczbę komórek zaobserwowano na najbardziej chropowatej

powierzchni, tj. dolnej powierzchni membrany PEG 1000 i dla tych membran obserwowano

również najniższy poziom różnicowania i mineralizacji (Rys. 46 A, B). Największą liczbę

komórek zaobserwowano w przypadku górnej powierzchni membrany PEG 1000, ale stopień

różnicowania i mineralizacji był niższy niż w przypadku obydwu powierzchni membrany

PEG 400.

Przedstawione wyniki sugerują, że membrana PEG 400 posiada korzystniejszą

topografię powierzchni dla hMSC niż membrana PEG 1000 ponieważ pomimo niższej

proliferacji komórki wykazują lepsze zróżnicowanie oraz wyższą mineralizację. Co więcej

widać, że w przypadku membrany PEG 400, gdzie różnica w budowie górnej i dolnej

powierzchni była niewielka (Ra góra ~ 390 nm, Ra dół ~ 460 nm) również nie zauważono

znaczących różnic pomiędzy proliferacją, różnicowaniem i mineralizacją hMSC. Zauważalna


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

93

jest jedynie tendencja, że na powierzchni górnej pomimo niższej proliferacji obserwujemy

nieznacznie lepsze różnicowanie i mineralizację [99]. Obserwacje morfologii komórek

(Rys. 47 – 50) nie uwidoczniły żadnych nieprawidłowości – na wszystkich badanych

materiałach komórki są dobrze rozpłaszczone, posiadają wrzecionowate i wielokątne kształty.

Przedstawione wyniki jeszcze raz potwierdziły biozgodność badanych membran, jak również

pokazały, że dzięki modyfikacjom właściwości powierzchni i budowy mikrostrukturalnej

proponowanych materiałów, możliwe jest kształtowanie optymalnych warunków do wzrostu

i różnicowania komórek kostnych.

2.4.3. Badania w kokulturach komórkowych: ludzkie fibroblasty i ludzkie mezenchymalne

komórki macierzyste

Na podstawie wyników badań przedstawionych w pkt. 2.6.2. zdecydowano, że dalsze badania

będą prowadzone na jednej stronie membran. Wybrano górne powierzchnie membran. Taki

wybór został podyktowany faktem, że dla fibroblastów strona membrany nie wpływała na

proliferację, natomiast w przypadku hMSC górna powierzchnia membrany wywierała

korzystniejszy wpływ na namnażanie i różnicowanie się komórek. Szczegóły prowadzenia

hodowli zostały opisane w pkt. 1.7.3.

2.4.3.1. Proliferacja komórek

Badania wykazały, że proliferacja fibroblastów hodowanych w kokulturze z hMSC jest niższa

niż dla próby kontrolnej TCPS (Rys. 51). Wyniki pokazują również, że liczba komórek dla

membrany PEG 1000 (~ 52 tys.) jest mniejsza niż dla membrany PEG 400 (~ 65 tys.).

Po 7 dniach proliferacja komórek na membranie PEG 400 była wyższa, ale po 14 dniach

liczby komórek były podobne dla obydwu membran. Między 14 a 21 dniem odnotowano

najszybszą proliferację komórek (~ 60%). W przypadku membrany PEG 1000 między 21 a 28

dniem proliferacja była niewielka. Biorąc pod uwagę, że w drugim eksperymencie

(pkt. 2.6.2.) proliferacja fibroblastów na membranach była zbliżona do proliferacji na próbie

kontrolnej TCPS (Rys. 45 A), to można zauważyć, że proliferacja fibroblastów w kokulturze

jest inhibitowana przez obecność hMSC.

Na Rys. 52 przedstawiono wyniki badań proliferacji hMSC hodowanych w kokulturze

z fibroblastami w medium różnicującym (DM). Jak widać na wykresie proliferacja hMSC na

membranach jest wyższa niż proliferacja hMSC na próbie kontrolnej TCPS. Liczba komórek

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

po 28 dniach hodowli na obydwu membranac

w przypadku fibroblastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14

(~ 65%). Porównując otrzymane wyniki z wynik

można zauważyć, że proliferacja hMSC w ko

komórki rosły bez kontaktu z fibroblastami (R

Przedstawione wyniki ba

o wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy komórkami.

Rys. 51 Proliferacja fibroblastów hodowanych w ko

podstawie pomiaru stężenia

istotność statystyczną względem


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

na obydwu membranach, jest podobna (~ 44 tys

blastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14

Porównując otrzymane wyniki z wynikami z drugiego eksperymentu (pkt. 2.6.2.)

ażyć, że proliferacja hMSC w kokulturze jest wyższa niż w przypadku kiedy

bez kontaktu z fibroblastami (Rys. 45 B).

Przedstawione wyniki badania proliferacji komórek w kokulturze mogą świad

o wzajemnym oddziaływaniu pomiędzy komórkami.

ja fibroblastów hodowanych w kokulturze z hMSC, wyznaczo

podstawie pomiaru stężenia LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki

względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; ***p <0,001.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

94

h, jest podobna (~ 44 tys.). Podobnie jak

blastów, najszybszą proliferację zaobserwowano między 14 a 21 dniem

ami z drugiego eksperymentu (pkt. 2.6.2.)

kulturze jest wyższa niż w przypadku kiedy

kulturze mogą świadczyć

kulturze z hMSC, wyznaczona na

LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają

p <0,001.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 52 Proliferacja hMSC hodowanych w ko

podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki

istotność statystyczną względem

2.4.3.2. Różnicowanie i mineralizacja

Badania różnicowania komórek (R

inkubacji. Poziom ALP dla próby kontrolnej TCPS był wyższy niż dla badanych membran.

Biorąc pod uwagę liczbę komórek (R

proliferacji (wyższej niż dla próby kontrolnej TCPS)

Również mineralizacja komórek (R

membranach niż na próbie kontrolnej

DM niż BM. Wyższą mineralizację

Ca+2 odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było

również porównywalne do


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

oliferacja hMSC hodowanych w kokulturze z fibroblastami, wyznaczona na

podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki

istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,01.

óżnicowanie i mineralizacja komórek

omórek (Rys. 53 A) pokazały najwyższy poziom ALP po 21 dniach


orąc pod uwagę liczbę komórek (Rys. 52) można zauważyć, że pomimo wysokiej

proliferacji (wyższej niż dla próby kontrolnej TCPS) stopień różnicowani

Również mineralizacja komórek (Rys. 53 B) była niższa dla komórek hodowanych na

membranach niż na próbie kontrolnej. Poziom mineralizacji komórek był wyższy w medium

DM niż BM. Wyższą mineralizację obserwowano po 28 dniach. Najwyższe stężenie jonów

odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było

próby kontrolnej TCPS.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

95

z fibroblastami, wyznaczona na

podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają

p <0,01.

pokazały najwyższy poziom ALP po 21 dniach


można zauważyć, że pomimo wysokiej

różnicowania komórek był niski.

B) była niższa dla komórek hodowanych na

neralizacji komórek był wyższy w medium

obserwowano po 28 dniach. Najwyższe stężenie jonów

odnotowano dla membrany PEG 1000 w medium DM po 28 dniach, stężenie to było

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 53 Różnicowanie – aktywność ALP (A

hodowanych w kokulturze z fibroblastami, mierzone

rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki

kontrolnej TCPS: *p <0,05;

mediami BM i DM: ■■■p < 0,0

przyjęto jako 100%.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca

lturze z fibroblastami, mierzone po 21 i 28 dniach inkubacji w dwóch

rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną

p <0,05; **p <0,001. Kwadraty oznaczają istotność statystyczną pomiędzy

p < 0,001. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS)


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

96

stężenie Ca+2 (B) hMSC

dniach inkubacji w dwóch

czną względem grupy

totność statystyczną pomiędzy

Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


Na obrazach z mikroskopu fluorescencyjnego

hodowane w kokulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.

Widoczne są jądra wybarwione na

zielono) takie jak osteonektyna dla hMSC

liczby jąder można oszacować, że liczba hMSC w ko

kontrolnej (Rys. 54 A, B). Odwrotne zjawisko występuje

liczba komórek w kokulturze jest niższa

Obserwacje te zgadzają się z

Rys. 54 Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibr

w kokulturze (A, C) oraz w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400

dniach hodowli. Barwienie fluorescencyjne: DAPI,

(fibroblasty).


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

komórek

mikroskopu fluorescencyjnego (Rys. 54) widać, ż

kulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.

wybarwione na kolor niebieski oraz specyficzne białka (wybarwione na

steonektyna dla hMSC oraz wimentyna dla fibroblastów.

oszacować, że liczba hMSC w kokulturze jest wy

A, B). Odwrotne zjawisko występuje w przypadku fibroblastów,

kulturze jest niższa niż dla próby kontrolnej TCPS (R

Obserwacje te zgadzają się z wynikami badań proliferacji (Rys. 51, 52).

Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibroblastów (C, D) hodowanych

w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400

Barwienie fluorescencyjne: DAPI, osteonektyna (hMSC)


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

97

) widać, że zarówno komórki

kulturze jak i w separowanych warunkach, posiadają podobną morfologię.

oraz specyficzne białka (wybarwione na

oraz wimentyna dla fibroblastów. Na podstawie

kulturze jest wyższa niż dla próby

w przypadku fibroblastów, gdzie

niż dla próby kontrolnej TCPS (Rys. 54 C, D).

).

oblastów (C, D) hodowanych

w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400 po 28

(hMSC) i wimentyna

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.4.3.4. Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym

Ostatnim etapem badań by

jakie panują w organizmie żywym.

wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani

charakter pilotażowy, a przedstawione wyniki obrazują

modelu.

Największym problemem był

kiedy insert był obrócony. Wynikało to z

insert nie pływał, a jednocześnie poziom medium

wyschły i komórki nie uległy uszkodzeniu. Do osadzenia

fibroblasty, z tego względu, że ich adhezja i proliferacja przebiega

Na Rys. 54 przedstawiono

rozpoczęcia eksperymentu.

bardzo mała (Rys. 55 A)

kontrolnej TCPS. Taki wynik mógł świadczyć o tym, że liczba fibroblastów osadzonych na

membranie była za mała, ale również

do powierzchni i uległa odczepieniu

po 14 dniach hodowli (R

części membrany jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na

próbie kontrolnej (Rys. 56

liczby komórek fibroblasty

również zdjęcia hMSC (Rys. 56

nie zauważono różnic między

kontrolnej TCPS.

Rys. 55 Morfologia fibroblastów

odwróconym insercie (A) i

h, zdjęcia wykonane przy 5


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Model symulujący warunki panujące w organizmie żywym

ań była próba stworzenia warunków jak najbardziej zbliżonych do tych

jakie panują w organizmie żywym. Szczegóły hodowli oraz schemat przedstawiający sposób

wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badani

a przedstawione wyniki obrazują możliwość rozwoju opracowanego

Największym problemem było osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie

kiedy insert był obrócony. Wynikało to z konieczności zapewnienia takich waru

, a jednocześnie poziom medium był na tyle wysoki

nie uległy uszkodzeniu. Do osadzenia na dolnej stronie zostały wybrane

fibroblasty, z tego względu, że ich adhezja i proliferacja przebiegają s

przedstawiono zdjęcia membrany i płytki hodowlanej wykonane po 24 h od

rozpoczęcia eksperymentu. Jak można zauważyć liczba fibroblastów

w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie


membranie była za mała, ale również, że część komórek nie przylgnęła

egła odczepieniu po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzon

hodowli (Rys. 56) pokazują, że liczba fibroblastów hodowanych

jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na

ys. 56 A, C). Świadczy to o tym, że pomimo niewielkiej początkowej

liczby komórek fibroblasty zaadherowały do podłoża i zaczęły się namnażać.

ys. 56 B, D). Również w tym przypadku, co jest bardzo korzystne,

między morfologią i liczbą komórek na membranie

ibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany

odwróconym insercie (A) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (B).

djęcia wykonane przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

98

jak najbardziej zbliżonych do tych

Szczegóły hodowli oraz schemat przedstawiający sposób

wysiania komórek na materiał przedstawiono w pkt. 1.7.3.3. Przeprowadzone badania miały

możliwość rozwoju opracowanego

osadzenie komórek na dolnej stronie membranie, w momencie

konieczności zapewnienia takich warunków, aby

na tyle wysoki, aby membrany nie

na dolnej stronie zostały wybrane

ją szybciej niż hMSC.

wykonane po 24 h od

Jak można zauważyć liczba fibroblastów na membranie jest

w porównaniu do liczby fibroblastów obserwowanych na próbie


ła wystarczająco mocno

po obróceniu insertu. Kolejne badania przeprowadzone

hodowanych na dolnej

jest znacznie większa i zbliżona do liczby komórek obserwowanych na

o tym, że pomimo niewielkiej początkowej

i zaczęły się namnażać. Wykonano

, co jest bardzo korzystne,

na membranie, i na próbie

powierzchni membrany przy

TCPS (B). Czas hodowli 24

po wybarwieniu MTT.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Rys. 56 Morfologia fibroblastów

hodowanych na górnej powierzchni

TCPS (C, D). Czas hodowli

wybarwieniu MTT.


Głównym celem badań w ko

ludzkie fibroblasty i hMSC

po wszczepieniu, będą reagowały na właściwości mikrostrukturalne membran. Wiadome jest,

że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i ko

się ze sobą, co wpływa na ich proliferację czy różnicowanie

w niniejszej pracy przeprowadzono badania w kokulturach, będące znacznie bardziej

zaawansowanym sposobem badań cytozgodności nowych biomateriałów.

Przedstawione wyniki

fibroblastów jest niższa niż na próbie kontrolnej TCPS (Rys. 51). Odwrotną sytuację

obserwujemy w przypadku hMSC, gdzie liczba komórek na próbie kontrolnej TCPS jest

znacząco niższa niż na membranach (

proliferacji komórek hodowanych w separowanych warunkach (Rys. 45 A, B), można

zauważyć, że proliferacja fibroblastów po 14 dniach hodowli na membranach jest niższa


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany (A)

powierzchni membrany (B) i w próbie kontrolnej

hodowli 14 dni, zdjęcia wykonano przy 5-krotnym powiększeniu

Dyskusja wyników

Głównym celem badań w kokulturach komórkowych było sprawdzenie czy komórki

ludzkie fibroblasty i hMSC – z którymi materiał będzie miał kontakt w organizmie ludzkim


że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i ko

się ze sobą, co wpływa na ich proliferację czy różnicowanie [100



Przedstawione wyniki proliferacji pokazują, że na obydwu membranach liczba



znacząco niższa niż na membranach (Rys. 52). Porównując otrzymane wyniki




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

99

powierzchni membrany (A) i hMSC

i w próbie kontrolnej – na dnie płytki

krotnym powiększeniu po

kulturach komórkowych było sprawdzenie czy komórki –

z którymi materiał będzie miał kontakt w organizmie ludzkim


że w warunkach panujących w organizmie komórki różnych typów kontaktują i komunikują

100, 101, 102]. Dlatego



proliferacji pokazują, że na obydwu membranach liczba



równując otrzymane wyniki z wynikami




________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

100

w kokulturach niż w separowanych warunkach (Rys. 51, Rys. 45 A). Biorąc również pod

uwagę, że w separowanych warunkach proliferacja fibroblastów była porównywalna do próby

kontrolnej TCPS, a w przypadku kokultury liczba fibroblastów była znacząco niższa niż na

TCPS, można stwierdzić, że proliferacja fibroblastów jest obniżona na skutek obecności

hMSC. Dla hMSC obserwujemy odwrotną zależność. Liczba komórek hodowanych na

membranach, w kokulturze jest istotnie wyższa niż na próbie kontrolnej TCPS

i w porównaniu do hodowli w separowanych warunkach (Rys. 52, Rys. 45 B). Przedstawione

wyniki sugerują, że hMSC rosną lepiej jeśli mają kontakt z fibroblastami. Niemniej jednak,

pomimo wysokiego poziomu proliferacji hMSC, w kokulturze, zaobserwowano niski stopień

różnicowania i mineralizacji hMSC (Rys. 53 A, B). W separowanych warunkach liczba

komórek była niższa niż na próbie kontrolnej, a mimo to zarówno poziom ALP jak

i mineralizacji były wyższe dla komórek hodowanych na membranach, w porównaniu do

próby kontrolnej (Rys. 46 A, B). Z tej zależności wynika wniosek, że obecność fibroblastów

korzystnie wpływa na proliferację hMSC, ale powoduje również osłabienie ich różnicowania

i mineralizacji. Obserwacje morfologii nie uwidoczniły istotnych zmian w budowie komórek

hodowanych w kokulturze (Rys. 54).

Wyniki badań w kokulturach, w modelu symulującym warunki panujące w organizmie

żywym dowodzą, że możliwa jest hodowla in vitro w układzie polegającym na jednoczesnej

hodowli fibroblastów oraz hMSC na obu stronach membrany. Jednakże, względu na problem

z osadzeniem komórek na dolnej części membrany zastosowany model powinien zostać

udoskonalony, tak aby możliwe było uzyskanie powtarzalnych warunków hodowli, a dzięki

temu wiarygodnych wyników badań.

Podsumowując, przeprowadzone badania membran w kokulturach komórkowych

pokazały, że badane membrany są cytozgodne w warunkach jednoczesnego kontaktu z oboma

typami komórek. Co ważniejsze, zauważono że w warunkach kokultur komórkowych

fibroblasty mające kontakt z membraną proliferują wolniej niż hMSC. Taki wynik sugeruje,

że opracowane membrany będą spełniać swoją funkcję jako bariera przeciwdziałająca

wnikaniu miękkiej tkanki łącznej (wytwarzanej przez fibroblasty) do miejsca ubytku

kostnego. Zapewnią zatem korzystne warunki do odtworzenia się tkanki kostnej.

III CZĘŚĆ DOŚWAIDCZALNA PODSUMOWANIE I WNIOSKI

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

101

3. PODSUMOWANIE I WNIOSKI

Przeprowadzone w rozprawie badania dotyczyły możliwości wykorzystania

kopolimeru laktydu i glikolidu (PLGA), przetworzonego w postać membran jako materiałów

do sterowanej regeneracji tkanek (GTR) w periodontologii. Zakres badań obejmował zarówno

otrzymanie materiału w postaci membran i badania ich właściwości fizykochemicznych oraz

biologicznych.

W części teoretycznej pracy (część I) przedstawiono zagadnienia dotyczące genezy

chorób przyzębia oraz metod ich leczenia (rozdział 2 i 3), skupiając się na metodzie

regeneracyjnej. Metoda ta opiera się na zastosowaniu techniki (GTR), która zakłada użycie

materiału w postaci membrany, izolującej tkanki dziąsła od ubytku kostnego i stwarzającej

korzystne warunki do odbudowy tkanki kostnej. Następnie przedstawiono przegląd literatury

dotyczącej materiałów wykorzystywanych w technice GTR (rozdział 4). Uwzględniono

wymagania jakie stawia się takim materiałom, a następnie ocenie poddano materiały, które

obecnie stosowane są do leczenia chorób przyzębia. Przedstawiono ich charakterystykę jak

również zalety i wady, wskazując na to jakie parametry należałoby zmodyfikować, aby

uzyskać materiał o jak najlepszych właściwościach dla zastosowania w GTR.

W części II pracy przedstawiono cel i tezę rozprawy oraz pokrótce opisano

zrealizowane zadania cząstkowe.

W części doświadczalnej (część III) scharakteryzowano użyte materiały, tj. polimer

matrycowy PLGA oraz poli(glikol etylenowy) – PEG, wykorzystany jako porogen, opisano

metodę otrzymywania membran, a następnie scharakteryzowano metody badań otrzymanych

materiałów (rozdział 1). Następnie przedstawiono uzyskane wyniki i poddano je analizie

(rozdział 2).

W pierwszej kolejności otrzymane membrany scharakteryzowano pod względem budowy –

makro- i mikrostrukturalnej oraz właściwości fizycznych i chemicznych (podrozdz. 2.1, 2.2).

Ustalono optymalne stężenie porogenu, zapewniające maksymalną porowatość przy

jednoczesnym zachowaniu ciągłości struktury membrany. Zbadano również wpływ masy

cząsteczkowej porogenu na mikrostrukturę membran. Przeprowadzone badania zostały

uzupełnione o pomiary szybkości odparowywania rozpuszczalnika, co pozwoliło na

zaproponowanie mechanizmu tworzenia się membran. Badania wykazały, że w układzie

PLGA/PEG/dichlorometan dochodzi do spontanicznej separacji faz, która jest spowodowana

różnicą współczynników rozpuszczalności oraz swobodnych energii powierzchniowych


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

102

użytych polimerów. W przypadku stężenia porogenu (mniejszego lub równego 60%), PEG

tworzy izolowane, kuliste wydzielenia równomiernie rozłożone w całej objętości blendy.

Wraz ze wzrostem stężenia PEG (powyżej 70%) rośnie liczba wydzieleń, a faza PEG staje się

fazą ciągłą powodując jednocześnie nieciągłość drugiej fazy, tj. polimeru matrycowego

PLGA. Badania przeprowadzone z użyciem różnych mas cząsteczkowych porogenu

wykazały, że w przypadku kiedy masa cząsteczkowa PEG jest niska (300 Da) w matrycy

PLGA tworzy się duża liczba niewielkich i kulistych wydzieleń PEG. Wraz ze wzrostem

masy cząsteczkowej PEG liczba wydzieleń maleje, ale rośnie ich rozmiar. Uwzględniając

wyniki pomiarów szybkości odparowania rozpuszczalnika wysunięto wniosek, że tworząca

się asymetryczna mikrostruktura jest wynikiem sedymentacji oraz łączenia się ze sobą dużych

wtrąceń PEG, które akumulują się przy dolnej powierzchni membran. Dzięki zdobytej wiedzy

możliwe było sterowanie procesem otrzymywania membran, co w efekcie pozwoliło uzyskać

membrany o najbardziej pożądanych i najlepiej zdefiniowanych właściwościach

z punktu widzenia medycyny.

W drugim etapie pracy najbardziej obiecujące membrany zostały poddane badaniom

degradacji w płynie PBS (podrozdz. 2.3). Celem badań było określenie kinetyki

i mechanizmu degradacji, a co za tym idzie, ich przydatności w technice GTR. Wcześniejsze

badania degradacji użytego polimeru obejmowały badania PLGA w postaci rusztowań lub

folii, dlatego istotnym elementem niniejszej pracy było sprawdzenie czy inna budowa

mikrostrukturalna otrzymanych materiałów nie wpłynęła w znaczący sposób na mechanizm

i kinetykę degradacji. Otrzymane wyniki badań potwierdziły, że PLGA w postaci membrany

degraduje w sposób heterogeniczny w masie. Oprócz tego czas degradacji membran, który

okazał się być porównywalny do czasu degradacji folii oraz wytrzymałość po degradacji,

która jest podobna do tej z doniesień literaturowych, świadczą o tym, że membrana będzie

zapewniać odpowiednie warunki dla odtwarzającej się w miejscu ubytku nowej tkanki

kostnej.

Ostatnią grupą badań były badania biologiczne in vitro (podrozdz. 2.4). Badania te zostały

podzielone na trzy etapy, tj. od podstawowych do najbardziej zaawansowanych. Pierwsze

badania zostały przeprowadzone z wykorzystaniem komórek osteoblastopodobnych MG-63

(podrozdz. 2.4.1). Do badań zostały wytypowane trzy membrany otrzymane z 60% udziałem

wagowym PEG o różnych masach cząsteczkowych: 300 Da, 400 Da i 1000 Da. Oprócz tego

badaniom poddano obie powierzchnie membran: górną, która w trakcie procesu

otrzymywania miała kontakt z powietrzem i dolną, które w trakcie procesu otrzymywania


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

103

miała kontakt ze szklaną powierzchnią szalki Petriego. Celem tych badań było sprawdzenie

jak PLGA w postaci membran o różnej mikrostrukturze i porowatości będzie zachowywał się

w kontakcie z komórkami oraz czy różna chropowatość poszczególnych powierzchni

membran wpływa na proliferację i różnicowanie komórek. Test żywotności komórek MTT

pokazał, że komórki dobrze adherują i proliferują na wszystkich badanych materiałach,

a różnice miedzy poszczególnymi powierzchniami są stosunkowo niewielkie, ale istotne

statystycznie. Badanie poziomu tlenku azotu nie wykazało żadnych nieprawidłowości

w hodowli i było zgodne z badaniem MTT. Obserwacje morfologii komórek również

zgadzały się z wynikami wcześniejszych badań i pokazały, że komórki hodowane na

membranach miały wrzecionowaty, wielokątny kształt i były dobrze rozpłaszczone. Badania

te wykazały, że przetworzony w postać membrany PLGA jest cytozgodny, a jego

mikrostruktura wpływa na zachowanie się komórek.

Na podstawie uzyskanych wyników do dalszych badań komórkowych wytypowano

membrany PEG 400 i PEG 1000 (podrozdz. 2.4.2). Taki wybór został również podyktowany

faktem, że z założenia membrana do GTR powinna posiadać asymetryczną budowę,

w wyniku czego wybrano dwie membrany istotnie różniące się mikrostrukturą – membranę

uzyskaną za pomocą PEG 400 charakteryzującą się niewielką asymetrycznością i najbardziej

asymetryczną membranę otrzymaną przy udziale PEG 1000. Hodowla komórek była

prowadzona na obu powierzchniach membran (górnej i dolnej). Badania zostały

przeprowadzone z wykorzystaniem ludzkich komórek – fibroblastów oraz ludzkich

mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), czyli komórek z którymi membrana

będzie miała kontakt w po wszczepieniu do organizmu ludzkiego. Przedstawione wyniki

pokazują, że komórki fibroblastów proliferują na jednakowym poziome niezależnie od

rodzaju materiału, a liczba komórek jest porównywalna do liczby komórek na próbce

kontrolnej TCPS. W przypadku hMSC różnice w proliferacji są bardziej widoczne. Liczba

komórek jest większa w medium różnicującym (DM) niż medium podstawowym (BM).

Istotne statystycznie różnice widać było również pomiędzy stronami membran – najwięcej

komórek zaobserwowano na górnej powierzchni membrany PEG 1000, a najmniej na dolnej

powierzchni membrany PEG 1000. Znaczące różnice obserwowane były również

w przypadku różnicowania (poziom ALP) i mineralizacji komórek. Wyniki pokazały, że

najbardziej zróżnicowane i zmineralizowane komórki znajdowały się na membranie PEG 400.

Taki wynik może świadczyć o tym, że ta membrana posiada korzystniejszą mikrostrukturę dla

różnicujących się komórek, ponieważ pomimo mniejszej ich liczby (w porównaniu do górnej


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

104

powierzchni membrany PEG 1000), komórki macierzyste łatwiej różnicują się w kierunku

osteoblastów. Obserwacja komórek, za pomocą metod mikroskopowych, nie pokazała

żadnych nieprawidłowości w ich morfologii. Już po 24 h na powierzchniach membran można

było zaobserwować pojedyncze, ale dobrze rozpłaszczone komórki o wrzecionowatych

kształtach, a po 7 dniach komórki tworzyły szczelnie przylegającą do powierzchni materiału

monowarstwę. Budowa mikrostrukturalna membran miała wpływ nie tylko na proliferację,

ale również na różnicowanie i mineralizację hMSC.

W ostatnim etapie badań biologicznych hodowla była prowadzona w kokulturach

komórkowych (podrozdz. 2.4.3); wykorzystano te same komórki, tj. ludzkie fibroblasty

i hMSC, ale były one hodowane na górnych stronach membran PEG 400 i PEG 1000. Takie

rozwiązanie zostało podyktowane faktem, że w wyżej opisanym eksperymencie dowiedziono,

że fibroblasty rosły dobrze, niezależnie od strony membrany, natomiast hMSC wykazywały

wyższą proliferację na górnych powierzchniach membran. Eksperyment w kokulturze

komórkowej miał na celu sprawdzenie zachowania membran w warunkach najbardziej

zbliżonych do warunków jakie panują w organizmie żywym. Uzyskane wyniki pokazały, że

w warunkach kokultury komórkowej fibroblasty hodowane na membranach wykazują niższą

proliferację niż na próbie kontrolnej TCPS. Odwrotne zjawisko zaobserwowano w przypadku

hMSC, gdzie liczba komórek hodowanych na membranie była wyższa niż na próbie

kontrolnej TCPS. Porównując uzyskane wyniki z wynikami wcześniejszych badań można

wnioskować, że proliferacja fibroblastów kontakcie z hMSC została wyhamowana,

a proliferacja hMSC, jest lepsza w kontakcie z fibroblastami niż w separowanych warunkach.

Jednakże pomimo wyższej liczby hMSC ich stopień zróżnicowania i mineralizacji był niższy

niż komórek z próby kontrolnej, co było najprawdopodobniej wynikiem oddziaływania

między komórkami, poprzez rozpuszczalne w medium cytokininy. Przemawia również za tym

fakt, że tak samo jak w poprzednich eksperymentach, obserwacje morfologii komórek nie

wykazały żadnych nieprawidłowości w ich budowie.

Reasumując, przeprowadzone badania potwierdziły tezę postawioną w rozprawie, iż

możliwe jest otrzymanie materiału w postaci resorbowalnej membrany o zdefiniowanej

mikrostrukturze, charakteryzującego się niewłóknistą asymetryczną budową. Zaproponowany

w pracy mechanizm separacji faz w układzie PLGA/PEG/rozpuszczalnik w zależności od

stężenia porogenu i jego masy cząsteczkowej pozwala na kontrolowanie mikrostruktury

i właściwości fizykochemicznych produkowanych membran. Przeprowadzone badania

biologiczne potwierdziły, że mikrostruktura membran ma istotny wpływ na zachowanie


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

105

komórek, co stwarza wiele możliwości doboru optymalnych warunków dla odbudowy tkanki

kostnej.

Uzyskane wyniki badań pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków:

1. Opracowano skuteczną metodę otrzymywania resorbowalnych membran opierającą się

na separacji faz w układzie PLGA/PEG/dichlorometan, która polegała na odlewaniu

z roztworu i wypłukiwaniu porogenu.

2. Optymalne stężenie porogenu, użytego do otrzymania membrany, zostało ustalone na

60% wagowych, ponieważ przy takim stężeniu otrzymywane membrany mają

maksymalną porowatość przy jednoczesnym zachowaniu homogeniczności i przy

najkorzystniejszych parametrach mechanicznych.

3. Przeprowadzone badania pozwoliły na zaproponowanie mechanizmu tworzenia się

membran oraz wpływu stężenia porogenu i jego masy cząsteczkowej na mikrostrukturę

membran.

4. Masa cząsteczkowa użytego porogenu ma istotny wpływ na budowę mikrostrukturalną

materiału. W przypadku niskiej masy cząsteczkowej PEG otrzymywane membrany

posiadają niewielkie, kuliste pory, które są równomiernie rozłożone w całej objętości

membrany. W miarę wzrostu masy cząsteczkowej rośnie wielkość porów, stają się one

miej kuliste, a ich rozkład w objętości jest mniej jednorodny, w wyniku czego rośnie

asymetryczność otrzymywanych membran.

5. Proces degradacji membran zachodzi w sposób typowy dla poliestrów i oparty na reakcji

hydrolizy. Czas degradacji jest wystarczający, aby materiał spełnił swoją funkcję jako

materiał barierowy, zapewniając warunki korzystne do odbudowy struktury tkanki

kostnej w miejscu ubytku.

6. Przeprowadzone badania in vitro z wykorzystaniem komórek osteoblastopodobnych

MG-63 pokazały, że membrany nie są cytotoksyczne.

7. Badania biologiczne z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów i ludzkich komórek

mezenchymalnych (hMSC) pokazały, że oba typy komórek dobrze proliferują na

membranach. Proliferacja fibroblastów nie zależała od rodzaju i mikrostruktury

membran, natomiast proliferacja hMSC zależała od porowatości i chropowatości

powierzchni.


________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

106

8. W kokulturze proliferacja fibroblastów została wyhamowana, a proliferacja hMSC była

istotnie wyższa, niż dla próby kontrolnej TCPS, co jest bardzo korzystne z punktu

widzenia GTR.

9. Opracowane membrany spełniają założenia stawiane materiałom do sterowanej

regeneracji tkanek i mogą być brane pod uwagę jako potencjalny materiał do zastosowań

w medycynie.

IV STRESZCZENIE __________________________________________________________________________

107

IV STRESZCZENIE

Celem przedstawionej pracy było opracowanie nowego materiału membranowego

przeznaczonego do leczenia ubytków tkanki kostnej w periodontologii i chirurgii

stomatologicznej zgodnie z założeniami sterowanej regeneracji tkanek (GTR). Dotychczas

używane membrany GTR wytwarza się głównie z kolagenu lub syntetycznych polimerów

resorbowalnych i nadaje im się formę włóknistą, przez co ich mikrostruktura i porowatość są

trudne do kontrolowania. Proponowane w tej pracy rozwiązanie umożliwia otrzymanie

niewłóknistych, anizotropowych membran o zdefiniowanej budowie mikrostrukturalnej.

W pierwszym etapie pracy podjęte zostały badania nad otrzymaniem szeregu

membran polimerowych z kopolimeru L-laktydu z glikolidem za pomocą metody separacji

faz z wykorzystaniem poli(glikolidu etylenowego) jako porogenu. Po otrzymaniu membrany

zostały poddane badaniom mającym na celu scharakteryzowanie ich mikrostruktury

i właściwości mechanicznych oraz powierzchniowych. Kolejnym krokiem było

przeprowadzenie badań degradacji w warunkach symulujących środowisko biologiczne.

Badania te pozwoliły na określenie mechanizmu i czasu degradacji materiału w postaci

membrany. Następnie membrany przebadano w warunkach in vitro. Dzięki badaniom

przeprowadzonym z komórkami osteoblastopodobnymi MG-63 oraz ludzkimi fibroblastami

i ludzkimi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (hMSC) potwierdzono

cytozgodność otrzymanych membran jak również wykazano wpływ porowatości membrany

na proliferację i różnicowanie analizowanych komórek. W ostatnim etapie przeprowadzono

badania z wykorzystaniem kokultur komórkowych, które polegały na jednoczesnej hodowli

komórek tkanki łącznej (fibroblastów) z jednej strony membrany i tkanki kostnej (hMSC)

z drugiej strony membrany. Tak zaprojektowany eksperyment miał na celu przebadanie

wytworzonych membran w warunkach najbardziej zbliżonych do tych, jakie panują

w organizmie żywym.

Efektem końcowym pracy było opracowanie resorbowalnych membran do sterowanej

regeneracji tkanek o ściśle zdefiniowanej budowie mikrostrukturalnej i właściwościach

biologicznych najlepiej przystosowanych do leczenia ubytków tkanki kostnej wywołanych

przez choroby przyzębia.

V SUMMARY __________________________________________________________________________

108

V SUMMARY

The aim of this study was to develop a new membrane material for the treatment of

bone defects in periodontics and oral surgery according to guided tissue regeneration (GTR)

approach. Commercially available membranes used in GTR technique are made from

collagen or resorbable synthetic polymers. They possess a porous, fibrous microstructure

which is difficult to control. The solution proposed in this PhD-thesis allows to obtain

non-fibrous, anisotropic membranes with defined microstructure.

First step of the research was to obtain the range of polymeric membranes from

poly(L-lactide-co-glycolide) using phase separation method, with poly(ethylene glycol) as a

porogen. Afterwards, the material tests of the membranes were conducted, allowing to assess

and characterize the microstructure, as well as mechanical and surface properties. The next

step of the experiment was to determine the degradation of the material under conditions

simulating the biological environment. Those experiments permitted to describe the

mechanism and time of membrane degradation. Subsequently membranes were tested in vitro.

As a result of the experiments conducted with the presence of MG-63 osteoblast-like cells,

human fibroblasts and human mesenchymal stem cells (hMSCs) cytotoxicity of the obtained

membranes was evaluated. In addition the influence of the membrane porosity on

proliferation and differentiation of analyzed cells was determined. Finally, the examination of

the membranes in cell co-cultures was proceeded. The connective tissue cells (fibroblasts)

were cultured on the one side of the membrane simultaneously with the culture of hMSCs on

the other side. This design of the experiment was meant to examine obtained membranes

under the conditions as similar as possible to those prevailing in living organisms.

The final result of the thesis was obtaining resorbable membranes for the guided tissue

regeneration with strictly defined microstructure and biological properties, which were most

suitably adapted for the treatment of bone tissue defects induced by periodontium diseases.

SPIS TABEL __________________________________________________________________________

109

Spis Tabel:

Tabela 1 Charakterystyka porównawcza dostępnych na rynku membran do sterowanej regeneracji tkanek – GTR [11, 15]. .......................................................................................... 26

Tabela 2 Właściwości mechaniczne folii PLGA oraz membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z różnym udziałem procentowym porogenu (PEG 400). ......................................................... 50

Tabela 3 Grubość, procent wypłukania PEG, rozmiar porów i chropowatość membran PLGA (mPLGA) otrzymanych z 60% udziałem porogenu o różnych masach cząsteczkowych (średnia ± błąd standardowy). .................................................................................................. 57

Tabela 4 Szybkość odparowania rozpuszczalnika i pozostałość rozpuszczalnika w blendach PLGA/PEG. .............................................................................................................................. 59

Tabela 5 Wartości chropowatości (Ra) folii i membran przed i po inkubacji w PBS. ............. 78

SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________

110

Spis Rysunków:

Rys. 1 Schemat przedstawiający obszar zdrowy ząb-dziąsło (A.) i obszar objęty chorobą z widocznym cofnięciem kości dziąsła (B.). .............................................................................. 9

Rys. 2 Schemat prawidłowego obszaru ząb-dziąsło (A.), obszaru objętego chorobą z widoczna kieszonką dziąsłową i zanikiem kości wyrostka zębodołowego i więzadła zębodołowo-zębowego (B.) oraz obszaru po leczeniu metodą reparacji (C.) i regeneracji (D.) [12]. .......................................................................................................................................... 12

Rys. 3 Schemat umieszczenia membrany GTR pod powierzchnią dziąsła (A.), proces aktywacji osteoblastów (B.) [12]. ............................................................................................. 14

Rys. 4 Schemat przedstawiający triadę Lyncha [13]. ............................................................... 14

Rys. 5 Schemat przedstawiający asymetryczną budowę membrany przeznaczonej do sterowanej regeneracji tkanek. Mikrofotografie SEM pochodzą z badań własnych. ............... 16

Rys. 6 Mikrostruktura e-PTFE [25]. ......................................................................................... 18

Rys. 7 Biostabilne membrany wykonane z politetrafluoroetylenu o wysokiej gęstości (d-PTFE, Cytoplast®TXT-200) i z d-PTFE wzmocnionego siatką tytanową (Cytoplast®Ti-250) przeznaczone do GTR [28]. ............................................................................................. 19

Rys. 8 Budowa membrany BioGide® A. powiększenie 40x B. powiększenie 100x, C. strona gładsza, powiększenie 250x, D. strona bardziej chropowata, powiększenie 10000x [37]. ...... 21

Rys. 9 Budowa membrany Cytoplast® RTM Collagen [28]. .................................................. 21

Rys. 10 Schemat przedstawiający ideę gradientowego materiału funkcjonalnego (FGM). ..... 28

Rys. 11 Schemat membrany FGM [64]. ................................................................................... 29

Rys. 12 Wzór półstrukturalny PLGA ...................................................................................... 33

Rys. 13 Wzór półstrukturalny PEG .......................................................................................... 33

Rys. 14 Schemat otrzymywania membran PLGA .................................................................... 34

Rys. 15 Schemat odparowywania rozpuszczalnika .................................................................. 37

Rys. 16 Schemat hodowli komórkowej MG-63 w insertach i dołkach .................................... 39

Rys. 17 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach ............................... 41

Rys. 18 Schemat hodowli fibroblastów i hMSC w insertach i w dołkach w kokulturze ......... 44

Rys. 19 Schemat hodowli komórkowej po obu stronach membrany ....................................... 45

SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________

111

Rys. 20 Morfologia membran otrzymanych z użyciem porogenu PEG 400 o stężeniu wagowym A. 20% , B. 40%, C. 60% i D. 70% ........................................................................ 47

Rys. 21 Mikrofotografia SEM membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG 400: 20% (A, B, C), 40% (D, E, F), 60% (G, H, I), 80% (J, K, L); powierzchnia górna (A, D, G, J), powierzchnia dolna (B, E, H, K) i przełamy (C, F, L, L). .............................................. 48

Rys. 22 Wykres zależność wytrzymałości na rozciąganie od odkształcenia dla reprezentatywnych próbek folii PLGA i membran otrzymanych przy różnym stężeniu wagowym PEG. ........................................................................................................................ 49

Rys. 23 Właściwości mechaniczne membran otrzymanych z przy różnym stężeniu wagowym PEG A. wytrzymałość na rozciąganie, B. moduł Younga, C. wydłużenie przy maksymalnej sile, D. wydłużenie całkowite w momencie zerwania. ............................................................. 50

Rys. 24 Schemat otrzymywania membran PLGA o różnej morfologii w zależności od stężenia PEG ........................................................................................................................................... 53

Rys. 25 Mikrofotografie SEM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% PEG o różnej masie cząsteczkowej: PEG 300 (A, B, C), PEG 400 (D, E, F), PEG 600 (G, H, I), PEG 1000 (J, K, L), PEG 3400 (M, N, O); górna powierzchnia (A, D, G, J, M), dolna powierzchnia (B, E, H, K, N) i przełamy (C, F, I, L, O). ............................................................................... 55

Rys. 26 Zdjęcia AFM membran z PLGA otrzymanych z użyciem 60% stężenia PEG 300 (A, B), PEG 400 (C, D), PEG 600 (E, F), PEG 1000 (G, H) i PEG 3400 (I, J); górna powierzchnia (A, C, E, G, I) i dolna powierzchnia (B, D, F, H, J). ......................................... 56

Rys. 27 Szybkość odparowania rozpuszczalnika z PEG o różnych masach cząsteczkowych A. wykres zależności masy od czasu dla PEG 300 ■, PEG 400 ●, PEG 600 ▲, PEG 1000 ▼, PEG 3400 ►, B. obraz makroskopowy PEG na szalce po odparowaniu rozpuszczalnika. ..... 58

Rys. 28 Widma FTIR-ATR dla czystego porogenu PEG 300 (A.) i PEG 1000 (B.), blend, membran oraz folii PLGA. ....................................................................................................... 60

Rys. 29 Schemat otrzymywania membran PLGA z 60% udziałem porogenu PEG o różnych masach cząsteczkowych. .......................................................................................................... 63

Rys. 30 Makroskopowy obraz foli PLGA (A), membrany PEG 400 (B) oraz membrany PEG 1000 (C) przed i po inkubacji w PBS przez czas od 1 do 24 tygodni. ..................................... 65

Rys. 31 Zależność zmian masy czystej folii PLGA, membrany PEG 400 i membrany PEG 1000 po procesie inkubacji w PBS przez czas 24 tyg. ............................................................. 66

Rys. 32 Zależność pH PBS w funkcji czasu inkubacji folii i membran z PLGA przez 24 tyg. .................................................................................................................................................. 67

Rys. 33 Wartość kąta zwilżania dla czystej folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C) w funkcji czasu degradacji. .......................................................... 68

SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________

112

Rys. 34 Zmiany właściwości mechanicznych folii PLGA oraz membran PEG 400 i 1000 przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni A. wytrzymałość (Rm), B. moduł Younga (E), C. maksymalne wydłużenie (eFmax) i D. wydłużenie całkowite (eFTotal) ............. 70

Rys. 35 Wykresy zmiany zależności wytrzymałości od odkształcenia przed i po inkubacji w PBS w czasie 1, 2, 4 i 6 tygodni dla wybranych próbek folii PLGA (A), membrany PEG 400 (B) i membrany PEG 1000 (C). ......................................................................................... 71

Rys. 36 Mikrofotografie SEM czystej folii PLGA A. próbka przed inkubacją w PBS (wyjściowa) i po inkubacji prze B. 4 tygodnie, C. 12 tygodni i D. 20 tygodni. ....................... 72

Rys. 37 Mikrofotografie SEM membrany PEG 400 A – C przed degradacją (wyjściowe), D – F po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M – O po 9 tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U – W po 18 tygodniach degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R, T, W; przełamy C, F, I, L, O. .............................................................................................................. 74

Rys. 38 Mikrofotografie SEM membrany PEG 1000 A – C przed degradacją (wyjściowe), D – F po 2 tygodniach, G – I po 4 tygodniach, J – L po 6 tygodniach, M – O po 9 tygodniach, P – R po 12 tygodniach, S – t po 15 tygodniach i U – W po 18 tygodniach degradacji; górna powierzchnia A, D, G, J, M, P, S, U; dolna powierzchnia B, E, H, K, N, R, T, W; przełamy C, F, I, L, O. .............................................................................................................. 75

Rys. 39 Obrazy topograficzne powierzchni foli PLGA A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ....................................................................................... 76

Rys. 40 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 400 A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ......................................................... 77

Rys. 41 Obrazy topograficzne powierzchni membrany PEG 1000 A. próba wyjściowa (przed inkubacją), B. po 6 tygodniach inkubacji w PBS. ......................................................... 77

Rys. 42 Żywotność komórek MG-63 (test MTT) na membranach PEG 300, PEG 400 i PEG 1000 oraz próbach kontrolnych PLGA i TCPS. Wyniki zaprezentowano jako średnia ± błąd standardowy. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05; °°°p < 0,001 oraz do grupy kontrolnej PLGA: ●●p <0,01; ●●●p < 0,001. ........................ 81

Rys. 43 Poziom NO w nadsączu hodowli komórek MG-63 na membranach PEG 300, PEG 400 PEG 1000, folii PLGA i TCPS. Brak istotności statystycznej pomiędzy próbkami wg. t-testu. ...................................................................................................................................... 82

Rys. 44 Morfologia komórek MG-63 hodowanych na membranach PEG 300 (A, B), PEG 400 (C, D) i PEG 1000 (E, F); górna powierzchnia (A, C, E), dolna powierzchnia (B, D, F) oraz na folii PLGA (G) i TCPS (H); barwienie oranżem akrydyny. ........................................ 83

SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________

113

Rys. 45 Proliferacja fibroblastów (A) i hMSC (B) wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 14 dniach hodowli komórek w dwóch rodzajach medium: BM i DM. Kółko oznacza istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °p < 0,05 ............................................... 85

Rys. 46 Różnicowanie – aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca+2 (B) hMSC mierzona po 14 dniach hodowli w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna w stosunku do grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kółka oznaczają istotność statystyczną pomiędzy stronami membran: °°p < 0,01. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100% .................................................. 87

Rys. 47 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D). .................... 88

Rys. 48 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D) hodowanych przez 24 h na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C) i dolna powierzchnia (B i D). .................. 89

Rys. 49 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych przez 14 dni na membranie PEG 400; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia (B, D, F). ................................................................................................................................... 90

Rys. 50 Morfologia fibroblastów (A, B) i hMSC (C, D w BM i E, F w DM) hodowanych przez 14 dni na membranie PEG 1000; górna powierzchnia (A, C, E) i dolna powierzchnia (B, D, F). ................................................................................................................................... 91

Rys. 51 Proliferacja fibroblastów hodowanych w ko-kulturze z hMSC, wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczna względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; ***p <0,001.................... 94

Rys. 52 Proliferacja hMSC hodowanych w ko-kulturze z fibroblastami, wyznaczona na podstawie pomiaru stężenie LDH po 7, 14, 21 i 28 dniach inkubacji. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,01. ...................... 95

Rys. 53 Różnicowanie – aktywność ALP (A) i mineralizacja – stężenie Ca+2 (B) hMSC hodowanych w ko-kulturze z fibroblastami, mierzone po 21 i 28 dniach inkubacji w dwóch rodzajach mediów: BM i DM. Gwiazdki oznaczają istotność statystyczną względem grupy kontrolnej TCPS: *p <0,05; **p <0,001. Kwadraty oznaczają istotność statystyczną pomiędzy mediami BM i DM: ■■■p < 0,001. Maksymalne wartości otrzymane dla kontroli (TCPS) przyjęto jako 100%. .................................................................................................................. 96

Rys. 54 Morfologia komórek hMSC (A, B) w DM i fibroblastów (C, D) hodowanych w kokulturze (A, C) oraz w separowanych warunkach (B, D) na membranie PEG 400 po 28 dniach hodowli. Barwienie fluorescencyjne: DAPI, osteonektyna (hMSC) i wimentyna (fibroblasty). ............................................................................................................................. 97

Rys. 55 Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany przy odwróconym insercie (A) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (B). Czas hodowli 24 h, zdjęcia wykonane przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT. ...................... 98

SPIS RYSUNKÓW __________________________________________________________________________

114

Rys. 56 Morfologia fibroblastów hodowanych na dolnej powierzchni membrany (A) i hMSC hodowanych na górnej powierzchni membrany (B) i w próbie kontrolnej – na dnie płytki TCPS (C, D). Czas hodowli 14 dni, zdjęcia wykonano przy 5-krotnym powiększeniu po wybarwieniu MTT. ................................................................................................................... 99

LITERATURA __________________________________________________________________________

115

Literatura:

[1] GUS – „Stan zdrowie ludności Polski w 2004 r.”.

[2] Y. Ikada: Tissue Engineering Fundamentals and Applications, Interface Science and Technology, Vol.8., Elsevier, Amsterdam 2006, 36-42,70-87.

[3] T. Karring, S. Nyman, J. Gottlow, J. Laurell: Development of biological concept of guided tissue regeneration-animal and human studies, Periodontal 2000 1 (1993) 26-35.

[4] F. Yang, S. K. Both, X. Yang, X. F. Walboomers, J. A. Jansen: Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application, Acta Biomaterialia 5 (2009) 3295-3304.

[5] J. D. Bashutski, H-L. Wang: Periodontal and Endodontic Regeneration, JOE, Vol. 35, No 3, 2009.

[6] J. Behring, R. Junker, F. Walboomers, B. Chessnut, J.A. Jansen: Toward Guided Tissue and Bone Regeneration: morphology, attachment, proliferation and migration and cells cultured on collagen barrier membranes. A systematic review, Odontology 96 (2008), 1-11.

[7] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 69-135.

[8] A. Stavropoulous, A. Sculean, T. Karring: GTR treatment of intrabony defects with PLGA/PGA copolymer or collagen bioresorbable membranes in combination with deproteinized bovine bone (Bio-Oss), Clinical Oral Investigation 8 (2004) 3-159.

[9] S. Ivanovski: Periodontal regeneration, Australian Dental Journal 54 (2009) S118-S128.

[10] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 136-146, 209-224.

[11] Z. Jańczuk: Choroby Przyzębia, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005, 146-192.

[12] T. G. Jr. Wilson: Periodontal regeneration: enhanced clinical applications of enamel matrix proteins, Quintessence Publishing Co. Inc., USA 1999, 1-18.

[13] M. C. Bottino, V. Thomas, G. Schmidt, Y. K. Vohra, T-M. G. chu, M. J. Kowolik, G. M. Janowski: Recent advanced in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration – a materials perspective, Dental Materials 28 (2012) 703-721.

[14] D. Jiang, R. Dziak, S. E. Lynch, E. B. Stephans: Modyfication of an osteoconductive anorganic bovine bone mineral matrix with growth factors, Journal of Periodontology 70 (1999) 834-839.

LITERATURA __________________________________________________________________________

116

[15] A. Cieślik –Bielecka, T. Bielecki, T. S. Gaździk, T. Cieślik: Growth factors in the platelet-rich plasma as autogenic material which stimulates bone healing processes, Journal of Stomatology 59, 7 (2006) 510-517.

[16] D. F. Stamatialis, B. J. Papenburg, M. Girones, S. Saiful, S. N. M. Bettahalli, S. Schmitmeier, M. Wessling: Medical Applications of membranes: Drug delivery, artificial organs and tissue engineering, Journal of Membrane Science 308 (2008) 1-34.

[17] P. Gentile, V. Chiono, Ch. Tondra-Turo, A. M. Ferreira, G. Ciardelli: Polymeric membranes for guided bone regeneration, Review, Biotechnology Journal 6 (2011) 1187-1197.

[18] G. Owen, J. Jacson, B. Chehroudi, D. Brunette, H. Burt: A in vitro study of plasticized poly(lactic-co-glicolic acid) films as possible tissue regeneration membranes: Materials properties and drug release kinetics, Journal of Biomedical Materials Research Part A 3 (2010) 857-869.

[19] A. Sculean, D. Nikolidakis, F. Schwarz: Regeneration of periodontal tissue: combinations of barrier membrane as and grafting materials – biological foundation and preclinical evidence: a systematic review, Journal of Clinical Periodontology 35 (2008) 106-116.

[20] T. Karring: Regenerative periodontal therapy, Journal of the International Academy of Periodontology 2 (2000) 101-109.

[21] S. Liao, W. Wang, M. U. S. Okhawa, T. Akasaka, K. Tamura, et al.: The degradation of three layered nano-carbonated hydroxyapatite/collagen/PLGA composite membrane in vitro, Dental Materials 23 (2007) 1120-1129.

[22] L. S. Nait, C. T. Laurencin: Biodegradable polymers as biomaterials, Progress in Polymer Science 32 (2007) 762-798.

[23] K. Fuijhara, M. Kotaki, S. Ramakrishna: Guided bone regeneration membrane made of policaprolactone/calcium carbonatecomposite nano-fibre, Biomaterials 26 (2005) 4139-4147.

[24] M. Simion, C. Dahlin, K. Blair, R. K. Schen: Effect of different microstructures of e-PTFE membranes on bone regeneration and soft tissue response: a histological study in canine mandible, Clinical Oral Implants Research 10 (1999) 73-84.

[25] Zdjęcie ze strony: http://www.ptfe-membrane.com (2.11.2012).

[26] H. D.Barber, J. Ligneli, B. M. Smith, K. Bartee: Using a dens PTFE membrane without primary closure to achieve bone and tissue regeneration, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 65 (2007) 748-752.

LITERATURA __________________________________________________________________________

117

[27] F. Watzinger, J. Luksch, W. Millesi, C. Achopper, J. Neugebauer, D. Moser, R. Ewers: Guided bone regeneration with titanium membranes: a clinical study, British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 38 (2000) 312-315.

[28] Wykorzystane zdjęcia pochodzą z broszury: Osteogenics clinical education; Implant Site Development and Extraction Site Grafting Manual: Bone Biology & Physiology, Selection of Grafting Materials, Selection of Barrier Membranes, and Surgical Technique, B.K. Bartee, DDs. MD.

[29] E. Milella, P. A. Ramires, E. Brescia,G. La Sala, L. Di Paola, V. Bruno, Physicochemical, mechanical and biological properties of commercial membranes for GTR, Journal of Biomedical Materials Research (Appl Biomater) 58 (2001) 427-435.

[30] S. Zhao, E. M. Pinholt, J. E. Madsen, K. Donath, Histological evaluation of different biodegradable and non-degradable membranes implanted subcutaneously in rats, Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery 28 (2000) 116-122.

[31] B. Alpar, G. Leyhausen, H. Günay, W. Geurtsen: Compatybility of resorbable and nonresorbable guided tissue regeneration membranes in cultures of primary human periodontal ligament fibroblasts and human osteoblast-like cells, Clinical Oral Investigation 4 (2000) 219-225.

[32] A. Kasaj, C. Reichert, H. Gotz, B. Rohig, R. Smeets, B. Willershausen: In vitro evaluation of various bioabsorbable and nonresorbable barrier membranes for guided tissue regeneration, Head & Face Medicine 4 (2008) 22-29.

[33] M. Nałęcz: Biocybernetyka I inżynieria biomedyczna, Akademicka Oficyna Wydawnicza EXIT, Warszawa 2003,tom 4: S. Błażewicz, L. Stoch: Biomateriały 257-330.

[34] M. Felipe, P. F. Andreade, M. F. M. Grisi, S. L. S. Souza, M. Taba, DB Palioto, et al.: Comparision of two surgical procedures for use of the acellular dermal matix graft in the treatment of gingival recession: a randomized controlled clinical study, Journal of Periodontology 78 (2007) 1209-1217.

[35] A. Santos, G. Goumenos, A. Pascula: Management of gingival recession by the use of acellular dermal graft material: a 12-case series, Journal of Periodontology 76 (2005) 1982-1990.

[36] Matsuda: Suturable adhesion-preventing membrane, United States Parent no. US 6,997,231 B1, 20.12.2005.

[37] Zdjęcia pochodzą z prospektu firmy Geistlich: The original remains unique, zdjęcia wykonane przez Dr. Bufler Wolhusen.

LITERATURA __________________________________________________________________________

118

[38] M. C. Bottino, V. Thomas, M. V. Jose, D. R. Dean, GM. Jaworski: Acellular dermal matrix graft: synergistic effect of rehydration and natural crosslinking on mechanical properties, Journal of Biomedical Research Part B: Applied Biomaterials 25 (2010) 276-282.

[39] A. D. Bhrany, C. J. Lien, B. L. Beckstead, N. D. Futran, N. H. Muni, C. M. Giachelli, et al.: Crosslinking of an oesophagus acellular matrix tissue scaffold, Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2 (2008) 365-372.

[40] H. G. Sundararaghavan, G. A. Monteiro, N. A. Lapin, Y. J. Chabal, J. R. Miksan, D. I. Shreiber: Ganipin-induced changes in collagen gels: correlation of mechanical properties to fluorescence, Biomedical Research Part A 87 (2008) 308-320.

[41] A. N. Versypt, D. W .Pack, R. D. Braatz: Mathematical modeling of drug delivery from autocatalytically degradable PLGA microspheres-A Review, Journal of Controlled Release doi: 10.1016/j.jconrel.2012.10.015

[42] H. Seyednejad, A. H. Ghassemi, C. F. van Nostrum, T. Vermonden, W. E. Hennink: Functional aliphatic polyesters for biomedical and pharmaceutical applications, Journal of Controlled Release 152 (2011) 168- 176.

[43] J. Gottlow: GTR Rusing resorbable and nonresorbable devices: initial healing and long term results, Journal of Priodontology 64 (1993) 1157-1165.

[44] A. Bilir, B. Aybar, S. H. Tanrikulu, H. Issever, et al.: Biocompatybility of different barrier membranes in cultures of human CRL 11372 osteoblast-like cells: an immunohistochemical study, Clinical Oral Implants Research 18 (2007) 46-52.

[45] T. Takata, H. L Wang, M. Miyauchi: Migration of osteoblastic cells on various guided bone regeneration membranes, Clinical Oral Implants Research 12 (2001) 332–338.

[46] B. A. Coonts, S. L. Whitman, M. O’Donnell, A. M. Polson, et al.: Biodegradation and biocompatibility of a guided tissue regeneration barrier membrane formed from a liquid polymer material, Journal of Biomedical Materials Research 42 (1998) 303-311.

[47] P. M. Camargo, V. Lekovic, M. Weinlaender, N. Vasilic, et al: Platelet-rich plasma and bovine porous bone mineral combined with guided tissue regeneration in the treatment of intrabony defect in humans, journal of Periodontology Research 37 (2002) 300-306.

[48] G. Rh. Owen, J. Jackson, B. Chehroudi, H. Burt, D. M. Brunette: A PLGA membrane controlling cell behaviour for promoting tissue regeneration, Biomaterials 26 (2005), 7477-7456.

[49] M. L. Houchin, E.M. Topp: Physical Properties of PLGA Films During Polymer Degradation, Journal of Applied Polymer Science 114 (2009) 2848 – 2854.

LITERATURA __________________________________________________________________________

119

[50] P. Hoser: Fizjologia organizmów z elementami anatomii człowieka, WSiP, Warszawa 1999, 160-187.

[51] M. De Sanctis, G. Zucchelli: Guided tissue regeneration with a resorbable barrier membrane (Vicryl) for the management of buccal recession: a case report, International Journal of Periodontics and Restorative Dentristy 16 (1996) 435-441.

[52] R. Pontoriero, J. Wennström, J. Lindhe: The use of barrier membranes and enamel matrix proteins in the treatment of angular bone defects. A prospective controlled clinical study, Journal of Clinical Periodontology 26 (1999) 833-840.

[53] N. Donos, L. Kostopoulos, T. Karring: Alveolar ridge augmentation using a resorbable copolymer membrane and autogenous bone grafts. An experimental study in the rat. Clinical Oral Implants Research 13 (2002) 203–113.

[54] M. F. Meek, K. Jansen, R. Steendam, W. Van Oeveren, et al.: In vitro degradation and biocompatibility of poly(DL-lactide-epsilon-caprolactone) nerve guides, Journal of Biomedical Materials Research 68 (2004) 43-51. .[55] E. J. Hoogeveen, P. F. Gielkens, J. Schortinghuis, J. L. Ruben, et al.: Vivosorb as a barrier membrane in rat mandibular defects. An evaluation with transversal microradiography, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 38 (2009) 870-875.

[56] S. Agarwal, J. H. Wendorff, A. Greiner: Use of electrospinning technique for biomedical application, Polymer 49 (2008) 5603-5621.

[57] K. H. Kim, L. Jeong, H. N. Park, S. Y. Shin, W. H. Park, S. C. Lee, T. I. Kim, Y. J. Park, Y. J. Seol, Y. M. Lee, Y. Ku, I. C. Rhyu, S. B. Han, C. P. Chung: Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for guided bone regeneration, Journal of Biotechnology 120 (2005) 327-339.

[58] Y. J. Park, K. H. Nam, S. J. Ha, Ch. M. Pai, Ch. P. Chung, S. J. Lee: Porous poly(L-lactide) membrane as a guided tissue regeneration and controlled drug delivery: membrane fabrication and characterization, Journal of Controlled Release 43 (1997) 151-160.

[59] W-J. Lin, C-H. Lu: Characterization and permeation of microporous poly(ε-caprolactone) film, Journal of Membrane Science 198 (2002) 109-118.

[60] Ch. Xianmiao, L. Yubao, Z. Yi, Z. Li, L. Jidong, W. Huanan: Properties and in vitro biological evaluation of nano-hydroxyapatite/chitosan membranes for bone guided regeneration, Materials Science and Engineering C 29 (2009) 29-35.

LITERATURA __________________________________________________________________________

120

[61] S. W. Song, J. M. Torkelson: Coarsening effects on the formation of microporous membranes produced via thermally induced phase separation of polystyrene-cyclohexanol solution, Journal of Membrane Science 98 (1995) 209-222.

[62] W. K. Kim, K. Char, C. K. Kim: Control of droplet size of polymer – diluents blends through thermally induces phase separation, Journal of Polymer Science: Part B 38 (2000) 3042-3052.

[63] P. L. Hanks, D. R. Lloyd: Deterministic model for matrix solidification in liquid-liquid thermally induced separation, Journal of Membrane Science 306 (2007) 125-133.

[64] Y. Tagauchi, N. Amizuka, M. Nakade, H. Ohnishi, N. Fujii, K. Oda, S. Nomura, T. Maeda: A histological evaluation for guided bone regeneration induced by a collagenous membrane, Biomaterials 26 (2005) 6158-6166.

[65] K. Owens, R. Yukna: Collagen membran resorption in dog: a comparative study, Implant Dentristy 10 (2001) 49-58.

[66] M. C. Bottino, M. V. Jose, V. Thomas, D. R. Dean, G. M. Janowski: Freez-dried acellular dermal matrix graft: effect of dehydrationon physical, chemical and mechanical properties, Dental Materials 25 (2009) 1109-1115.

[67] P. Bunyaratavej, H. L. Wang: Collagen membranes: a review, Journal of Periodontology 72 (2001) 215-229.

[68] L. T. Hou, J. J. Yan, A. Y. M. Tsai, C. S. Lao, S. J. Lin, C. M. Liu: Polymer-assisted regeneration therapy with Atrisorb® barriers in human periodontal intrabony defects, Journal of Clinical Periodontology 31 (2004) 68-74.

[69] U. Klinge, B. Klosterhalfen, M. Muller, V. Schumpelick: Foreign body reaction to meshes used for the repair of abdominal wall hernias, European Journal of Surgery 165 (1999) 665-673.

[70] M. Kikuchi, Y. Koyama, T. Yamada, T. Okada, et al.: Development of guided bone regeneration membrane composed of β-tricalcium phosphate and poly(L-lactide-co-glycolideco-ε-caprolatone) composites, Biomaterials 25 (2004) 5979–5986.

[71] H. H. Lu, S. F. El-Amin, K. D. Scott, C. T. Laurencin: Threedimensional, bioactive, biodegradable, polymer-bioactive glass composite scaffolds with improved mechanical properties support collagen synthesis and mineralization of human osteoblast-like cells in vitro, Journal of Biomedical Materials Research, Part A 64 (2003) 465-474.

[72] J. Yao, S. Radin, P. Leboy, P. Ducheyne: The effect of bioactive glass content on synthesis and bioactivity of composite poly (lactic-co-glycolic acid)/bioactive glass substrate for tissue engineering, Biomaterials 26 (2005) 1935–1943.

LITERATURA __________________________________________________________________________

121

[73] M. C. Bottino, V. Thomas, G. M. Janowski: A novel spatially designed and functionally graded electrospun membrane for periodontal regeneration, Acta Biomaterialia 7 (2011) 216-224.

[74] P. Dobrzynski, J. Kasperczyk, H. Janeczek, M. Bero: Syntesis of biodegradable copolymers with the use of low toxic zirconium compounds. Copolymerisation of glycolide with L-lactide initiated by Zr(acac)4, Macromolecules 34 (2001) 5090-5098.

[75] P-391519. Method of manufacturing of resorbable membrane for guided tissue regeneration / Sposób wytwarzania resorbowalnej membrany do sterowanej regeneracji tkanek inventors / inventors / wynalazcy: E. Pamuła, S. Błażewicz, M. Krok, D. Kościelniak, P. Dobrzyński. (2010-06-15).

[76] F. Yang, S. K. Both, X. Yang, X. F. Walboomers, J. A. Jansen: Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application, Acta Biomaterialia 5 (2009) 3295-3304.

[77] S. Schenderlein, M. Luck, B.W. Muller: Partial solubility parameters of poly(D,L-lactide-co-glycolide), International Journal of Pharmaceutic 286 (2004) 19-26 .

[78] K. Sepassi, S. H. Yalkowsky: Solubility Prediction in Octanol: A Technical Note, AAPS Pharmaceutic Science and Technology 7(1) (2006) E1-E8.

[79] T. Nieminen, I. Kallela, J. Keränen, I. Hiidenheimo, H. Kainulainen, E. Wuolijoki, I. Rantala: In vivo and in vitro degradation of a novel bioactive guided tissue regeneration membrane, International Journal of Oral Maxillofacial Surgery 35 (2006) 727-732.

[80] M. Krok, E. Pamula: Poly(L-lactide-co-glycolide) microporous membranes for medical application produced with the use of polyethylene glycol as a pore former, Journal of Applied Polymer Science 125 (2012) E187-E199.

[81] K. Pielichowska, S. Gkowinkowski, J. Lekki, D. Binias, , K. Pielichowski, J. Jenczyk: PEO/fatty acid blends for thermal energy storage materials. Structural/morphological features and hydrogen interactions, Eurpean Polymer Journal 44 (2008) 3344–3360.

[82] E. Pamula, M. Blazewicz, C. Paluszkiewicz, P. Dobrzynski: FTIR study of degradation products of aliphatic polyesters-carbon fibres composites, Journal of Molecular Structure 596 (2001) 69-75.

[83] Sperling, L.H. Introduction to Physical Polymer Science, third ed., Wiley, New Jersey, 2006.

[84] K. Pielichowski, K. Flejtuch: Differential scanning calorimetry studies on poly(ethylene glycol) with different molecular weight for thermal energy storage materials, Polymers for Advanced technology 13 (2002) 690-696.

LITERATURA __________________________________________________________________________

122

[85] A. Gopferich: Mechanisms of polymer degradation and erosion, Biomaterials 17 (1996) 103-114.

[86] P. Dobrzynski, J. Kasperczyk, H. Janeczek, M. Bero: Synthesis of biodegradable copolymers with the use of low toxic zircinium compounds 1. Copolymerization of glycolide with L-lactide by Zr(acac)4, Macromolecules 34 (2001) 5090-5098.

[87] E. Pamula, E. Dryzek, P. Dobrzynski: Hydrolitic degradation of poly(L-lactide-co-glycolide) studied by positron anihilation spectroscopy and Rother techniques, Acta Physica Polonica A 110 (2006) 631-639.

[88] R. T. Morrison R. N. Boyd: Chemia Organiczna, Tom 1 Wydawnictwo PWN, Warszawa, 194, 700-702.

[89] I. Grizzy, H. Garreau, S. Li, M. Verte: Hydrolytic degradation of devices based on poly(DL-lactic acid) size dependence, Biomaterials 16 (1995) 305-311.

[90] L. Lu, S. J. Peter, M. D. Lyman, H-L. Lai, S. M. Leite, J A. Tamada, S. Uyama, J P. Vacanti, R. Lager, A. G. Mikos: In vitro and in vivo degradation of porous poly(DL-lactic-co-glicolic acid) foams, Biomaterials 21 (2000) 1837-1845.

[91] S. Li, S. MaCrthy: Futures investigations on the hydrolytic degradation of poly(DL-lactide), Biomaterials 20 (1999) 35-44.

[92] P. Mastalerz: Elementarna Biochemia, Wydawnictwo Chemiczne, Wrocław 2009, 145-165.

[93] S. Stokłosowa: Hodowla Komórek i Tkanek, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2006.

[94] L. Scheideler, D. Geis-Gerstorfer, D. Kern, F. Pfeiffer, F. Rupp, H. Weber, H. Wolburg: Investigation of cell reactions to microstructured implant surfaces, Materials Science and Engineering C 23 (2003) 455-459.

[95] C. C. Berry, G. Campbell, A. Spadiccino, M. Robertson, A. S. G. Curtis: The influence of microscale topography on fibroblast attachment and motility, Biomaterials 25 (2004) 5781-5788.

[96] L. Bacakova, E. Filova, M. Parizek, T. Ruml, V. Svorcik: Modulation of cell adhesion, proliferation and differentiation on material designed for body implants, Biotech Adv 29 (2011) 739-767.

[97] G. Mendonca, D. B. S. Mendonca, F. J. L. Aragao, L. F. Cooper: Advancing dental implant surface technology – from micron- to nanotopography, Biomaterials 29 (2008) 3822-3835.

LITERATURA __________________________________________________________________________

123

[98] Y. Wan, Y. Wang, Z. Liu, X. Qu, B. Han, J. Bei, S. Wang: Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(L-lactide), Biomaterials 26 (2005) 4453-4459.

[99] M. Krok, R. Hess, I. Wojak, D. Kościelniak, D. Scharnweber, E. Pamuła: In vitro evaluation of poly(L-lactide-co-glicolide) membrane, Engineering of Biomaterials 94 (2010) 7-10.

[100] I. N. W Wang, W. H. Lu.: Role of Cell-Cell Interaction on the Regeneration of Soft Tissue-to-Bone Interface, 28th IEEE, EMBS Annual International Conference, NYC, USA, 30-Sept 3, 2006

[101]C. Johnen, I. Steffen, D. Beichelt, K. Brautigam, T. Witascheck, N. Toman, V. Moser, C. Ottomann, B. Hartmann, J. C. Gerlach: Culture of subconfluent human fibroblasts and keratinocytes using biodegradable transfer membranes, Burns 34 (2008) 655-663

[102] Fan H., Liu H, Toh S. L., Goh J. C. H., Enhanced differentiation of mesenchymal stem cells co-cultured with ligament fibroblasts on gelatin/silk fibroin hybrid scaffold, Biomaterials 29 (2008) 1017-1027.

resorbowalne membrany do sterowanej regeneracji tkanek

Documents

Transcript of resorbowalne membrany do sterowanej regeneracji tkanek