Relatório de final de iniciação científica

Processo:

Estudo eletroquímico para determinação seletiva de α-lapachona e β-lapachona usando um

eletrodo compósito de epóxi- grafite

Aluna: Ana Beatriz Azevedo

Orientador: Ricardo Queiroz Aucélio

Co-orientadora: Joseany de Moraes Santos Almeida

Departamento de Química

Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro (PUC-Rio)

Resumo

O projeto teve como objetivo a determinação dos isômeros α-lapachona e β-lapachona

através da voltametria anódica por onda quadrada (VOQ), utilizando um eletrodo de epóxi-

grafite feito no laboratório. O meio eletrolítico consiste em uma solução aquosa contendo o

surfactante catiônico CTAB (1,2 × 10-4 mol L-1), tampão fosfato (4,0 × 10-2 mol L-1; pH 6,0) e

KNO3 (1,0 mol L-1). O surfactante catiônico conseguiu melhorar a difusão e a interação do

eletrodo com os analitos, produzindo um processo reversível para β-lapachona e quasi-reversível

para α-lapachona que melhorou a detecção da corrente total através da VOQ. Os sinais de α-

lapachona e β-lapachona foram detectados em -370 mV e -190 mV, respectivamente, após uma

pré-concentração em 400 mV durante 140 s, usando uma frequência de 30 Hz e uma amplitude

de pulso de 40 mV e com um passo potencial de 20 mV. O limite de detecção instrumental foi

na ordem de 10-7 e 10-6 mol L-1 para α-lapachona e β-lapachona, respectivamente e a faixa

dinâmica linear foi na ordem de duas grandezas. A determinação de α-lapachona e β-lapachona

no extrato etanólico fortificado presente no cerne da planta Tabebuia Impetiginosa foi obtida

através da uma extração líquido-líquido usando, acetato de etila e solução de bicarbonato de

sódio 2,5 %, que promoveu a separação de α-lapachona e β-lapachona dos interferentes da

amostra, incluindo o lapachol que é o componente majoritário presente na amostra. Os resultados

concordaram, em um nível de confiança de 95%, com os obtidos utilizando a cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção absorciométrica.

Palavras-chave: eletrodo de epóxi-grafite; α-lapachona; β-lapachona; voltametria de onda

quadrada; extração líquido-líquido.

Resumo da produção científica

Apresentação de trabalhos em eventos científicos:

“Determinação da concentração micelar crítica de surfactantes catiônicos utilizando pontos quânticos de

grafeno amino-funcionalizados como sonda fotoluminescente” Toloza CAT, Khan, S, Azevedo ABO,

Peréz-Gramatges A, Aucelio RQ, 18º Encontro Nacional de Química Analítica (ENQA) CD de Resumos

OUT 022, Florianópolis, Brasil, setembro de 2016.

Obs: Esse trabalho estava relacionado com o projeto original da candidata, que foi posteriormente

alterado por razões logísticas e por conta do potencial de publicação mais rápido do assunto do novo tema

do projeto.

Artigo científico: O artigo científico referente ao projeto está em processo de elaboração e

deverá ser submetido em breve.

1 Introdução

Os isômeros α-lapachona e β-lapachona são substâncias de origem natural pertencente à

classe das naftoquinonas, encontrado, em pequenas quantidades, nas plantas da família

Bignoniacea e com atividade fungicida comprovada [1,2]. Diversas atividades biológicas das

naftoquinonas, tais como antitumoral [3], bactericida [4], inibidora do HIV [5], moluscicida [6]

entre outras, foram comprovadas. Isto despertou grande interesse pela química das bignoniáceas

nos últimos anos. De Souza e colaboradores mostraram que lapachol, β-lapachona e α-lapachona,

têm atividade contra o fungo Fusarium oxysporum [2]. Ao contrário dos agentes quimioterápicos

convencionais, a β-lapachona foi relatada para induzir seletivamente a morte celular em

humanos, em células cancerígenas, mas não em células normais [7]. Neste contexto particular, a

β-lapachona resultou em um tratamento promissor na fase I dos testes de câncer pancreático,

câncer de cabeça e pescoço e leiomiossarcoma [8].

A principal abordagem na determinação de α-lapachona e β-lapachona e de outras

naftoquinonas presentes em extratos de plantas é baseada na cromatografia líquida de troca

iônica (HPLC) e na fotometria de absorção e detecção UV [9,10]. Steinert et al. propôs a

cromatografia líquida de alta eficiência na região do ultravioleta (HPLC-UV) para separar e

determinar as naftoquinonas em extratos de Tabebuia avellanedae (Bignoniaceae) [9].

Naftoquinonas foram isoladas com extrato etanólico da raiz da Zeyheria montana (genus

Tabeluia) e foi quantificado, com sucesso, através da HPLC-UV [10].

Voltametria foi empregada em estudos redox e na determinação de naftoquinonas [11-

14]. A redução eletroquímica de α e β-lapachonas foi estudada por Oliveira-Brett et al.,

utilizando a voltametria cíclica (VC), voltametria de onda quadrada (VOQ) e voltametria de

pulso diferencial (VPD) em um meio hidroalcóolico. O processo de redução, promovido pelo

eletrodo de carbono vítreo (ECV), para a β-lapachona, ácido 3-sulfônico-β-lapachona e β-

lapachona 3-bromo-β-lapachona foi reversível e dependente do pH. Entretanto, para a α-

lapachona o processo foi irreversível no pH 4,5 e quasi-reversível para pH 7,0. Outro estudo

sobre a redução eletroquímica de β-lapachona e seu derivado de ácido 3-sulfônico em meio

aquoso também foi feito usando ECV. Os resultados indicaram um processo de redução

reversível e dependente do pH e a evidência de interação entre a β-lapachona e a topoisomerase

[14]. Abreu et al., relatou a determinação eletro-analítica individual da redução de α-lapachona e

β-lapachona usando o ECV em solução aquosa etanólica (20%) e meio tamponado (pH 4,5), por

meio da VOC e VPD com LOD de 0,41 mg L-1 [12].

Os eletrodos feitos de carbono são amplamente utilizados como sensores eletroquímicos

devido à sua janela de potencial operacional favorável em uma ampla faixa de pH. Eles são

dispositivos de baixo custo e fáceis de modificar e manusear [15]. Adams, em 1958, introduziu

os compósitos, os quais são constituídos de uma fase condutiva mista de carbono e um material

isolante, como resinas, polímeros e óleos [15-17]. Os compósitos são microscopicamente

heterogêneos e apresentam propriedades de materiais precursores [18]. Os eletrodos compósitos

podem ser aplicados em uma ampla faixa de pH e potencial e também apresentam uma boa

condutividade, baixo custo, estabilidade mecânica e versatilidade na maneira em que podem ser

preparados. Mudanças químicas, principalmente com surfactantes, podem melhorar a

sensibilidade e a seletividade em analitos específicos. Além disso, mudanças reprodutíveis

podem ser facilmente feitas na a superfície do eletrodo [19,20].

Semaan et al., desenvolveu um compósito de poliuretano-grafite para determinação de

furosemida em fármacos através de VOQ. A resposta do analito foi linear até 7 mg L-1. Não

houve necessidade de renovação constante da superfície do eletrodo, uma vez que o analito não

adsorveu no material do eletrodo [20]. Mais recentemente, Balbin-Tamayo et al., validou o

compósito de epóxi-grafite para ser usado como sensor de DNA [21]. Eletrodos feitos com

diferentes proporções de epóxi/grafite foram caracterizados por VC, espectroscopia de

impedância eletroquímica e microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo. A

melhor resposta eletroquímica, usando VOQ, para a guanosina monofosfato e a adenina foi

obtida usando uma resina endurecedora de epóxi-grafite nas proporções 3,3/2,5/1m/m/m.

Neste trabalho, um método eletroanalítico sensível, usando voltametria de onda quadrada

(VOQ) e eletrodo compósito de epóxi-grafite (EGE), para determinar simultâneamente α-

lapachona e β-lapachona em amostras de extrato etanólico de T. impetiginosa foi desenvolvido.

As condições experimentais foram ajustadas de tal forma a se ter um sinal voltamétrico intenso e

seletivo na resposta eletroquímica. A resposta analítica foi melhor em um meio contendo o

surfactante catiônico CTAB. Uma separação prévia de α-lapachona e β-lapachona do interferente

lapachol foi obtida através da extração líquido-líquido no extrato etanólico do cerne de T.

impetiginosa.

2 Experimental

2.1. Instrumentação

O método voltamétrico foi desenvolvido utilizando-se um potenciostato / galvanostato

(m-AUTOLAB Type III, Metrohm, Holanda) interligado a um computador e operando no modo

de onda quadrada de análise voltamétrica e voltametria cíclica. O eletrodo de trabalho foi de

epóxi-grafite e foi feito de acordo com o trabalho de Balbin-Tamayo et al. [21]. Utilizou-se o Ag

/ AgCl (KClsat) como eletrodo de referência do sistema eletroquímico e um fio de platina como

eletrodo auxiliar. Uma célula eletroquímica de 15 mL, feita de borosilicato, foi utilizada com

uma tampa de Teflon, a qual proporcionou o acesso dos três eletrodos até a solução. As medidas

de pH foram feitas em um pHmetro (modelo mPA-210, MS Tecnopon, Brasil) usando um

eletrodo de vidro combinado com um eletrodo de referência Ag / AgCl (KClsat). As análises de

cromatografia foram feitas em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (modelo 1200, Agilent

Technologies, Japão), equipado com detecção de absorção fotométrica, em um forno de coluna

(mantido a 30oC) e em um Agilent Eclipse XDB–C18 com coluna (250 × 4.6 mm e tamanho

médio de partícula de 5 μm, EUA).

2.2. Reagentes e materiais

Todas as soluções foram preparadas utilizando água deionizada (resistividade inferior a

18 Mcm) obtida a partir de um purificador de água Milli-Q Gradient Sistem A10, Millipore

(EUA). α-Lapachona (140oC), β-lapachona (155oC) e lapachol (142-143oC), foram obtidos

segundo os procedimentos obtidos na literatura [22-24]. Todas as naftoquinonas foram

purificadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos e os resultados concordaram com os

dados da literatura [25-27]. O brometo de hexadeciltrimetilamônio (CTAB) e o ácido acético

(grau analítico) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA). O nitrato de potássio, fosfato de

sódio monobásico e o fosfato de sódio dibásico foram obtidos na Merck (Alemanha). O álcool

metílico e etanol (todos com grau HPLC) foram obtidos na Tedia (Brasil). O acetato de etila e o

bicarbonato de sódio foram adquiridos da Isofar (Brasil), o ferrocianeto de potássio foi obtido na

Autolabor (Brasil) e o tampão Tris.HCl foi comprado na Synth, Brasil.

O pó de grafite de grau espectroscópico foi da Ringsdorff-Werke GMBH (Alemanha).

A resina epóxi foi obtida a partir de um kit comercial de pasta Araldite®. A pasta de alumínio (1

m) foi adquirida da Fortel (Brasil). O gás nitrogênio, marca comercial, foi comprado na Linde-

gases (Brasil). Os filtros de seringa de PTFE (0,45 μm) foram comprados na Whatman (Reino

Unido). O cerne natural da T. impetiginosa (Ipê Rosa) foi comprado em um mercado local.

2.3. Construção e caracterização do eletrodo de epóxi-grafite

Para a construção do eletrodo de epóxi-grafite foi utilizado o procedimento descrito na

literatura [21], com pequenos ajustes. A resina epóxi e o endurecedor (do kit de Araldite) foram

misturados em quantidades iguais, antes da adição do pó de grafite. Esses componentes foram

misturados a fim de se obter um compósito homogêneo constituído de 3%m/m de uma mistura

resina-endurecedor e 97% m/m de grafite. Antes do compósito de epóxi-grafite endurecer, ele foi

introduzido na ponta de um capilar de vidro (aproximadamente 10 mm), onde já tinha um fio de

cobre, estabelecendo o contato elétrico entre o fio de cobre e o compósito. Após 24 h, a

superfície do compósito foi polida usando uma lixa (1200 e 600 grão) e depois realizou-se um

polimento final utilizando alumina em suspensão (1 μm). A área ativa de superfície do eletrodo

foi determinada usando medidas de VC (de -250 até +650 mV na faixa de varredura de 20-100

mV s-1) de uma solução de K4[Fe (CN)6] (1,0 × 10-3 mol L-1) usando uma solução de K2SO4 (0,5

mol L-1) como eletrólito suporte. Varreduras sequenciais (Figura 1) geraram uma corrente de

pico (Ip) que aumenta linearmente em função da faixa de varredura (v), de 20 a 100 mV s-1.

Como a concentração de espécies eletroativas (C) foi 1,00 × 10-6 mol cm-3, foi possível estimar a

área eletroativa como 0,0078 cm2 pela simplificação da equação de Randles-Sevcik: A =

Ip/(2,686 × 105 v1/2 n3/2 C D1/2 ), onde D é 6,32 × 10-6 cm2 s-1 e n=1.

Figura 1: (A) Voltamogramas cíclicos em diferentes velocidades de varredura de potencial para o sistema

ferrocianeto / ferrocianato em solução 1,0 × 10-3 mol L-1 de K3[Fe(CN)6]/ 0,5 mol L-1 de K2SO4. (B) Curva da

variação da corrente de pico com a raiz quadrada da velocidade de varredura. Dados retirados da Figura 2A.

2.4. Soluções-estoque e soluções padrões

Quantidades apropriadas de cada uma das naftoquinonas (α-lapachona, β-lapachona e

lapachol) foram usadas para preparar as soluções estoque de 1,0 × 10-2 mol L-1 e 1,0 × 10-3 mol

L-1 em metanol. Soluções mais diluídas de naftoquinonas foram preparadas para diluir nas

soluções estoque com metanol. As concentrações finais dos componentes presentes na solução

eletrolítica de trabalho foram: tampão fosfato (4,0 × 10-2 mol L-1; pH 6,0), nitrato de potássio

(1,0 mol L-1) e o surfactante catiônico CTAB (1,2 × 10-4 mol L-1) em água deionizada. A

presença de α-lapachona e β-lapachona diminuiu a concentração micelar crítica do CTAB

-400 -200 0 200 400 600 800

-1.4

-0.7

0.0

0.7

1.4

2.1 A100 mV s

-1

20 mV s-1

I (A

)

Potential (mV) x Ag/AgCl

5 6 7 8 9 101.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0 BI (A

)

v1/2

(normalmente em 9,2 × 10-4 mol L-1 [28]), o que torna o sistema eletrolítico rico em micelas e

estruturas pré-micelas.

2.5. Preparação da Amostra

Como descrito por Lima et al. [29], o cerne da T. impetiginosa (Ipê Rosa) foi triturado

finamente (aproximadamente 1 g). Depois, porções de 125 mg do pó resultante foi extraído,

utilizando etanol, em um banho de ultrassom (5 min) e depois o extrato foi passado por um filtro

seringa (0,45 μm) e coletado em um balão volumétrico de 10,00 mL. Todos os extratos da

amostra foram realizados em triplicata.

2.6. Extração líquido-líquido

Um procedimento de extração líquido-líquido usando, acetato de etila e solução de

bicarbonato de sódio 2,5 % foi feito para separar α-lapachona e β-lapachona dos interferentes da

amostra incluindo o lapachol que é o componente majoritário presente na amostra.

Inicialmente preparou-se uma amostra simulada mista, a partir de solução estoque de α-

lapachona, β-lapachona e lapachol na concentração 1 × 10-4 mol L-1 em metanol. Em seguida 1

mL dessa amostra foi adicionado ao funil de separação e na sequência 5 mL de acetato de etila e

5 mL de solução de bicarbonato de sódio 2,5 % foram adicionados ao funil nessa ordem. Uma

agitação por cerca de 2 mim foi feita e a mistura foi deixada em repouso até que a separação das

fases fosse observada. Em seguida a coleta da fase aquosa que ficou na parte inferior foi feita e

esta foi descartada, pois continha os interferentes da matriz. A fase orgânica que contém os

analitos de interesse foi lavada 4 vezes com 5 mL de solução de bicarbonato de sódio 2,5 % para

eliminação do excesso de acetato de etila e em seguida 4 lavagens com H2O foram realizadas

para retirar o excesso de bicarbonato de sódio, a fase aquosa era sempre coletada e descartada.

Após as lavagens, coletou-se em um tubo graduado a fase orgânica que foi levada ao

aquecimento em banho-maria para evaporação dos resíduos de acetato de etila e após a

evaporação o conteúdo residual foi retomado com 1 mL de metanol. Uma alíquota de 250 µL foi

adicionada à célula eletroquímica e analisada.

Esse mesmo procedimento foi realizado na amostra real de cerne de T. impetiginosa (Ipê

Rosa), porém esta amostra foi previamente fortificada com uma solução estoque de α-lapachona

e β-lapachona na concentração 1 × 10-2 mol L-1, pois estes estão presentes em quantidades abaixo

do limite de detecção do método e o lapachol estava presente em altas concentrações, pois este é

o componente majoritário presente na amostra. A fortificação do extrato foi feita com 600 µL de

solução estoque de α-lapachona e β-lapachona na concentração 1 × 10-2 mol L-1 e 1 mL do

extrato fortificado foi utilizado para a realização do procedimento de extração líquido-líquido

descrito acima.

2.7. Medições Voltamétricas de α-lapachona e β-lapachona

Todos os experimentos voltamétricos foram realizados depois da purga com gás inerte da

solução na célula eletrolítica (aproximadamente 2 min) e antes da medição. Também foram

realizados experimentos de VC para avaliar o processo redox na faixa de -900 mV a +600 mV,

usando 4 × 10-4 mo L-1 de α-lapachona e β-lapachona na solução eletrolítica de trabalho que

continha CTAB. Medições de VOQ foram realizadas, usando a solução eletrolítica de trabalho,

para avaliar o processo redox e também para determinar analiticamente α-lapachona e β-

lapachona. Realizaram-se experimentos de diagnóstico redox na faixa de +600 mV a -900 mV.

Determinações analíticas foram obtidas com uma pré-concentração analítica em +400 mV por

140 s (sob regime de transporte convectivo e purga com gás nitrogênio). Após o tempo de

equilíbrio (1 min) sem agitação e purga, as medidas de +600 mV até -900 mV foram realizadas

usando 30 Hz, 20 mV de passo potencial e 40 mV de amplitude de pulso. O sinal analítico foi

obtido em potenciais de -370 mV e -190 mV após adições sequenciais de 10 µL de solução

estoque 1 × 10-3 mo L-1 de α-lapachona e β-lapachona, respectivamente.

2.8. Análise da Cromatografia

As amostras extraídas foram analisadas por HPLC-UV sob uma eluição isocrática com

metanol/solução 5% de ácido acético (80/20% v/v) [29]. A vazão da fase móvel foi 1 mL min-1 e

o volume de amostra injetado foi 10 μL. Sob essas condições, o tempo de retenção de α-

lapachona e β-lapachona foi de 3,9 min e 4,3 min, respectivamente. As curvas analíticas foram

construídas através da injeção de 20 μL de soluções estoque de α-lapachona e β-lapachona com

faixa de concentração de 1 × 10-5 mol L-1 a 4 × 10-4 mol L-1. As análises foram realizadas em

triplicata com detecção absorciométrica em 278 nm.

3 Resultados e Discussão

3.1. Estudos preliminares visando a determinação seletiva de α-lapachona e β-lapachona

Processos redox envolvendo naftoquinonas em substratos à base de carbono

especialmente no caso do ECV são muito conhecidos, e tem sido amplamente abordados na

literatura [12,30]. No entanto, esses estudos são quase sempre realizados com apenas uma

naftoquinona, pois outras naftoquinonas tendem a ter potenciais redox muito próximos, e a

avaliação de misturas torna a realização de tais estudos muito desafiadora devido a interferências

significativas. Portanto, é desejável alcançar condições seletivas que possibilitem a observação

simultânea do comportamento de diferentes naftoquinonas, permitindo também a sua detecção.

No caso específico deste trabalho, dois isômeros da naftoquinona (α-lapachona e β-

lapachona) foram escolhidos. Estudos indicaram que a interferência mútua imposta por este par

de isômeros pode ser minimizada por uma combinação de meio eletrolítico adequado e

condições instrumentais / experimentais adequadamente escolhidas (força iônica, pH, proporção

e tipo de mistura eletrolítica, potencial aplicado e tempo de deposição, freqüência, amplitude de

pulso e passo potencial), que foram os mesmo utilizados por Almeida et al. [31] na determinação

do lapachol, que é uma outra naftoquinona dessa classe.

Um estudo usando VC (Figura 2A) mostrou que, para α-lapachona, os picos 1 e 4 estão

respectivamente relacionados à oxidação (em -442 mV) e à redução (em -503 mV), enquanto que

para β-lapachona, os picos 2 e 3 estão respectivamente relacionados com a oxidação (em -190

mV) e redução (em -344 mV) usando 100 mV s-1 na faixa de potencial de -1000 mV a 1000 mV

e sem transporte de massa convectivo forçado. Vários ciclos de VC foram feitos para verificar a

estabilidade do processo e, mesmo após 15 ciclos (Figura 2A), não houve evidência de uma

diminuição na magnitude dos picos, indicando que as espécies na interface eletrodo-solução são

prontamente e repetidamente convertidas nas formas oxidadas e reduzidas.

Os gráficos da raiz quadrada de v (com v variando de 40 a 100 mV s-1) em função do Ip

para a redução de ambas lapachonas foram lineares, com R2 = 0,989 para a α-lapachona (pico 4)

e R2 = 0,997 para a β-lapachona (pico 3). A partir desse mesmo estudo (Figura 2B), observou-se

que o processo redox da β-lapachona (picos 2 e 3) é claramente reversível, uma vez que tanto a

oxidação quanto a redução possuem intensidades próximas. Além disso, a literatura [30] afirma

que processos eletroquímicos envolvendo este tipo de naftoquinona são reversíveis devido à

rápida cinética e disponibilidade de prótons para o processo de protonação de duas fases afetando

ambos os grupos carboxílicos, levando-o a ser visto como um processo de uma etapa envolvendo

dois elétrons e dois prótons. Para a α-lapachona, resultado semelhante ao descrito por Abreu et

al., [12] foi observado, com um comportamento diferente do que é geralmente esperado a partir

de naftoquinonas em meio aquoso [12] com o VC apresentando um pico catódico intenso e um

anódico menos intenso. Segundo Abreu et al., o comportamento eletroquímico da α-lapachona é

mais dependente do pH que da β-lapachona, uma vez que a redução de α-lapachona, em pH 4,5,

é considerada irreversível, envolvendo a transferência de dois elétrons. Além disso, em pH 7,

uma espécie intermediária semi-reduzida formada por α-lapachona sofre clivagem que favorece

uma ressonância que resultará em uma espécie intermediária mais estável (espécie semi-

reduzida) que é estabilizada pela forma canônica de ligação de hidrogênio que prevalece durante

a VC [12] resultando em um processo quasi-reversível. O aumento de Ip em função de √f (Figura

2C) foi diretamente proporcional e linear (R2 = 0,974 e 0,997 para α-lapachona e β-lapachona,

respectivamente), o que é uma indicação de que o processo foi controlado pela difusão de

reagentes [32].

-1000 -500 0 500 1000-6

-4

-2

0

2

4

A

Potential x Ag/AgCl (mV)

o

a

o

a

oxidation

reduction

4

3

2

1

I (

A)

-1000 -500 0 500 1000

-4

-2

0

2

4 B

6 7 8 9 10

-1

-2

-3

-4

I (

A)

v 1/2

34

2

1

I (

A)

Potential x Ag/AgCl (mV)

2 4 6 8 10 12 14 160

-5

-10

-15

-20

-25

-30

-35C

I (

A)

f 1/2

Figura 2: (A) Voltamogramas cíclicos sequenciais (linha a-o) para α-lapachona e β-lapachona (ambos em 4,0 × 10-4

mol L-1) a 100 mV s-1. (B) Voltametria cíclica usando v de 40-100 mV s-1 para α-lapachona e β-lapachona na

presença de CTAB 1,2 × 10-4 mol L-1. (C) Estudo de √f × Ip com f na faixa de 10 a 200 Hz usando tampão fosfato

(4,0 × 10-2 mol L-1 e pH 6), CTAB (1,2 × 10-4 mol L-1), KNO3 (1 mol L-1) em v = 100 mV s-1.

3.2. Estudo da influência do pH e do surfactante

Os surfactantes representam um importante papel no processo eletroquímico, pois eles

conseguem mediar à interação entre as espécies eletroativas e o eletrodo [33,34]. Eles também

podem influenciar processos redox e minimizar a passivação da superfície do eletrodo causada

pela adsorção de produtos eletrogerados ou por componentes da matriz da amostra [35,36]. Além

disso, eles melhoram a solubilidade de analitos hidrofóbicos e facilitam o transporte de massa

[37,38].

Um estudo com CTAB antes da concentração micelar crítica (CMC), próximo à CMC e

após a CMC (Figura 3A) foi feito com o objetivo de melhorar a resposta eletroquímica e além

disso, a presença de CTAB pareceu melhorar a difusão das lapachonas, já que o eletrodo realizou

um melhor transporte e uma reação redox mais eficiente. As micelas e os agregados pré-micelas

confinaram os reagentes e produtos envolvidos na reação fazendo a concentração local (dentro

da micela normal ou entre os monômeros que formam a estrutura micelar) ficar muito alta, mas

melhorando a cinética da reação. A formação de radicais também é favorecida, pois eles são

estabilizados pelo sistema de micelas.

Na Figura 3A é possível observar que a melhor separação dos sinais de α e β-lapachona

ocorre quando se trabalha com o CTAB antes da CMC, nas outras condições que seriam na CMC

e abaixo da CMC é possível observar para os sinais de redução que ocorre uma sobreposição dos

picos que pode estar sendo influenciada pela cinética da reação. Assim, o meio tamponado em

pH 6 e contendo CTAB foi escolhido para estabelecer o método quantitativo voltamétrico.

-1000 -500 0 500 1000-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6 A

apos CMC

na CMC

antes da CMC

I (

A)

Potencial (mV)

6 7 8 9

-3

-4

-5

-6

-7 B

A

pH

beta-lapachone

alfa-lapachone

I (

A)

Figura 3: Voltametria cíclica do processo redox 2 × 10-4 mol L-1 de α e β-lapachona em meio aquoso na presença de

CTAB antes da CMC (8,1 × 10-4 mol L-1), na CMC (1,0 × 10-3 mol L-1) e após CMC (1,5 × 10-3 mol L-1). Condições

experimentais: tampão fosfato (4 × 10-2 mol L-1; pH 6), KNO3 (1 mol L-1) em meio aquoso a v = 100 mV s-1.

Influência da resposta do pH empregando a voltametria de onda quadrada para a determinação simultânea de α e β-

lapachona.

Na faixa de pH avaliada (6,0 a 9,0) utilizando tampão fosfato, ambos os picos de redução

foram mais intensos entre pH 6,0 e 7,0. Nessa faixa, as intensidades relativas de cada um dos

picos, avaliadas por meio de voltametria de onda quadrada (VOQ). Na Figura 3B, as

intensidades dos picos voltamétricos com máximos em -370 mV e -190 mV para α e β-

lapachona, respectivamente, são mostradas em toda a faixa de pH estudada. Observou-se uma

clara diminuição da resposta nas condições mais básicas de pH para a β-lapachona. O pH 6,0 foi

escolhido para prosseguir com o desenvolvimento do método porque produziu mais resultados

reprodutivos e estáveis.

3.3 Otimização de condições experimentais e instrumentais para análise de α e β-

lapachonas usando VOQ

Os isômeros α e β-lapachonas acumulam na superfície do eletrodo (sob transporte

convectivo forçado e purga com N2) na mesma faixa não importando o potencial aplicado (na

faixa de +600 a -900 mV), o que permite uma pré-concentração dos analitos antes da

quantificação. Os parâmetros instrumentais empregados para a voltametria de onda quadrada

amplitude de pulso de 40 mV e frequência de 30 Hz, foram os mesmos adotados por Almeida et

al., usando um passo potencial de 20 mV, pois estas foram as condições que melhor se

adequaram ao método. A corrente de redissolução medida após diferentes tempos de pré-

concentração foi monitorada e uma saturação é alcançada após 140 s. Para fins quantitativos, 140

s de acumulação do analito em +400 mV foram usados para medir a VOQ da corrente de

redissolução do analito. A VOQ foi usada para quantificar simultaneamente esses isômeros. As

condições empregadas foram as mesmas usadas por Almeida et al., (Tabela 1).

Tabela 1: Condições para determinação de α e β-lapachonas por VOQ.

Parâmetro Valor

Mistura Eletrolítica CTAB (1,2 × 10-4 mol L-1) / tampão fosfato (4 × 10-2 mol L-1;

pH 6) / KNO3 (1 mol L-1)

Potencial de Deposição 400 mV

Tempo de Deposição 140 s

Amplitude 40 mV

Passo Potencial 20 mV

Frequência 30 Hz

Sinal Monitorado em -370 mV e -190 mV

Alcance do Potencial de Varredura 600 a -900 mV

3.4 Determinação analítica de α e β-lapachonas usando VOQ

Voltamogramas correspondentes aos sinais da α-lapachona (-370 mV; pico 1) e β-

lapachona (-190 mV; pico 2) são mostrados na Figura 4A. A concentração das lapachonas foi

variada de 1,0 × 10-6 mol L-1 a 1,3 × 10-5 mol L-1 para construção das curvas analíticas (inserção

na Figura 4A) que confirma que o sinal analítico (corrente de pico) foi diretamente e linearmente

proporcional à concentração de ambas lapachonas na célula eletroquímica (R2 = 0,997 para o

pico 1 e R2 = 0,995 para o pico 2). As equações da curva de adição padrão foram Ip (μA) = (9,0 ×

10-2 ± 6,0 × 10-4) Cα-lapachona (mol L-1) + (3,1 × 10-8 ± 4,5 × 10-9) com base no pico 1 e Ip (μA) =

(4,8 × 10-2 ± 2,3 × 10-4) Cβ-lapachona (mol L-1) + (5,0 × 10-8 ± 4,5 × 10-9) com base no pico 2,

cobrindo o intervalo até 1,3 × 10-5 mol L-1) de analito. As medições foram realizadas em três

repetições e os erros associados à sensibilidade e ao coeficiente linear foram calculados como

desvios-padrão.

-1200 -800 -400 0 400 8000

-1

-2

-3

0.0 4.0x10-6

8.0x10-6

1.2x10-5

0.0

-0.2

-0.4

-0.6

-0.8

-1.0

-1.2

-1.4

I (

A)

concentration (mol L-1)

A

2

1

I (

A)

Potential (mV)-1200 -800 -400 0 400 8000

-2

-4

-6

-8

-10

-12

-142

1

0.0 4.0x10-6

8.0x10-6

1.2x10-5

0

-2

-4

-6

-8

-10

I (A)

concentration (mol L-1)

B

I (

A)

Potential (mV)

-1200 -800 -400 0 400 8000

-4

-8

-12

-16C

EEG

ECV

I (

A)

Potential (mV)

Figura 4: Curva de adição analítica VOQ de α-lapachona e β-lapachona cobrindo a faixa de concentrações de 1,0 ×

10-6 mol L-1 a 1,3 × 10-5 mol L-1 usando: (A) eletrodo de epóxi-grafite e (B) eletrodo de carbono vítreo (ECV). (C)

Sinal de fundo medido usando eletrodo de epóxi grafite (EEG) e eletrodo de carbono vítreo (ECV).

Estudos usando eletrodo de epóxi-grafite ou o ECV foram feitos a fim de comparar os

sinais e comportamentos dessas naftoquinonas isômeras nestes substratos. O experimento usando

ECV foi realizado nas mesmas condições empregadas para o eletrodo de epóxi-grafite. A curva

de adição padrão usando o ECV foi Ip (μA) = (5,3 × 10-1 ± 7,3 × 10-3) Cα-lapachone (mol L-1) + (1,0

× 10-6 ± 5,9 × 10-8) (R2 = 0,969) usando o pico 1 e Ip (μA) = (4,1 × 10-1 ± 3,8 × 10-3) Cβ-lapachone

(mol L-1) + (2,0 × 10-7 ± 2,4 × 10-8) (R2 = 0,994) usando o pico 2. Embora cobrindo

aproximadamente a mesma faixa de concentração e permitindo sensibilidades semelhantes, a

área do eletrodo do carbono vítreo é aproximadamente três vezes maior que a área do eletrodo de

epóxi-grafite. Observou-se também que o sinal de linha de base (sinal de fundo) produzido pelo

eletrodo de epóxi-grafite foi significativamente menor que o produzido pelo ECV, o que

possibilitou melhor poder de detecção (Figura 4C). No entanto, aparentemente, a resolução

alcançada por qualquer um dos eletrodos permite determinações seletivas em faixas

relativamente mais altas de concentração dos isômeros (acima de 10-6 mol L-1).

As medidas foram realizadas em triplicata e os erros associados à sensibilidade e

coeficiente linear foram calculados como desvio-padrão. O limite de detecção e quantificação

instrumental foi na ordem de 10-7 e 10-6 mol L-1 para α-lapachona e β-lapachona, respectivamente

e foram calculados usando, respectivamente, 3sb/m e 10sb/m, onde sb é o desvio-padrão de dez

medições consecutivas de sinal da menor concentração de analito na curva de adição analítica e

m é a sensibilidade dessa curva. A Figura 5 um sinal produzido pelo analito no nível do LOQ é

mostrado contra o sinal em branco. A precisão instrumental de 2% foi obtida a partir de dez

medições consecutivas de sinal (medidas após a pré-concentração) produzido pelos padrões

analíticos em duas diferentes concentrações (2 × 10-6 mo L-1 e 1 × 10-5 mo L-1).

-1200 -800 -400 0 400 800

-0.2

-0.3

-0.4

-0.5

-0.6

I (

A)

potential (mV)

Figura 5: Voltamogramas mostrando a diferença entre o sinal produzido pelo (1) branco (2) α e β-lapachonas em

uma concentração equivalente ao LOQ e LOD, respectivamente.

3.5 Interferência do lapachol e β-lapachona sulfonada na determinação de α e β-lapachona

no extrato etanólico de T. impetiginosa

A interferência do lapachol, que também é uma naftoquinona e está presente em

quantidades majoritárias nas amostras analisadas foi estudada. α-lapachona e β-lapachona

(ambos isômeros do lapachol) foram avaliados na presença desse analito. O sinal correspondente

ao voltamograma por VOQ do isômero α-lapachona (pico 1) é completamente sobreposto pelo

lapachol (Figura 6A), pois ambos apresentam resposta no mesmo potencial. Em contraste, o sinal

voltamétrico correspondente a β-lapachona (pico 2) por VOQ, não sofreu interferências

significativas com a adição de lapachol. Portanto, uma determinação isolada de β-lapachona na

presença de lapachol é viável. Porém uma determinação simultânea de α-lapachona e β-

lapachona na presença de lapachol não é possível, e de acordo com os estudos feitos, é

necessário um pré-tratamento da amostra para que garanta a seletividade do método na

determinação simultânea dos analitos estudados no presente trabalho em relação à presença de

lapachol.

Outra naftoquinona, a β-lapachona sulfonada também foi avaliada como possível

interferente na determinação simultânea de α e β-lapachona. A interferência da β-lapachona foi

avaliada na presença dos analitos de interesse α-lapachona e β-lapachona. O sinal correspondente

ao voltamograma por VOQ dos isômeros α-lapachona (pico 1) e β-lapachona (pico 2) sofrem

interferência da β-lapachona sulfonada (Figura 6B), pois à medida que concentrações crescentes

do interferente é adicionada ambos os sinais para α-lapachona e β-lapachona aumentam.

Portanto, uma determinação simultânea na presença desse interferente é inviável.

-1200 -800 -400 0 400 800

0

-1

-2

-3

-4

-5

-6 g

a

beta

alfa

I (

A)

potencial (mV) -1200 -800 -400 0 400 800

0.0

-0.5

-1.0

-1.5

-2.0

-2.5

-3.0

-3.5

-4.0

g

a

beta

alfa

I (

A)

potencial (mV) Figura 6: Voltamogramas de misturas contendo α-lapachona e β-lapachona (6 × 10-5 mol L-1) e outras

naftoquinonas: A) mistura com lapachol e B) mistura com β-lapachona sulfonada. Concentrações indicadas para as

naftoquinonas: a) branco; b) 0 mol L-1; c) 2 × 10-5 mol L-1; d) 4 × 10-5 mol L-1 e e) 6 × 10-5 mol L-1. Condições

otimizadas experimentalmente (Tabela 1).

A adição de uma alíquota do extrato etanólico do cerne da T. impetiginosa fortificado

com α e β-lapachona (1 × 10-3 mol L-1) sem nenhum tipo de pré-tratamento foi adicionada

diretamente dentro da célula eletroquímica e produziu um sinal amplo e largo, o que indicou que

a matriz interfere na análise. Para separar α e β-lapachona dos componentes da amostra incluindo

o lapachol, o procedimento de extração líquido-líquido foi realizado, o que permitiu recuperação

de α-lapachona e β-lapachona de 94% e 95%, respectivamente. Além disso, uma avaliação do

processo de extração foi feita através da injeção de uma alíquota da fase aquosa e uma da fase

orgânica após a extração em um HPLC, e o resultado comprovou a presença de lapachol na fase

aquosa e na fase orgânica a presença das duas naftoquinonas, alvo de estudo do presente

trabalho. Amostras do extrato do cerne da T. impetiginosa foram analisadas, com sucesso, a fim

de determinar α e β-lapachona. A concentração média de α-lapachona e β-lapachona (com limite

de confiança de 95% e n=3) no extrato fortificado do cerne de T. impetiginosa foi de 1,53 × 10-5

± 1,2 × 10-7 mol L-1 e 1,49 × 10-5 ± 1,4 × 10-7 mol L-1, respectivamente. A análise de diferentes

alíquotas do extrato foram feitas em três dias diferentes e os resultados (média das três

replicatas) estão mostrados na Tabela 2. Uma amostra simulada para α e β-lapachona, contendo o

interferente lapachol foi preparada e esta foi analisada por VOQ, após passar pela extração

líquido-líquido. Os resultados obtidos são reportados na Tabela 2.

Tabela 2: Concentração de α e β-lapachona (analisada em três dias, com n=3 replicatas) em amostra

simulada e na madeira da T. impetiginosa (Ipê Rosa) após separação por extração líquido-líquido.

Amostra Dia Concentração α-lapachona

(mol L-1)

Concentração β-lapachona

(mol L-1)

Amostra simulada

1 9,72 × 10-5 ± 1,8 × 10-7 7,52 × 10-5 ± 4,2 × 10-7

2 9,80 × 10-5 ± 1,1 × 10-7 7,75 × 10-5 ± 3,9 × 10-7

3 9,60 × 10-5 ± 1,4 × 10-7 7,92 × 10-5 ± 3,5 × 10-7

Extrato de T.

impetiginosa

(Ipê Rosa)

1 1,53 × 10-5 ± 1,2 × 10-7 1,49 × 10-5 ± 1,4 × 10-7

2 1,51 × 10-5 ± 1,0 × 10-7 1,47 × 10-5 ± 1,7 × 10-7

3 1,55 × 10-5 ± 1,3 × 10-7 1,51 × 10-5 ± 1,9 × 10-7

As mesmas amostras simuladas e de extrato da madeira T. impetiginosa também foram

analisadas por HPLC e os resultados (três amostras feitas em três replicatas) são mostrados na

Tabela 3 junto com os obtidos pelo método proposto por VOQ. Os resultados são

estatisticamente concordantes entre si, pois o teste t Student (usando o valor da média geral) deu

um valor para tcalculado = 1,3 e 1,7; tcalculado = 1,1 e 2,2 e tcrítico = 2,2 e 2,2; tcrítico = 1,2 e 2,2 para α e

β-lapachona, respectivamente, em um nível de confiança de 95% (n1 = n2 = 12) para a amostra

simulada e amostra real, respectivamente. A análise da variância (fator único) usando cada valor

médio como um resultado independente produziu um Fcalculado de 1,6 e 3,0; 1,2 e 4,7 e Fcrítico de

4,9 e 5,0; 1,5 e 4,7, em um nível de confiança de 95% e n1 = n2 = 12 para as amostras simuladas

e real.

Tabela 3: Determinação de α e β-lapachona em amostras simulada e no cerne da madeira de T.

impetiginosa (Ipê Rosa) fortificados.

Amostra Método Concentração

α-lapachona

(mol L-1)

Concentração de

β-lapachona

(mol L-1)

Amostra

Simulada

VOQ a 9,71 × 10-5 ± 1,1 × 10-6 a 7,75× 10-5 ± 2,0 × 10-6

HPLC-

UV

9,79 × 10-5 ± 1,0 × 10-6 7,91 × 10-5 ± 8,2 × 10-7

Extrato

Madeira

Fortificado

VOQ a 1,53 × 10-5 ± 2,0 × 10-7 a 1,49 × 10-5 ± 2,0 ×10-7

HPLC-

UV

1,53 × 10-5 ± 3,6 × 10-7 1,42 × 10-5 ± 6,9 × 10-7

a Procedimento de extração para separar analito

4 Conclusão

Um método voltamétrico foi desenvolvido para quantificar simultaneamente α-lapachona

e β-lapachona e foi aplicado em análises de extratos do cerne da T.impetiginosa na presença do

interferente lapachol. Um eletrodo de epóxi-grafite produzido no laboratório forneceu uma

resposta linear e sensível além de baixo ruído. A utilização de CTAB no eletrólito suporte (em

pH 6,0) possibilitou picos redox intensos e reversíveis para as lapachonas. O procedimento de

extração líquido-líquido utilizado para separar α-lapachona e β-lapachona do lapachol, além de

outros potenciais componentes, presentes em extratos de plantas, permitindo assim determinação

seletiva e simultânea dos analitos.

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