Reprogramacion de Celulas Madre

REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS

MADRE

Autora: A. Vanesa Macías CañoSeminario: Dinámica celular y tisularSupervisión: Dra. Dña. Isabel Fariñas

Curso: 2010 - 2011Fecha: 16/12/10http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-

your-inner-healers

¿Qué son las células madre?

Las c. madre, también denominadas c. troncales, estaminales o en inglés c. Stem son, según el NIH

“una célula no especializada, auto-renovable, capaz de generar uno o más tipos celulares diferenciados, a esta característica se le denomina potencialidad.

I.L. Weissman. New England Journal of Medicine 346; 1576-1583, 2002http://www.ecojoven.com/uno/05/celulasm.html

http://www.macroestetica.com/articulos/perspectivas-para-el-uso-clinico-de-las-celulas-madre/

¿Qué son las células madre?

www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf

Tipos de células madre

R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567-582, 2008http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1137-

66272003000500002

Aguilera, J. J. (2004). Presente y futuro de las células troncales. Últimas investigaciones en Biología: Células madre y CélulasEmbrionarias.

Ventajas e inconvenientes de cada tipo

Células madre embrionarias

¿De dónde se obtienen c. madre embrionariarias?

De embriones sobrantes de fecundación in vitro

Producidos por transferencia nuclear somática (clonación)

Generados por partenogénesis de ovocitos animales /humanos

http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers

¿POR QUÉ EL USO DE C MADREEMBRIONARIAS = A POLÉMICA

SOCIAL ? Para obtenerlas hay que destruir un embrión humano

Importante para estudios biomédicos

Aplicaciones terapéuticas medicina regenerativa y reparadora

Problemas éticos que su utilización conlleva

Posibilidad de rentabilizar económicamente su uso

J. Rossant Cell 132, 527-531, 2008R Darabi y col. Nature Medicine 14; 134-143, 2008

M.A. Laflamme y col. Nature Biotechnology 25; 1015 – 1024, 2007

PROPUESTAS PARA LAUTILIZACIÓN CLÍNICA C. MADRE

EMBRIONARIASGeron tto de lesiones de la médula espinal

Novocell generar c. Productoras de insulina

Mytogen células epiteliales pigmentadas de retina

Nature Biotechnology 26, 598-599, 2008Soria, B. et al. (2005). Gastrointestinal Stem Cells I. Pancreatic stem cells. Am J PhysiolGastrointest

Liver Physiol, 289:177-180.

LA FDA DENIEGA LA AUTORIZACIÓN

PARA REALIZAR ESTAS EXPERIENCIAS

Las tres propuestas fueron denegadas por la FDA, objetando que antes de ensayos clínicos había que cumplimentar rigurosos controles de seguridad y

experiencias en animales

Nature Biotechnology 26, 598-599, 2008http://bodybuildingdominicano.blogspot.com/2009/11/retirada-de-suplementos-sospechosos-de.html

EXPECTATIVAS TERAPÉUTICASUTILIZANDO C. MADRE

EMBRIONARIASIneficiencia del proceso de clonación,

Falta de conocimiento de los mecanismos que regulan estos procesos,

Necesidad de terapia inmunosupresiva,

Desarrollo de teratomas

Dificultades éticas

PLoS Med 6; e1000029Nature Biotechnology 2009; 27: 213-214M. Enserink. Science 313; 160-163, 2006

“Nadie podría prometer hoy la falsedad de que con c. madre embrionarias se puede

curar a alguien inminentemente”

Alternativas para la obtención de c. madre embrionarias

ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS

MADRE EMBRIONARIASImportante problema ético

Se planteó procedimientos que no requirieran la destrucción de embriones

Consejo Asesor de Bioética propuso alternativas

Best Practical Research Clinical Obstetrics and Gynecology 18; 929-940, 2004White Paper Alternate Sources of Human Pluripotent Stem Cells.Washington DC. President’s Councel

on Bioethics. 2005http://www.wikiteca.org/celulas-madre

1. Embriones en fase muy temprana de desarrollo

2. Estructuras biológicas no embrionarias generadas por

transferencia nuclearsomática alterada (ATN)

3. Estructuras biológicas obtenidas por transferencia

nuclear somática alterada (ATN) con reprogramación

asistida del ovocito (OAR) de pseudoembriones

4. De c. madre germinales

5. De ovocitos activados por partenogénesis

6. Por fusión de núcleos de c. somáticas adultas con

c.madre

embrionarias

7. Por reprogramación de c. somáticas

adultas

Alternativas

Ventajas e inconvenientes

Aguilera, J. J. (2004). Presente y futuro de las células troncales. Últimas investigaciones en Biología: Células madre y CélulasEmbrionarias.

Obtención de c.madre ≈ a las c. m. embrionarias por reprogramación directa de c. adultas

Reprogramación de c. adultas


C. Madre. Pasado y futuro


Reprogramación de células

adultas animales

K. Takahashi y S. Yamanaka. Cell 126; 652-655, 2006


adultas animales

J. Yu y col. (grupo Thomson). Science 318; 1917-1920, 2007http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-

healersK. Takahashi y col. (grupo Yamanaka). Cell 131; 861-872, 2007

Confirman las experiencias realizadas en animales por Takahashi y Yamanaka

Confirman las anteriores experiencias y además consiguen producir quimeras ya que si son inyectadas en blastocistos murinos pueden generar embriones vivos

Reprogramación de c.adultas animales

M. Wernig y col. Nature; 318-324, 2007

N. Maherali y col. Cell Stem Cell 1; 55-70, 2007

Pero el paso de las experiencias animales a humanos no parecía fácil

Así, Janet Rossant se preguntaba:

“¿Serán eficientes los mismos mágicos factores moleculares

para generar células iPS humanas?


J. Rossant. Nature 448; 260-262, 2007http://homepage.mac.com/femtobio/plexus/C1766198132/E1670782726/index.html

Las células iPS generadas muestran:

expresión génica y modelos de metilación

muy parecidos a los de las c. madre embrionarias,

crecen internamente mientras expresan

telomerasa,

tienen un cariotipo normal

forman teratomas si se trasplantan a ratones inmunosuprimidos


Ch.E. Murry y G. Keller. Cell 132; 661-680, 2008http://es.wikipedia.org/wiki/Cariotipo

2007, tras la reprogramación celular en animales por Takahasi y Yamanaka, se consigue: la reprogramación de c. adultas humanas.


adultas humanas

M Evans y col Nature 292; 154-156, 1981JR Martin PNAS 78; 763-7638, 1981

JA Thomson y colScience 282; 1145-1147, 1998

Experiencias de los grupos de Yamanaka y Thomson

Thomson pensaba que la posibilidad de reprogramar células adultas humanas tardaría al menos 20 años

Por ello, cuando se logró la reprogramación de células adultas humanas:

“No podíamos creer que la reprogramación fuera tan fácil”

B Goldman Nature Reports Stem Cells DOI: 10.1038/stemcells.2008.67http://cenizaenlosbolsillos.blogspot.com/2009/11/preambulo-las-instrucciones-

para-dar.html

Genes reprogramadores¿Cuántos genes se requieren para obtener

las células iPS?

Takahasi y Yamanaka partieron de 24 genes reprogramadores

Cell 126; 663-676, 2006R. Jaenisch y R. Young Cell 132; 567-582, 2008

Yamanaka et al, Vol 448| 19 July 2007| doi:10.1038/nature05934http://cordis.europa.eu/fetch?CALLER=NEWSLINK_ES_C&RCN=31158&ACTION=D

IH Park y col. Confirman a Takahasi y Yamanaka

derivan células iPS de c. adultas, especialmente de

fibroblastos de fetos neonatos y sujetos adultos, utilizando los cuatro mismo

genes reprogramadores

Similitud entre las c. iPs y las c. embrionarias

humanasBiológicamente no hay diferencias entre las células iPS y las embrionarias humanas

Para confirmarlo producción de embriones humanos por clonación a partir de las c. iPS

Éticamente no es posible llevarlo a cabo

Genes reprogramadoresEl Oct4 es altamente

específico para las células pluripotentes

Los otros tres factores se expresan en otras células:

Sox2 en células madre neurales y células progenitoras

Klf4 en células de piel, estómago, intestino y músculo esquelético

c-Myc se expresa aleatoriamente

El gen que parece no poder ser reemplazado

es el Oct4

Nakagawa et al (Yamanaka) Nature Biotechnology 26; 101-106, 2008


Kim et al han demostrado que se pueden conseguir células iPS reprogramando células madre

neurales utilizando como factor de trascripción únicamente el Oct4

Genes reprogramadores

Kim et al Cell 136; 411-419, 2009ScienceDaily.com, 24/05/2010

http://www.monografias.com/trabajos60/linaje-dopaminergico/linaje-dopaminergico.shtml

Ramón y Cajal, ref. 3www.imediapr.es/ranf-documentos_files/monografia-celulas-madre.pdf

Generación de c. iPS a partir de

fibroblastos de piel humana

diferenciación a todo tipo de

tejidos pluripotencialidad


WE Lowry y col. PNAS 105; 2883-2888, 2008

Interés por la reprogramación c.

Interés clínico y experimental que tienen las c. iPS, numerosos laboratorios han iniciado trabajos destinados a obtenerla.

Melina Fan (Addgene) distribuye los vectores virales utilizados por Yamanaka y Thomson, y a fecha de 2008, habían recibido:

704 peticiones, de 178 laboratorios el vector viral utilizado por Thomson

514 de 131 laboratorios del vector utilizado por Yamanaka para la transferencia de los factores de trascripción a células humanas,

más de 1500 peticiones procedentes de 232 laboratorios del vector utilizado para la transferencia a células murinas

Nature Reports Stem Cells DOI: 10.1038/stemcells.2008.67

Importancia de la reprogramación c.

Science ha calificado esta técnica como el descubrimiento científico del año 2008 por:

• la utilidad en la investigación de enfermedades

• la probable utilización en la medicina regenerativa y reparadora

Science 322; 1767-1773, 2008http://iss.schoolwires.com/coddlecreek/site/default.asp

Inconvenientes técnicos

Posibilidad de transmisión de enfermedades virales

Posibilidad de producir tumores

Posibles introducción del DNA de los genes reprogramadores en las c. receptoras integración genómica aleatoria mutagénesis

Aunque los genes reprogramadores son tras la reprogramación posible activación epigenética de Oct-4 y Sox2 efectos no deseados en las c. iPS transferidas

MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008

Problemas a resolver

Técnicos:

Sustituir los vectores virales

Sustituir el oncogén c-Myc

Biológicos:

Conocer mejor los mecanismos de la

reprogramación celular, especialmente si es

debida a:

1. modificaciones epigenéticas

2. modificaciones genéticas todavía no identificadas

J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/therapy?show=all

Problemas resueltoso Yamanaka, en tres meses, consigue:

reprogramar hepatocitos y c. de epitelio de gástrico sin utilizar el c-Myc, tanto en humanos como en ratones, sin que se generaran tumores

o Utilización de vectores virales Aoki y col, comprueban que al reprogramar c. de estómago e hígado murinas, estos no alteran su genoma

o Stadtfeld y col: consiguen introducir los FT utilizando vectores virales que no se integran en el genoma de las c. receptoras

Evitan la formación de tumores y las alteraciones génicas Consiguen derivar c. de músculo, sistema nervioso, corazón y pulmón Posible aplicación en ensayos clínicos con humanosN. Nakagama y col. Nature Biothecnology 26; 101-106, 2008

T. Aoki y col. Science: DOI 10.1126 / science 1154884 (14 – 2 – 2008)M Stadtfeld y col. Science: DOI 10.1126 / science 1162494

Ac anti c-Myc

Obtención de c. iPS sin integración del genoma viral

Generan células iPS a partir de:

o Hepatocitos de ratón utilizando adenovirus para transferir factores reprogramadores

o Fibroblastos de embriones de ratón utilizando plásmidos

o Utilizando un único vector policistrónico no vírico obtenido a partir de un plásmido que favorece la expresión de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc

o Se pueden sustituir por nanotubos de carbono, ya que permiten introducir proteínas complejas (hasta 12) en c. testiculares y de retina

Reticencias de expertos, pues no han sido publicadas en una revista científica de garantía

Algunos indican que su introducción en las c. puede tener efectos tóxicos hasta la muerte

o Reemplazarlos introduciendo directamente los factores reprogramadores con ciertos aminoácidos unidos, lo que les permite penetrar las membranas celulares

o También utilizando pequeñas moléculas no proteícas que remeden la actividad de los factores de trascripción y que puedan penetrar las membranas celulares

Okita et al (Yamanaka) Science 322; 949-953, 2008Kaji et al Nature DOI: 10.1038/nature 07864, 2009

B Goldman Nature Reports Stem Cells DOI: 101038/stemcells.2008.671st May 2008

Obtención de c. iPS utilizando compuestos químicos

o Químicos que pueden reemplazar uno o dos genes reprogramados

Huangfu et al Nature Biotechnology 26; 1269-1275, 2008PNAS 106; 8912-8917, 2009

Shi et al Cell Stem Cell 2; 525-528, 2008Cell Stem Cell 3; 346-353, 2008

o Moléculas que inhiben el ácido valpróico e inducen reprogramación utilizando solo Oct4 y Sox2

o Otra molécula, el kenpaullné, puede sustituir el Klf4

Obtención de c. iPS utilizando pequeñas moléculas

Obtención de células iPS utilizando:o Vectores episomales que no se integran en el genoma. Así, la célula iPS

generada queda libre de secuencias transgénicas extrañas

o Utilizan doxyciclina para potenciar vectores víricos (lentivirus) y usan la recombinasa Cr/LoxP para eliminar los restos trangénicos que se hayan podido insertar

Jaenisch (MIT) la utiliza para mejorar la técnica y conseguir c. iPS de 2ª generación. Las c. obtenidas tienen una gran homogeneidad genética uso clínico

o Utilizan plásmidos del tipo piggy Bac

Ventajas del uso de iPsNo rechazo inmunológico

Fármacos específicos /paciente

No usa ovocitos humanos

Facilidad técnica

Coste reducido

Aplicaciones

Para estudios experimentales sobre la diferenciación celular y para valorar posibles diferencias entre células normales y patológicas

Para su uso en la medicina regenerativa

Podrían suplir información que ahora proporcionan las células madre embrionarias en investigación y en medicina MF Pera Nature 451; 135-136, 2008

http://www.scientificamerican.com/

article.cfm?id=interactive-your-inner-healers

Reprogramación directa de c. adultas

El equipo dirigido por D Melton

ha conseguido reprogramar células exocrinas del páncreas en células beta productoras de insulina

Con esta técnica se evita el paso intermedio de convertir la célula adulta en una célula pluripotencial

Los factores de trascripción que utilizan son el Ngn3, Pdx1 y Mafa

Nature DOI: 10.1038/nature 07314

¿Puede el uso de iPS innecesario el uso de c. madre embrionarias?

Hyun: Sería un importante error llegar a la conclusión de que la obtención de las células iPS evita la necesidad de usar células madre embrionarias

La investigación con células iPS debería continuar junto con la investigación con células madre embrionarias

D Melton: Es prematuro afirmar esto

GQ Daley: En el momento actual no estamos seguros de que las células iPS sean absolutamente equivalentes a las células madre embrionarias

K Egan: Para estar seguro de la utilidad de las células iPS se necesita hacer un gran número de experiencias con células iPS de diferentes individuos y compararlos con células madre embrionarias

I Hyun y col. Cell Stem Cell 1; 367-368, 2007CI-Hyun Park. Hastings Center Report 38; 20-22, 2008

BM Kuehn JAMA 299; 26, 2008 Holden y G Vogel Science319; 560-563, 2008

Preclínica: ratones con

anemia falciforme

Se obtienen c. somáticas de ratones con anemia falciforme tras la corrección de la anomalía genética se generan células iPS

A partir de ellas se generan c. madre hematopoyéticas normales que se reinyectan, consiguiendo mejorar su clínica

Hanna J et al Science 318; 1920-1923, 2007

Demuestran que iPS se pueden diferenciar en c. madre precursoras neurales que en cultivo puede generar c. neurales o de glia

Si las c. generadas se transfieren al cerebro de fetos de ratones, migran a distintas regiones y se diferencian en glia y neuronas

También iPS se diferencian a neuronas dopaminérgicas. Se mejoran los síntomas del Parkinson

Preclínica: ratones con Parkinson

M Wernig y col PNAS 105; 5856-5861, 2008http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=interactive-your-inner-healers

Preclínica: injerto de piel


Resultados obtenidos de c. iPS derivadas de

diferentes patologíasDesde fibroblastos de una mujer de 82 años que padecía una ELA, células iPS y diferenciarlas a neuronas motoras

También se han podido derivar células iPS en pacientes con distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, diabetes mellitus tipo 1, síndrome de Down y síndrome de Lesch-Nyhan...

En 2009 se logró también obtener células iPS de pacientes con anemia de Fanconi las c. somáticas previamente tratadas con terapia génica para corregir su defecto genético, por lo que las células iPS producidas podían ser transplantadas

Raya A, et al. Nature 2009; 460: 53-59Park I H, et al. Cell 2008; 134: 877-886

Dimos J, et al. Science 2008; 321: 1218-1221.

Creación de SV a partir. iPS

Dos grupos de investigadores chinos han logrado producir ratones vivos:

Uno lo consiguió a partir de la producción de blastocistos tetraploides a los que se habían previamente transferido las células iPS

Zhao y col han logrado producir ratones vivos a partir de líneas de células iPS generadas de fibroblastos de piel.

A partir de los ratones producidos 2ª generación de ratones vivos que tenían las características genéticas del ratón del cual se habían derivado las células iPS

Boland M, et al. Nature 2009; 461 91-94Zhao X, et al. Nature 2009; 461:86-9

Kang L, et al. Cell Stem Cell 2009; 5: 135-138

ConclusiónA pesar de todas las controversias, no cabe duda de que la utilización de células madre en el futuro ha despertado unas enormes expectativas.

Bien como:

materia prima para terapia regenerativa de enfermedades hasta ahora incurables como la enfermedad de Parkinson, diabetes o enfermedades cardíacas crónica

vehículo de terapia génica,

sólo hemos empezado a imaginar las posibilidades terapéuticas de las c. madre.

Es fundamental recordar que para que las c. madre se trasformen en una realidad terapéutica es imprescindible:

investigación rigurosa y estricta que nos permita llegar a conclusiones.

a pesar de la presión social

imprescindible que ni los científicos, ni los políticos, ni los periodistas ni la sociedad en general levanten expectativas que lejos de la realidad, llevaran a la frustración y desencanto de los enfermos.

PREGUNTAS

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Bibliografía

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