Renan Chiprauski Testolin

5/23/2018 Renan Chiprauski Testolin

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

CURSO DE MESTRADO EM CINCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

AVALIAO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAO

DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUTICOS PARA ANLISE

TOXICOLGICA

Renan Chiprauski Testolin

Itaja, SC, julho 2013


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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

CURSO DE MESTRADO EM CINCIA E TECNOLOGIA AMBIENTAL

AVALIAO DO IMPACTO AMBIENTAL DO FORMICIDA MACEX: UTILIZAO

DE UMA BATERIA DE BIOTESTES AQUTICOS PARA AVALIAO

TOXICOLGICA

Renan Chiprauski Testolin

Dissertao apresentada Universidade do Vale

do Itaja, como parte dos requisitos paraobteno do grau de Mestre em Cincia eTecnologia Ambiental.

Orientador: Claudemir Marcos Radetski, Dr.

Itaja, SC, julho 2013


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AGRADECIMENTOS

Ao professor Dr. Claudemir Marcos Radetski, pela orientao, confiana, amizade e

disponibilidade para o desenvolvimento deste trabalho.

A minha famlia, em especial aos meus pais Sergio e Iris, meu irmo Alexandre e a

minha companheira Tatiane, pelo apoio incondicional.

A colega de curso e grande amiga, Albertina.

Aos colegas do Laboratrio de Remediao Ambiental.

A Universidade do Vale do ItajaUNIVALI.

A todos aqueles, que direta ou inderatamente, contriburam para este trabalho.


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RESUMO

As formigas desempenham um papel fundamental na ecologia dos ecossistemas. No

entanto, quando as formigas se tornam indesejveis causam prejuzos econmicos, sendo

ento combatidas com aplicao de formicidas. Por outro lado, o aumento da conscinciaambiental e um maior rigor na legislao ambiental conclamam por uma diminuio da

toxicidade dos agrotxicos para minimizar/eliminar os impactos ambientais causados por

estes produtos. Uma alternativa para este problema a utilizao de formicidas naturais em

substituio aos produtos mais txicos disponveis atualmente no mercado. Para a

comercializao dos agroqumicos exige-se testes prvios para avaliar possveis impactos

ambientais sobre os organismos terrestres e aquticos no-alvos. Assim, o objetivo deste

estudo foi o de avaliar o impacto ambiental no ecossistema aqutico causado pelo formicida

natural Macex. Testes ecotoxicolgicos com algas, peixes, bactrias e dfnias, bem como

testes de fitogenotoxicidade com Vicia faba e de hidrlise do diacetato de fluorescena

(atividade microbiolgica) foram usados na avaliao, sendo que os resultados permitiram

estabelecer a concentrao mxima deste formicida que no causa toxicidade significativa

nas espcies testadas. Os resultados dos testes de ecotoxicidade, com as concentraes

testadas de 0,03 at 2,0 g L-1, apresentaram valores de CE50(ou CI50) variando de 0,49 (P.

subcapitata)a > 2,0 g L-1 (D. rerio).J para o teste de fitogenotoxicidade com V. faba, as

concentraes testadas foram de 0,06 a 2,0 g L-1, onde se observou a formao de

microncleos somente na concentrao mais alta.

Palavras-chaves:Formigas; Agrotxicos; Ecotoxicologia aqutica, Vicia faba.


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ABSTRACT

Ants play a key role in the ecology of the terrestrial ecosystems. However, when ants

become undesirable, these organisms can cause economic losses and are then counteredby the application of insecticides. But increased environmental awareness and more

stringent environmental legislation calls for a reduction in the toxicity of pesticides, in order to

mitigate the environmental impacts caused by these products. An alternative to this problem

is the use of natural insecticides that can replace the currently commercialized toxic

pesticides. Prior to marketing, agrochemicals must undergo testing to assess possible

environmental impacts on aquatic and terrestrial non-target organisms. Thus, the objective of

this study was to assess the environmental impact on the aquatic ecosystem caused by the

natural pesticide Macex. For this purpose, ecotoxicity tests with algae, fish, daphnids and

bacteria, as well as tests with Vicia faba and fluorescein diacetate hydrolysis (microbial

activity), were performed in this evaluation. The results enabled us to establish that the

maximum concentration of this pesticide that does not cause significant toxicity to the tested

species. The EC50 (or IC50) values ranged from 0.49 (Pseudokirchneriellasubcapitata) to >

2.0 g L-1(Danio rerio). In the phytogenotoxicity test with Vicia faba, the tested concentrations

ranged from 0.06 to 2.0 g L-1

, but micronuclei formation was observed only at the highestconcentration.

Keywords: Ants; Pesticides; Aquatic biotests, Vicia fabatest.


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SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 8LISTA DE TABELAS .................................................................................................. 9SIGLAS E ABREVIAES ...................................................................................... 101 INTRODUO ................................................................................................... 112 OBJETIVOS ....................................................................................................... 14

2.1 Objetivo Geral ........................................................................................................ 142.2 Objetivos especficos ............................................................................................. 14

3 REVISO BIBLIOGRFICA .............................................................................. 153.1 Formigas................................................................................................................ 153.2 Aspectos Econmicos-Ambientais Relativos s Formigas ..................................... 173.3 Agrotxicos ............................................................................................................ 203.4 Testes ecotoxicolgicos ......................................................................................... 29

4 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................. 334.1 Preparao do Txico ............................................................................................ 334.2 Testes de Ecotoxicidade ........................................................................................ 33

4.2.1 Teste Lumistox com a bactriaAliivibrio fischeri.................................................. 344.2.2. Teste de inibio do crescimento das algas Pseudokirchneriella subcapitata. 344.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna.......................................................... 354.2.4. Teste com peixe Danio rerio........................................................................... 354.2.5. Determinao da atividade enzimtica pela hidrlise da FDA. ........................ 36

4.3 Teste de Genotoxicidade ....................................................................................... 36


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4.2.6 Teste de genotoxicidade com Vicia faba......................................................... 364.4. Anlise estatstica dos dados dos testes de ecotoxicidade .................................... 37

5 RESULTADOS ................................................................................................... 385.1 Teste de estabilidade toxicolgica do macex ......................................................... 385.2 Teste de toxicidade comAliivibrio fischeri.............................................................. 395.3 Teste de toxicidade com Pseudokirchneriella subcapitata. .................................... 405.4 Testes de Ecotoxidade do Macex com Daphnia magna. ........................................ 425.5 Testes de Ecotoxidade do Macex com Danio rerio................................................ 435.6 Teste da Hidrlise Enzimtica do FDA ................................................................... 445.7 Teste de Genotoxicidade com Vicia faba............................................................... 45

6 DISCUSSO ...................................................................................................... 487 CONCLUSO ..................................................................................................... 528

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 54

9 ANEXOS............................................................................................................. 66

9.1 Artigos ................................................................................................................... 66


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LISTADEFIGURAS

Figura 1 Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas.

FONTE: IBAMA, 2010. ......................................................................................................... 22

Figura 2Locais potenciais de ao dos inseticidas sobre o axnico e o terminais pores

do nervo. Fonte: ECOBICHON, 2001................................................................................... 24Figura 3 - Clculo da rea total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005............... 27Figura 4 Fluxograma dos testes usados na avaliao ecotoxicolgica e genotxica do

formicida Macex. .................................................................................................................. 33Figura 5 Valores de luminescncia para as bactrias Aliivibrio fischeri expostas

diferentes concentraes do formicida Macex durante 30 minutos. ..................................... 39Figura 6 - Valores mdios da variao da fluorescncia da alga Pseudokirchneriella

subcapitataexposta diferentes concentraes de Macex durante 72 h. ............................ 41Figura 7 - Valores mdios de Daphnia magna imobilizada aps 48 h de exposio a

diferentes concentraes de Macex. .................................................................................... 42Figura 8 - Valores mdios da variao da absorbncia devido hidrlise do FDA por

microorganismos presentes nas guas expostos diferentes concentraes de Macex

durante 72 h......................................................................................................................... 44Figura 9 - Mdia ( DP) da frequncia de microncleos (Mcn/1000 clulas) e ndice mittico

(IM, %) em razes de Vicia fabaexpostas 48h ao formicida Macex HM (hidrazida maleica):

controle positivo. .................................................................................................................. 46


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LISTADETABELAS

Tabela 1reas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE:

ABRAF capturado em 2012 ................................................................................................. 19

Tabela 2 - Formicidas, dosagens e pocas de aplicao de alguns formicidas

comercializados no Brasil. FONTE: GALLO et al. 2002. ...................................................... 26Tabela 3 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas

diferentes concentraes do formicida Macex. Os valores so de 4 testes iniciados com 24 h

de intervalo usando a mesma soluo estoque de Macex no preparo das diluies. ........... 38

Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactrias Aliivibrio fischeriexpostas diferentes concentraes do formicida Macex. .................................................................... 40Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subcapitata expostas

diferentes concentraes do formicida Macex. .................................................................... 41Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas diferentes

concentraes do formicida Macex. ..................................................................................... 43

Tabela 7 - Valores mdio de letalidade de Danio rerio, aps 96 h de exposio diferentesconcentraes de Macex. .................................................................................................... 43Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquticos expostos

diferentes concentraes do formicida Macex. .................................................................... 45Tabela 9 - Ecotoxicidade do Macex obtidos atravs de quatro espcies de organismosteste

e outros dados de ecotoxicidade para formicidas comercializados a base de sulfluramida,

fipronil e clorpirifos. .............................................................................................................. 49


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SIGLASEABREVIAES

ABNT Associao Brasileira de Normas Tcnicas

ABRAF Associao Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas

CCEO Concentrao Com Efeitos Observveis

CE50 Concentrao Efetiva (para 50% dos organismos expostos)

CI50 Concentrao Inibidora (para 50% dos organismos expostos)

CL50 Concentrao Letal (para 50% dos organismos expostos)COT Carbono Orgnico Total

CSEO Concentrao Sem Efeitos Observveis

DBO Demanda Bioqumica de Oxignio

DQO Demanda Qumica de Oxignio

FDA Diacetato de Fluorescena

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

ISO International Organization for Standardization

MCN Microncleos

USEPA United States Environmental Protection Agency


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1 INTRODUO

As formigas so um dos grupos de organismos que apresentam grande diversidade

de espcies na Terra e esto presentes em todos os ecossistemas terrestres, exceto emregies polares, algumas ilhas ocenicas e grandes altitudes (WARD, 2006). Com relao a

diversidade, abundncia relativa e impactos ecolgicos, as formigas desempenham um

papel importante em muitas comunidades, exibindo vrias funes como organismos

detritvoros, predadores e herbvoros. Nos ecossistemas tropicais as formigas so um

componente notvel, constituindo mais de 15% da biomassa animal total desses

ecossistemas (BEATTIE & HUGHES, 2002).

Com relao aos insetos que se apresentam em sociedade, as formigas so as que

mais se adaptaram s cidades, sendo que no Brasil estima-se que das 2000 espcies de

formigas existentes, aproximadamente 50 espcies so pragas urbanas causando prejuzos

na jardinagem e nas plantaes urbanas (e.g., nos parques alimentando-se de sementes e

desfolhando plantas) (CAMPOS-FARINHA et al., 2002). J na agricultura, os prejuzos

econmicos podem ser tanto na produo como no armazenamento. Tambm causam

problemas em locais onde se manipulam alimentos, instituies de pesquisa, biotrios,

zoolgicos, museus, cabines de eletricidades e centrais telefnicas, pois so portadores de

grmens que podem contaminar estes diferentes locais.

Visando a proteo das culturas, o atual sistema de produo agrcola faz uso de

produtos qumicos estranhos s condies naturais dos agroecossistemas. Esta utilizao

de produtos qumicos visa controlar populaes de organismos em desequilbrio, plantas

daninhas e doenas que proliferam de maneira desordenada em funo de ambientes

favorveis ao desenvolvimento destes organismos que so popularmente denominados de

pestes (MOREIRA et al., 1996)

Dentre os produtos qumicos estranhos aos ecossistemas naturais esto os

pesticidas que tambm recebem a denominao de produtos agrotxicos ou fitosanitrios,

os quais so molculas sintetizadas para afetar determinadas reaes bioqumicas de

insetos, microrganismos, animais e plantas que se quer controlar ou eliminar. Busca-se

desenvolver agrotxicos com efeito especfico em um dado organismo a ser eliminado, e

assim, evitar que o efeito se manifeste nos outros seres que compem os ecossistemas.

Contudo, a introduo de agrotxicos no ambiente agrcola pode provocar perturbaes ou

impactos ambientais, pois podem exercer uma presso de seleo nos organismos e a lterar


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a dinmica do ecossistema natural, tendo como conseqncia, mudanas na estrutura e na

funo do ecossistema (SPADOTTO et al., 2004). Por outro lado, Tiepo et al. (2010)

definiram Pesticidas Verdes como biocidas naturais ou sintetizados produzidos de acordo

com os princpios da qumica verde e que agem de forma especfica sobre um alvo preciso,com o mnimo de efeitos prejudiciais ou nocivos sobre os componentes no-alvos presentes

no ecossistema onde o produto foi aplicado. O Pesticida Verde na verdade uma

concepo ideal de um agrotxico.

Enquanto as indstrias qumicas se esforam para desenvolver agrotxicos menos

impactantes para o meio-ambiente, os governos exigem, alm dos estudos toxicolgicos

visando a proteo da sade humana, estudos ecotoxicolgicos que mostram a previso de

impacto ambiental destes produtos no ambiente antes de autorizar a comercializao dosmesmos. Nesse contexto, os testes ecotoxicolgicos tem se consolidado como ferramenta

importante para a compreenso dos impactos potenciais provocados por agentes qumicos

nas comunidades biolgicas. Em decorrncia da possibilidade de estender/extrapolar

resultados da ecotoxicidade obtido com um organismo-teste para um grande nmero de

organismos presentes no meio natural, esses biotestes tem sido empregados no

gerenciamento, manejo e monitoramento do meio-ambiente. Assim, para o planejamento de

polticas ambientais, criao de legislao especfica e controle das emisses de efluentes,

procede-se avaliao de riscos ambientais e, para tanto, dados ecotoxicolgicos egenotoxicolgicos precisam ser gerados e usados nos setores de vigilncia ambiental e de

sade publica (LOURENO, 2006).

Existe no mercado um formicida de composio natural denominado Macex e que,

teoricamente, no deveria causar impacto ambiental significativo. Pelo fato deste produto

ser usado no ecossistema terrestre, os poucos dados ecotoxicolgicos existentes na

literatura cientfica privilegiam este compartimento. Assim, Tiepo et al. (2010) sugeriram que

o formicida Macex seja classificado como pesticida verde com base em testes de toxicidadecom organismos terrestres: vegetais (Brassica oleracea, Lactuca sativa , Mucuna aterrima),

aneldeo (Eisenia fetida) e colmbolas (Folsomia cndida). A literatura no

registra resultados de ecotoxicidade aqutica e nem de genotoxicidade do Macex e sabe-se

que a maioria dos agrotxicos usados nos ecossistemas terrestres acabaro por atingir o

ecossistema aqutico, entrando em contato com os microorganismos e com os

macroorganismos que compem este ecossistema. essa falta de dados ecotoxicolgicos

em organismos do meio aqutico que justifica a escolha deste pesticida como objeto de


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estudo nesta dissertao. Um teste de fitogenotoxicidade de importncia fundamental,

visto que as alteraes genticas so efeitos parte, no sendo observados nos testes

ecotoxicolgicos clssicos. A gerao de dados preliminares servir de base para futuras

avaliaes de risco ecolgico que busquem um gerenciamento otimizado deste produtousado no controle das formigas que causam danos s culturas vegetais. Assim, o presente

trabalho est vinculado ao laboratrio de Remediao Ambiental UNIVALI, onde o mesmo

realiza estudos cientficos nos diagnsticos ambientais e nas avaliao dos efeitos

ecotoxicolgicos e genotoxicolgicos dos compostos qumicos liberados no meio ambiente.


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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Utilizar uma bateria de biotestes aquticos para avaliao preliminar da ecotoxicidade

e genotoxicidade potencial do formicida Macex.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar as concentraes letais, efetivas ou inibidoras (ao nvel de 50%)

do formicida natural Macex para as espcies Danio rerio,Daphnia magna,

Scenedesmus subspicatus eAliivibrio fischeri;

Determinar se o formicida natural Macex genotxico ou no com o uso da

espcie Vicia faba;

Determinar a concentrao efetiva (ao nvel de 50%) do formicida Macex nos

microorganismos presentes nas guas naturais;

Estabelecer as ConcentraesSem Efeito Observado (CSEO) para todas as

espcies testadas a fim de basear futuros estudos de anlise de risco

ecolgico, permitindo o estabelecimento de valores-limites legais para este

produto no meio-ambiente;


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3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 FORMIGAS

As formigas so um dos grupos de maior sucesso na histria dos metazorios

terrestres. Em mdia, as formigas apresentam de 15% a 20% da biomassa terrestre animal,

e em regies tropicais onde as formigas so especialmente abundantes, podem chegar a

25% ou mais. A famlia Formicidae soma mais de 9.500 espcies descritas e com nmero

estimado de 3.000 a 9.000 espcies desconhecidas para a cincia (SCHULTZ, 2000).

Constituem importantes componentes dos ecossistemas, no s por apresentarem uma

grande biomassa animal, mas tambm porque as formigas agem como engenheiros dos

ecossistemas (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Essa alta biodiversidade torna esses

organismos altamentes sensveis aos impactos ambientais, podendo reduzir essa

biodiversidade (FOLGARAIT, 1998)

As formigas cortadeiras, pertencentes tribo Attini, famlia Formicidae e subfamlia

Myrmicinae, representando um grupo especial de formigas associadas vegetao. Neste

grupo encontram-se os gnerosAttae Acromyrmex. Embora existam outros gneros, estes

assumem pouca importncia no forrageamento de plantas cultivadas (GIESEL, 2007). A

tribo Attini (Hymenoptera: Formicidae) compreende 14 gneros com aproximadamente 230

espcies de formigas descritas, que se especializaram em uma dieta essencialmente

fungvora (SCHULTZ & BRADY, 2008).

Um formigueiro tpico formado internamente por dezenas ou centenas de cmaras

(panelas) subterrneas ligadas entre si e com a superfcie por meio de galerias (canais).

Nas diversas panelas, as formigas cultivam o jardim de fungo, criam suas larvas e

depositam lixo. Externamente, o formigueiro apresenta um monte de terra solta, formado

pelo acmulo de terra extrada das cmaras, alm de pequenos montculos e numerosos

orifcios, denominados olheiros, os quais servem para ventilao, limpeza ou entrada dematerial vegetal coletado (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Dos olheiros de trabalho saem

trilhas ou carreiros, que so os caminhos externos percorridos pelas formigas operrias

procura de material vegetal. As trilhas geralmente so superficiais e limpas (facilmente

notadas) e muitas vezes bastante longas; terminam em olheiros que nem sempre indicam a

localizao das panelas do formigueiro (DELLA LUCIA & MOREIRA, 1993; ANJOS et al.,

1998).


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A populao do formigueiro constituda por indivduos morfologicamente distintos,

de acordo com suas funes na colnia. Estas formigas possuem castas permanentes e

temporrias. As castas permanentes emAtta so compostas por uma fmea ptera (rainha)

fundadora do sauveiro (casta reprodutiva) e por operrias (fmeas estreis) querepresentam a maior parte da populao e executam as mais variadas tarefas necessrias

ao funcionamento do formigueiro. Nas castas temporrias, esto os machos (bitus) e

fmeas aladas (ias ou tanajuras), que aparecem nos formigueiros adultos anualmente,

garantindo a reproduo das espcies (DELLA LUCIA et al., 1993a; GALLO et al., 2002). As

operrias do gnero Atta so facilmente identificadas pela presena de trs pares de

espinhos no dorso do trax (ANJOS et al., 1998; GALLO et al., 2002).

Devido aos vrios efeitos que podem causar na cadeia trfica, as consequncias

ecolgicas da ao das formigas sobre um ecossistema pode ser muito variado. No caso

das espcies herbvoras, isto , cortadeiras que cultivam um fungo simbionte, conhecido

que sua atividade cortadora nem sempre negativa sobre a flora. Como estas espcies

cortam geralmente partes especficas de plantas, podem regular o crescimento diferencial

em uma mesma planta ou entre diferentes espcies de plantas, acelerando o crescimento

de flores, por exemplo, ou de espcies vegetais especficas. Por sua vez, estas formigas

acumulam grande quantidade de nutrientes em um s lugar, permitindo o crescimento de

certos vegetais que no podem sobreviver em solo pobre dos arredores, exercendo destaforma, o papel de recicladores de nutrientes (BRASIL, 2012).

Outro efeito importante das formigas sobre um ecossistema a predao sobre

outros insetos e artrpodos (HOLLDOBLER & WILSON, 1986). Algumas espcies so muito

eficientes como predadoras. o caso das formigas-de-correo que arrasam com toda a

fauna de uma zona, obrigando a colnia a migrar continuamente em busca de novos

ambientes. A presso depredadora destas e de outras formigas to importante que muitos

organismos tm desenvolvido, durante sua evoluo, mecanismos de defesa especficos

contra formigas. o caso de muitas vespas, cupins, mariposas e plantas (BRASIL, 2012).

Algumas espcies de formigas encontram-se associadas s atividades antrpicas

causando incmodo, infestando aparelhos eletrnicos e podendo ainda causar srios

problemas na sade pblica quando a infestao se d em hospitais (CAMPOS-FARINHA et

al, 2002)


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Segundo Boaretto & Forti (1997), para o controle de formigas cortadeiras de folhas

pode-se usar mtodos mecnicos, culturais, biolgicos e qumicos. O controle mecnico (ou

manual) praticamente no utilizado, em virtude de ser de viabilidade restrita a pequenas

reas e ninhos com at 4 meses de idade. Mtodos qumicos para controle de formigascortadeiras so os mais frequentemente utilizados, sendo o produto qumico aplicado

diretamente nos ninhos, nas formulaes em p, lquido ou lquidos nebulizveis, ou

apresentado na forma de iscas granuladas que so aplicadas nas proximidades das

colnias. J o controle biolgico certamente uma rea promissora de pesquisa, mas

atualmente est clara a necessidade de conhecimentos biolgicos bsicos para que

estratgias de controle para formigas cortadeiras possam ser de fato aplicadas. O preparo

do solo como arao e gradagem podem ser importantes na eliminao de sauveiros iniciais

e quenquenzeiros.

Entre os fatores comportamentais que podem influenciar no controle das formigas

cortadeiras destacam-se: a comunicao qumica, a sensibilidade olfativa, a capacidade de

aprendizagem, a seletividade e a produo de substncias antibiticas. A comunicao

qumica (via odores) muito importante na defesa e na agressividade, na seleo de

plantas, nas atividades sociais, corte e acasalamento e em outros tipos de comportamento.

Essa comunicao qumica essencial no sucesso das colnias de cortadeiras (MARINHO

et al., 2006), sendo que estas causam impactos econmicos significativos, o que abordadona seo seguinte.

3.2 ASPECTOS ECONMICOS-AMBIENTAIS RELATIVOSS FORMIGAS

No Brasil existem muitas reas reflorestadas que apresentam problemas com as

formigas. Por exemplo, as formigas cortadeiras esto entre as pragas mais importantes em

fazendas brasileiras, porque seus ataques vorazes ocorrem durante o ano todo, seespalhando pelo pas. O dano imenso, trazendo prejuzos s culturas pequenas e

grandes, culturas de frutas e legumes e pastos, sendo assim consideradas tambm como a

praga "nmero 1entre as empresas de reflorestamento (BRASIL, 2012), o que se tem se

verificado tambm com outras espcies de formigas em outros pases (GUTRICH et al.,

2007).

Entre os problemas silviculturais dessas florestas implantadas, sobressaem as

formigas cortadeiras dos gneros Atta (savas) e Acromyrmex (quenquns), que


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alcanaram o nvel de praga pela magnitude dos prejuzos que causam aos plantios de

pastagens ou florestais (MACARONI et al., 1963; NICKELE et al., 2009). Os danos das

formigas cortadeiras so mais expressivos nas plantas exticas do que nas nativas, isso se

deve provavelmente devido baixa co-evoluo existente entre esses grupos (DELLALUCIA & VILELA, 1993).

Assim, as pastagens tm seu desenvolvimento prejudicado, pois o ataque de

formigas leva morte das plntulas e m formao do pasto. Alm do mais, as formigas

competem diretamente com o gado pelo recurso forrageiro da rea. Estudos demonstram

que 10 sauveiros adultos ocupam uma rea de 715 m e consomem em mdia 21 kg de

capim por dia, o equivalente a um boi em regime de pasto (GALLO et al., 2002).

No Brasil, as espcies vegetais mais usadas nos reflorestamentos so o Pinus e o

Eucalyptus, sendo que as formigas cortadeiras destacam-se como as principais pragas,

principalmente nas fases de pr-corte (reas de reforma ou conduo da floresta) e aps o

plantio ou no incio da conduo de brotao.

Segundo a Associao Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas (ABRAF,

2013), a rea ocupada de plantios em 2011 de Eucalyptus e Pinus no Brasil totalizou

6.515.844 h sendo 74,8% correspondente rea de plantios de Eucalyptuse 25,2% aos

plantios de Pinus. A Tabela 1 apresenta os valores das reas de plantio das respectivas

espcies acima citadas nos diferentes estados do Brasil. Percebe-se na Tabela 1 que os

estados do Paran e Santa Catarina se destacam em reas reflorestadas por Pinus por

causa do clima predominante, pois a espcie rende mais em climas temperados, suportando

melhor temperaturas mais baaixas.

As formigas cortadeiras causam danos significativos em plantios homogneos, os

quais favorecem o desenvolvimento dessas pragas pela falta de predadores naturais nas

reas de plantio. Assim, essas formigas so consideradas como fatores limitantes ao

desenvolvimento da cultura, causando tanto perdas diretas, como a morte e a reduo do

crescimento de mudas e rvores; quanto indiretas, como a diminuio da resistncia das

rvores a outras pragas (ANJOS et al., 1993).


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Tabela 1reas de plantio florestal com Eucalyptus e Pinus nos Estados do Brasil. FONTE:ABRAF capturado em 2012

Florestas Plantadas no Brasil (Km2)

UF Eucalyptus Pinus Total %MG 1.401.787 75.408 1.477.195 22,70%

SP 1.031.677 156.726 1.188.403 18,20%

PR 188.153 658.707 846.860 13,00%

BA 607.440 21.520 628.960 9,70%

SC 104.686 538.254 642.941 9,90%

RS 280.198 164.806 445.004 6,80%

MS 475.528 11.871 487.399 7,50%

ES 197.512 2.546 200.058 3,10%

PA 151.378 - 151.378 2,30%

MA 165.717 - 165.717 2,50%

GO 59.624 10.760 70.384 1,10%

AP 50.099 445 50.543 0,80%

MT 58.843 - 58.843 0,90%

TO 65.502 850 66.352 1,00%

PI 26.493 - 26.493 0,40%

RJ 8.844 - 8.844 0,10%

OUTROS 470 - 470 0,00%TOTAL 4.873.951 1.641.893 6.515.844 100,00%

Segundo Zanetti et al. (2002), o ataque realizado pelas formigas cortadeiras de

maneira intensa e constante, podendo ocorrer danos em qualquer fase do desenvolvimento

da planta, ocasionados por cortes de folhas, brotos, ramos finos e flores, os quais so

carregados para o interior de ninhos subterrneos, dificultando o seu controle.

Zanetti et al. (2002; 2004) descrevem dados quantitativos sobre o impacto das aesdas formigas sobre plantas. Assim, estudos com Eucalyptus salignademonstraram que as

rvores desfolhadas 100 % deixaram de produzir cerca de 40% da madeira no ano

seguinte desfolha e que as rvores com 50% de desfolha reduziram a produo da

madeira em 13,2% no ano seguinte, comparativamente s rvores no desfolhadas. J para

o caso da espcie Pinus caribaea atacada pelas formigas, o crescimento em altura das

rvores diminuiu em 12%, enquanto o dimetro diminuiu de 17,4% e a mortalidade mdia

aumentou em 11,7%. Quando rvores de Eucalyptus grandis de 6 meses de idade so


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desfolhadas, elas tem 99,3% de probabilidade de morrerem, enquanto diminuem seus

crescimentos de altura e dimetro em 31,7% e 25,1%, respectivamente, provocando uma

reduo de 61,6% na produo da madeira, comparativamente s rvores no desfolhadas.

As rvores com idade de 1 a 3 anos so as mais susceptveis aos ataques das formigas,sendo que um desfolhamento total retarda significativamente o crescimento das mesmas,

mas dois ou trs desfolhamentos consecutivos geralmente levam as plantas morte. Ainda

segundo Zanetti et al. (2002), estudos demonstraram que a perda de rendimento em volume

de madeira na espcie Pinus spp provocada por 5 formigueiros de Atta sexdensficou em

14% e que quando a densidade de formigueiros da espcie Atta laevigata for maior que

30/ha em plantios de Pinus caribaeacom menos de 10 anos de idade, h uma reduo de

mais de 50% na produo de madeira/ha. De uma maneira geral, h uma perda anual de

0,87% na produo do volume de madeira de Eucalyptuspara cada 2,76 m2de sauveiro/ha

(ZANETTI et al., 2004).

Para evitar todas estas perdas produtivas, as empresas de reflorestamento tem

empregado o controle qumico de formigas cortadeiras de forma sistemtica, atravs de

iscas, termonebulizao e fumigantes, sendo o aspecto econmico das operaes de

grande importncia, em virtude dos altos custos envolvidos (FORTI & BOARETTO, 1997).

Nesse sentido, 75% dos custos e do tempo gasto no controle de pragas florestais dizem

respeito ao combate das formigas cortadeiras (ZANETTI et al., 2002)

Algumas consideraes sobre o uso de agrotxicos so abordadas nas seo

seguinte.

3.3 AGROTXICOS

Os agrotxicos e afins so definidos como os produtos originrios de processosfsicos, qumicos ou biolgicos que so destinados ao uso nos setores de produo, no

armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de

florestas (nativas ou implantadas) e de outros ecossistemas, e tambm de ambientes

urbanos (jardins e indstriais), cuja finalidade seja alterar a composio da flora ou da fauna,

a fim de preserv-las da ao danosa de seres vivos considerados nocivos, podendo ser

ainda substncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores

e inibidores de crescimento (BRASIL, 2002).


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Segundo Pope (2005), agrotxicos so substncias ou mistura de substncias

destinadas a prevenir, destruir, repelir ou mitigar qualquer praga (roedores, insetos,

nematides, fungos, plantas daninhas, de outras formas de planta terrestre ou aqutico ou

vida animal ou vrus, bactrias ou outros microorganismos, exceto os vrus, bactrias, ououtros microrganismos sobre ou dentro do homem. Pode ser tambm qualquer substncia

ou mistura de substncias destinadas utilizao de um regulador de crescimento de

planta, desfolhantes, dessecantes. No termo agrotxico esto includos os termos

herbicidas, inseticidas, nematicidas, fungicidas e fumigantes do solo, sendo que estas

substncias representam um grupo diversificado de produtos qumicos inorgnicos e

orgnicos (IMFELD & VUILLEUMIER, 2012).

De uma forma resumida, os agrotxicos tm como objetivo o controle dos seres vivosconsiderados indesejveis para a conservao de outros seres vivos, produtos ou do meio

ambiente. Os agrotxicos possuem em sua composio substncias qumicas txicas,

denominadas ingredientes ativos, que interferem na atividade biolgica normal dos seres

vivos alvos de controle. O ingrediente ativo o agente qumico, fsico ou biolgico que

confere eficcia aos agrotxicos e afins (BRASIL, 1989).

A Figura 1 apresenta os ingredientes ativos para os quais h maior comercializao

de agrotxicos no Brasil. No entanto, no levantamento desses dados foi utilizado apenas

valores declarados em marcas comerciais de produtos formulados.


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Figura 1Ingredientes ativos mais comercializados no Brasil em 2009 em toneladas. FONTE:IBAMA, 2010.

Quando aplicados diretamente no solo, os agrotxicos podem ser degradados por

vias qumicas, por fotlise ou por ao de microorganismos. Contudo as molculas com alta

persistncia, ou seja, baixas taxas de degradao podem permanecer no ambiente sem

sofrer qualquer alterao por um longo perodo (AMARANTE JUNIOR et al., 2006). Essas

molculas podem ser adsorvidas pelas partculas do solo, dessorvidas a partir dessas

mesmas partculas, sofrer lixiviao e atingir os lenis subterrneos ou sofrer carreamento

e atingir guas superficiais (VIJVER et al., 2008). J nos ambientes aquticos, os

agrotxicos podem sofrer adsoro ou dessoro das partculas de sedimentos, ser

degradados por vias qumicas, biolgicas ou fotlise, bem como ser volatilizados. No ar, as

molculas na forma de gs ou de vapor podem ser transportadas por muitos quilmetros,

atingindo reas a grandes distncias da regio de aplicao (AMARANTE JUNIOR et al.,

2006).

Para o presente trabalho, o interesse sobre agrotxicos recai mais especificamente

sobre os inseticidas, os quais so produtos base de substncias qumicas ou agentes

biolgicos, de ao direta ou indireta, que provocam a morte dos insetos. Quimicamente,

podem ser classificados de diferentes modos, sendo que uma delas a diviso dos


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inseticidas em trs grandes grupos: os organoclorados; os inibidores da colinesterase

(fosforados orgnicos e carbamatos) e os piretrides naturais e sintticos (IBAMA, 2010).

Segundo Costa (2008), os inseticidas desempenham um papel mais relevante no

controle dos insetos (como pragas), particularmente nos pases em desenvolvimento. Todos

os inseticidas qumicos em uso hoje so neurotxicos e agem por interferncia no sistema

nervoso dos organismos-alvo. O sistema nervoso central dos insetos altamente

desenvolvido e no to diferentes dos mamferos, bem como o sistema nervoso perifrico

que tambm apresenta semelhanas com os organismos superiores (ECOBICHON, 2001).

Desta maneira os inseticidas no so seletivos em relao a espcie alvo no que diz

respeito a toxicidade e os mamferos, incluindo os humanos, so altamente sensveis a sua

toxicidade. Quando essa seletividade existe, esta muita vezes, devido as diferenas na viade desintoxicao existentes entre insetos e humanos (COSTA 2008).

Muitos inseticidas afetam o sistema nervoso em diferentes locais. O desenvolvimento

desses compostos tem sido baseado em relaes especficas estrutura/atividade

requerendo a manipulao de uma estrutura qumica bsica com intuito de se obter uma

forma ideal que afeta uma reao bioqumica especfica em um organismo alvo. Esses

locais ou reaes especficos e/ou mecanismo de ao pode ser semelhantes em todas as

espcies, no entanto, a dosagem (nvel de exposio e durao) ir ditar a intensidade dos

efeitos biolgicos. Os locais potencias de ao dos inseticidas e suas interferncias no

transporte de ons de sdio, potssio, clcio e cloretos nas membranas celulares podem ser

visto na Figura 2 onde ocorre a inibio das atividades enzimticas especificas ou a

contribuio para a liberao e/ou a persistncia dos transmissores qumicos nas

terminaes nervosas (ECOBICHON, 2001).


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Figura 2Locais potenciais de ao dos inseticidas sobre o axnico e o terminais pores donervo. Fonte: ECOBICHON, 2001.

Entre a diversidade de produtos em que os invertebrados podem ser expostos, os

inseticidas so o grupo com os maiores efeitos, seguido dos fungicidas. Isto em parte

devido presena de receptores especficos bioqumicos (e.g., colinesterases, canais de

ons) que so os alvos da ao inseticida e que so encontradas em todas as espcies de

insetos (STRAALEN, 2004).

Os efeitos dos inseticidas (ou de qualquer agrotxico) sobre a microflora do solo so

de suma importncia, devido ao fato de que muitas funes microbianas so fundamentais

para a produo agrcola, sustentabilidade do solo e da qualidade ambiental (TOPP, 2003).

O mecanismo de ao dos inseticidas em organismos microbianos pode ser diferente do


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que os apresentados para os organismos alvos (i.e., insetos). Em microorganismos, os

inseticidas tem apresentado interferncia na respirao, na fotossntese, em reaes de

biossntese, bem como no crescimento, diviso e composio molecular (DELORENZO et

al., 2001).

A literatura registra dados sobre a eficcia dos formicidas atualmente mais

comercializados no Brasil, os quais so: sulfluramida, fipronil e clorpirifs. A sulfluramida (N-

etilperfluoroctano sulfonamida) o ingrediente ativo da isca granulada de Mirex-S Max,

Dinagro-S, AttaMax e Pikapau sendo esses os produtos mais comercializadas no Brasil.

Para esses produtos de isca granulado (0,6% de ingrediente ativo), Cameron(1990) relatou

que 1,8 g.m-2de formigueiro foi suficiente para controlar a formiga A. texana. O metablito

perfluoroctano sulfonamida (DESFA), atua no organismo no processo de fosforilaooxidativa, em nvel mitocondrial, interrompendo a produo de ATP (SCHNELLMAN &

MANNING, 1990).

O clorpirifos (O, O-dietilo O-3 ,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) como formicida em

isca comercializado no Brasil como Fersol 480 EC e Landrin-F, entre outros. Oliveira &

Zanuncio (1997) testaram este produto a base de clorpirifos para o controle da formigaAtta

laevigata, mas as iscas so eficazes apenas quando a aplicao realizada

simultaneamente com um processo de fumigao (FORTI et al, 2003; TOMLIN, 2000). O

Clorpirifs age por contato e ingesto. Como todo inseticida organofosforado, o clorpirifs

liga-se ao centro estersico da acetilcolinesterase (AChE), impossibilitando-a de exercer sua

funo, ou seja, hidrlise do neurotransmissor acetilcolina (ACh), em colina e cido actico.

Nos insetos, interfere com a transmisso dos impulsos nervosos, levando-os paralisia e

morte (TOMLIN, 2000).

O fipronil, comercializado como Blitz, Frontline, Regent 800 WG e outros, apresenta

ao txica retardada na colnia de formigas, sendo eficaz em testes de laboratrio a uma

concentrao de 5 ppm (FORTI & BOARETTO, 1997). O fipronil pertence famlia dos

fenilpirazis. Seu mecanismo de ao baseia-se no bloqueio pr e ps-sinptico da

passagem dos ons cloro pelos neurotransmissores (cido gama amino butrico GABA),

matando os organismos por hiper-excitao (TOMLIN, 2000).

A Tabela 2 nos mostra as dosagens de alguns inseticidas comumentemente usados

no combate de formigas cortadeiras.


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Tabela 2 - Formicidas, dosagens e pocas de aplicao de alguns formicidas comercializados noBrasil. FONTE: GALLO et al. 2002.

Formicida Dosagem/m2Compasso (rea mdia

de uma aplicao)

poca

aconselhvel

Lquido

fenitrotion(Sumithion 50 E)

5 ml + 0,5 L gua 2 m2 Chuvosa

clorpirifs (Lorsban480)

5 ml + 0,5 L gua 2 m2 Chuvosa

P

fipronil (Reagente

800 WG)

0,25 g + 0,5 L

gua

50 ml/olheiro (aplicar em

2 olheiros) -

permetrina (K-Othrine 2%)

30 g 3 m2 Seca

Iscas

fipronil (Blitz) 10 g - Seca

sulfuramida (Mirex-s) 10 g - Seca

A rea do formigueiro que determina a dosagem da maioria dos formicidas. Dentreas formas de calcular essa rea, destaca-se a seguir o mtodo da rea total de terra solta.

Por meio desse mtodo, a rea obtida atravs da multiplicao do maior comprimento pela

maior largura da rea ocupada pelos montculos de terra solta (ZANETTI et al., 2005). Para

economizar na quantidade de formicida usado, pode-se calcular rea individual de cada

ninho. As dimenses podem ser medidas com o auxlio de uma trena, ou com passadas

largas de aproximadamente 1 metro.


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rea Total = comprimento AB x comprimento CD () = olheiro de abastecimento.

Figura 3 - Clculo da rea total de um formigueiro. FONTE: ZANETTI et al. 2005.

Forti et al. (2003) compararam a eficincia formicida de iscas formulados com

sulfluramida 0.3% (Mirex-S Max e Dinagro-S), fipronil 0.003% (Blitz) e clorpirifos

0.125% (Pikapau) no controle da formiga Atta capiguara, cortadora de gramneas. Foram

avaliados a frequncia de transporte das iscas, a devoluo das iscas, a frequncia de corte

e cargas, a quantidade de formigas e a quantidade de solo solto nos ninhos. Estes

parmetros foram avaliados durante 232 dias aps o tratamento e os autores concluram

que as iscas dos produtos Blitz e Pikapau no foram adequados para o controle de Attacapiguara, enquanto que Mirex-S Max (8 g m-2) e Dinagro-S (10 g m-2) apresentaram alta

eficincia no controle das formigas.Atualmente, o controle de formigas cortadeiras em reas reflorestadas tem sido feito

quase que exclusivamente com a aplicao de inseticidas convencionais, que podem

provocar impactos negativos ao ambiente e ao homem. Alternativamente ao uso de

inseticidas sintticos, surgem outros produtos e mtodos de controle, como o uso de

produtos naturais, os quais tm sido utilizados para controlar pragas animais, doenas de

plantas e ervas daninhas, desde os tempos antigos. As plantas tm sido as mais

importantes fontes de pesticidas naturais durante sculos e preparaes padronizadas para

o ingrediente(s) ativo(s) atravs de mtodos analticos modernos tornou-se disponvel nas

ltimas dcadas, tornando possvel a fabricao de produtos confiveis(UJVRY, 2010).

Um produto considerado alternativo por sua composio natural o formicida Macex,

fabricado pela Macex do Brasil, localizada na cidade de Caador, SC. A empresa afirma em

seu site (www.macex.com.br) que este formicida eficaz contra as formigas cortadeiras dos


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gnerosAtta eAcromyrmex, os quais so os gneros que causam maior impacto nas

plantaes brasileiras. A composio qumica do Macex a seguinte: cafena (0,04%),

cidos graxos (palmtico -1.5%, oleico -1.9%, linoleico6.2% e esterico -0.4%), sendo que

polpas de ma e de ctricos agem como agentes atraentes.

Uma reviso da literatura no mostrou dados toxicolgicos para os cidos graxos

concluindo-se que deve ser a cafena o ingrediente ativo deste formicida. A cafena um

alcalide da famlia metilxantina, agindo como um produto qumico de defesa em certas

plantas e mostrando propriedades repelentes ou txicas (ARAQUE et al., 2007). As

metilxantinas, incluindo a cafena e a teofelina, so naturalmente produzidas em frutos,

sementes e folhas de certas espcies de chs, caf, cacau e cola. Entretanto, as

metilxantinas naturais e sintticas inibem a alimentao dos insetos e tambm sopesticidas, nas concentraes encontradas nas plantas. Esses efeitos so ocasionados

principalmente pela inibio da atividade de fosfodiesterase e um aumento no ciclo

intracelular do monofosfato de adenosina. J em concentraes mais baixas, as

metilxantinas so sinrgicos potentes de outros pesticidas por ativar a adenilato ciclase, a

qual cataliza a converso de ATP AMPc em insetos (NATHANSON, 1984).

Enquanto a cafena pode ser considerado um inseticida (ARAQUE et al., 2007), seria

interessante avaliar se o produto Macex apresenta um impacto ecotoxicolgico quando em

contato com diferentes organismos que compem os ecossistemas. O conhecimento pelo

diagnstico ecotoxicolgico dos problemas causados pelo uso de agrotxicos de suma

importncia para uma viso prospectiva na avaliao do impacto ambiental das atividades

relacionadas agricultura, incluindo o uso de inseticidas. Essa informao pode subsidiar o

desenvolvimento de alternativas que conduzem sustentabilidade dos agroecossistemas

(MOREIRA et al., 1996).Assim, com respeito s caractersticas do Macex, no se tem dados

ecotoxicolgicos deste formicida no ecossistema aqutico, mas Tiepo et al. (2010)

publicaram um artigo abordando a ecotoxicidade deste produto sobre organismos terrestresincluindo plantas (Brassica olaracea, Lactuca sativa eMucuna aterrima), aneldeos (Eisenia

foetida), colmbolas (Folsomia candida) e microorganismos (hidrlise do diacetato de

fluorescenaFDA). O estudo mostrou que a maior concentrao testada (i.e., 50 g kg-1de

solo seco) no apresentou toxicidade para os organismos testados. Esta ausncia de

toxicidade para estes diverssos organismos fez com que os autores sugerissem que o

formicida Macex fosse considerado um formicida ambientalmente correto, isto , com baixo

impacto sobre os organismos no-alvos (TIEPO et al., 2010).


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3.4 TESTES ECOTOXICOLGICOS

Segundo Loureno (2006), os testes ecotoxicolgicos constituem o elemento

fundamental da Ecotoxicologia, os quais permitem avaliar o efeito da relao entre dose,

tempo de resposta e efeitos dos organismos em teste, possibilitando estimar o potencial

txico do agente qumico testado. O mesmo autor ainda cita que o potencial txico de uma

substncia calculado por meio de vrios parmetros que caracterizam sua ao, no em

um individuo isolado, mas em uma populao. Os organismos vivos podem exibir diferentes

reaes a uma mesma substncia txica, dependendo do metabolismo prprio da espcie,

das quantidades absorvidas e do tempo de exposio. Desta forma, os parmetros de

avaliao de toxicidade podem compreender desde alteraes fisiolgicas, bioqumicas e

histolgicas e at a letalidade. Os testes de toxicidade so divididos basicamente em doistipos, o agudo e o crnico, podendo ainda estes serem estticos (sem renovao do meio) e

dinmicos (com renovao do meio).

A ecotoxicidade, assim como a toxicidade humana, seja crnica ou aguda, muito

varivel entre os agrotxicos. Produtos muitos txicos para um organismo podem no ser

para outros e vice-versa. Entretanto, organismos muitos sensveis a um dado agrotxico

podem no ser expostos a ele em concentraes ou doses superiores aos nveis txicos

sendo que a exposio funo da biodisponibilidade do agrotxico ao organismo-teste

(SPADOTTO, 2006).

A mensurao da sensibilidade (resposta) de um organismo frente qualidade do

seu ambiente em funo do tempo pode ser denominada de biomonitoramento, o qual pode

ser a nvel bioqumico, fisiolgico, morfolgico e comportamental (KNIE & LOPES, 2004).

Toda essa sensibilidade depende no somente do fator a ser monitorado, mas tambm do

nvel nutricional, idade do organismo, sexo, fase de desenvolvimento, caractersticas

genticas, competio entre indivduos ou espcies, alm de fatores laboratoriais/ambientais

como luminosidade e temperatura do local onde o organismo exposto (MAGALHES &

FERRO FILHO, 2008).

A escolha dos organismo-testes geralmente segue alguns critrios, tais como:

abundncia e disponibilidade; representao ecolgica; cosmopolitismo da espcie;

conhecimento da sua biologia, fisiologia e hbitos alimentares; estabilidade gentica e

uniformidade de suas populaes; baixo ndice de sazonalidade; sensibilidade constante e

apurada; importncia comercial; facilidade de cultivo em laboratrio e, se possvel, a espcie


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deve ser nativa para a melhor representatividade dos ecossistemas estudados (KNIE &

LOPES, 2004).

Varias espcies de organismos vem sendo empregadas internacionalmente em

testes de toxicidade, gerando subsdios importantes para uma melhor avaliao e

caracterizao dos efeitos agudos e crnicos de diversos agentes txicos por si s ou

quando presentes em corpos receptores. Em outros termos, os testes de ecotoxicidade so

ferramentas muito importantes nas avaliaes de riscos ecolgicos provocados por produtos

qumicos. Dentre os principais grupos de organismos utilizados em ensaios laboratoriais,

destacam-se: microalgas, microcrustCCEOs, equinides, poliquetas, oligoquetas, peixes e

bactrias, representando os mais diversos ecossistemas e nveis trficos (MAGALHES;

FERRO FILHO, 2008).

Assim, os testes de toxicidade so ferramentas desejveis para avaliar a qualidade

das guas e/ou a carga poluidora de efluentes, uma vez que somente as anlises fsico-

qumicas tradicionalmente realizadas (e.g., DQO, DBO, COT, concentraes de metais e de

outras substncias de carter orgnico ou inorgnico), cujos limites encontram-se

estabelecidos nas legislaes ambientais, no so capazes de distinguir entre as

substncias que afetam os sistemas biolgicos e as que so inertes no ambiente e, por isso,

no so suficientes para avaliar o potencial de risco ambiental dos contaminantes

(BOUDOU & RIBEYRE, 1989; FERRARI et al., 2004; PANDARD et al., 2006).

Segundo Warne (2003), em uma mistura, trs tipos de efeitos combinados so

referenciados: potenciao, sinergismo e antagonismo. A potenciao descreve os casos

em que a toxicidade da mistura igual esperada por adio do efeitos txicos de cada um

dos elementos da mistura. J o sinergismo descreve casos em que a toxicidade da mistura

est mais elevada do que o esperado se a mistura fosse aditivo. Por ltimo, o antagonismo

de uma mistura realada quando a sua toxicidade menor do que a soma das toxicidades

do substncias que compem a mistura (WANE, 2003; PANOUILLRES et al., 2007).

Um outro tipo de resposta paralela toxicidade clssica a genotoxicidade, a qual

so agresses ao material gentico. H muito tempo j se conhece que no meio-ambiente

existem muitos agentes fsicos e qumicos capazes de provocar alteraes no material

gentico dos seres vivos (KIHLMAN, 1956), definidos aqui como agentes genotxicos. O

interesse maior de estudar os agentes genotxicos que esta classe de poluentes ameaa

a integridade dos ecossistemas, pois estes dependem da sobrevivncia e reproduo das


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espcies/populaes. Nesse sentido, a proteo das espcies/populaes depende do

desenvolvimento de sistemas eficazes de deteo de agentes genotxicos no ar, na gua e

no solo. Uma abordagem mais pragmtica do ponto de vista ambiental a realizao de

testes in vivo e/ou in situ, os quais durante suas execues experimentais integram asmuitas variveis ambientais que podem influenciar no potencial genotxico de uma

substncia qumica (KLEKOWSKI, 1982; SANDHU et al., 1994). Entre os organismos que

podem ser usados nestas avaliaes genotxicas, os vegetais ocupam um lugar de

destaque (GRANT, 1994, COTELLE et al., 1999)

Dentre os vegetais que podem ser utilizados, o teste com a espcie Vicia fabapode

ser considerado um dos mais simples (MA, 1982), permitindo variaes experimentais

maiores, o que de interesse para o presente projeto. O teste com V. faba geralmente baseado em aberraes cromossmicas e/ou formao de microncleos que podem ter

origem clastognica (quebra de cromossomos pelo txico) ou aneugnica (no-migrao de

algum cromossomo durante a diviso celular), sendo inclusive padronizado por

organizaes como a Associao Francesa de Normalizao (AFNOR) e Organizao

Internacional de Padronizao (ISO) para o caso da deteco de guas e solos

contaminados (AFNOR, 2004; ISO, 2010).

Com relao ao impacto do formicida sobre os micro-organismos aquticos, a

hidrlise de FDA um mtodo que avalia a atividade hidroltica indiscriminada e tem sido

correlacionada positivamente com a respirao dos micro-organismos no solo (SCHNRER

& ROSSWALL, 1982). Em particular, a atividade enzimtica proporciona catlise de diversas

reaes que so necessrias ao ciclo de vida dos microrganismos, na decomposio de

resduos orgnicos durante o ciclo de nutrientes e na formao da matria orgnica e na

estrutura do solo (BURNS, 1978). Diversas pesquisas utilizando FDA para determinar a

atividade enzimtica j foram evidenciadas. As atividades enzimticas (FDA, urease e

glicosidase) serviram como indicadoras do potencial da funcionalidade dos ecossistemas e,aliadas aos demais atributos biolgicos, tornam-se boas indicadoras da qualidade

microbiolgica de uma amostra (CARVALHO, 2005).

Por outro lado, as alteraes de comportamento podem ser resultantes dos efeitos

txicos e o comportamento dos organismos intoxicados permite explorar os possveis

mecanismos de intoxicao envolvidos na ao dos txicos (HODGSON, 2010). As

formigas, sendo organismos eussociais (vivendo em comunidades), podem ter suas


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mobilidades, comportamento e percepes alteradas pela influncia do txico absorvido,

pois sabe-se que mudanas de comportamento podem ter bases fisiolgicas e/ou

neurolgicas (HODGSON, 2010). Qualquer mudana de comportamento nos organismos

que vivem em comunidade pode inviabilizar a cooperao entre os organismos e destruir acomunidade (AYASSE et al., 2001).


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4 MATERIAIS E MTODOS

A Figura 4 apresenta a sequncia metodolgica utilizada neste trabalho para a

avaliao do formicida. Os testes de ecotoxicidade foram realizados no Laboratrio Ecotec,localizado no municpio de Balnerio Camburi. J os testes de genotoxicidade e hidrolise

do FDA foram realizados no laboratrio de Remediao Ambiental da UNIVALI. As

metodologias empregadas no presente estudo foram baseadas em trabalhos publicados e

so descritas a seguir.

Preparao do

Macex

Teste de

estabilidade

toxicolgica

Testes

ecotoxicolgicos

Teste da hidrlise

enzimtica do

FDA

Teste de

GenotoxicidadeResultados

Figura 4 Fluxograma dos testes usados na avaliao ecotoxicolgica e genotxica doformicida Macex.

4.1 PREPARAO DO TXICO

Como o formicida Macex comercializado na forma de pequenos gros (iscas),

este foi macerado usando um almofariz e pilo, obtendo assim um p que foi

homogeneizado em gua destilada levemente aquecida, com intuito de facilitar a diluio e

com uma temperatura mxima de 45 C para que no ocorra a degradao trmica dos

compostos, em um perodo de duas horas, sob agitao na concentrao de 5 g L -1. Em

seguida houve a diluio desta soluo em diferentes concentraes que foram usadas na

exposio dos organismos-testes.

4.2 TESTES DE ECOTOXICIDADEPara a realizao dos testes ecotoxicolgicos foram utilizados neste trabalho cinco

organismos testes, sendo eles: Danio rerio, Daphnia magna, Scenedesmus subspicatus,

Aliivibrio fischeri e Vicia faba e uma mistura de microorgaanismos presentes nas guas

naturais.


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4.2.1 Teste Lumistox com a bactria Ali iv ibr io f ischeri

O teste bacteriano de inibio de luminescncia utilizando Aliivibrio fischeri

(anteriormente conhecido comoAliivibrio fischeri) como organismo-teste (Lumistox, Dr.Bruno

Lange, Dsseldorf, Alemanha) foi realizado de acordo com a norma ISO (1996), seguindo as

condies protocolares (23C 2C, com pH igual a 7 e tempo de exposio de 30 min.). O

reagente bacteriano liofilizado foi obtido a partir da Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM # 7151 N, Braunschweig, Alemanha). Executou-se

trs ensaios diferente em duplicata a fim de avaliar a variabilidade do processo, onde o

composto 3,5 diclorofenol a 6 mg L-1 foi utilizado com controle positivo. A diluio da

amostra de formicida que causou 50% de inibio de luminescncia das bactrias com

relao s bactriascontroles (CI50) foi calculada pelo programa acoplado ao equipamento(Luminmetro), usando a interpolao grfica.

4.2.2. Teste de inibio do crescimento das algasPseudokirchneriel lasubcapitata

A espcie de alga utilizada foi a Pseudokirchneriella subcapitata (no passado

conhecida por Selenastrum capricornutum) Chodat (cepa 86.81 SAG, Gttingen, Alemanha).

Realizaram-se trs testes com as algas de acordo com a ISO (1990), tendo, em cada teste,trs replicas para cada concentrao e controle. Como controle positivo utilizou-se

dicromato de potssio. A densidade da mistura foi ajustada para 10.000 clulas.mL-1atravs

de diluio com meio ISO. J os frascos do ensaio foram incubados em um agitador (100

rpm), com iluminao contnua de 70 mE m-2s-1com lmpadas brancas fluorescentes (luz

fria) e temperatura de 23 2C. Aps 72 h de incubao, realizou-se a medio do efeito

inibidor com base na atividade fluorescente (excitao/emisso foram fixados em

comprimentos de ondas 488/685 nm) com um espectrofotmetro Shimadzu RF-551 (Kyoto,

Japo).

Alm disso, com intuito de verificar a estabilidade txica do Macex, foram realizados

4 ensaios com algas colocadas em microplacas (96 poos) em dias consecutivos de acordo

com o procedimento descrito no Radetski et ai. (1995), usando sempre a soluo de agente

txico preparada no primeiro dia. Nestes testes com as microplacas, a pr-cultura de algas

com idade de 3-d foi preparada de meio ISO concentrado 2 vezes. A densidade celular da

mistura foi ajustada a 40.000 clulas.mL-1 e 110 L dessa soluo de algas foi micro


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35

pipetado em 60 poos da microplacas (os poos exteriores no foram usados), onde

tambm foram acrescentados 110 L das solues txicas concentradas 2 duas vezes

(gua para os controles). Aos se misturarem, as solues de algas e de txico caem pela

metade pela diluio entre elas. Antes da incubao, cada microplaca foi selada em sacosplsticos transparente para minimizar a evaporao durante o perodo de exposio. Ao fim

de 72 h, os contedos das microplacas foram novamente suspensos e o volume total de

cada poo foi micro-pipetado para uma frasco contendo 20 ml de uma soluo eletroltica

(Isoton II, Coulter-Frana, Paris, Frana). O fator de diluio foi estimado em 20/0,22, tendo

a evaporao sido inferior a 5%. As algas foram enumeradas com um contador Coulter

(modelo ZM, a abertura da clula de 70 mm). A determinao da porcentagem de inibio, a

rea sob a curva de crescimento foi calculada com apenas dois tempos de exposio

(exemplo 0 e 72 h). A determinao da concentrao inibidora de 50% do crescimento

(CI50) foi determinada pelo mtodo Probit.

4.2.3 Teste de imobilidade com Daphnia magna

O teste de imobilizao de Daphnia magnacom durao de 48 horas foi realizado

em conformidade com a norma ISO (1999) 232C, utilizando 5 indivduos para cada

rplica (com menos de 24 horas de vida) em copos de vidro de 50 mL com 30 mL do meio

teste contendo o txico. Dois ensaios diferentes (em triplicatas) foram realizados para cada

concentrao do formicida e controle a fim de avaliar a variabilidade do processo, tendo o

dicromato de potssio com controle positivo 0,9 mg L-1. Aps 48 h de exposio foi

verificado o nmero de indivduos imobilizados, o que permitiu a determinao do valor de

CE50 atravs do teste de Fischer.

4.2.4. Teste com peixe Danio rerio

Os testes de toxicidade estticos foram conduzidos de acordo com a norma ISO

(1993) utilizando Danio rerio. As amostras de peixes zebras Danio rerioHamilton Buchanan,

foram obtidos a partir de um fornecedor comercial (indivduos jovens, recm eclodidos) e

aclimatados s condies de teste com gua sem cloro (pH: 8,1; condutividade: 56 mS.cm-1;

OD: 10,5 mg L-1; dureza total: 88 mg mg L-1de CaCO3; alcalinidade: CaO 71 mg mg L-1) 9

dias antes da experincia. A concentrao de oxignio dissolvido nas solues-teste foi

medida no incio e no fim da experincia utilizando um eletrodo de Oxignio. Os peixes


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36

foram expostos diferentes concentraes de Macex durante 96 h, com trs replicas de

quatro indivduos por diluio e colocados em frascos de 2,5 L de soluo de teste

ligeiramente arejadas sob 232C, onde para os controles foi utilizado gua da torneira sem

cloro. Realizaram-se dois diferentes testes para cada concentrao do txico a fim deverificar a variabilidade do processo, sendo que para o controle positivo utilizou-se

dicromato de potssio (concentrao de 97 mg mg L-1). Aps 96 h de exposio foi

verificado o nmero de indivduos mortos, o que permitiu a determinao do valor de CI50

atravs do teste de Fischer.

4.2.5. Determinao da atividade enzimtica pela hidrlise da FDA.

O mtodo consiste em quantificar o Diacetato de Fluorescena [3,6-

diacetilfluoresceina (FDA)] hidrolisada em amostras que contm microorganismos. O teste

foi iniciado com a preparao de uma soluo tampo de fosfato de sdio 60 mM, pH 7,6

(8,7 g de K2HPO4+ 1,3 g KH2PO4para 1 L de gua), sendo que o pH foi ajustado com o HCl

0,01M. As amostras de gua coletadas em campo foram distribudas em tubos de ensaios (5

mL de amostra) em trs repeties para cada amostra. Concluda esta fase, acrescentou-se

0,2 mL da soluo de FDA (concentrao final no tubo del 2 mg.mL -1). A preparao da

soluo de FDA foi feita pela dissoluo de 40 mg de Diacetato de Fluorescena (FLUKA)

em 1 mL acetona p.a. e 15 mL gua destilada. Posteriormente a esta etapa os frascos sem

formicida e com diferentes concentraes do formicida foram fechados com folhas de

alumnio e incubados na temperatura de 27C por at 72 h. As amostras foram analisadas

no espectrofotmetro 490 nm (Espectrofotmetro INSTRUTHERM, Modelo UV 1100). Os

resultados foram expressos de forma bruta, em valores de variao das unidades de

absorbncia. A determinao da concentrao inibidora de 50% da colorao (CI50) foi

determinada pelo mtodo Probit.

4.3 TESTE DE GENOTOXICIDADE

4.2.6 Teste de genotoxicidade comVicia faba

Para os testes de genotoxicidade foram utilizadas sementes secas de

Vicia faba. Um protocolo j publicado foi adotado com pequenas modificaes para este

teste (AFNOR, 2004). As sementes foram deixadas em gua deionizada durante 24 h

e depois se colocar as sementes entre duas camadas de algodo molhado a 22 C para


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durante 3 dias para que a germinao pudesse ocorrer. Aps a remoo das pontas das

razes primrias, as plantas foram colocadas em soluo nutritiva Hoagland a 22 C durante

4 dias para promover o desenvolvimento de razes secundrias. O formicida foi diludo

em soluo de Hoagland em uma srie de diluio partindo da concentrao de 5 g.L -1,tendo como controle negativo uma soluo de Hoagland e controle positivo a hidrazida

maleica (10 M) (HM; CAS No. 123-33-1) diludo em soluo nutritiva de

Hoagland. Colocou-se 3 plantas de Vicia faba em cada recipiente contendo 100 mL da

soluo-teste em triplicatas por concentrao, sendo que a exposio ocorreu em

lugar escuro e com durao 72 horas sem renovao do meio de exposio. Aps a

exposio, as razes secundrias foram lavadas com gua deionizada em abundncia. Para

o teste de microncleo, a ponta de cada raiz foi cortada e fixada durante a noite em soluo

de Carnoy (25% de cido actico glacial: etanol 75%, v:v) a 4 C e armazenada, se

necessrio, em etanol a 70% a 4 C. Em seguida, as pontas de razes foram

hidrolisadas em HCl 1 N a 60 C durante 6 minutos e esmagadas entre uma lmina e uma

lamela, sendo coradas com soluo a 1% de aceto-orcena. As frequncias de

microncleos foram numeradas com 1.000 clulas por ponta de raiz (duas razes por rplica)

em um microscpio com aumento de 400X. Ao mesmo tempo, houve a anotao do nmero

de clulas mitticas. A razo entre o nmero de clulas na mitose e do nmero total

de clulas chamado o ndice mittico (IM), sendo este indicador de citotoxicidade,

enquanto que o nmero de microncleos indicador de gentoxicidade.

4.4. ANLISE ESTATSTICA DOS DADOS DOS TESTES DE ECOTOXICIDADE

A anlise estatstica foi realizada atravs de um microcomputador utilizando o

programa TOXSTAT 3.0. Utilizou-se o teste de William (P 0,05) para obter a concentrao

sem efeitos observveis (CSEO) e menor concentrao com efeitos observveis (CCEO),aps a verificao da normalidade pelo teste de Shapiro-Wilk e a homogeneidade da

varincia pelo teste de Hartley. Em alguns casos (peixe e dafndeos) foi utilizados o teste de

Fischer (P 0.05). Por fim, os valores de CI50 ou CE50 foram calculados por interpolao

grfica ou anlise Probit.


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38

5 RESULTADOS

5.1 TESTE DE ESTABILIDADE TOXICOLGICA DO MACEX

Em virtude da durao dos testes ecotoxicolgicos, procurou-se conhecer a

estabilidade txica do formicida Macex em soluo em funo do tempo. Assim, um

experimento foi concebido para verificar se os compostos sofriam degradao em soluo, o

que se poderia perceber pela diminuio de sua toxicidade em funo do tempo. Os

resultados dos testes realizados com a mesma soluo estoque do formicida, mas com

idades diferentes, so mostrados na Tabela 3.Tabela 3 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subc apitataexpostas diferentesconcentraes do formicida Macex. Os valores so de 4 testes iniciados com 24 h de intervalo

usando a mesma soluo estoque de Macex no preparo das diluies.

Dia CSEO (g L-1) CCEO (g L-1) CI50 (g L-1)Intervalo deConfiana

(95%)

1 0,06 0,12 0,63

0,520,60

2 0,03 0,06 0,49

3 0,06 0,12 0,59

4 0,06 0,12 0,55

As leituras para os testes foram realizadas durante 4 dias com intervalo de 24 horas,

totalizado para o ultima leitura um total de 7 dias aps o preparo da soluo estoque. Os

resultados da Tabela 3 mostram que o Macex em soluo estvel para o perodo testado,

pois se contarmos desde o dia do preparo da soluo estoque at o ltimo dia do ltimo

teste. Assim, no conjunto dos dados obtidos, a CI50 mdia dos 4 testes foi de 0,56 g L-1 com

um desvio-padro de 0.06 g L-1e um coeficiente de variao de 10.6%. Esta estabilidade

txica do Macex assegura que os resultados dos testes no sofreram nenhum vis devido

degradao intrnseca do produto em soluo. A estabilidade da toxicidade do produto pode

ser explicada pela composio do formicida, pois os cidos graxos e a cafena no so

facilmente degradados ou hidrolisados em soluo com pH prximo do neutro. Entretanto,


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39

no se realizou analise qumica para cada leitura e sim, s para a soluo estoque a qual

mostrou valor similar concentrao nominal com variao de concentrao menor do que

10 % entre a concentrao medida e a concentrao nominal.

5.2 TESTE DE TOXICIDADE COMALIIVIBRIO FISCHERI.

O teste de ecotoxicidade mais realizado no mundo em termos de custo e rapidez o

que utiliza a bactria marinha bioluminescente Aliivibrio fischeri, o qual recebe o nome de

Microtox ou Lumistox. Nesse teste medida a reduo da luminescncia emitida

naturalmente pela bactria quando ela posta em contato com um agente txico, o qual

inibe a atividade da enzima luciferase. O tempo de durao do teste varia entre 15 e 60 min.

Este teste considerado rpido, sensvel, fcil de executar e de baixo custo que pode ser

utilizado no controle da poluio das guas e efluentes industriais, tendo este teste o maior

banco de dados ecotoxicolgicos. Em termos de amostras testadas. Apesar dessas

vantagens um teste criticado por empregar uma bactria marinha de pouco significado

ecolgico (ZAGATTO e BERTOLETTI, 2006), no entanto, o metabolismo e o comportamento

daA. fischeri parecido com os das bactrias heterotrficas presentes no meio ambiente.

Conforme mostra a Figura 4, houve diferena significativa na luminescncia

bacteriana entre os microrganismos controles e os que foram expostos ao formicida Macex.

Figura 5Valores de luminescncia para as bactrias Ali iv ibr io f ischer iexpostas diferentesconcentraes do formicida Macex durante 30 minutos.


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40

Assim, para A. fischeri, o valor de CI50 foi de 0,89 g L -1, enquanto os valores de

CSEO e CCEO foram de 0,12 g L-1e 0,25 g L-1, como podem ser vistos na Tabela 4. Os

valores dos coeficientes de variao, geralmente menores que 15%, so aceitveis, visto

que a literatura preconiza como valor aceitvel de at 20%. Baseado nesses valores obtidosnos testes, o Macex apresenta baixa toxicidade, podendo assim concluir que a quantidade

solubilizada do formicida no meio ambiente no afetar significativamente a atividade

bacteriana dos ecossistemas aquticos. O nico estudo de ecotoxicologia aqutica sobre o

Macex encontrado na literatura e que usouA. fischeri, mostrou uma CI50 de 0,98 g L-1, com

CSEO e CCEO de 0,25 e 0,50 g L-1, o que so valores muito prximos daqueles obtidos no

presente trabalho (BURGA-PEREZ et al., 2013).

Tabela 4 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as bactrias Ali iv ibr io f ischer i expostas diferentes concentraes do formicida Macex.

Macex(g L1)

LuminescnciaCV(%)

CSEO(g L1)

CCEO(g L1)

CI50(g L1)

Intervalo deconfiana (95%)

0 1,23 15,2

0,12 0,25 0,89 0,87-0,91

0,03 1,21 12,80,06 1,28 9,5

0,12 1,19 13,7

0,25 1,04 10,6

0,5 0,89 12,31 0,4 15,9

5.3 TESTE DE TOXICIDADE COM PSEUDOKIRCHNERIELLA SUBCAPITATA.

Quando se trata de um teste crnico em meio aqutico relativamente rpido, as algas

ocupam lugar de destaque, pois a cada cerca de 20 h, uma nova gerao de algas

formada. Os ensaios com algas tambm possibilitam determinar o potencial de eutrofizao

que os outros organismos aquticos no medem. A Figura 5 mostra os resultados dosensaios de inibio do crescimento das algas P. subcapitata expostas diferentes

concentrao de Macex.


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41

Figura 6 - Valores mdios da variao da fluorescncia da alga Pseudokirchneriellasubcapitataexposta diferentes concentraes de Macex durante 72 h.

Aps anlise estattica obteve-se um valor de CI50de 0,49 g L-1, CSEO de 0,06 g L-1e

CCEO de 0,12 g L-1 (tabela 5) O estudo de Burga-Prez et al. (2013) com Macex e P.

subcapitata encontrou um valor de CI50 de 0,79 g L-1, com valores de CSEO e CCEO de

0,25 e 0,50 g L-1, respectivamente. Estes valores no so to prximos aos encontrados

neste trabalho realizado em Erlenmeyers, pois os testes realizados por Burga-Prez et al.

(2013) foram realizados em microplacas.

Tabela 5 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para as algas P. subc apitataexpostas diferentesconcentraes do formicida Macex.

Macex(g L1)

FluorescnciaCV(%)

CSEO(g L1)

CCEO(g L1)

CI50(g L1)


0 1,49 13,5

0,06 0,12 0,49 0,44-0,54

0,03 1,54 14,9

0,06 1,42 10,8

0,12 1,21 13,50,25 1,09 18,10,5 0,71 11,5

1 0,31 20,3


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42

5.4 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DAPHNIA MAGNA.

Na Ecotoxicologia, o uso de espcies de pequeno porte e ciclo de vida no muito

longo se mostram ideal nos estudos em laboratrios. A espcie Daphnia magna (entre

outros cladceros) tem o protocolo de cultivo em laboratrio bem estabelecido e no

apresenta muitas dificuldades para sua manuteno (ZAGATTO & BERTOLETTI, 2006). As

dfnias so importantes nas cadeias alimentares e so fonte significativa de alimento para

peixes, como tambm so sensveis a vrios contaminantes do ambiente aqutico (COSTA,

2008). Alm disso, a reproduo assexuada desses crustCCEOs por partenognese

garante a produo de organismos geneticamente idnticos permitindo, assim, a obteno

de organismos-teste com sensibilidade constante.

A Figura 6 mostra os resultados dos ensaios de mobilidade do cladcero Daphnia

magnaexpostos diferentes concentrao de Macex.

Figura 7 - Valores mdios de Daphnia m agnaimobilizada aps 48 h de exposio a diferentesconcentraes de Macex.

Os resultados da Tabela 5mostram uma baixa toxicidade do formicida Macex face

ao cladcero Daphnia magna, uma vez que os valores CE50foi de 0,68 g L-1e para o CSEO

o valor foi de 0,12 g L-1 e CCEO de 0,25 g L-1, sendo esses valores prximos aos obtidos

para A. fischeri e P. subcapitata. No estudo de Burga-Perez et al. (2013), os valores de

CE50 encontrados para D. magnafoi de 0,82 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO

foram respectivamente de 0,25 e 0,50 g L-1.


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Tabela 6 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para Daphnia magna expostas diferentesconcentraes do formicida Macex.

Macex(g L1)

ImobilidadeCV

CSEO(g L1)

CCEO(g L1)

CE50(g L1)

Intervalo deconfiana (95%)(%)

0 0 -

0,12 0,25 0,68 0,61-0,75

0,03 0 -

0,06 0 -0,12 6,7 12,3

0,25 20 13,1

0,5 43,3 15,81 80 14,6

5.5 TESTES DE ECOTOXIDADE DO MACEX COM DANIO RERIOOs principais representantes dos consumidores secundrios nas cadeias alimentares

so os peixes (GHERARDI-GOLDSTEIN et al., 1990). Diversas espcies de peixes so

utilizadas como bioindicadores. No Brasil a espcie mais utilizada o Danio rerio, o qual

vulgarmente conhecido como peixe paulistinha ou peixe zebra. Outra espcie recomendada

pela ABNT Pimephales promelas(ABNT, 2004). Os peixes, por serem considerados como

importante recurso alimentcio, podem ser a principal via de contaminao de produtos

qumicos txicos para o homem, via bioacumulao, da a sua importncia como

organismos indicadores.

A Tabela 7 mostra os resultados dos ensaios de letalidade do peixe Danio rerio

expostos diferentes concentrao de Macex.

Tabela 7 - Valores mdio de letalidade de Danio rerio, aps 96 h de exposio diferentesconcentraes de Macex.

Macex(g L1) Letalidade(%) CV CSEO(g L1) CCEO(g L1) CL50(g L1) Intervalo deconfiana (95%)

0 0 -

1 2 >2 -

0,06 0 -

0,12 0 -

0,25 0 -0,5 0 -

1 0 -

2 12,5 16,9


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Os valores obtidos no teste de ecotoxicidade para Danio rerio nas diferentes

concentraes do Macex no foram suficiente para calcular uma CL50. Entretanto os valores

obtidos para CSEO e CCEO foram de 1,00 g L-1 e 2,00 g L-1 respectivamente. Assim os

resultados sugerem uma baixo impacto ambiental do Macex para peixes aps exposioaguda.

5.6 TESTE DA HIDRLISE ENZIMTICA DO FDA

O impacto do Macex sobre a atividade hidroltica dos microorganismos presentes nas

guas naturais foi analizada pela variao da absorbncia relativa hidrlise do FDA, a qual

forma a fluorescena, deixando a soluo com colorao verde. Assim, a Figura 8 mostra osresultados dos ensaios de variao da absorbncia provocada pela hidrlise da FDA quando

exposta aos microorganismos aquticos expostos diferentes concentrao de Macex.

Figura 8 - Valores mdios da variao da absorbncia devido hidrlise do FDA pormicroorganismos presentes nas guas expostos diferentes concentraes de Macex durante72 h.

Assim, para ahidrlise do FDA pelos microorganismos apresentados na Tabela 8, o

valor de CI50 foi > 1,0 g L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,25 g L -1e

0,50 g L-1. Estes valores podem ser comparados com os valores obtidos com o outro

microorganismo usado neste trabalho, a bactria A. fischeri, cujo valor de CI50foi de 0,89 g

L-1, enquanto os valores de CSEO e CCEO foram de 0,12 g L -1e 0,25 g L-1. Poder-se-a


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45

concluir que os microorganismos naturais so um pouco mais resistentes toxicidade do

Macex, mas mesmo assim, o valor da CI50 foi relativamente alto, com baixa probabilidade

de causar efeitos nefastos aos microorganismos, pois dificilmente encontraremos situaes

no meio ambiente onde o Macex estar em concentraes to elevadas quanto estas.

Tabela 8 - Valores de CSEO, CCEO e CI50 para microorganismos aquticosexpostos diferentes concentraes do formicida Macex.

Macex(g L1)

AbsorbnciaCV(%)

CSEO(g L1)

CCEO(g L1)

CI50(g L1)


0 0,95 15,8

0,25 0,5 >1 -

0,03 0,99 16,9

0,06 0,88 17,8

0,12 1,02 16,5

0,25 0,87 17,00,5 0,71 14,91 0,61 14,2

5.7 TESTE DE GENOTOXICIDADE COM VICIA FABA

A Figura 3 apresenta o ndice mittico e as frequncias de microncleos obtidos na

exposio de Vicia faba em diferentes concentraes do formicida. As concentraes de

Macex at 0,25 g L-1 no promoveram efeitos no ndice mittico da Vicia faba, mas as

concentraes de 0,5 e 2,0 g L-1apresentaram uma diminuio estaticamente significativa

no ndice mittico.

Em relao as frequncia de microncleos, foi observado a no-induo para

concentraes inferiores de 2,0 g L-1, enquanto que, o controle positivo (isto , B2) mostrou

um aumento significativo na frequncia de microncleos em comparao com o controle

negativo, ou seja, B1 (soluo Hoagland).


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46

Mcn/1000 clulas

Figura 9 - Mdia ( DP) da frequncia de microncleos (Mcn/1000 clulas) e ndice mittico (IM,%) em razes de Vicia fabaexpostas 48h ao formicida Macex HM (hidrazida maleica): controle

positivo.* diferena estatisticamente significativa com relao ao controle (P 0.05)** diferena estatisticamente significativa com relao ao controle (P 0.01).

Na literatura no h relatos sobre a genotoxicidade/mutagenicidade dos ingredientes

do Macex nas concentraes utilizadas para este estudo. A cafena, possvel ingrediente

ativo do Macex, foi relatada como sendo fracamente mutagnica em alguns modelos

animais no mamferos. Nos ensaios de Salmonella (teste de Ames), no houve

mutagenicidade e este composto (cafena) no teve efeitos significativo na frequncia deinduo nas trocas de cromtides irms (KIHLMAN & STURELID, 1978)

Apesar do nmero pequeno de ensaios utilizados neste estudo, esses resultados so

promissores em relao aos impactos ambientais a partir da genotoxicidade, pois enquanto

o Macex no apresenta este efeito, o formicida clorpirifos tem sido relatado como genotxico

para a espcie de peixe da espcie Channa punctatuse em leuccitos de ratos (ALI et al.,

2008; PORICHHA et al., 1998; RAHMAN et al., 2002.). Tambm h estudos relatando este

0

10

20

30

40

50

60

Formicida (g L-1)

12

IM (%)

Mcn

0 0.125 0.25 0.5 2 HM0

2

4

6

8

10IM *

*

**

***


47/66

47

produto como genotxico para clulas de razes das plantas Crepis capilares,Allium cepae

para ensaio de microncleo com Tradescantia (ASITA & MAKHALEMELE, 2008; DIMITROV

& GADEVA 1997; RODRIGUES et al., 1998).


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48

6 DISCUSSO

A crise de biodiversidade que se observa atualmente devido, entre outras causas,

presena de substncias qumicas txicas liberadas no meio ambiente. No caso dosagrotxicos, um estudo recente analizou os ndices de biodiversidade de invertebrados em

riachos da Frana, Alemanha e Austrlia (BEKETOV et al., 2013). Estes autores

constataram perdas de at 42% para certas famlias e espcies, mesmo em regies onde o

uso de agrotxicos est bem regulamentada, obedecendo aos padres de proteo

ambiental. Para se evitar este tipo de problema, de fundamental importncia o uso dos

testes de ecotoxicidade antes de se liberar o produto para o mercado e mesmo depois de

ser liberado, pois pode haver casos em que as transformaes ambientais deixam os

metablitos do produto mais perigosos. Tambm podem existir espcies de organismos notestados previamente que possam ser sensveis a este produto e/ou metablitos.

A Tabela 9mostra baixos efeitos a curto prazo (testes agudos) de ecotoxicidade em

diferentes espcies de organismos aquticos. Com base nesses valores, possvel

descrever a toxicidade do Macex como no sendo altamente txico, apresentando CE(CI)50

maiores que 0,1 g L-1, limite aceito como sendo no txico (KAMRIN, 1977). Essa baixa

ecotoxicidade pode ser explicado pelo fato que os ingredientes do Macex no so txicos e

tambm pelo fato que o produto comercializado mostra baixa solubilidade em gua. Nesse

sentido, alguns estudos realizados em vrias regies do mundo mostram que a

porcentagem dos produtos utilizados na agricultura que atingem os ambientes aquticos

geralmente baixa (JURY et al., 1987; SOLOMON et al., 1996).

Deve-se salientar que os bioensaios utilizados para este estudo incluem organismos-

testes requeridos pela Diretiva 91/414/CEE para os novos produtos qumicos industriais

(MARTINS et al. 2007).


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49

Tabela 9 - Ecotoxicidade do Macex obtidos atravs de quatro espcies de organismosteste eoutros dados de ecotoxicidade para formicidas comercializados a base de sulfluramida,fipronil e clorpirifos.

OrganismosTeste

Parmetros

(CI, CL ouCE50)

Produto (mg L-1)

Macex Sulfluramida Fipronil Clorpirifos

BacteriaInibio de

luminescncia890 (30

min)-

> 100(30 min)

2,8(30 min)

Microorganismos Hidrlise FDA>1000(72 h)

- - -

AlgaInibio decrescimento

490(72 h)

68,1 (96 h) 0,16 (96 h) 3,0 (96 h)

Dafnia Imobilidade680

(48 h)0,39 (48 h) 0,19 (48 h) 0,0017 (48 h)

Peixe Letalidade > 2000(96 h)

9,9 85 0,43

Segundo a classificao de toxicidade aguda da Organizao Mundial da Sade

(OMS), a sulfluramida classificada como pouco perigoso, enquanto finopropil e clorpirifos

so classificados como moderadamente perigosos. Entretanto, de acordo com os dados

publicados, a ecotoxicidade destes inseticidas diferente, com finopropil e clorpirifos sendo

classificados como altamentes ecotxicos (BARRON & WOODBURN 1995; GUNASEKARA

et al. 2007) e enquanto sulfluramida e considerando como ligeiramente ecotxico

(KRIEGER, 2001).

No caso do Macex, a classificao

Renan Chiprauski Testolin

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