Resistencia a Quinolonas

Detección de resistencia a quinolonas

Luis Martínez MartínezServicio de Microbiología

Hospital Univ. Marqués de ValdecillaDpto. Biología Molecular. Univ. Cantabria

Santander

Núcleo de las Fluoroquinolonas

GRAMNEGATIVE BACTERIAGENERAL STRUCTURE

Peptidoglycan

Outer M.

PBPß-lactamase

Antimicrobial agent

PorinaPorina

LPS

Phospholipids

PhospholípidsInner M.

Cytoplasm Dianas

Periplasm

Replicación del DNA

Superenrollamiento del DNA

PREFERENCIA EN LA DIANA DE ACCIÓN DE LAS QUINOLONAS

1.- M. tuberculosis, Corynebacterium, H. pylori y T. pallidumGirasa como única diana.

2.- Bacterias que contienen DNA girasa y topoisomerasa IVA2.1.- Gram-: girasa como diana principal2.2.-Gram+: topoisomerasa IV como diana primaria(...pero depende de la quinolona y de la especie)

Mecanismos de resistencia bacteriana: quinolonas

1. Disminución de la concentracion intracelular-permeabilidad reducida y/o -bombas de expulsión activas

2. Modificación de la diana: Cambios en las topoisomerasas

3. Protección de la diana:Proteínas Qnr

4. Inactivación enzimáticaAcetilasa AAC 6’ Ib-cr

MECANISMOS DE RESISTENCIA A QUINOLONAS


1. Disminución de la concentración intracelular

Gran complejidad de mecanismosEscaso interés para investigación “habitual”Relevancia en estudios pormenorizados de

mecanismos de resistencia

Es preferible realizar estudios fenotípicos:SDS-PAGE: Análisis de OMPs (porinas)

Demostración de expulsión activa

DETECCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A QUINOLONAS

K. pneumoniae SDS-PAGE OMP

10S 810R 738R

24

20

14 6

45

36

29

66

MW

Ardanuy et al, AAC 1998

LamB

Porinas

OmpA

Detección de secuencias de inserción en el gen ompK36 de K. pneumoniae

EXPULSIÓN ACTIVA PRINCIPALES FAMILIAS

1. MFS: Major Facilitator Superfamily

2. RND: Resistance Nodulation-Division

3. SMR: Small Multidrug Resistance

4. ABC: ATP-Binding Cassette

5. MATE: Multidrug And Toxic Extrusion

SISTEMAS DE EXPULSIÓN ACTIVA

EXTERIOR

INTERIOR

EFECTO DE P.A.N. EN LA CMI DE LEVOFLOXACINO FRENTE A P. aeruginosa

CEPA PAN CMI Levofloxacino+[PAN]

0 mg/L 10 mg/L 20 mg/L

WT >512 0,125 0,015 0,008

nalB >512 2 0,125 0,03

nfxB >512 2 0,125 0,03

nfxC >512 4 0,25 0,06

Mex(*) 32 0,015 0,015 0,008

Lomovskaya O et al, AAC 2001

PROPORCIONES DE LOS VALORES DE CMI DE NORFLOXACINO MÁS OTROS COMPUESTOS FRENTE A S. aureus

S. aureus 1199B

S. aureus K1748

S. aureus K2068

NorA (+++) Exp. Act(+) NorA (-)

Exp. Act.(+) NorA (-)

Reserpina 4 1 8

Clorpromazina 4 2 8

Flufenazina 4 2 8

Tioridazina 4 2 8

Cis(Z)-flupentixol 4 1 8

Kaatz GW et al, AAC 2003

ACUMULACIÓN DE NORFLOXACINO

acu

mu

lac

ión

K23 Mutante

Doménech-Sánchez et al. Datos no publicados

SOBREEXPRESIÓN DE BOMBAS DE EXPULSIÓN ACTIVA

MUTACIONES EN GENES REGULADORES:

acrR

mexR

mexT… (Etc, Etc!)

marC marO marBmarAmarR

Mar LOCUS

Nakae, Microbiología SEM, 1997 (Mod.)

Mar Regulon

Activación de genes relacionados con la resistancia a los antimicrobianos: AcrAB, micF (ompF)


2. Modificación de la diana:

Detección de mutaciones en los genes que codifican las topoisomerasas, en particular en las llamadas regiones “QRDR” (posiciones 51-106 de GyrA).

Amplificación y secuenciación de la región QRDR de:gyrA, gyrB: Cambios en la ADN girasaparC, parE: Cambios en la Topoisomerasa IV

DETECCIÓN DE GENES DE RESISTENCIA A QUINOLONAS

En E. coli (y la mayoría de enterobacterias), los cambios más habituales ocurren en las posiciones 83 y 87 de gyrA y en las posiciones equivalente de parC. Las mutaciones en gyrB y parE tienen menor relevancia clínica

La combinación de mutaciones conduce a mayores niveles de resistencia.

Alelos que confieren resistencia a quinolonas (E. coli)

E. coli RESISTENCIA A FLUOROQUINOLONAS

STRAIN CIP gyrA parC

I113 0.015 wt wt

I114 0.06 wt wt

I87 2 Ser83 wt

I237 16 Ser83 wt

I250 8 S83L D87G S80R

I253 32 S83L D87G S80R

Everett MJ et al., AAC 1996

ACTIVIDAD DE QUINOLONASMUTACIONES EN QRDR

GyrA ParC CIPRO Ac. NAL.

Ser83...Asp87 Ser80...Glu84 <0.12 4

Phe83 ó Tyr83 0.5-4 >128

Phe83Gly87 4-16 >128

Phe83Asn87 Ile/Arg80 16->256 >1024

Gly/Lys84

Alelos que confieren resistencia a quinolonas (Gram+)

RESISTENCIA A QUINOLONAS

ORIGEN MULTIFACTORIAL

Martínez Martínez, 1996, 1998, 2003

CEPA NORFLO GyrA OMPs Exp. Activa

LB3 2 Tyr83 SI NO

LB4 4 Tyr83 NO SI

CSUB10S 4 Phe83 SI NO

CSUB10R 16 Phe83 NO SI


3. Protección de la diana: Proteínas Qnr

QnrA, QnrB, QnrS

Proteínas de pentapéptidos repetidosGenes codificados por plásmidosRelacionados con genes cromosómicos de otras bacteriasEnterobacterias/Vibrionáceas/Shewanella ¿....?

Confieren bajo nivel de resistencia

Entornos genéticos complejos


SENSIBILIDAD DE K. pneumoniae C1, C2 y C3, E. coli J53 y P. aeruginosa PU21 CON/SIN pMG252


IDENTIDAD DE AMINOÁCIDOS (%) ENTRE GENES qnr Y GENES CROMOSÓMICOS RELACIONADOS


ENTORNO GENÉTICO DE qnrA, qnrB, qnrS

http://www.pnas.org/content/vol99/issue8/images/large/pq0820928001.jpeg

PCR target Primer name Primer sequence Product size Reference

intI1 Intn1 Intn2

5’-GCG AAG TCG AGG CAT TTC TGT C-3’ 5’-ATG CGT GTA AAT CAT CGT CGT AGA GA-3’

767 bp Designed in our laboratory

intI2 IntI2-F IntI2-R

5’-TTA TTG CTG GGA TTA GGC-3’ 5’-ACG GCT ACC CTC TGT TAT C-3’

233 bp Goldstein et al. AAC. 2001 45: 723-6

intI3 HS-208 HS-207

5'-TCA GCC GGG CGA CAA GTG CA-3' 5'-TGC ATG AAC AGG TAT AAC GG-3'

1044 bp Collis et al. JB. 2002 184:3017-26

orf513 341-A 341-B

5'-CGC CCA CTC AAA CAA ACG-3' 5'-GAG GCT TTG GTG TAA CCG-3'

469 bp Sabaté et al. AAC. 2002 46: 2656-61

qnrA QP1 QP2

5’-GAT AAA GTT TTT CAG CAA GAG G-3’ 5’-ATC CAG ATC GGC AAA GGT TA-3’

543 bp Jacoby et al. AAC. 2003 47: 559-62

blaTEM TEM-F TEM-R

5'-ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG-3' 5'-CTG ACA GTT ACC AAT GCT TA-3'

868 bp Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53

blaSHV SHV-F SHV-R

5'-GGG TTA TTC TTA TTT GTC GC-3' 5'-TTA GCG TTG CCA GTG CTC-3'

931 bp Rasheed et al. AAC. 1997 41: 647-53

blaCTX-M CTX-MU1 CTX-MU2

5'-ATG TGC AGY ACC AGT AAR GT-3' 5'-TGG GTR AAR TAR GTS ACC AGA-3'

593 bp Pagani et al. JCM. 2003 41: 4264-9

blaCTX-M-9 group CTX-M9-F CTX-M9-R

5’-GTG ACA AAG AGA GTG CAA CGG-3’ 5’-ATG ATT CTC GCC GCT GAA GCC-3’

857 bp Sabaté et al. AAC. 2000 44: 1970-3

REP-PCR REP-1 REP-2

5'-III-GCG CCG ICA TCA GGC-3' 5'-ACG TCT TAT CAG GCC TAC-3'

variable size Vila et al. JMM. 1996 44: 482-9

Detección de qnrA y genes

relacionados en enterobacterias

-

Result by PCR for: Group Isolate Species Date of isolation Specimen REP-pattern IntI1 IntI2 IntI3 qnrA blaCTX-M

A O-63 O-197 O-213

C. freundii M. morganii M. morganii

2/2004 3/2004 4/2004

urine urine urine

B A A

+ + +

ND ND ND

ND ND ND

- - -

- - -

B 2312 2519

E. coli E. coli

9/2004 10/2004

urine urine

E E

+ +

ND ND

ND ND

- -

- -

C

1108 1933 2252 2539 2982 2983 700 3384 3703 365 603 1013

E. coli E. coli E. coli E. coli

E. cloacae C. freundii

E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli

5/2004 8/2004 9/2004 10/2004 11/2004 11/2004 2/2005 11/2004 12/2004 2/2005 2/2005 3/2005

urine sputum urine urine

wound wound urine urine

sputum ascitic fluid

urine urine

F G F H D C I J K L M N

+ + + + + + + - - - - -

ND ND ND ND ND ND ND - - - - +

ND ND ND ND ND ND ND - - - - -

- - - - + + - - - - - -

+ + + + + + + + + + + +

Detección de qnrA y genes

relacionados en enterobacterias

Detección de qnrS en E. cloacae

E. cloacae E. aerogenes E. cloacae E. aerogenes (N=118) (N=22) 140 (N=37) (N=25) 62

qnrS 22 (18.6%) 0 (0%) 22 (15.7%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

qnrA 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

orf513 29 (24.6%) 0 (0%) 29 (20.7%) 2 (5.4%) 0 (0%) 2 (3.2%)

intI1 58 (49.1%) 3 (13.6%) 61 (43.6%) 8 (21.6%) 2 (8%) 10 (16.1%)

SANTANDER SEVILLE

qnrS-positive isolates

isolates intI1 orf513 qnrA qnrS15 + - - +2 + + - +5 - - - +

REP-PCR pattern A B C D E

Isolates number 14 4 2 1 1

MIC nalidixic acid (mg/L) >256 (R) 8 (S) 8-16 (S) >256 (R) 32 (R)

MIC ciprofloxacin (mg/L) >32 (R) 0.38 (S) 2-4 (I/R) 3 (R) 1.5 (I)

Mutations in gyrASer83Ile (14)

Asp87Asn (1)

None None Ser83Phe None

Mutations in parCSer80Ile (2)

Not done (12)

Not done

None Not done None

REP-PCR

Detección de qnrS en E. cloacae


4. Inactivación enzimática: Acetilasa AAC 6’ Ib-cr Origen plasmídico N-acetilación del grupo amino del radical piperacinilNo compromete la actividad frente a aminoglucósidos

Afecta a ciprofloxacino y norfloxacino (pero no a otras FQ)

Moderado incremento en la CMIFavorece la aparición de mutantes más resistentes


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