RENDIMIENTO Y CALIDAD DE ÁCIDO CARMÍNICO DE Dactylopius ...

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RENDIMIENTO Y CALIDAD DE ÁCIDO CARMÍNICO DE Dactylopius coccus Costa EN DIFERENTES ALTURAS DE LA NOPALOTECA

YIELD AND QUALITY OF CARMINIC ACID OF Dactylopius coccus Costa IN DIFFERENT HEIGHT LEVELS OF THE NOPALOTECA

José Rodolfo Zacarías-Alvarado1, Clara Lourdes Tovar-Robles1, Santiago de Jesús Méndez-Gallegos1*, Rafael Magallanes-Quintanar2, Gildardo Aquino-Pérez1

1Innovación en Manejo de Recursos Naturales. Campus San Luis Potosí. Colegio de Postgra-duados. 78622, Salinas de Hidalgo, San Luis Potosí, México. ([email protected]). 2Univer-sidad Autónoma de Zacatecas, Unidad Académica de Ingeniería Eléctrica. Avenida Ramón López Velarde, 801, 98064, Zacatecas, Zacatecas, México.

RESUMEN

Dactylopius coccus es un insecto de importancia comercial como fuente de un colorante natural denominado ácido carmínico. Para su producción comercial en cautiverio, se ha promovido la cría en cladodios suspendidos a diferentes alturas, en un sis-tema denominado “nopaloteca”. Sin embargo, se desconoce si su calidad y rendimiento es uniforme en los diferentes niveles. El objetivo de este estudio fue determinar la influencia de la al-tura del nivel en una “nopaloteca” y el índice de cosecha en la concentración de ácido carmínico (CAC, %) y peso fresco (PF, g) de D. coccus. La crianza del insecto se realizó en una “nopa-loteca” de madera (3x3 m), con cuatro niveles de altura (0.5, 1.0, 1.50 y 2 m). Durante el ciclo de cultivo se registró cada día la temperatura, la humedad relativa y la intensidad luminosa. Las hembras adultas se recolectaron en dos etapas del desarrollo: pre y postoviposición. La CAC más alta (19.2%) se obtuvo en 1.0 m de altura, aunque este nivel registró el PF más bajo con 3.5 g por cladodio, que expresa una correlación negativa entre la CAC y el PF. La recolecta en postoviposición generó una CAC superior (18.8%), aunque el PF se redujo. Tanto la humedad re-lativa (HR) como la iluminación total, pero principalmente la temperatura que incidió en cada nivel, influyeron en la calidad y el rendimiento de D. coccus, aunque de manera diferencial sobre ambos factores, lo cual indica la presencia de límites óptimos de desarrollo. Bajo las condiciones del estudio, el sistema de cría en “nopaloteca” produjo en promedio 4.5 g de cochinilla por cladodio y una CAC de 17.5%. Los niveles evaluados causaron diferencias en rendimiento y calidad, pero sus valores más altos

* Autor para correspondencia v Author for correspondence.Recibido: junio, 2019. Aprobado: febrero, 2020.Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 54: 705-716. 2020.

ABSTRACT

Dactylopius coccus is an important insect for commerce, as the source of a natural dye called carminic acid. For its commercial production in captivity, rearing has been promoted in cladodes suspended at different heights in a system called “nopaloteca”. However, it is unknown whether insect quality and yield vary at different levels. The objective of this study was to determine the influence of height level in a “nopaloteca” and the harvest index of carminic acid concentration (CAC, %) and fresh weight (FW, g) of D. coccus. Insect rearing was carried out in a wooden “nopaloteca” (3x3 m) with four height levels (0.5, 1.0, 1.50 and 2 m). During the culture cycle, temperature, relative humidity, and luminous intensity were measured daily. Adult females were collected in two development stages: pre- and post-oviposition. The highest CAC (19.2%) was obtained at 1.0 m high, although at this level the lowest FW was recorded, 3.5 g per cladode, which expresses a negative correlation between CAC and FW. Post-oviposition harvest generated a higher CAC (18.8%), although FW decreased. Relative humidity and total illumination, but mainly temperature at each level, affected quality and yield of D. coccus, though the two factors were affected differentially, indicating the presence of optimal limits for development. Under the conditions of this study, the “nopaloteca” rearing system produced an average of 4.5 g cochineal per cladode and a CAC of 17.5%. The levels evaluated caused difference in yield and quality, but the highest values were registered in the intermediate levels (1.0 and 1.5 m). The recommended harvest index to obtain more CAC was the post-oviposition phase.

Key words: Dactylopius coccus, cochineal, harvest index, rearing, prickly-pear cactus.

AGROCIENCIA, 1 de julio - 15 de agosto, 2020

VOLUMEN 54, NÚMERO 5706

se registraron en los niveles intermedios (1.0 y 1.5 m). El índice de cosecha recomendado para obtener mayor CAC fue la etapa de postoviposición.

Palabras clave: Dactylopius coccus, cochinilla, índice de cosecha, cría, nopal.

INTRODUCCIÓN

La cochinilla Dactylopius coccus Costa (Hemip-tera: Dactylopiidae) es un insecto originario de regiones tropicales y subtropicales de Amé-

rica (Müller-Maatsch y Gras, 2016), en particular de México y Perú, y es un parásito específico de especies de Nopalea Salm-Dyck y Opuntia Mill (Chávez-Mo-reno et al., 2009). Este insecto sintetiza un glucósido antraquinónico denominado ácido carmínico (AC) como defensa (Dettner, 2014). Por su estabilidad y capacidad de coloración se emplea en cosméticos, pinturas, biomedicina, alimentos y bebidas (Müller-Maatsch y Gras, 2016). El uso de AC y sus derivados está autorizado por la mayoría de los organismos re-guladores que evalúan inocuidad y riesgo de los aditi-vos alimentarios en el mundo. La Agencia de Drogas y Alimentos (FDA, por sus siglas en inglés) de EE. UU., les reconoce como Natural Red 5, y la Unión Europea les asignó el código E120 (EFSA, 2015).

Ahora, D. coccus está distribuida en 15 países, ya sea introducida o naturalizada (Chávez-Moreno et al., 2009). Aunque su sistema de cultivo varía en cada país y región (Müller-Maatsch y Gras, 2016) la crianza se puede realizar bajo dos modalidades: a cielo abierto y en condiciones semicontroladas (Aldama-Aguilera et al., 2005). Sólo en España, Chile, Bolivia, Etiopia y Perú la cría es a cielo abierto (Anculle et al., 2017), al disponer de condiciones agroecológicas para su desarrollo óptimo. En México, las precipita-ciones altas, temperaturas extremas, vientos fuertes y radiación alta, así como la presencia de enemigos naturales limitan su crianza a campo abierto (Alda-ma-Aguilera et al., 2005). Derivado de lo anterior, se han desarrollado e implementado alternativas para su cría masiva, las cuales incluyen desde estructuras de materiales rústicos, hasta invernaderos con cubiertas de vidrio o plástico.

Entre los sistemas de producción probados con éxito destacan las “nopalotecas”, las cuales reducen el impacto de los factores físicos y biológicos que limi-tan el desarrollo al insecto. Este sistema se probó en

INTRODUCTION

Cochineal, Dactylopius coccus Costa (Hemiptera: Dactylopiidae), is an insect native to the tropical and subtropical

regions of America (Müller-Maatsch and Gras, 2016), particularly Mexico and Peru. It is a specific parasite of species of Nopalea Salm-Dyck and Opuntia Mill (Chávez-Moreno et al., 2009). This insect synthesizes an anthraquinone glycoside called carminic acid (CA) as a defense mechanism (Dettner, 2014). Because of CA stability and dying capacity, it is used in cosmetics, paints, biomedicine, food, and beverages (Müller-Maatsch and Gras, 2016). Use of CA and its derivatives is authorized by most regulating organisms worldwide that evaluate the safety and risk of food additives. The US Food and Drug Administration (FDA) recognizes it as Natural Red 5, and the European Union assigned it the code E120 (EFSA, 2015).

Dactylopius coccus is now distributed in 15 countries, introduced, or naturalized (Chávez-Moreno et al., 2009). Although the system varies in each country and region (Müller-Maatsch and Gras, 2016), rearing has two modalities: in the open and in semi-controlled conditions (Aldama-Aguilera et al., 2005). Only in Spain, Chile, Bolivia, Ethiopia, and Peru rearing is done in the open (Anculle et al., 2017) because they have agroecological conditions for optimal development. In Mexico, high precipitation, extreme temperatures, strong winds and high radiation, as well as the presence of natural enemies, limit rearing in the open (Aldama-Aguilera et al., 2005). For this reason, alternatives for mass rearing have been developed and implemented. These alternatives vary from structures made of rustic materials to greenhouses with glass or plastic covering.

Among the proven successful production systems, the “nopalotecas” are outstanding. The system reduces impact of physical and biological factors that limit the insect development. It has been tested in Argentina (Alonso et al., 2013) and Peru (Hernández et al., 2017), and it is now protected by the Spanish Office of Patents and Trademarks (Oficina Española de Patentes y Marcas-OEPM, 2019) with the registration number 2 351 752. Despite the viability of the system, few studies have confirmed whether the CA concentration (CAC) and yield are uniform throughout the levels of the “nopaloteca”, since

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Argentina (Alonso et al., 2013) y en Perú (Hernán-dez et al., 2017) y está protegido desde el 2011 por la Oficina Española de Patentes y Marcas (OEPM, 2019) con Registro 2 351 752. A pesar de la viabi-lidad del sistema, hay pocos resultados de investiga-ción para confirmar si la concentración de AC (CAC) y el rendimiento, son uniformes en todos los niveles de la “nopaloteca”; ya que la distribución espacial de la temperatura, humedad relativa y la cantidad de luz, inciden de forma heterogénea de acuerdo con la altura en que se ubiquen los niveles para colocar cladodios.

Entre los factores que influyen en la CAC y el ren-dimiento de D. coccus destacan la edad y el estado nu-tricional del cladodio, así como la especie o cultivar del nopal hospedante (Méndez-Gallegos et al., 2010), cantidad y tipo de luz (Tello y Vargas, 2015), tempe-ratura, humedad relativa y la densidad de población del insecto en el cladodio (Rodríguez et al., 2005). Aunque el AC está presente en todas las etapas de desarrollo (Briseño-Garzón y Llanderal, 2008) exis-ten contradicciones respecto al índice de cosecha que produzca una mayor CAC. Müller-Maatsch y Gras (2016) recomendaron cosechar cuando las hembras son oviplenas (justo antes de la oviposición), mien-tras que Flores-Alatorre et al. (2014) afirmaron que se debe realizar después del periodo de oviposición.

A nivel internacional el precio de la cochinilla fluctúa constantemente porque su valor tiene relación directa con la CAC (Flores-Alatorre et al., 2014), y hay productores dedicados a la comercialización de producto fresco, como pie de cría. Por lo tanto, es importante mantener y aumentar estas variables pro-ductivas para hacer más eficiente el sistema de cría. El objetivo del estudio fue determinar la influencia de la altura del nivel en la “nopaloteca” y el índice de cosecha en pre y postoviposición, sobre la calidad, en función de la CAC (%) y el peso fresco (PF, g) de D. coccus, que permitan optimizar su manejo en cautive-rio. La hipótesis fue que alguno de los cuatro niveles evaluados o fase de desarrollo, o ambos, produce con-centración de AC y peso fresco mayores.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ubicación del sitio de estudio

La investigación se realizó de mayo a diciembre de 2018 en las instalaciones del Colegio de Postgraduados, Campus San Luis Potosí (22° 37’ 55.66” N, 101° 42’ 42.96” O, y altitud de 2078 m)

spatial distribution of temperature, relative humidity, and light are heterogeneous depending on the height at which the cladodes are placed.

Outstanding among the factors that affect CAC and D. coccus yield are cladode age and nutritional status, as well as the species or cultivar of the hosting pear cactus (Méndez-Gallegos et al., 2010), quantity and type of light (Tello and Vargas, 2015), temperature, relative humidity and insect population density in the cladode (Rodríguez et al., 2005). Although CA is present in all the insect development stages (Briseño-Garzón and Llanderal, 2008), there are some contradictions regarding the harvest index that produces more CAC. Müller-Maatsch and Gras (2016) recommend harvesting when the females are full of eggs (just before oviposition), while Flores-Alatorre et al. (2014) assert that harvest should take place after oviposition.

Internationally, the price of cochineal fluctuates constantly because its value has a direct relationship with CAC (Flores-Alatorre et al., 2014), and there are producers that commercialize it fresh, as rearing stock. Therefore, it is important to maintain and increase these production variables to make the rearing system more efficient. The objective of the study was to determine how height of the level in the “nopaloteca” and the harvest index in pre- and post-oviposition affect quality in function of CAC (%) and fresh weight (FW, g) of D. coccus, with the aim of optimizing its management in captivity. The hypothesis was that one of the four levels evaluated or the development phase, or both, produce higher CA concentration and fresh weight.

MATERIALS AND METHODS

Location of the study site

The study was conducted from May to December 2018 in the facilities of the Colegio de Postgraduados, Campus San Luis Potosí (22° 37’ 55.66” N, 101° 42’ 42.96” W, altitude 2078 m) in a glass greenhouse with a north-south orientation. The greenhouse was shaded with Spanish white (calcium hydroxide and water 2:1 v:v) to reduce light intensity on the “nopaloteca” during the day and conserve heat during the night.

Seed insects and host

In this study, 300 g of egg-filled females were used as biological material for initial propagation; these were provided



en un invernadero de cristal con orientación norte-sur, el cual se sombreó con blanco de España (hidróxido de calcio y agua 2:1 v:v) para reducir la intensidad luminosa sobre la “nopaloteca” en el día y conservar el calor durante la noche.

Simiente y hospedante

En este estudio se usaron 300 g de hembras oviplenas como material biológico para la propagación inicial, proporcionados por la empresa GranaZac S.P.R.R.L. (Villanueva Zacatecas, México). Como substrato alimenticio se emplearon 120 clado-dios de Opuntia ficus-indica (L.) Mill. cv Villanueva, de entre 10 y 12 meses de edad. Estos se cepillaron con cuidado, antes de la infestación, para remover polvo y residuos, y prevenir la inciden-cia de inmaduros de cochinilla silvestre (D. opuntiae).

Técnica de propagación artificial

Para realizar la infestación los cladodios se distribuyeron ho-rizontalmente en el piso y sobre éstos se colocaron dos tamices (40x40 cm); en cada tamiz se dispusieron 150 g de adultas grá-vidas (Figura 1A). A fin de obtener cladodios con densidad y distribución inicial homogénea de la progenie y tener cohortes de la misma edad, los cladodios con ninfas neonatas se sustituyeron cada dos días por cladodios nuevos. Después éstos se colgaron de manera invertida (acropétala), en el nivel respectivo dentro de la “nopaloteca” (Figura 1B). Los cladodios se colgaron de la base por medio de un gancho de alambre galvanizado calibre 12, para facilitar y asegurar la suspensión.

Sistema de cría

El sistema de crianza empleado fue el de “nopaloteca”. Ésta es una estructura de madera (9 m2) dividida en cuatro niveles de altura, con una separación de 0.50 m (el nivel 1 se ubicó a

A) B)

Figura 1. A) Infestación artificial de D. coccus B) Disposición de cladodios infestados en la estructura de la “nopaloteca”.Figure 1. A) Artificial infestation of D. coccus B) Arrangement of infested cladodes in the “nopaloteca” structure.

by the enterprise GranaZac S.P.R.R.L. (Villanueva Zacatecas, Mexico). The feed substrate was 120 Opuntia ficus-indica (L.) Mill. cv Villanueva pear cactus cladodes 10 and 12 months old. These were brushed carefully before infestation to remove dust and residues and to prevent incidence of immature wild cochineal (D. opuntiae).

Artificial propagation technique

For infestation, the cladodes were distributed horizontally on the floor and covered with two meshes (40x40 cm); on each mesh 150 g of pregnant females were spread out (Figure 1A). In order to obtain initial homogeneous density and distribution of the progeny and to have cohorts of the same age, the cladodes with neonate nymphs were substituted every two days. These new cladodes were then hung upside down (acropetal) in the respective level in the “nopaloteca” (Figure 1B). The cladodes were hung from their base using a galvanized wire hook (caliber 12) to facilitate and assure suspension.

Rearing system

The rearing system used was the “nopaloteca”. This is a wooden structure (9 m2) divided into four height levels, with a separation of 0.50 m (level 1 was 0.50 m above the ground and level 4 was 2.0 m high). The structure was placed in the center of the greenhouse to assure the same conditions throughout.

Experimental procedure

Effect of level height and harvest index on concentration of carminic acid and D. coccus fresh weight.

For determining whether temperature, relative humidity and quantity of light affect CAC and D. coccus yield, in the central



0.50 m del suelo y el nivel 4 a 2.0 m). La estructura se colocó en el centro del invernadero para asegurar que recibiera las mismas condiciones.

Procedimiento experimental

Influencia de la altura del nivel y del índice de cosecha so-bre la concentración de ácido carmínico y peso fresco de D. coccus

Para determinar si la temperatura, humedad relativa y can-tidad de luz influyen en la CAC y rendimiento de D. coccus, se colocó en la parte central de cada nivel de la “nopaloteca” un sensor HOBO Pro v2 temp/RH onset USA®, con el cual se hizo un registro de temperatura (°C) máxima, promedio y mínima (TMAX, TPROM, TMIN) y de humedad relativa (%) máxima, promedio y mínima (HRMAX, HRPROM, HRMIN). Las lec-turas se tomaron cada hora durante todo el ciclo biológico de D. coccus. La iluminación (lux) se cuantificó con un fotómetro EXTECH Instruments (Nashua, USA)® a las 09:00 h, 15:00 h y 18:00 h, un día por semana, la cantidad diaria cuantificada se acumuló durante todo el ciclo de desarrollo y se registró como iluminación total (ILTOTAL), para lo cual se tomaron lecturas de referencia en cada nivel, con el cuidado de realizarlas en el mismo punto siempre.

Para definir el índice de cosecha con la mayor CAC y ren-dimiento de D. coccus, se seleccionaron dos etapas de desarro-llo: preoviposición y postoviposición. En la preoviposición se seleccionaron 15 cladodios de cada uno de los cuatro niveles (60 cladodios en total); se cosecharon a mano, con un pincel 73 d después de la infestación, cuando en promedio 5% de las hembras iniciaron la reproducción. Las hembras grávidas se re-colectaron en un tamiz y se registró su peso fresco (PF, g) en una balanza analítica Explorer Pro® (NJ, USA) d=1/0.1 mg. Después, se colocaron en frascos de vidrio de 14 x 3.5 cm, los cuales se identificaron de acuerdo con el nivel de procedencia y luego se introdujeron en un congelador Maytag® a -10 °C por 3 d, para su sacrificio. Posteriormente, los insectos se sometieron a un proce-so de secado natural dentro del invernadero durante 10 d (40.1, 19.6 y 28 °C, de temperatura máxima, mínima y promedio, respectivamente), removiendo los frascos dos veces por día para evitar su compactación.

En la segunda fase evaluada (postoviposición) se recolectaron las hembras contenidas en 15 cladodios restantes de cada nivel (60 cladodios en total), según el procedimiento para el secado ya señalado. El índice de cosecha fue el fin del periodo reproductivo (~130 d después de la infestación).

part of each level of the “nopaloteca” a sensor (HOBO Pro v2 temp/RH onset USA®) was placed to record maximum, average and minimum temperature (°C) (TMAX, TPROM, TMIN) and maximum, average and minimum relative humidity (%) (HRMAX, HRPROM, HRMIN). Readings were taken every hour during the entire biological cycle of D. coccus. Illuminance (lux) was quantified with an EXTECH Instruments® (Nashua, USA) photometer at 0.900 h, 15:00 h and 18:00 h, one day a week. The daily quantified amount was accumulated during the entire development cycle and registered as total illumination (ILTOTAL). Reference readings were taken in each level, taking care that it was always at the same point.

To define the harvest index with the highest CAC and D. coccus yield, two development stages were selected: pre-oviposition and post-oviposition. In pre-oviposition, 15 cladodes were selected from each of the four levels (60 cladodes total), and the cochineal was harvested manually with a paint brush 73 d after infestation when an average of 5% of the females began reproduction. These females were collected in a mesh and their fresh weight (FW, g) was recorded using an analytical balance Explorer Pro® (NJ, USA), d=1/0.1 mg. They were then placed in 14 x 3.5 cm glass jars, which were labeled by level and killed by placing them in a Maytag® freezer at -10 °C for 3 d. Later, the insects were subjected to a process of natural drying in the greenhouse for 10 d (40.1, 19.6 and 28 °C, maximum, minimum and average temperatures, respectively), shaking the jars twice a day to prevent compaction.

In the second evaluated phase (post-oviposition), the females contained in the 15 remaining cladodes of each level (60 cladodes total) were collected and subjected to the drying procedure described above. The harvest index was the end of the reproductive period (~130 d after infestation).

Determination of carminic acid

The females from the 15 cladodes corresponding to each level and of the two development stages were combined in a compound sample. Thus, there were a total of eight samples with 70 to 80 g of fresh cochineal. Once dried, each sample was ground in a Wiley mini Mill® (3383-L10 115 V, 60 Hz (Thomas Scientific Swedesboro, NJ 08085-0099-U.S.A.), which reduced them to particles that would sieve through a 40 mesh.

CAC was determined by the method proposed by Briseño-Garzón and Llanderal (2008). In a precipitation beaker, 100 mg of ground cochineal was mixed with 30 mL hydrochloric acid (HCl 2N). The mixture was boiled for 10 min and gauged to 1000 mL with distilled water; the entire sample was



Determinación de ácido carmínico

Las hembras de 15 cladodios correspondientes a cada nivel y de las dos etapas de desarrollo se conjuntaron en una mues-tra compuesta. Así hubo ocho muestras en total con 70 a 80 g de cochinilla fresca. Una vez secas, cada muestra se pulverizó en un molino Wiley Mini Mill® (3383-L10 115 V, 60 Hz (Thomas Scientific Swedesboro, NJ 08085-0099-U.S.A.), que las redujo a partículas de tamiz malla 40.

La CAC se determinó por el método propuesto por Briseño-Garzón y Llanderal (2008). En un vaso de precipitado se coloca-ron 100 mg de cochinilla molida, se agregaron 30 mL de ácido clorhídrico (HCl 2N) y se mezclaron. La mezcla hirvió por 10 min, se aforó a 1000 mL con agua destilada y se filtró toda la muestra para desechar los primeros 200 mL. El resto se usó para determinar la absorbancia a 494 nm en un espectrofotómetro GENESYS 10S VIS Thermo Scientific®. La CAC se calculó al sustituir los valores de la absorbancia en la ecuación de una curva de calibración realizada con AC al 90% de pureza (SIGMA®). Para cada muestra compuesta de D. coccus, se realizó la cuantifi-cación por triplicado y se tomaron 10 lecturas de cada una.

Análisis estadístico

Con los datos se realizó un ANDEVA para determinar dife-rencia entre tratamientos (niveles y etapas de desarrollo), y en el caso de los niveles, las covariables fueron la temperatura, hume-dad relativa e iluminación, sobre las variables de CAC (%) y PF (g). El diseño experimental fue completamente al azar, con 15 repeticiones y la unidad experimental fue un cladodio. Para de-terminar diferencias estadísticas entre medias se usó la prueba de Tukey (p£0.05). Asimismo, se realizó un análisis de correlación simple (r, coeficiente de Pearson) entre tratamientos, variables de respuesta y covariables. El proceso estadístico se realizó con el sistema R Versión 3.5.1 (R Core Team, 2018).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Influencia de la altura del nivel y la fase de de-sarrollo de D. coccus sobre la concentración de

ácido carmínico (CAC)

En la concentración de ácido carmínico (CAC) en D. coccus, criada bajo el sistema de “nopaloteca” en condiciones semicontroladas, influyeron altura del nivel (gl=3, f=48.36, p£0.01), temperatura prome-dio (gl=1, f=27.34, p£0.01) y fase de desarrollo en que se cosechó (gl=1, f=311.30, p£0.01). La CAC mayor (19.2%) se registró en el nivel 2, a 1.0 m de altura, el cual tuvo diferencia estadística con la CAC

filtered, and the first 200 mL was discarded. The rest was used to determine absorbance at 494 nm in a GENESYS 10S VIS Thermo Scientific® spectrophotometer. CAC was calculated by substituting the absorbance values in the equation of a calibration curve constructed with 90% pure CA (SIGMA®). Each compound sample of D. coccus was quantified in triplicate and 10 readings were taken.

Statistical analysis

An ANOVA was performed on the data to determine differences between treatments (levels and development stages). In the case of levels, the covariables were temperature, relative humidity and illumination over the variables CAC (%) and FW (g). The experimental design was completely randomized with 15 replications, and the experimental unit was one cladode. To determine statistical differences between means, the Tukey test (p£0.05) was used. Also, a simple correlation analysis (r, Pearson coefficient) was performed for treatments, response variables and covariables. The statistical process was carried out with R Version 3.5.1 (R Core Team, 2018).

RESULTS AND DISCUSSION

Influence of level height and development phase of D. coccus on carminic acid concentration (CAC)

The carminic acid concentration (CAC) in D. coccus reared in the “nopaloteca” system in semi-controlled conditions was affected by level height (df=3, f=48.36, p£0.01), average temperature (df=1, f=27.34, p£0.01) and the development phase in which it was harvested (df=1, f=311.30, p£0.01). The highest CAC (19.2%) was found in level 2 at 1.0 m high and was statistically different form the CAC obtained in the other three levels. In contrast, the lowest average value (16.7%) was obtained in level 4 (Figure 2).

This trend contrasts with the results of Alonso et al. (2013), who recorded a higher CAC (17.5%) at 1.5 m, but it decreased at lower levels (16.9% at 1.0 m and 16.5% at 0.5 m); however, they tested three level instead of four. The behavior registered in our study could be associated with the cement floor used in the greenhouse. This type of floor causes an effect of radiation-convection of light and temperature at the lowest level, different from the effect of “Ground Cover” mesh floors.

International norms for classifying cochineal quality is diverse, and each enterprise that acquires



obtenida en los otros tres niveles; en contraste el valor promedio más bajo (16.7%) se obtuvo en el nivel 4 (Figura 2).

Esta tendencia contrasta con los resultados de Alonso et al. (2013) quienes registraron la CAC más alta en 1.5 m con 17.5%, pero disminuyó conforme la altura del nivel se redujo (16.9% a 1.0 m y 16.5% a los 0.5 m); aunque ellos probaron tres niveles, en lugar de cuatro. El comportamiento registrado en nuestra investigación podría asociarse con el piso de cemento usado en el invernadero de nuestro estudio. Este tipo de piso causa un efecto de radiación-con-vección de la luz y la temperatura en el nivel más bajo que difiere del obtenido en los invernaderos con piso de malla “Ground Cover”.

La normativa internacional para clasificar la cali-dad de la cochinilla es diversa, y ahora cada empresa adquiere el producto y establece su precio en fun-ción del contenido de AC, como criterio principal. En nuestra investigación, las CAC obtenidas en los niveles del 1 al 3 fueron superiores a las registradas por Alonso et al. (2013) en los mismos niveles de altura, pero son similares a las obtenidas en otros sis-temas de producción. Por ejemplo, Méndez-Gallegos

Figura 2. Concentración de ácido carmínico (CAC) en dos etapas de desarrollo de D. coccus criada en “nopaloteca” con cuatro niveles de altura.

Figure 2. Carminic acid concentration (CAC) in two development stages of D. coccus reared in a “nopaloteca” with four height levels.

Niveles de altura

21

18

15

N1 N2 N3 N4

Ácid

o C

arm

ínic

o (%

)

PostoviposiciónPreoviposición

Etapa

the product establishes its price in function of the content of CA, as the principal criterion. In our study, the CAC obtained in levels 1 to 3 were higher than those reported by Alonso et al. (2013) at the same height levels but similar to those obtained in other production systems. For example, Méndez-Gallegos et al. (2010) reported that CAC oscillated between 15 and 19% in the laboratory. In the same conditions in Chile, Rodríguez et al. (2005) found average values of 16.9% to 19.1% in two rearing stations. Moreover, Aldama-Aguilera et al. (2005) obtained 19.4% in a micro-tunnel covered with transparent plastic during the period from August to December.

Each height level evaluated in the “nopaloteca” had its particular climatic conditions, although only temperature had a higher degree of influence in CAC (p£0.0001). According to Campos Figueroa and Llanderal-Cázares (2003), this rearing system provides suitable conditions for establishment and development of the insect because it enables management of temperature oscillations (maximum 31 °C, minimum 12 °C and mean 20 °C), RH (95%) and ventilation. In this respect, Rodríguez et



et al. (2010) registraron que la CAC osciló entre 15 y 19%, en condiciones de laboratorio. En las mismas condiciones en Chile, Rodríguez et al. (2005) encon-traron valores promedio de 16.9% a 19.1% en dos estaciones de crianza. Además, Aldama-Aguilera et al. (2005) obtuvieron 19.4% en microtúnel con plás-tico transparente en el periodo de agosto-diciembre.

Cada nivel de altura evaluado en la “nopaloteca” presentó condiciones climáticas particulares, aunque sólo la temperatura influyó en mayor grado sobre la CAC (p£0.0001). De acuerdo con Campos-Figue-roa y Llanderal-Cázares (2003) este sistema de cría proporciona condiciones adecuadas para el estableci-miento y desarrollo del insecto, porque permite ma-nejar las oscilaciones de temperatura (máxima 31 °C, mínima 12 °C y media 20 °C), HR (95%) y ventila-ción. Al respecto, Rodríguez et al. (2005) demostra-ron que tanto la temperatura, como el fotoperiodo son factores considerados influyentes sobre la CAC.

La CAC más alta (p£0.05) se obtuvo en la fase de postoviposición con 18.8% y en preoviposición el valor promedio fue 16% (p£0.05), ambos con diferencia estadística (Figura 2). En el índice de co-secha hubo resultados contrastantes. Rodríguez et al. (2005) encontraron que las hembras recolectadas en preoviposición, tuvieron una CAC promedio de 18%, pero Flores-Alatorre et al. (2014) observaron que hembras recolectadas en fase post reproducti-va y hembras adultas estériles más pequeñas (CAC, 26.27%) producían concentraciones mayores de AC.

De manera similar, Aldama-Aguilera et al. (2005) observaron CAC de 19.4 a 22.9% en hembras reco-lectadas 15 d después de iniciada la reproducción. En hembras recolectadas cuando el 50% inició la ovi-posición, la CAC fue 23.6% con 16 h de luz (Tello y Vargas, 2015). Lo anterior sugiere que entre más tiempo se mantengan las hembras de D. coccus en re-producción sobre el cladodio, la CAC aumenta hasta en 3.8%. Sin embargo, lo anterior requiere obtener cosechas cada 120 d; es decir, solo tres de las cuatro esperadas por año (Campos-Figueroa y Llanderal-Cázares, 2003).

Influencia de la altura del nivel y de la fase de desarrollo sobre el peso fresco de D. coccus

Los factores que influyeron en el PF (g) de D. coccus fueron altura del nivel (gl=3, f= 17.57, p£0.0001), fase de desarrollo (gl=1, f=47.61,

al. (2005) demonstrated that both temperature and photoperiod are factors considered to affect CAC.

The highest CAC (p£0.05) was obtained in the post-oviposition phase, 18.8%, compared with the pre-oviposition phase with an average value of 16% (p£0.05); the two values are statistically different (Figure 2). Rodríguez et al. (2005) found that females collected in pre-oviposition had an average CAC of 18%, but Flores-Alatorre et al. (2014) observed that females collected in the post-reproductive stages and smaller sterile adult females produced higher concentrations of CA (CAC, 26.7%).

Likewise, Aldama-Aguilera et al. (2005) observed CAC of 19.4 to 22.9% in females collected 15 d after initiating reproduction. In females reared with 16 h of light and collected when 50% had initiated oviposition, CAC was 23.6% (Tello and Vargas, 2015). This suggests that the longer D. coccus females remain in reproduction on the cladode, when D. coccus females remain in production longer on the cladode, CAC can increase by up to 3.8%. However, this requires harvesting every 120 d, that is, only three of the four expected harvests per year (Campos-Figueroa and Llanderal-Cázares, 2003).

Effect of height level and of development phase on D. coccus fresh weight

The factors that influenced D. coccus FW (g) were level height (df=3, f=17.57, p£0.0001), development phase (df=1, f=47.61, p£0.0001), average temperature (df=1, f=192.70, p£0.0001) and maximum temperature (df=1, f=7.90, p£0.01). Contrary to the behavior of CAC, level 2, 1 m high, had the lowest value of FW (3.5 g per cladode), while the highest value was recorded in level 3, 1.5 m high, with 4.9 g per cladode. It is worth mentioning that at this level, besides the highest value of FW, an adequate value of CAC was also obtained (Table 1).

The FW values obtained in our study were lower than those reported by Alonso et al. (2013), who also underlined that yield in function of FW per cladode decreases as the height of the level increases. In this respect, Campos-Figueroa and Llanderal-Cázares (2003) did not observe differences in FW among the three levels they tested, but they obtained a higher yield of fresh cochineal per cladode (7.8 g). The values obtained in our study (2.5 g) were higher than those reported by Tovar et al. (2005).



p£0.0001), temperatura promedio (gl=1, f=192.70, p£0.0001) y temperatura máxima (gl=1, f=7.90, p£0.01). Contrario al comportamiento observado en CAC, el nivel 2 ubicado a 1 m de altura obtuvo el valor más bajo de PF (3.5 g por cladodio); mientras que el valor más alto se registró en el nivel 3, a 1.5 m, con 4.9 g por cladodio. Cabe señalar que en este nivel también se obtuvo un valor apropiado de CAC y el PF mayor (Cuadro 1).

Los valores de PF obtenidos en nuestro estudio fueron inferiores a los reportados por Alonso et al. (2013) quienes además destacaron que el rendimien-to, en función del PF por cladodio, disminuye con-forme la altura del nivel es mayor. Al respecto, Cam-pos-Figueroa y Llanderal-Cázares (2003) no observa-ron diferencias respecto a PF entre los tres niveles que probaron, pero obtuvieron un rendimiento más alto de cochinilla fresca por cladodio (7.8 g). Los valores obtenidos en nuestro estudio (2.5 g) fueron mayores a los de Tovar et al. (2005).

Rodríguez et al. (2005) determinaron que la cochinilla con PF mayor presentó una CAC más baja, aunque pueden deponer un número mayor de huevos, lo cual supone una relación inversa entre la CAC y la fecundidad. Esta relación además sugiere la existencia de un compromiso fisiológico entre la asignación de recursos a reproducción o a defensa. La tendencia también podría estar relacionada a que un PF mayor brinda mejor protección a las ninfas “migrantes” para su establecimiento y desarrollo, en detrimento de la CAC. De manera similar, Méndez-Gallegos et al. (2010) determinaron que la cohorte con los valores de crecimiento poblacional más altos produjo la CAC más baja.

Otro aspecto importante es la competencia in-traespecífica, porque una reducción del número de insectos en la superficie del cladodio podría reflejar-se en un aumento de la CAC, como mecanismo de defensa (Aldama-Aguilera et al. 2005). Asimismo, se podría interpretar que al recibir poca luz las condicio-nes son adecuadas para la fijación y el desarrollo de D. coccus, pero hay un efecto negativo en la CAC, al reducirse la tasa fotosintética del hospedante (Nobel, 1998). De acuerdo con lo anterior, las diferencias en el PF de D. coccus se podrían atribuir a la distribución espacial de la iluminación y humedad relativa, pero principalmente de la temperatura en los niveles de la “nopaloteca”.

Cuadro 1. Valores promedio de peso fresco (g) de D. coccus criada en cuatro niveles de altura en “nopaloteca”.

Table 1. Average values of fresh weight (g) of D. coccus reared in four height levels in a “nopaloteca”.

Niveles y altura (m) Peso fresco (g)

1 (0.5 m) 4.8 a†

2 (1.0 m) 3.5 b 3 (1.5 m) 4.9 a4 (2.0 m) 4.4 a

†Valores promedio con letra diferente indican diferencia estadís-tica (Tukey, p£0.05). v Average values with different letters are statistically different (Tukey, p£0.05).

Rodríguez et al. (2005) determined that cochineal with the highest FW had the lowest CAC, even though they can have more eggs, which assumes an inverse relationship between CAC and fecundity. This relationship also suggests the existence of a physiological compromise in terms of resource allocation to reproduction or defense. The trend may also be related to better protection that a higher FW offers to the “migrant” nymphs for establishment and development, in detriment of CAC. Likewise, Méndez-Gallegos et al. (2010) determined that the cohort with the highest population growth values produced the lowest CAC.

Another important aspect is intraspecific competition. A reduction in the number of insects on the surface of the cladode could be reflected in an increase in CAC, as a defense mechanism (Aldama-Aguilera et al., 2005). It could also be interpreted that, receiving little light, the conditions are adequate for establishment and development of D. coccus. But there is a negative effect on CAC when the host photosynthetic rate decreases (Nobel, 1998). It follows that the differences in D. coccus FW can be attributed to spatial distribution of illumination and relative humidity, but mainly of temperature, in the levels of the “nopaloteca”.

The FW obtained in this study in the pre-oviposition phase was high (4.9 g per cladode); this is associated with the weight of the eggs contained in the females. In contrast, those that concluded the reproductive process had only 3.9 g per cladode. This implies taking advantage of the reproductive process to obtain progeny for a successive generation of D.



El PF obtenido en este estudio en la fase de preo-viposición fue superior (4.9 g por cladodio), lo cual se asocia con el peso de los huevos contenidos en las hembras. En contraste, aquellas que concluyeron el proceso reproductivo tuvieron solo 3.9 g por clado-dio. Lo anterior implica que se puede aprovechar el proceso de reproducción para obtener progenie para una generación sucesiva de D. coccus y al mismo tiempo generar una CAC mayor. Los valores prome-dio de PF en nuestro estudio fueron bajos en com-paración a los 9.6 g de cochinilla fresca obtenidos en estudios en Perú con este mismo sistema (Hernández et al., 2017). El análisis de correlación (Pearson) se mostró signi-ficativo sólo para PF y CAC, lo cual indica que a me-nor peso fresco del insecto la CAC es más alta (Cua-dro 2); un resultado similar al registrado por Alonso et al. (2013). Existen algunas tendencias destacadas que podrían explicar el comportamiento de las varia-bles productivas (Cuadro 2). Por ejemplo, entre ilu-minación total (ILTOTAL), temperatura mínima (T MIN), humedad relativa promedio (HRPROM) y la CAC (CA) o entre la temperatura máxima (TMAX) e iluminación (ILTOTAL) y el PF. Todas las tendencias indican que CAC y PF aumentan en forma propor-cional, cuando una de las dos variables se incrementa hasta cierto límite; lo cual sugiere que D. coccus tiene umbrales específicos para su desarrollo óptimo.

Cuadro 2. Matriz de correlación entre variables productivas y variables climáticas analizadas.Table 2. Correlation matrix between the analyzed productive and climatic variables.

AC† PF TMAX TPROM TMIN HRMAX HRPROM HRMIN ILTOTAL

1.00 -0.38¶ 0.21 0.06 0.26 -0.18 0.41 0.24 0.28PF 1.00 -0.11 0.05 0.01 -0.03 -0.33 -0.10 -0.19TMAX 1.00 0.89 -0.06 0.48 0.36 -0.80 0.94TPROM 1.00 0.24 0.18 -0.05 -0.82 0.71TMIN 1.00 -0.86 -0.34 0.29 -0.26HRMAX 1.00 0.54 -0.60 0.59HRPROM 1.00 0.04 0.53HRMIN 1.00 -0.69ILTOTAL 1.00

†AC = Concentración de ácido carmínico (%); PF = peso fresco (%); TMAX = temperatura máxima (°C); TPROM = temperatura pro-medio (°C); TMIN = temperatura mínima (°C); HRMAX = humedad relativa máxima (%); HRPROM = humedad relativa promedio (%); HRMIN = humedad relativa mínima (%); ILTOTAL = iluminación total (lux). ¶Los valores en negrita son significativos (r, Pearson; a=0.05). v †AC = Carminic acid concentration (%); PF = fresh weight (%); TMAX = maximum temperature (°C); TPROM = average temperature (°C); TMIN = minimum temperature (°C); HRMAX = maximum relative humidity (%); HRPROM = average relative humidity (%); HRMIN = minimum relative humidity (%); ILTOTAL = total illumination (lux). ¶Values in bold type are significant (r, Pearson; a=0.05).

coccus and, at the same time, generate a higher CAC. The average values of FW in our study were low, compared with the 9.6 g of fresh cochineal obtained in studies in Peru with the same system (Herández et al., 2017).

The correlation analysis (Pearson) was significant only for FW and CAC, indicating that the lower the fresh weight of the insect, the higher the CAC (Table 2). A similar result was reported by Alonso et al. (2013). There are some outstanding trends that could explain the behavior of the productive variables (Table 2), for example, in total illumination (ILTOTAL), minimum temperature (TMIN), average relative humidity (HRPROM) and CAC (CA), or between maximum temperature (TMAX) and illumination (ILTOTAL) and FW. All the trends indicate that CAC and FW increase proportionally when one of the two variables, increases up to a certain limit. This suggests that D. coccus has specific thresholds for optimal development.

The results and trends obtained in this study indicate that both relative humidity and luminosity, but principally temperature, at each height level within the “nopaloteca” affected productivity (FW) and quality (CAC) of D. coccus. Therefore, and because cochineal producers use colonies of their own systems as rearing stock for successive generations of production or they commercialize them as seed



Los resultados y tendencias obtenidos en esta in-vestigación indican que tanto la humedad relativa y la luminosidad, pero principalmente la temperatura de cada nivel de cría dentro de la “nopaloteca”, influ-yeron en la productividad (PF) y calidad (CAC) de D. coccus. Por lo tanto, y debido a que los producto-res de cochinilla utilizan colonias de su propio siste-ma como pies de cría para las siguientes generaciones de producción o las comercializan como simiente, se sugiere seleccionar las hembras provenientes del nivel 3 (1.5 m) en la “nopaloteca”.

Con la finalidad de incrementar la CAC en D. coccus se recomienda dejar que las hembras conclu-yan su proceso reproductivo, aunque se requiera un número mayor de insectos por unidad de medida. Esta cantidad mayor se requiere por la reducción del peso corporal que implica el proceso reproductivo. Una ventaja adicional de esta opción es que la hem-bra muere de manera natural, y se evita su sacrificio.

CONCLUSIONES

El nivel (altura) más eficiente en la nopaloteca para la producción de ácido carmínico fue 1.0 m. Sin embargo, no proporciona las mejores condiciones para que las hembras de D. coccus generen peso cor-poral mayor. La parte media de la estructura brinda las condiciones adecuadas para incrementar tanto la productividad, como la concentración del ácido car-mínico.

La etapa de postoviposición fue mejor para la re-colecta de las hembras, en función de la concentra-ción de ácido carmínico, la cual fue mayor cuando el peso fresco de la hembra se redujo. Estos resultados pueden facilitar a los productores la toma de decisio-nes, sobre las condiciones requeridas para mantener o incrementar la calidad y el rendimiento de la cochini-lla en su sistema de cría, de acuerdo con sus objetivos (venta para colorante o pie de cría).

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insects, we suggest selection of females from level 3 (1.5 m) in the “nopaloteca”.

With the goal of increasing CAC in D. coccus, we recommend allowing the females to conclude their reproductive process, even though it requires a larger number of insects per unit of measure. This higher number is required because of the reduction in body weight that occurs in the reproductive process. An additional advantage of this option is that the females die naturally, and their sacrifice is avoided.

CONCLUSIONS

The most efficient height level in the “nopaloteca” for production of carminic acid was 1.0 m. However, this level does not provide the best conditions for D. coccus females to generate more body weight. The middle part of the structure provides adequate conditions for increasing both productivity and the concentration of carminic acid.

The post-oviposition stage was better for collecting the females, as a function of the concentration of carminic acid, which was higher when the fresh weight of the female was reduced. These results can facilitate decision-making by the producers regarding the conditions required to maintain or increase quality and yield of cochineal in their rearing systems, depending on their objectives (sale for dye or for rearing stock).

—End of the English version—

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