Relationship between free amino acids and glucosinolates in primary and secondary inflorescences of...

4
Relationship between free amino acids and glucosinolates in primary and secondary inflorescences of 11 broccoli (Brassica oleracea L var italica) cultivars grown in early and late seasons Eduardo Rosa* and M Helena Gomes Horticulture Section, Universidade de Tra ´s-os-Montes e Alto Douro, Apt 202, P-5001-911 Vila Real Codex, Portugal Abstract: Amino acids have been identi®ed as the precursors of a class of secondary plant metabolites, the glucosinolates, but there is no report on the relationship between the two in vivo. In this work we have investigated the relationship between free amino acids and glucosinolates in 11 broccoli cultivars grown in early April±July) and late August±January) seasons. Free amino acids and glucosinolates were quanti®ed by HPLC in primary and secondary in¯orescences at maturity stage. Analysis of the data revealed that no signi®cant correlation exists between free amino acids and glucosinolates, suggesting that the precursors of these compounds might be used during the ®rst step of the biosynthetic process to form intermediates, the aldoximes and thiohydroximates, which will then be used in the second stage of the biosynthesis to form, apart from glucosinolates, other secondary plant metabolites. # 2001 Society of Chemical Industry Keywords: free amino acids; glucosinolates; broccoli; Brassica oleracea var italica; glucosinolate biosynthesis INTRODUCTION Plants of the Brassicaceae family are well known for the presence of a class of secondary plant metabolites, the glucosinolates, with a side chain R group) and D- glucopyranose as b-thioglucoside attached to carbon atom 0 in Z)-N-hydroximine sulphate esters Fig 1). About 100 different glucosinolates have been isolated from various plant sources, with structural variation mainly in the R group. Glucosinolates are classi®ed into the aliphatics alkenyls derived from the amino acid methionine Met), the aromatics derived from phenylalanine Phe) and tyrosine Tyr) and the indolyls in which the precursor amino acid is tryptophan Trp). Glucosinolates in contact with the enzyme myrosinase b-thioglucoside glucohydrolase, EC 3.2.3.1) are hydrolysed to produce a wide range of products, typically isothiocyanates, nitriles and thio- cyanates, depending on the degradation conditions Fig 1). Several studies reviewed by Rosa et al 1 have reported glucosinolates and their derived products to be involved in the plant±environment interaction and in speci®c biological activities. Biosynthesis of gluco- sinolates involves the modi®cation of amino acids via an aldoxime intermediate and subsequent conjugation reactions that successively introduce a sulphur, a glucosyl and a sulphate moiety. 2 These conjugation reactions are catalysed by enzymes not speci®c for the side chain, indicating that different glucosinolates in a plant are formed by the same enzymes. 3 Side chain modi®cations such as hydroxylation and methoxyla- tion are assumed to occur after the parent glucosino- late has been synthesised, but the order in which these modi®cations occur is uncertain. 4 Information on the biosynthesis of glucosinolates has generally come from feeding whole plants with various radiolabelled com- pounds, which has clari®ed the chemical nature of the glucosinolate precursors and some of the intermedi- ates. However, several questions are still to be answered when assaying the complete glucosinolate biosynthetic pathway. 4,5 Despite these studies, it is not known how much of the glucosinolate precursors exist in the plant and what the relationship is between the precursor concentration and the ®nal compound. Broccoli Brassica oleracea L var italica) has received increased interest in the last decade owing to the protective health effect of its in¯orescences, based on the glucosinolate composition, particularly 4-methyl- sulphinylbutyl glucosinolate glucoraphanin), a pre- (Received 21 March 2001; revised version received 28 August 2001; accepted 5 September 2001) * Correspondence to: Eduardo Rosa, Horticulture Section, Universidade de Tra ´s-os-Montes e Alto Douro, Apt 202, P-5001-911 Vila Real Codex, Portugal E-mail: [email protected] # 2001 Society of Chemical Industry. J Sci Food Agric 0022±5142/2002/$30.00 61 Journal of the Science of Food and Agriculture J Sci Food Agric 82:61±64 online: 2001) DOI: 10.1002/jsfa.999

Transcript of Relationship between free amino acids and glucosinolates in primary and secondary inflorescences of...

������ �� � ����� �� ���� ��� ��������� ��� ���� ����� .*<;"/;3 �������< -��"��=4< "�#"��-92���#>>>

Relationship between free amino acids andglucosinolates in primary and secondaryinflorescences of 11 broccoli (�������� ������L var ������) cultivars grown in early and lateseasonsEduardo Rosa� and M Helena GomesHorticulture Section, Universidade de Tras-os-Montes e Alto Douro, Apt 202, P-5001-911 Vila Real Codex, Portugal

(Rec

� CoCodeE-ma

� -

��������� ��� �� � ���� ���� ����� �� ��� ���������� �� � ����� �� ����� ��� ����� ����������

��� �������������� ��� ����� � �� ������ �� ��� ���������� ������� ��� ��� �� ����� �� ��� ���� ��

���� ��������� ��� ���������� ������� ���� ��� �� � �� ������������� � �� ������� ��������

����� � ����� ������ ���! �� ���� �������� ������! �������� "��� ��� �� � �� �������������

���� #������ �� $%&' � ����� �� ����� ��� �(���������� �� ������ ������ ������� �� ���

��� ������� ���� �� �������� ���������� �)��� ������� ���� ��� �� � �� ��������������

��������� ���� ��� ���������� �� ����� ������ � ��� �� ��� ���� ��� ���� ���� �� ���

���������� ������� �� ��� ����� ����� ��� �� �)�� �� ����� ��)����� ���� ��� ���� ��

��� � ��� ����� ����� �� ��� ���������� �� ���� ����� ��� �������������� ����� ����� ��� �����

����������

� *++� ,����� �� '����� �� �����

-����� �� ���� ����� ���� ������������� ������� �������� ������ ��� ������� ����������� ������������

INTRODUCTION������ �� ��� ���������� ������ ��� ���� ����� ��� ���

������� �� � ���� �� ������� ����� ������������ ���

������������� ���� � ��� ���� �� ����� �� ��

����������� �� ������ ������ ������ �� �����

���� � �� ���������� ����� �������� ������ �!� "�#

$���� "�� �������� ������������ ���� ���� �������

���� ������� ����� ������� ���� ��������� ���������

������ �� ��� � ����# %������������ ��� �����&�

���� ��� ��������� �������� ����� ���� ��� �����

�� ���������� �'���� ��� �������� ����� ����

������������� ����� �� �������� �(��� �� ���

������� �� ���� ��� �������� ����� �� ��

���������� �(���# %������������ �� ����� ���� ���

��)��� ���������� ������� ������ ������������

*+ ,#-#,#"� ��� �������� �� ����� � ��� ��� � ��

������� �������� ��������������� �������� �� �����

�������� ������ �� ��� � ������� ��������

�!� "�# .������ ������ ������� �� ���� ��" ����

������� ������������ �� ����� ����� ������ ��

�� ������� �� ��� �����/����������� ���������� ��

�� ����& ����� ��� ���������# 0����������� �� ����

��������� �������� ��� ���&����� �� ����� ��� ���

�� ��� ��� ����������� �� �����1���� ��2� �����

eived 21 March 2001; revised version received 28 August 2001; acce

rrespondence to: Eduardo Rosa, Horticulture Section, Universidadex, Portugalil: [email protected]

��" .����� �� +������ 4������# ��� ���� ����� ��--/6"3-9-

�������� ���� ���������� ������� � �������� �

������ �� � �������� ������#- (���� ��2� �����

�������� ��� ������� �� ��)���� ��� ����& ��� ���

��� ����� ������� ���� �������� ������������ �� �

����� ��� ����� �� ��� ���� ��)����#, .�� ����

���&������ ��� �� ���� ������� �� ����� ����

���� ��� ������ �� ��� ����� ��� ������ ��������

���� ��� ���� ����������� ��� ��� ���� �� ���� �����

���&������ ��� �� ��������#3 4���������� �� ���

������������ �� ������������ ��� �������� ��� ����

����� ����� ������ ���� ������� ����������� ���

������ ���� ��� ����&� ��� ������ ������ �� ���

����������� ��������� �� ���� �� ��� ���������

����# 5������� ������� 1�������� ��� ����� �� ��

������� ���� ������� ��� ������� �����������

����������� �������#3�6 ������� ����� ������� �� �� ���

����� ��� ��� �� ��� ����������� ��������� � ���

�� ��� ����� �� ���� ��� ������������ �� ������� ���

�������� ����������� �� ��� &��� ������#

0����� ��������� ������ 7 ��� ������� ��� ������������� �������� �� ��� ���� ��� ���� �� ���

��������� ������ ����� �� ��� ��8��������� ���� ��

��� ����������� ����������� ����������� 3��������

�������������� ����������� � ������������� � ����

pted 5 September 2001�

de Tras-os-Montes e Alto Douro, Apt 202, P-5001-911 Vila Real

��-9:,�#�� ;"

Figure 1. General structure of intact glucosinolatesand their myrosinase hydrolysis products.

� ����� �� ����

����� �� 3��������������������� ������������� �����

������������ � ������ ����� �� ��)���� ���� ������

� ����� ������ ����� ���#;/? 4� ��������� ��������

���� �� � ������ �� 3��������������������� ��������

���� ��� ��������� �� ���� ���������� �� ���

�������� �� ����� ���� �� �� ��������� �� ��������

��� �� ��� ������� ���������� � ������������ ��

���������� �����1��� ��� �� �� ������� ���� �����

�� ���� ���� ��� ��8���� �� ��� ������ �� 3�

�������������������� �����������# !�� �������� ���

����� @ ������������� ��� ����� �� ������� ��� ����

����� �� ������ �� ���� �� ����8����#> .���

������ �� ������������ ��� ��8���� �� ������

�������� �� ����� ������ �� ����� ���� �����

������ �� ������� �� ���� ���" �� ���� �� ���������� ������ ��� ����� ����� ��� ��������� �� ������������

�� ���� ������������ �� ������� ������� ��� ����

����� ��� �� ��� ������������# (��� ���� ���

���� �� �������� ���� ������������ ���� ��� �������

�� ������� ��8�������� �� "" ������ ��������

���� �� ����� �� ���� �������#

EXPERIMENTALPlant material(�� ������ �� ������ 7 ��� ������� �������� 0�2��

+��A���� ����� �� %���� B������� 7� ��� '��������

.������ .�� ��� .C,� .C3 �� (������� ����

���� �� ��� � ���������� &��� �� ��� D���������

� (��A�����'����� � $��� ����� �� �� ������� ��

36,�� 3"°"E�@� E°33�F# .���� ���� ���� " $����

">>E ��� ��� ����� 9������ �..� ������ �� "3

$� ��� ">>E ��� ��� ������9������ �.F� ������#

(�� ���������� ��� � ��� � �������� ���� ������

���� ����� ��������� �� -" ������ ���# !�� ���������

&�� ������ ���� ��� ���� ��� �� ��� ����� ���������#

+�������� �������� ��� � ����� �� ��� ����� 9

������ ������ ������� 6- �� E� ��� ����� �������

��� ��� ������� ��8�������� �� ������� ;3 �� ?3

��� ����� ������� ��� ��� ������� ��8��������# 4�

��� ������9������ ������ ��� ������� ����� ���

������� ;E �� >3 ��� ����� ������� ��� ��� �������

��8�������� �� ������� ""E �� "," ��� �����

������� ��� ��� ������� ��8��������# 4�8�����

;-

���� ���� ������ �������� �� ��� ���� ���� �� ��

�� ���� ������ ��8����# 5��� �� ��� ��8��������

�� ��� �������� ���� ���� ���������� ����)������

������ ��� ����� ���� ���� ��� �� � �������� ���� ��

;�°+ ����� ������� ��� �� �� �������� ��� ��

��� ��#

.������ ���� �� ���� ����)����� ���� ���� ��

� &�� �����# $� ������ �� ����� ������� �#- ���

��� �� ���� � ������� � ����� �� ���� ��� ��

�#-�� �� ���)�� ����������� �� �� �������� �������

� ����� ���� ������ �������� �>�G� ��� -��� ����

��������� ���� ��������� �4C$ �.������� %�������

D�����(���� (-6� �� ���� ������� � ��� -��� ��

-6����"# (�� ����������� ��� ����� ���� � "���

��������� 8���# (��� ���� ��� ������� ���� ����

�������� �� E�G �� ��� ������ ������������ ����

��� �� �� � &��� ������ �� "��� ���� �������� ��

E�G �� ���� �� �"?°+#

Glucosinolates(�� ������� ������������ ���� ������� ����� ����

�&����� ����� � � .����� $-6 ����� ����� ����

���������� �.� �� +������ +�� .� 7����� '=� D.$�

��� �����������# $������� ��� �������� �� 5�7+

���� � 6�� .��������� ������ .����������� �������

DC� ����� ����� �� ��� ����� ������ ��

.����� ��� "�

Amino acids(��� ���� ��� ���� �� ��� ������� ������� ��

%����� ���"" ���� ������� ��� �� ��� �� ���

����������� ������ ������� �� ��� �������#"- $����

��� ���� �������� �� 5�7+ �%����� �������

���� +"? ������ �F������ .��������� ., =�.-� �

3#;��� �� "6��� ��� �� �� � DB9B4. ������ ���

�� ,3���� ����� �������� ������������� ���� ��������������9-���������������� �������� � ���

���� ������� ������ �� +����� ��", ��

.H������ ��� "3 4����&����� �� 1�����&����� ��

��� ����� ����� ��� ���� ��� �� � ������

������� ����� �2������� ����� � �� ������� �����#

Statistical analysis$������� �� ������� �� ���������� �������� ����

��� ���� ����� ���;"/;3 �������< -��"�

�� ����� ����� ��� ������������ �� ��������

�������� ���� � .������� ���� � �� 6#�� .$.

4�������� 4�� +���� @+� D.$�#

RESULTS AND DISCUSSION(�� ������ �� ��������� ������� �� ����� ������

������� �� ��� ������� �� ������� ��8�������� ���

��� �� ��� "" ������ �������� ���� �� ����� �� ����

�������� �� ��� ������ �� ��� ��������� ��������� ���

��� ���� �� ������������� '��� ��� �� (��� ��

(��� ��� ��������� �� (���� "#

(�� �������� �� ������� ������� �� ��&��� ������

���� ��� ���� �� ��� ������ �� ������� �� ��� ��� ��

Table 1. Content of free amino acids andglucosinolates (mmol kg�1 DW) in the primary (P)and secondary (S) inflorescences of 11 broccoli(Brassica oleracea var italica) cultivars grown inspring/summer (SS) and summer/winter (SW)seasons

�������� �

���� ��

��

�������� ��

��

������� ��

��

����� �����! ��

��

"����� ��

��

#���!$�� ��

��

���%$� ��

��

�$���� ��

��

�&� ��

��

�&� ��

��

'�()���*� ��

��

��+ ��! ��!�,!��- '���.$

��� ���� ����� ���;"/;3 �������< -��"�

��� ����������� ������ ������ ��� ��� ����� ��� ���

�������� ��� ������� �(���� -�# .��� ��� ��2��

������� ��� �� ������� ��� ��� ��� ������ �� ���������

����� ����� ���� �� ��� ��8�������� �� ������

������ �� ��� ��������� ����� �� ������������� �

���������� �������� ���� ��� ����� ��� ��� ��������#

@� �� ��&��� ����������� ���� ���� ������� ���

�������� ���� �� ���������� �� I�#�,?�� �������

��� ����� ���� �� ���������� �� I�#��"� ��

������� ��� ������� ���� �� ������ �������������

�� I�#�6�� �� �������� �� I��#�3"�# F��� ���������

�������� �������� ��� ��� ����� �� ���� ������� �� ���

��� ������� �� ������� ��8��������� � ��� ��

�� � �

��� � ����� ������� �����

�� �� ��� ��� ������ ����� �� ���

� �� ��� �� ��� ���� �� �� �

� �� �� ��� � � ��� �� ���

� ��� �� ��� � � ��� � � �����

� �� �� �� � � ����� � � ����

� ��� ��� ��� �� ��� � ��� �

� � �� �� � � ����� ��� � ���

� ��� ��� ��� ��� � ��� �� � ��

� �� � ��� ��� �� ��� �� ����

� � ��� ��� � � ���� �� � ���

� �� �� �� � � �� �� ���

� �� �� ��� � � ��� ��� ���

� ���� �� �� � � ��� � � �����

� ��� ��� �� � � ���� �� ���

� ��� ��� �� ��� �� �� ����

� ��� ��� ��� �� ���� �� ����

� �� � ��� ��� ���� ��� ���

� ��� �� ��� � � ���� �� ����

� ���� �� �� � � ���� � �����

� ��� �� ��� �� ���� �� �����

� ��� ��� ��� ��� ���� �� �����

� ��� �� ��� � � ���� �� ����

� ���� �� ��� � � �� � �� ���

� ���� ��� ��� �� ����� ��� ���

� ���� �� ��� � � ��� ��� ����

� ��� ��� ��� � � ��� �� �����

� ��� ��� ��� ��� ��� �� � ���

� ��� �� �� ��� ����� �� � ���

� � ��� ��� �� ����� �� �����

� � � ��� ��� � � � ��� �� ���

� ��� �� �� ��� ���� ��� ����

� �� � ��� �� �� � � � ����

� ���� �� ��� � � � �� �� ��� �

� � ��� ��� ��� ���� �� �����

� ��� ��� �� ��� ����� �� ����

� ��� ��� �� � � ��� ��� ����

� ���� �� ��� � � ���� � � ��

� �� � ��� ��� � � �� � �� � ��

� ���� ��� �� � � ���� �� ���

� � ��� ��� � � ���� ��� � �

� ��� ��� �� ��� ����� � � ���

� ��� ��� �� ��� ���� ��� ���

� ��� ��� ��� � ���� �� � ��

� ��� ��� ��� ��� ��� �� �����

� � � ��� �� �� ��� � � � �

+ !�!�� ���.$�!�,%- '���*+ !�!�� ���*�!�,%- '�����+ !�!�� ������%�

;,

Table 2. Results of the analysis of variance for the three groups ofglucosinolates (aliphatic, aromatic and indolic) and the respective precursors(the amino acids methionine, phenylalanine and tyrosine, and tryptophan) inthe 11 cultivars of broccoli (Brassica oleracea var italica)

���� �� ����� �

��� � ����� ������� �����

�� �� ��� ��� ����� ���� � ���

���%�� /�0 ** *** �� * *** *** ��

1�2���%,��,� /10 �� �� �� �� *** �� ***�� 1 �� * *** �� *** �� ***���!�3�� /�0 �� �� �� �� *** *** ***��� ** * �� *** *** *** ***1�� �� �� �� �� �� *** *�� 1�� * �� �� �� �� *** ***

��+ *+ **+ ***4 ��! %����5,��! �� %����5,��! �! ����+ ��+ �� 6)

7�8 7�

� ����� �� ����

�� ��&��� ����������� ���� ����# $ ������� &���

����� ���� ��� �������� ���� ������� ����������

�� ������ ����� �� ����� �� ���� ��������#

$���� �� J��� ���- ��� ����������� ������� �� ����������� �������� ��� ��� ��� ��� &��� ����� ��

��� ��������� �� ��� ���� ��� ������ ������ ��

������������� �� ��� ���� �� ���� ��� ���

������ ��� ��� ������������� ��� ��� ��������� ��

�������� ������ �� ������� ������������# .���

�� �� ��&��� ����������� ���� ���� ������� ���

��������� �� ��� ���������� �� �� ������ ���� ���

����� ��� ���� ��� �� ��� &��� ���� �� ���

����������� ������� �� ���� ��� ��������� ��� ����

�� �������� ������� ���� ��� ���� ��� �� ���

��������� �� ����� ������� ��� �� ������� ��

�������� �������, �� �� ��� ��������� �� ��������

�� ��#"6 (��� ��� ��������� �� ������������ �� ��

�� ������� �� ����� ����������� �� �� ��� ��� ��

����� ������������ ��� ��� ��������� �� ����� ���

�����# !������ ������ ��� ���� �� ������ ���

�������� ������� ��� ����� ��� �� ��� ���������

���� �� ��� ����������� ������������# *������� ���

����� ����� ������ �� ����������� �� ��� ����� ��

��� ����� �� ���������� ������ ��� ������ ������ ��

�� ������� �� ��� ������ �� 3���������������������

����������� �� ��� ��������� ���������� ��� �������

����&��� �������������� ��� ��� ���� ���� �������

���� �� ���������� ������� �� � ��� ������� ��� ���#

$ ������� ��������� �� �� ��� ������� ����������

�� ��� ������ ����� ���� ��� ���� �� ������ ��

��������� ���� �� �������� � ����� ����� ���

�������#

CONCLUSIONSF� ����� ���� �� ������ ��8�������� ����� �� ��

;3

���������� ������� ��� ������������ �� �����

���������� ��� ���� ����� ���# 4� ��� �����������

�������� ����� ������� ��� �� ��� ���� ��

�������� ������ ����� �� ������� ��� ��� � ������

���������� ���� ����� ���������#

REFERENCES" ���� *$.� 5����� �C� !����� %� �� ������ +� %��������

����� �� ��� ������# ��� � �/<>>/-"6 �">>E�#

- J��� J+� %����F������ JF�� ��� �F �� D������� *F�

���������� ������&����� �� ��)���� �����)�� ��� ��1�������

����������� �� ��������� ����� �� ����������� ������������#

!��� !�"���� �01<,6;/,;" �">>��#

, %����F������ JF�� ��� �F �� C��������� $F� 4������

����&����� �� �������������������� �� ��� �����������

����������� ��)��� �������� ����� .� �����������������#

!��� !�"���� �+2<3-6/3,, �">>3�#

3 F���� ���� �' �� 0������ �@� (�� ������������ �� ������

������� �� ���������� �� ����� ����� ��� #��� $�� �� � ��

����� !����� * �� F���� ���� �'� ����� .������

D��������� �� +����� �� +����� �� �� -3,/-E6 �">>6�#

6 7��������� J �� 7����� �'H���� 0� .�������� �� ���)�� ����

�������� �� #��%����� ��&�� 7# 4������������� �� ������

��)��� ����������# !��� !�"���� �+*<;�>/;", �">>,�#

; K��� L� (������ �� +�� +�% �� ������ %5� $ ��2�� �����

�� ��������� ��� ��������� ��)���� ���� ������< ���������

�� ��������� �� ��������# !��� ��� ���� ��� ./<-,>>/-3�,

�">>-�#

E !���� JF� K��� L �� (������ �� 0����� �������< ��

� ���������� ��� ����� �� ������ �� ��)���� ���� ������

� ����� ������ ����� ���# !��� ��� ���� ��� /3<"�,;E/

"�,E- �">>E�#

? !���� JF �� .��������� CC� +���� ������������� ������

�� ��������� �� �������# �������� 03<""6>/"";, �">>>�#

> *��������� F5 �� 0���� .F� !��� �� ����� ����� ��

���������� �� ����� ����� �� ������ ����� ������� ����8����

�� �������� �� ��8���� �� ����� �� ������������� ��

���������� �� ��������� �&����# ��� ���� �����

4�<33>/36? �">>;�#

"� .����� $� .���� C �� !����� %�� (�� 1����������� �������� ��

������������ �� ��������� �� �������� ������� �� ���� �

���� ���� �� � ���������� ��1�� ������� �����# �

���� ���������� .1<--?/-," �">?3�#

"" %����� +F� C�� C+� C����� !* �� K������ �F� $������� ��

����� ��� �� �� ������� ����� �� ��� �����8��������� ��

����� ������# ����� '�� ���� (�� 4+<";�/"E� �">?E�#

"- %���� '5 �� ���� *$.� !��� ����� �� ���������� ��

������� �� ������� ��8�������� �� "" ������ ���������

������ ��� ������� �������� �� ��� ��������� ������� �����

�������# ��� ���� ����� .�<->6/->> �-��"�#

", +����� J�5� = �� %� '4����� J �� (������ �+� (��

��������� �� ��� ��������������9-��������������� ������

����� �� ����� ���< �� ������� ����� ���� �� ���������� ��1��

������� ����� ���� � �������� �������)����� �����1��#

���� ������ �3*<>?/"�- �">?3�#

"3 .H������ 5� .H������ .� 02�� � ��� + �� '�������� .�

(���������%�" ��� (�%�����" �����%������ �� ���� ����"���#

����� .����� �� +��������� +����� �� �� ,,-/,,3 �">>>�#

"6 5������ �� J� ����� ( �� 5�� ����� F� $ ������� �������

����� ���� +������ ���� � ������� ������,������� ���

�� 4$$# !�"�������" *1<;"6/;"? �">?E�#

��� ���� ����� ���;"/;3 �������< -��"�