Proteoglicanos heparan sulfato como reguladores de la señal del FGF2 en células endoteliales cerebrales.

• El FGF2 es un potente estimulante de la angiogénesis en procesos de cicatrización de heridas y crecimiento tumoral, ya que induce la degradación de la ME, migración y proliferación de células endoteliales y diferenciación a tubos vasculares.

• In vivo los HS se encuentran unidos covalentemente a proteínas, formando HSPG.

• Existen dos tipos, de membrana (syndecan y glypican) y secretados (perlecan).

• Las células tienen la habilidad de ajustar las cadenas de HS respondiendo a cambios ambientales.

• Alteraciones en HSPG fueron reportadas durante el proceso de malignización.

• La unión del FGF2 al receptor tyrosin kinase (FGFR) requiere la presencia de HSPG.

• El objetivo de este trabajo es examinar la contribución de los HSPGs de diferentes células cerebrales endoteliales en la señalización y angiogénesis del glioma.

Glioma:Tumor cerebral formado por el crecimiento de células anormales o proliferación incontrolada de células en el cerebro. Los tumores cerebrales primarios involucran a cualquier masa que se origina en el cerebro y no que se disemine hasta el cerebro desde otra parte del cuerpo.

Requerimiento de HS en la señalización del FGF2 en células endoteliales

• Incubación con NaCl para inhibir la sulfatación de los HS.

• Heparina y SO4 son sustitutos del HS.

• BrdUrd es requerido para la proliferación celular (mitogénesis).

• uPA es una serina proteasa que rompe coágulos de la ME facilitando la migración celular durante la angiogénesis.

Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores del FGF2.

• HSPGs fueron extraídos de diferentes tipos de CE y fueron tratadas con heparintinasa y condroitinasa para degradar secuencias de GAG.

• Corridas en SDS-page.

• MBE: 5, 7-9.

• HMVEC: 6

• HSPGs más abundantes:

Syndecan-2 (MBE, HMVEC)

Syndecan-4 (HUVEC, HSVEC)

• Menor cantidad:

Syndecan-1

Syndecan-3

• Sólo detectable en HMVEC:

Glypican-1

• Presente en todos los tipos celulares:

Perlecan

Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores del FGF2.

• HSPGs de MBE fueron fraccionados según la habilidad para unirse al FGF2, al pasar por una columna.

• El complejo (C) y el sobrenadante (S) fueron corridos en SDS-page.

• Calles: 1- control 3- HSPGs unidos al FGF2. 4 y 5- sitios de unión al FGF2 bloqueados. 6 y

7- con heparina (sustituto de HS)

Caracterización de HSPGs de células endoteliales como co-receptores del FGF2.

• Se aislaron HSPGs de MBE y se incubaron con el FGFR1c inmovilizado, en presencia o ausencia de FGF2.

• Se corrió en SDS-page.• Calles: 1-control 2- control negativo con heparitinasa. 3- control negativo sin FGF2. 4- idem control (sugiriendo que todas

las proteínas presentan secuencias HS con similar potencial para promover la unión del FGF2 al FGFR1c)

• Los complejos son resistentes a una concentración 0.6 M de NaCl pero se disocian a mayores concentraciones.

Actividad de HSPGs de diferentes células endoteliales cerebrales como promotores de la señalización del FGF2

• Células FR1c-11 con HSPGs endógeno bloqueado fueron tratadas con y sin FGF2 y con diferentes concentraciones de HSPG exógeno. Luego fueron corridas en Western blot.

• Observándose que los HSPG asociados a membrana y los extracelulares promueven la unión del FGF2 al FGFR1c de igual modo.

Reconstrucción del complejo FGF2-HSPG-FGFR1 in situ.

• Secciones congeladas de tejidos de glioma fueron primero incubadas con FGF2 y luego lavadas con proteína de fusión soluble FR1-AP.

• Rojo: complejo ternario.• Verde: células endoteliales.• Azul: núcleos.• A y E: GBM (incremento de la unión al

receptor).• B y F: control negativo (heparitinasa)• C y G: control negativo (sin FGF2)• D y H: control (células normales)• El incremento de la unión se debe al

aumento en la cantidad de HSPG, y no a la alteración de la estructura del HS.

Detección Inmunohistoquímica de las proteínas del core de HSPGs en secciones de parafina.

• Tratadas con heparitinasas: A y B.• Bajo nivel de Syndecan-4 en células normales y del glioma (C y D).• Glypican-1 es sobreexpresado en células endoteliales de vasos de gliomas (F) y

bloqueado en normales (E).• Marker de CD31 en vaso de glioma (G).• Syndecan-1 es indetectable en células normales y del glioma (H: control positivo).

Detección de las proteínas del core en glioma humano y en células normales de cerebro por inmunofluorescencia.

• Syndecan-2 es incrementado medianamente en células del glioma, en la periferia del tumor.

• Syndecan-3 es expresado moderadamente en ambos.

• Glypican-1 es abundante en células tumorales mientras que en células normales está bloqueado.

• Entonces, el Glypican-1 es el responsable de los elevados niveles de HSPG total en las células del glioma.

HSPGs fueron extraídos de células MBE tranfectadas con Glypican-1/ Syndecan-1 cDNA y células Mock. Luego corridos en SDS-page.

La sobreexpresión del Glypican-1 estimula el crecimiento de las células endoteliales y estimula la mitogénesis inducida por FGF2, la cual es independiente de la composición de la cadena de HS.

Conclusión :

• Todas las proteínas core de HSPGs de células endoteliales, presentan cadenas HS capaces de unirse al FGF2 estabilizando el complejo con el FGFR1c y activando a este receptor tyrosine kinase.

• Glypican-1, el cual es sobreexpresado en vasos del glioma, tiene la habilidad específica para sensibilizar la mitogénesis inducida por el FGF2 en células endoteliales de cerebro.

• VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y FGF2 pueden actuar sinérgicamente o tener distintos roles en el desarrollo tumoral por mostrar su actividad angiogénica en diferentes estadíos y en diferentes regiones del tumor.

• La expresión de FGF2 predomina en tumores pequeños o en la periferia tumoral, mientras, el VEGF lo hace en grandes tumores y en el centro.

• La maquinaria enzimática en el Golgi, responsable de la síntesis y modificación de HS no distingue entre diferentes proteínas core. Esto no implica que la composición de las cadenas de HS sea estática. La actividad de unión del HS cambia durante el desarrollo tumoral y la malignización.

• La sobreexpresión de Glypican-1 en células endoteliales estimula el crecimiento e induce la respuesta del FGF2, a pesar de no aumentar la cantidad total de HSPGs.

• Los sitios de unión de las cadenas HS de Glypican están localizados cerca de la membrana celular, mientras que los de Syndecan están cerca del extremo N- terminal del ectodominio variable.

• La proximidad de las cadenas de HS a la superficie celular hace de soporte en la formación del complejo ternario.

• Glypicans se distinguen de Syndecans porque su ancla a membrana es vía glicosilfosfatidilinositol.

• Glypican-1 puede suplir al FGF2 en células endoteliales de cerebro y/o la composición de HSPGs durante la angiogénesis.

• Glypican-1puede actuar como chaperona protegiendo al VEGF del daño oxidativo.

• Glypican-1 actúa como co-receptor de baja afinidad para el potente inhibidor de la angiogénesis.

• Glypican-1 sensibiliza a las células endoteliales para que el FGF2 active la angiogénesis característica de gliomas de alto grado. • Como el FGF2 es resistente a la radiación, la potenciación de esta señal de supervivencia dada por el Glypican-1 puede ser responsable de la resistencia a la radiación del glioma.

• El rol central de Glypican-1 en la señalización del FGF2 y del VEGF puede presentarse como una atractiva oportunidad para la intervención terapéutica.