Direccionamiento de fenotipo de microglas en un modelo de EAE y evaluacin de su rol en soporte de remielinizacin

Direccionamiento de fenotipo de microglas en un modelo de EAE y evaluacin de su rol en soporte de remielinizacin

Estudiante: Mara Marisela Snchez-Chaparro, 353836Supervisor: Estudiante de PhD Ilia D. Vainchein; Dr. H.W.G.M. Boddeke

Diciembre 2011 Marzo 2012

Departamento de Neurociencias, Universidad de GroningenUMCG Groningen, Los Pases Bajos

TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN 1

INTRODUCCIN 2

MATERIALES Y MTODOS 7Induccin de EAE 7Anlisis de Expresin de Genes 7Aislamiento y tamizaje por FACS de microglas/macrfagos

RESULTADOS 8

DISCUSION 11

REFERENCIAS13

APPENDICES15Apndice I: Protocolos 15Apndice II: Anlisis Estadstico19

ABSTRACT

Esclerosis mltiple es una enfermedad inflamatoria, crnica y autoinmune del SNC y afecta solamente a humanos. Se caracteriza por condiciones desmielinizantes seguido por la eliminacin de neuronas. La remielinizacin es un proceso compensatorio que ayuda a mitigar el dao. Este proceso falla o no se lleva a cabo cuando la inflamacin se vuelve crnica. Las microglas son clulas inmunes del SNC. Participan en el proceso de la fagocitosis y se les compara con los macrfagos perifricos. Normalmente, estas clulas han sido identificadas como precursores de procesos neuroinflamatorios. Sin embargo, existen repores de que las clulas microgliales estn involucradas en los procesos tempranos de remielinizacin, ayudando a las clulas precursoras de oligodendrocitos (OPC). Un modelo de cuprizona en ratones fue desarrollado anteriormente y sugiere que la microglas presenta un fenotipo capaz de inducir o dar soporte en procesos remielinizantes. Nuestro objetivo fue investigar un fenotipo de microglas en EAE, un modelo mimtico de EM durante fases primarias de desmilinizacin. Analizamos mRNA de microglas/macrfagos. Nuestras evidencias indican un fenotipo que est influenciando remielinizacin y sugiete que la microglas se involucra en fagocitosis, inflamacin y estimulacin de procesos en OPC, que son necesarios para desarrollar hiperplasia en oligodendrocitos y mejorar OPC. Este estudio ayuda a conocer ms acerca del papel de las clulas microgliales como soporte homeosttico en mecanismos estabilizadores.

Palabras claves: Microglas, fenotipo, remielinizacin, modelo EAE, EM.

INTRODUCCIN

Esclerosis mltiple (EM) es una enfermedad autoinmune, crnica e inflamatoria caracterizada por desmielinizacin y degeneracin axonal (Glas et al., 2010). Tiene sntomas desestabilizantes como alteracin sensorial, neuritis ptica, discapacidad motriz, ataxia, disfuncin de la vejiga, dficit cognitivo y fatiga (Green et al. 2010).

EM es la causa ms importante de discapacidad neurolgica en adultos jvenes entre los 20 40 aos, afectando principalmente a mujeres (3-2:1), y tiene una prevalencia de 260 por cada 100,000 habitantes en Reino Unido (Hirts, 2008). Esta enfermedad resulta de la interaccin entre factores ambientales an no identificados, y la susceptibilidad gentica (Compston, 2002). Hasta la fecha no se conoce una cura para EM y los tratamientos intentan restablecer las funciones despus de un ataque, prevenir nuevos ataques y discapacidad, pero hasta ahora, no se ha desarrollado una terapia exitosa debido a que los mecanismos de la enfermedad an no son comprendidos del todo.

EM se caracteriza por periodos de recada-remitencia seguidos por una fase progresiva, la cual es dirigida por el sistema inmune adaptativo y estn involucradas clulas T cooperadoras (Th) tipo 1 (Th1), Th17 y CD8 que se infiltran al SNC y provocan un ataque. Estas clulas estn moduladas por regulacin de clulas T y B. La infiltracin de clulas T inicia una cascada de seales, causada por un epitope que provoca nuevos ataques y adems activa el sistema inmune innato como microglas, clulas dendrticas, astrocitos, etc. (Vigletta, 2004; Lassmann et al., 2001).

Usualmente, cuando el dao y la inflamacin pasan, la remielinizacin puede llevarse a cabo como parte de mecanismos de reparacin y homeostasis; no obstante, si la inflamacin se vuelve crnica, este procesos se afecta resultando en nuevos sntomas que derivan en degeneracin axonal y la subsecuente desaparicin de neuronas (Glass et al. 2010).

Este procesos se ha visto en varias citocinas inflamatorias que se producen de manera previa por clulas del sistema inmune perifrico y las residentes del SNC, como la microglas activada, que promueve procesos de inflamacin, que mediante el cual rutas de sealizacin son activadas y que finalmente resultan en la sntesis de autoanticuerpos dirigidos a las vainas de mielina que luego destruyen y producen la prdida de sta (Zindler and Zipp, 2010).

La remielinizacin es ms activa durante los procesos de inflamacin aguda y fases progresivas y coincide con la remocin fagoctica de restos de mielina (Williams, 2007). Las clulas precursoras de oligodendrocitos (OPCs) no diferenciados estn alrededor de las lesiones de MS y adems actan como fuente de clulas que tienen un potencial de restablecer axones (Chandran, 2008). En teora, el proceso de remielinizacin falla debido a una deficiencia en el restablecimiento y/o diferenciacin de OPCs, este ltimo proceso es el ms complicado de realizar y por lo tanto el ms susceptible a fracasar. (Franklin, 2008). Se sabe que las clulas OPC pueden la capacidad y habilidad de convertirse en oligodendrocitos maduros que son las clulas reparadoras del SNC y son el producto final del linaje celular. Este proceso est sujeto a una compleja y precisa sincronizacin de procesos como proliferacin, migracin, diferenciacin y mielinizacin para producir vainas de mielina en axones que sean capaces de reparar los sitios daados. Sin embargo, la manera en cmo se realiza el proceso de remielinizacin no es claro. (Lully, 2010).

Las neuronas son clulas que no pueden dividirse o ser reemplazadas, por lo tanto requieren un sistema de defensa que las proteja contra patgenos y que adems acte despus de un dao y ayude a restablecer el SNC. Este trabajo es realizado por el grupo de clulas gliales, compuesto por la macroglia (astrocitos, oligodendrocitos y polidendrocitos) y microglas (Ransohoff and Cardona, 2010). A principios del siglo XIX, Cajal describi la existencia de un tercer elemento adems de neuronas y neuroglia, (Kaur, et al, 2001), subsecuentemente del Ro-Hortega identific dentro de este elemento dos tipos de clulas, nombrndolas oligodendroglia y microglas, las cuales estn diferenciadas una de otra por su morfologa externa as como su origen embrionario (del Ro-Hortega, 1932). Cabe sealar que el origen del desarrollo de las microglas han sido tema de debate por muchos aos y ste tiene 3 principales teoras acerca del origen de estas clulas (1) mesodermal, (2) neuroectodermal, y (3) monoctico (revisado por Tambuyer, 2009). Actualmente, la mayora de las investigaciones soportan la hiptesis de que las microglas son un linaje derivado de clulas mieloides-monocticas y/o precursores hematopoyticos (Chan et al 2007).

Las microglas constituyen entre 5-20% del total de poblacin de clulas gliales dentro del SNC, encontradas en la materia gris que en materia blanca (Lawson, 1992), y estn distribuidas en regiones como hipocampo y el tlamo dorsal en el desarrollo del CNS (Perry, 1993). Las clulas microgliales se distribuyen en hipocampo y cerebelo en ratn (Jinno, 2007) y pueden permanecer quiescentes largo tiempo, pero cambian su comportamiento en respuesta a diferentes seales del medio ambiente celular, de un estado inactivo a uno activo que es estrictamente controlado por la secrecin de productos como citocinas, aminocidos excitatorios y radicales libres. Mediante este proceso, las microglas pueden comunicarse con otras clulas del cerebro y del sistema inmunolgico. Este proceso se denomina como plasticidad de desarrollo (revisado por Tamboyuzer, 2009).

Frecuentemente, las microglas se comparan con los macrfagos porque ambas son atrados por factores quimiotcticos end- y exgenos, tienen la capacidad de migrar hasta sitios de daos o infeccin en el SNC (Hanisch, 2001), y representan una defensa esencial y un sistema de reparacin (Lawson, 1992). Ellas se comportan como clulas de primera lnea de defensa y realizan procesos de fagocitosis, adems son conocidas por su funcin como fagocitos transitorios responsables de la limpieza de cuerpos celulares neurales en estado apopttico durante la ontogenia del SNC (Stolozing, 2004). El papel de las microglas endgena es proteger la integridad de tejidos, realizando una exhaustiva vigilancia y respondiendo efectivamente sobre seales de alerta. (Nimmerjahn et al. 2005). No obstante, la importancia del proceso de fagocitosis en varias patologas neurolgicas es un tema controvertido.

Pese a que las microglas pueden capturar, procesar, y presentar la mielina como antgeno, las investigaciones no han demostrado precisamente stas sean un factor clave para iniciar el proceso de desmielinizacin en EM. En ausencia de inflamacin linfocitaria en no autoinmune contexto, los agentes patgenos asociados con la aparicin de la inflamacin, las clulas microgliales protege compartimento neuronal (Remington et al. 2007). Sin embargo, este proceso se invierte tanto en los Estados miembros y que la microgla activada y los macrfagos derivados de la periferia se mueven hacia un fenotipo pro-inflamatorias, debido a que la participacin de las citocinas como el TNF- e IL-1 que induce la inflamacin y sustancias neurotxicas, incluyendo xido ntrico (NO), las especies reactivas del oxgeno (ROS) y las enzimas proteolticas (Ransohoff de 2009, Vogt et al., 2009).

Aunque las clulas microgliales pueden capturar, procesar y presentar la mielina como un antgeno, las investigaciones no han probado que exactamente stas son un factor clave de iniciacin de procesos desmielinizantes de EM. En ausencia de inflamacin linfoctica en un contexto no autoinmune, la patognesis asociada al inicio de la inflamacin, las microglias protegen el compartimento neuronal (Remington et al. 2007). Sin embargo, este proceso se revierte tanto en EM y en las microglias activadas y los macrfagos derivados del sistema perifrico se mueven hacia un fenotipo pro-inflamatorio, debido a que se involucran citocinas como TNF- y IL-1 que indicen sustancias inflamatorias y neurotxicas, incluyendo xido ntrico (NO), especies reactivas de oxgeno (ROS) y enzimas proteolticas (Ransohoff, 2009, Vogt et al., 2009).

La infiltracin de macrfagos y clulas dendrticas dirigidas dentro del SNC han sido considerados como procesos necesarios y la activacin simultnea o subsecuente de las microglas, son un resultado de la interferencia inmune con infiltracin de clulas inmunolgicas a travs de quimiocinas y sealizacin de IL (Carson, 2002; Raivich yd Banati, 2004, Becher et al, 2006).

Encefalomielitis alrgica experimental (EAE) sirve como un modelo animal para EM, y desde la primera vez que fue descrito por Rivers in 1933, ste ha sido desarrollado de manera mimtica con todas las caractersticas clnicas de EM, incluyendo formas como las de remitencia-recurrencia, progresiva, y ptico-espinal, as como otras formas espontneas (Lassman, 2007). La mayora de los tratamientos para EM han basados en estudios de modelos de EAE, as como conceptos bsicos de procesos autoinmunes que son relevantes para esta enfermedad humana (Steinman, 2006). Diferentes cepas de roedores son genticamente susceptibles a los componentes de la mielina, y EAE se activa mediante la inmunizacin de la mielina, las protenas asociadas, tales como la glicoprotena de mielina de oligodendrocitos (MOG) o protena bsica de mielina (MBP), as como otros inductores (Wekerle, 2008).

Debido a la etiologa compleja de la EM y que ste se considera que slo afectan a los humanos, es difcil desarrollar un modelo animal nico para imitar exactamente la condicin y los sntomas de los pacientes con esta patologa, diferentes modelos animales se han desarrollado las distintas especies animales que se centran en los aspectos de la enfermedad. Los sntomas y la susceptibilidad dependen del tipo de la inmunizacin, ya sea por la estimulacin inmune, viral o qumica, y la cepa o especie de usar, ya que no funcionan todos los antgenos de mielina en todas las cepas tipos de roedores, y combinaciones diferentes que son capaces de reflejar un subtipo especfico de EM (Gao y Tsirka, 2011).

EAE ha recibido la mayor atencin como un modelo de esclerosis mltiple y es habitualmente utilizado en el ensayo de estrategias teraputicas para la EM. Esta enfermedad presenta muchas caractersticas clnicas e histolgicas de la esclerosis mltiple y es causada por la induccin de la autoinmunidad a los antgenos que se encuentran de forma natural o artificial (como el implantado micobacterias o la ovoalbmina que, despus de la sensibilizacin perifrica a estos antgenos, permite a los locales de las lesiones especficas que se desarroll) expresados en el SNC (Owen, 2006). Despus de la sensibilizacin a los antgenos de mielina, los animales desarrollan la enfermedad caracterizada por parlisis de las extremidades. EAE se asocia con disfuncin de la barrera hematoenceflica, la infiltracin de clulas mononucleares en la CNS y bloqueo de la conduccin que resulta en la neurotransmisin alterada. Esto puede suceder en ausencia de la desmielinizacin y pone de manifiesto una idea falsa de los muchos que EAE se debe a la destruccin de la mielina. En algunos modelos de enfermedad tambin se asocia con una prdida significativa axonal, que es la causa subyacente de la incapacidad persistente (Lavi, 2005).

Cepas como ratones Biozzi ABH y SL mice, cepas de ratas DA y cepa 13 de cobayos desarrollan EAE con recadas despus de haber inmunizado con mielina completa, mientras que los ratones C57BL/6 son relativamente resistentes. Sin embargo, MOG es capaz de inducir EAE con parlisis crnica, incluyendo en C57BL/6 (Revisado por Baker, 2011). El modelo de cuprizona (CPZ) es usado para una desmielinizacin txica en ratones jvenes que se alimentan con un quelante de cuprizona de cobre, lo que lleva a la muerte de oligodendrocitos y luego una desmielinizacin reversible, pero que es posible realizar un proceso de remielinizacin 4 das despus si los ratones no se alimentan de este compuesto. La ingestion de cuprizona en ratones induce una desmielinizacin altamente reproducible de las regiones cerebrales distintas, entre ellas del cuerpo calloso, que representa la zona ms frecuentemente investigada de la materia blanca en este modelo animal. Estos modelos reflejan cada uno de los diferentes aspectos de la patologa de la EM y son los actuales estndares aceptados de oro para el modelado de la enfermedad (Zhang, 2011). Sin embargo, CPZ, as como otros modelos de inductores qumicos neurotxicos (o biolgicos) no se comparan con la EAE, ya que stas no se desarrollan bajo las caractersticas autoinmunes (Moreno, 2012).

Olah et al. (2012) han obtenido recientemente los datos de un modelo de desmielinizacin en CPZ inducida en ratones que muestran que microglas locales exhiben un fenotipo de apoyo de la remielinizacin y que este fenotipo se expresa ya en los primeros signos de desmielinizacin debido a que no encontraron evidencia que apoya la idea de que hay microglas fenotipos desmielinizantes. El fenotipo observado durante la remielinizacin desarrollado durante el curso de la desmielinizacin y persisti en la remielinizacin.

Los patrones de expresin de la mayora de los genes mostraron todo el proceso de desmielinizacin y remielinizacin fue uniforme, incluyen genes asociados con el complejo MHC-II. Otro aspecto encontrado por esta investigacin fue un fenotipo que apoya la diferenciacin de oligodendrocitos porque genes como PDGFA, PDGFB, VEGF, Vegfb, TGFb1, IGF1, y SPP1 se encontraron sobreregulados. Estos y otros resultados sugieren que las clulas microgliales puede jugar un papel de apoyo en la induccin de una remielinizacin. (Olah et al., 2012). Sin embargo, el modelo de CPZ permite la remielinizacin por s mismo, por lo que es necesaria una evaluacin en el modelo de EAE, porque este es un modelo mimtico a la EM.

En este estudio nuestro objetivo fue identificar el direccionamiento de fenotipo en microglas en un modelo de ratn para EM (EAE), y tambin encontrar un fenotipo capaz de apoyar el proceso de remielinizacin, proinflamatorio, y el fenotipo de la infiltracin de macrfagos perjudiciales en el tejido de la mdula espinal, que por lo tanto, no dara un mejor entendimiento del comportamiento de microglas y su papel de proteccin hacia el SNC, lo que podra ayudar a desarrollar nuevos tratamientos dirigidos a incrementar o estimular la remielinizacin de las vainas de mielina.MATERIALES Y MTODOS

Induccin de EAE El manejo del ratn y los experimentos se llevaron a cabo en estricta conformidad con la prctica de buen animal como se define en la normativa nacional y / o los organismos locales de proteccin de los animales, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el Comit Institucional de Empleo y Cuidado de Animales de la Universidad de Groningen. EAE se indujo la utilizacin activa de una mezcla de la glicoprotena de mielina de oligodendrocitos (MOG) 3555 (MEVGWYRSPFSRVVH LYRNGK) y toxina de pertussis (PTX). Esta emulsin fue sintetizada por Hooke Laboratories (Hooke Kit MOG35-55/CFA Emulsion PTX EK-0113). El procedimiento para inducir EAE se realiz siguiendo el instructor por el fabricante (Apndice 1.1). Un total de 10 ratones hembra, cepa C57BL/6JOla se utilizaron en este experimento, comprende 5 jaulas, cada una con dos ratones. Los signos de la enfermedad fueron controlados como se describe: 0, no hay cambios evidentes: 1, cola inerte; 2, cola flcido y alteracin del movimiento; 3, la cola flcido y una parlisis parcial de las patas traseras; 4, cola flcido, parlisis completa de las patas traseras; 5, tetraplejia; 6, muerte. Los ratones fueron sacrificados a una puntuacin de 3-4.

Anlisis de expresin de genes En resumen, el ARN total se aisl a partir microglas utilizando un protocolo basado en fenol / cloroformo (Apndice 1.2). Descripcin detallada de la RT-qPCR ensayo se indica en el apndice 1.3. La calidad y cantidad de ARN se comprob con el Nanodrop. Las muestras con resultado Nanodrop en la relacin A260/280 con 1.9-2.1 se utilizaron para el anlisis de la expresin gnica. Los genes de inters fueron analizados CD74, CD80, CD86, IL-1, TNF, Pdgfa, ApoE, TGF, Cxcl16, Spp1 y Lgals3 en ambos tipos celulares; CD40, y Il4ra fueron evaluados solo en macrfagos. Los resultados se normalizaron comparando con HMBS y HPRT1. La descripcin y anlisis estadsticos se realizaron Minitab v 16 y Prims GraphPad 5. ANOVA de un factor y la comparacin de Tukey se calcularon para encontrar significativa diferencia.

Aislamiento y FACS de microglas/macrfagosLos ratones fueron anesteciados con una mezcla de pentobarbital de sodio y fenitoina de sodio (Euthasol VIRBAC AH, Inc.) por inyeccin intraperitoneal y se perfundieron con solucin salina helada al 0.9%. Despus de la perfusin, se extrajeron la mdula espinal y el cerebro y se colocaton en medio A. Los tejidos fueron homogenizados en este mismo medio con un mortero de vidrio y se realiz el procedimiento de aislamiento (Apndice 1.4). La suspensin celular se incub con los anticuerpos de citometra de flujo anti-CD11b PE (eBioscience; Cat. No. 12-0112) y anti-CD45 FITC (eBioscience; Cat. No. 11-0451) por 15 min en hielo y lavados con medio A sin color. Subsecuentemente, las clulas microgliales y macrfagos se separaron por medio de un separador celular usando el canal para los perfiles de microglia de CD11b high/CD45.

RESULTADOS

Determinacin de perfil de expresin genticoEl patrn de expresin gentica en nuestro modelo de EAE evaluado fue determinado comparando los puntajes 0 y 4 de discapacidad, tanto en microglas y macrfagos (Tabla 1). Las clulas microgliales mostraron incremento en la expresin de CD74, as como en CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2) pero en estas dos ltimos resultados, resultaron ser altamente significativo (p 0.005) se muestra en un color caracterstico.