Relation entre les deux souches bactériennes principales d ...composant de fertilisants agricoles...

i

UniversitéduQuébec

INRS-InstitutArmand-Frappier

Relationentrelesdeuxsouchesbactériennesprincipales

d’unbiofilmdénitrifiant

Par

JonathanCloutier

Mémoireprésentépourl’obtentiondugrade

Maîtredessciences(M.Sc.)enmicrobiologieappliquée

Juryd’évaluation

Présidentdujuryetexaminateurinterne

Examinateurexterne

Directeurderecherce

ÉricDéziel

INRS-InstitutArmand-Frappier

FranceDaigleUniversitédeMontréal

RichardVillemurINRS-InstitutArmand-Frappier

ii

Résumé

Lorsd’étudesportantsurunbiofilmprovenantd'unbioprocédéde

dénitrification,ilaétédéterminéqu’ilyavaitdeuxsouchesbactériennesquiétaient

lesplusabondantesentermedeproportiondelabiomasse.Cesdeuxsouches,NL23

etJAM1,ontéventuellementétédésignéescommenouvellesespècesbactériennes

HyphomicrobiumnitrativoransNL23etMethylophaganitratireduscenticrescens

JAM1.TandisquelasoucheNL23estenmesured'effectuertouteslesétapesde

dénitrification,lasoucheJAM1estincapablederéduirelenitriteetdoncnepeutpas

réduirecomplètementlenitrateenazotegazeux.Plusieursfacteursdansleur

relationsuggèrentunecertainecoopération.Cemémoireprésentelestravaux

effectuésafind’enapprendredavantagesurl’interactionentrecesdeuxbactéries

Dansunpremiertemps,desconditionsoptimalesdeco-culturesentrelesdeux

souchesontétédéveloppées.Lacaractérisationdeladynamiquedeconsommation

dunitrateetdunitriteadémontréquelesco-culturesdessouchesNL23etJAM1

n’étaientpasnécessairementplusrapidespoureffectuerladénitrificationquela

soucheNL23enculturepure.Parcontre,desco-culturesdelasoucheNL23avecun

mutantdelasoucheJAM1(inactifpourréduirelenitrate)ontdémontréune

dénitrificationplusrapidequelasoucheNL23enculturepure.

LarechercheaaussipermisdedémontrerquelasoucheJAM1apporteune

aidedecroissanceàlasoucheNL23enconditionsaérobiesetuneaideenréduction

denitrateenconditionsanaérobies.Parcontre,iln’apasétédémontréquela

soucheNL23procureunavantageàlasoucheJAM1.

iii

Remerciements

J’aimeraisremerciermondirecteurderecherche,RichardVillemur,de

m’avoirpermisdecomplétermamaîtrisedanssonlaboratoire,luiquiatoujoursété

disponiblepouroffrirsonaideetsesconseils.Sanssapatience,sacompréhension

etsagénérositéjen’auraispaspufinirleprojet.

J’aimeraisaussiremerciertouslesmembresdulaboratoiredeRichard

Villemurpourleuraide,enparticulierChristineMartineau,poursonaide

indispensabledansmesdébutsnerveux;KarlaVasquezpoursonsoutien,son

expérienceetsaluttepourl’entretienduIC;etFlorianMauffrey,poursesconseils

(etsesmutants).MerciaussiàGeneviève,Marc-AndréetValérie,ainsiqu’aux

membresduGRMEquiontrendul’expérienceencoreplusagréable.

Sanslesoutienmoraldemafamilleetdemesamis,cetteentrepriseaurait

étéimpossible.Merciàmesparents,àmasœuretàtouslesgensquiontfaitpartie

demaviedurantcettepériode.

iv

Tabledesmatières

1. Introduction..............................................................................................12. Revuedelittérature...............................................................................42.1. Dénitrification..........................................................................................................................................42.2. Biofilms.......................................................................................................................................................72.3. Osmoprotection.......................................................................................................................................82.4. Bioprocédés...............................................................................................................................................92.5. BiodômedeMontréal..........................................................................................................................102.6. Methylophaganitratireduscenticrescens.....................................................................................132.7. Hyphomicrobiumnitrativorans.......................................................................................................142.8. Co-cultures,partagederessources...............................................................................................152.9. Hypothèseetobjectifs........................................................................................................................17

3. Matérieletméthodes...........................................................................183.1. Souchesbactériennes..........................................................................................................................183.1.1. Mutants.............................................................................................................................................18

3.2. Culturedesbactéries...........................................................................................................................193.2.1. MilieuoptimaldelasoucheJAM1.........................................................................................193.2.2. MilieuoptimaldelasoucheNL23.........................................................................................213.2.3. Milieudecroissanceadaptéàlaco-culture......................................................................223.2.4. Milieuxsousformedegéloses................................................................................................23

3.3. Préparationdescultures...................................................................................................................233.3.1. Ensemencement............................................................................................................................243.3.2. Conditionsdeculture..................................................................................................................24

3.4. Récoltededonnées..............................................................................................................................253.4.1. Spectrophotométrie....................................................................................................................263.4.2. Chromatographieionique.........................................................................................................263.4.3. Extractiond’ADN..........................................................................................................................263.4.4. qPCR...................................................................................................................................................27

4. Résultats...................................................................................................304.1. Déterminationdesconditionsoptimalesdeculture.............................................................304.1.1. Suividecroissancepréliminaireenconditionsaérobies...........................................304.1.2. Suividecroissanceenconditionsanaérobies..................................................................314.1.3. Variationsproblématiques.......................................................................................................404.1.4. Réductiondelaquantitéinitialedenitrate......................................................................46

4.2. CaractérisationdelarelationentrelessouchesNL23etJAM1........................................494.2.1. Croissancedeculturespuresenprésencedesurnageant..........................................494.2.2. Recherched’unosmoprotecteur...........................................................................................534.2.3. Caractérisationapprofondiedelaconsommationdunitrate/nitriteàl’aidedemutantsdelasoucheJAM1......................................................................................................................57

5. Discussion................................................................................................645.1. Paramètresoptimauxpourlacroissancedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1 645.2. Profildeconsommationdenitrateetdenitritelorsdeladénitrification...................665.3. LessouchesNL23etJAM1enbiofilm..........................................................................................70

v

5.4. Échangederessources.......................................................................................................................73

6. Conclusion................................................................................................75

vi

Listedestableaux

Tableau3.1:compositiondumélangedanschaqueréactiondeqPCR.28Tableau3.2:détailssurlatechniqueduqPCR.................................................29Tableau4.1:concentrationdeNaClpartubedanslarecherched’un

osmoprotecteur..............................................................................................................54

vii

ListedesfiguresFigure2.1:Représentationschématiquesimplifiéeducycledel’azote..............................................................4

Figure2.2:Voiemétaboliquedeladénitrification........................................................................................................6

Figure2.3:BioréacteurdubiodômedeMontréal.......................................................................................................11

Figure3.1:LessouchesNL23etJAM1.............................................................................................................................15

Figure3.2:Exempledecultureenanaérobiose...........................................................................................................25

Figure4.1:Croissanceenconditionsaérobies(InstantOcean15g/L).............................................................31

Figure4.2:Lacroissancedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies...........33

Figure4.3:Consommationdenitratedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies.....................................................................................................................................................................................35

Figure4.4:concentrationdenitritedanslesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enconditionsanaérobies.....................................................................................................................................................................................36

Figure4.5:Concentrationd’azotetotaledanslesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobie........................................................................................................................................................................................38

Figure4.6:Consommationdenitratepourchaqueréplicatdesco-cultures1:5........................................40

Figure4.7:Concentrationdenitritepourchaqueréplicatdesco-cultures1:5...........................................41

Figure4.8:Concentrationd’azotetotalpourchaqueréplicatdesco-cultures1:5.....................................41

Figure4.9:Consommationdenitratepourchaqueréplicatdesco-cultures1:10......................................42

Figure4.10:Concentrationdenitritepourchaqueréplicatdesco-cultures1:10......................................43

Figure4.11:Concentrationd’azotetotalpourchaqueréplicatdesco-cultures1:10...............................43

Figure4.12:QuantitésrelativesdesgènesnapAetnarG1danslesco-cultures1:5..................................44

Figure4.13:QuantitésrelativesdesgènesnapAetnarG1danslesco-cultures1:10................................45

Figure4.14:Consommationdenitratedesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enconditionsanaérobies.....................................................................................................................................................................................47

Figure4.15:Concentrationdenitritedanslesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enanaérobie....47

Figure4.16:Concentrationd’azotetotaldanslesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies.....................................................................................................................................................................................48

Figure4.17:CroissanceenconditionsaérobiesdelasoucheNL23enprésencedesurnageant...........50

Figure4.18:CroissanceenconditionsaérobiesdelasoucheJAM1enprésencedesurnageant...........52

Figure4.19:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(0%deNaCl)................................................................................................................................................................................................55


Figure4.21:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(1,5%deNaCl)................................................................................................................................................................................................56


Figure4.23:Consommationdunitrateparlesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies)..........................................................................................59

viii

Figure4.24:Concentrationdenitritedanslesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies)..........................................................................................60

Figure4.25:Concentrationd’azotetotaldanslesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies)..........................................................................................61

Figure5.1:ProfildeconsommationdunitrateetdunitriteparlasoucheNL23lorsdeladénitrification..............................................................................................................................................................................66

Figure5.2:ProfildeconsommationdunitrateetdunitriteparlasoucheJAM1lorsdeladénitrification..............................................................................................................................................................................67

Figure5.3:Profildeconsommationdunitrateetdunitriteparuneco-culturedessouchesNL23etJAM1lorsdeladénitrification.............................................................................................................................................67

Figure5.4:Profildeconsommationdunitrateetdunitriteparuneco-culturedesespècesBacillussubtilisetPseudomonasdenitrificanslorsdeladénitrification.............................................................................68

Figure5.5:Supportenplastiquegarnid’unbiofilm...................................................................................................71

Figure7.1:Schémadelaméthodedecréationd’unbiofilm...................................................................................77

ix

Listedessiglesetdesabbréviations˚C:degrésCelsius

ADN:acidedésoxyribonucléique

DO600:densitéoptiqueàunelongueurd’ondede600nm

EPS:extracellularpolymericsubstances

FISH:fluorescentin-situhybridization

TSA:trypticasesoyagar

R2A:Reasoner’s2Aagar

ATCC:americantypeculturecollection

Pb:pairesdebases

FAM:carboxylfluorescein

BHQ:blackholequencher

rpm:rotationsparminute

1

1. Introduction

Lenitratereprésenteunpolluantpotentieldanslecontexte

d’environnementsaquatiquesnaturelsousimulés.Lamoléculeesttoxiquepourles

animauxàdesconcentrationsexcédantenviron30ppm(0,49mMd’azote).La

limiteimposéeàl’eaupotableauCanadaetauxÉtats-Unisestde10mg/Ld’azote-

nitrate(45mg/Ldenitrate),concentrationàlaquellel’eauestconsidérée

définitivementsécuritairepourleshumainslesplusvulnérables.Lenitriteest

encoreplustoxique:quelquesmilligrammesparlitresontsuffisantspourla

manifestationdeproblèmeschezlespoissonsetlalimiteacceptabledansl’eau

potableestde1mg/Ld’azotenitrite(3mg/Ldenitrite).Lenitrateestsouventun

composantdefertilisantsagricolesets’accumuledoncàhautesconcentrationsà

l’embouchuredecoursd’eau.Outreleseffetsdirectssurlasantédespopulations

humainesetanimales,ilpeutyavoirproliférationd’algues,hypoxieetautreseffets

reliéscausantdeschangementsnocifsàl’écosystèmedumilieu(Camargoetal.,

2005).Dansunsystèmeaquatiquefermé,commeunaquarium,l’accumulationdu

nitratepeutseproduiredemanièreinexorablepuisquel’eaudumilieuestrecyclée

etquelesorganismesvivantsensontdessourcescontinuelles.Unesolutionnon-

biologiqueestleremplacementtotaldel’eau,cequipeutserévélerêtredispendieux

etpeupratique.Unesolutionpotentielleestladénitrificationbiologiquepardes

organismesbactériens.

UndesécosystèmesenexhibitionauBiodômedeMontréalestlemésocosme

dufleuveSaint-Laurent,quicomporteungrandaquariummarindanslequelvivent

plusieursespècesanimalesoriginairedel’estuairedufleuveSaint-Laurent.

L’accumulationdunitrateétantproblématique,unbioréacteurfutinstallé,dans

l’espoirquedesespècesbactériennesdénitrifiantespuissentréduirelamolécule

toxiqueenazotegazeux.Cebioréacteurétaitcomposéd’unmécanismesupportant

lacroissanced’unbiofilmexhibantdel’activitédénitrifiante;cebiofilmestétudié

pardesmembresdulaboratoireduPr.RichardVillemurdepuis2000.Plusieurs

2

souchesbactériennesdistinctesenontétéisolées,etplusieursorganismesnon-

bactérienssontnotésd’ycohabiter.Deuxsouchesbactériennes,cependant,

composentlagrandemajoritédelacommunautébiologiquedubiofilm,entermes

debiomasseetd’activitédénitrifiante:lessouchesJAM1etNL23,touteslesdeux

méthylotrophesetanaérobesfacultatives.Depuisleurdécouverteetleur

caractérisationcommedesespècesdistinctes,ellessontdénomméesMethylophaga

nitratireducenticrescensetHyphomicrobiumnitrativorans,respectivement.

Ladénitrificationestunprocessusderéductiondunitrateetdecomposés

intermédiairesenquatreétapesprincipales.Lenitrateestd’abordréduitennitrite,

quiestréduitenacidenitrique,etensuiteenacidenitreuxpourfinalementproduire

del’azotegazeux.Àchacunedesétapesestassociéuneenzyme.LasoucheJAM1

n’effectuequetroisdesquatreétapesdedénitrification,nepossédantpasdegène

codantpourlanitriteréductase.Elleréduitlenitratedefaçonefficacegrâceàdeux

nitrateréductasesmembranaires,Nar1etNar2.Lasoucheestaussitoléranteaux

conditionssalées,exhibantunecroissancenormaledansunmilieucontenant

jusqu’à8%deNaCl.LasoucheNL23,quantàelle,effectuetouteslesétapesdela

dénitrification.Toutefois,sanitrateréductasepériplasmiqueexécutelaréduction

dunitratebeaucoupmoinsrapidementqueleduod’enzymesdelasoucheJAM1.

Contrairementàcettedernière,lasoucheNL23netolèrepasleseldanssonmilieu,

etuneconcentrationdeplusde1%NaClinhibesacroissance.Notamment,ceci

sembleparticuliercarlemilieudanslequelétaitcultivélebiofilmétaitmarinet

incluaitprèsde3%desel.

Puisquecesdeuxsouchesprincipalesétaientdeloinlesplusabondanteset

activesdubiofilm,ilestnaturellementintéressantdelesétudierenplusdedétails

defaçonindividuelle.Parcontre,unbiofilmestunecommunautécomplexede

microorganismes,etlessouchesNL23etJAM1interagissentdoncpresque

certainementàuncertainniveau.Ilestdoncégalementintéressantd’étudierla

relationentrelesdeuxsouches,spécialementlorsdeladénitrification.Ceprojetde

recherchetentededéterminers’ilexisteunecoopérationentrelesdeuxespèces

3

principalesdubiofilm.Cetterechercheserasurtoutaxéesurlepartagedesoxydes

d’azotemaisviseraégalementdetrouverd’autresélémentspouvantcontribuerà

unesynergie,telsquedesfacteursdecroissance,desmoléculesessentielles(ex:

vitamineB12),etc.

4

2. Revuedelittérature

2.1. Dénitrification

Leprocessusdedénitrificationestunedescomposantesmajeuresducycle

del’azote,oùl’azotecirculedansl’atmosphère,lesoletl’eausousdiversesformes

moléculaires.L’importancedecettecirculationprovientengrandepartiedela

dépendanced’organismesvivantsàl’azotepourlastructureetlaformationde

moléculesprotéiquesetnucléiques.Eneffet,aucunevieterrestrenepeutexister

sanscetélément,etlesorganismesexistantauseindemilieuxpauvresenazote

doiventdévelopperdesstratégiesspécialesdesurvie.

Figure2.1:Représentationschématiquesimplifiéeducycledel’azote Lecycledel’azoteestunsystèmecomplexederéactionschimiquesengrandepartiecatalyséespardesorganismesmicrobiens.(1)Fixationd’azote;(2)nitrification;(3)dénitrification;(4)co-dénitrification;(5)anammox;(6)l’oxydationd’ammoniacdurantlanitrification.(Hayatsuetal.,2008)

5

Ladénitrificationréfèrespécifiquementàtouteslesétapesdelaréductiondu

nitrateenazote(Fig.2.2).Danslaplupartdescas,cetteréductionestexécutéepar

desespècesbactériennesprofitantdupotentielénergétiquedesréactionschimiques

impliquées;leprocessusréduitséquentiellementlenitrateennitrite,enoxyde

nitrique,enoxydenitreuxetfinalementenazotegazeux,chaqueétapeoffrantun

avantageénergétiquedifférent.Chacunedesréactionsestcatalyséeparuneenzyme

spécifique:

- Lanitrateréductasecatalyselaréductiondunitrateennitrite,cequioffrele

plusd’énergiepotentielleparmilesétapesdeladénitrification.Deux

versionsdissimilatoiresdecetteenzymeexistent:uneversionmembranaire,

codéeparlesgènesnar,etuneversionpériplasmique,codéeparlesgènes

nap.Ilexisteégalementdesvariétésdenitrateréductasesassimilatoires.

(Zumft,1997)

- Lanitriteréductaseàsontourpermetlaréductiondunitriteenoxyde

nitrique,lapremièreformegazeusedesmoléculesazotéesdela

dénitrification.Ilyaaussideuxversionsdecetteenzyme:Cu-Nir,qui

contientunatomedecuivre,estcodéparlegènenirK;cd1-Nir,quicontient

uncytochromecd1,estcodéparlegènenirS.Cesdeuxvariétésd’enzymes

n’ontjamaisétéretrouvéesensembledanslamêmeespèceetaucuneétude

n’apurévélerunedifférencefonctionnelleentreelles.(Priemeetal.,2002,

Zumft,1997)

- L’oxydenitriqueréductasecatalyselaréductiondel’oxydenitriqueenoxyde

nitreux.Laversiondel’enzymequiestprésentedanslesbactéries

dénitrifiantesestcNor,quicontientuncytochromecetestcodéparlesgènes

nor(unitécatalytiquecodéeparnorB).Ilexisteégalementd’autresversions

del’oxydenitriqueréductasedanscertainesespècesbactériennesquifont

partiedusystèmedeleursdéfensescontrelatoxicitédel’oxydenitrique.

(Hinoetal.,2012)

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- L’oxydenitreuxréductasecatalyselaréductiondel’oxydenitreuxenazote

gazeux.Cetteenzymecontientunatomedecuivreetestcodéeparlesgènes

nos(unitécatalytiquecodéeparlegènenosZ).(Pauletaetal.,2013)

Figure2.2:Voiemétaboliquedeladénitrification Lavoiecomplètededénitrificationtransformelenitrateenazotegazeuxparunesériederéactionschimiquescatalyséespardesenzymes(surlignées).Lesmoléculessontlenitrate(NO3),lenitrite(NO2),l’oxydenitrique(NO),l’oxydenitreux(N2O)etl’azotegazeux(N2).

Cesenzymespeuventsemanifestersousdesformesdifférentesetavoirdes

activitésvariablesselonl’espèce.Puisqu’elleoffreunavantageénergétique

inférieuràlarespirationaérobie,ladénitrificationestprincipalementutilisépardes

espècesstrictementanaérobiesoucommealternativepardesbactériesanaérobies

facultatives.Seuleunefractiond’espècesbactériennespossèdelacapacité

d’effectuerladénitrificationetcelles-cin’eneffectuentpasnécessairementtoutes

lesétapeselles-mêmes(Zumft,1997).Plusieursespècesbactériennessecontentent

d’effectuerseulementlarespirationdunitrate,tellequeSerratiamarcescens,quine

peutproduiredel’oxydenitriquequeparlaréductionnon-enzymatiquedunitrite

(Andersonetal.,1986).Celles-ciconstituentleplusimportantsous-groupede

bactériesprofitantdelaréductiond’oxydesd’azote(Gregoryetal.,2003).D’autres

espècesseserventplutôtd’enzymesderéductioncommemécanismededéfense

contrelesmoléculestoxiques.L’enzymeqNorestutilisépardesbactériescomme

Neisseriagonorrhoeaepoursedébarrasserd’oxydenitrique(Hinoetal.,2012).De

7

plus,certainesbactériesréduisentdesmoléculesintermédiairesdeladénitrification

enconditionsaérobies.Parexemple,l’espèceParacoccuspantatrophus

(précédemmentnomméeThisphaerapantatropha)estenmesuredeperformerune

dénitrificationcomplèteenprésenced’oxygène.Ilestpossiblequecetteactivité

permetteàlabactériededissiperlesmoléculesréductricesetretrouverun

équilibreredox.(Berksetal.,1995)

2.2. BiofilmsDanslanature,lavastemajoritédelaviemicrobienneexistesousformede

biofilm,etnondiffuseenmilieuliquide.Unbiofilmestcomposéd’organismesde

classificationstaxonomiquesvariéesainsiqued’unematricecomplexede

polymèresbiologiquesgénéralementconnussouslenom«substances

polymériquesextracellulaires»(enAnglais,EPS).Celles-cisontproduites

directementparlesorganismesvivantdanslebiofilmousontmodifiéespardes

enzymesproduitesparcesorganismes.Cependant,lacompositionexactedela

structured’unbiofilmestdifficileàdéterminer.LesEPSsontintimement

impliquéesdanslaviemicrobienned’unbiofilm,etleursfonctionssontmultiples.

LesEPSpeuventagircommesourcedenourriture,faciliterl’échangegénétique

entrebactéries,faciliterlarétentiond’eau,fourniruneprotectioncontredes

facteursantibactériensetbiend’autreschoses.L’architectured’unbiofilmestaussi

hautementvariéeetdépenddel’organisationdesEPS.Ilpeutyavoirdescanauxet

descompartiments,etlaformedubiofilmpeutvarierselonlasituation.Unedes

composantesessentiellesàlaformationd’unbiofilmestlagammedemolécules

(protéines,ADN,polysaccaridesetmoléculesamphiphiles)quiserventàl’adhésion

debactériescolonisatricesàunesurface.Eneffet,lapremièreétapedansla

formationd’unbiofilmestl’attachementàunesurface,suividelaformationd’une

microcoloniepardivisioncellulaire.Cen’estqu’aprèsl’adhésionoriginalequeles

autrescomposantesdelamatricedubiofilmsontproduitesetqued’autresespèces

bactériennesysontrecrutées.Sanslaprésenced’unesurfacepropice,lesbactéries

8

nepeuventpasformerdebiofilm,etrestentenphaseplanctoniqueous’agrègenten

d’autresformes(ex:floc).(Flemmingetal.,2010)

Ilestaussipossiblequ’unbiofilmsoitnécessairepourlafonctionde

certainessubstancesrelâchéespardesbactéries.Ilaétédocumentéquecertaines

souchesbactérienneshalophilespouvaientrelâcherdesparticulesosmoprotectrices

(ectoïne,glutamate)dansleurmilieupouraideràlasurviedebactériesdansleur

entourage.(Plakunovetal.,2008)

2.3. OsmoprotectionLorsqu’ellessontconfrontéesàdesfluctuationsdel’osmolaritédedeleur

milieu(comme,parexemple,uneaugmentationensel),lesbactériesdoivent

équilibrerlesgradientsosmotiquescrééspoursurvivre.Pouratteindrecetobjectif,

ellespeuventproduiredesosmoprotecteurs(ousolutéscompatibles)oulesobtenir

dansleurenvironnement.Unosmoprotecteurestunemoléculeavecunpotentiel

osmotiqueélevéquin’interfèrepasaveclesprocessusmétaboliquesd’unecellule,

mêmeenhautesconcentrations.Enl’accumulantdanssoncytoplasme,unebactérie

peutréduirelapressionosmotiqueentrelesdeuxcôtésdesamembrane.(Kempfet

al.,1998)

Ilexisteunevariétéd’osmoprotecteurs.Ceux-ciincluent:desdiholosides

commelesaccharoseetletréhalose;despolyolscommeleglycérol;ainsiquedes

acidesaminés(etdérivés)commelaproline,lesbétaïnes,lacarnitineetl’ectoïne

(Kempfetal.,1998).Plusieursbactériesontdessystèmescomplexesenplacepour

lerèglementfindeleurréponseàunstressosmotique.L’espècebactérienne

Bacillussubtilis,parexemple,faitlasynthèsedelaprolinepourseprotéger,mais

ellepossèdeaussiuntransporteurspécifiqueàlacapturedeprolinedans

l’environnement.Ellepeutaussicapturerdespeptidesetenextrairedelaproline

avecdesprotéases,unestratégiequiestadoptéeparplusieursautresespèces

également(ex:Listeriamonocytogenes,Lactobacilluscasei,Oenococcus

9

oeni)(Zaprasisetal.,2013).Deplus,certainesbactériespeuventfaireusagede

plusieursosmoprotecteursdifférents.Escherichiacoliestcapabledesynthétiserle

tréhaloseetlaglycinebétaïne,ainsiqued’utiliserlaprolineetl’ectoïneretrouvées

danssonenvironnement(Jebbaretal.,1992).L’ectoïne,dérivédela

tetrahydropyrimidine,estl’osmoprotecteurquelasoucheJAM1semblepouvoir

produire(voirsection2.6).Cetosmoprotecteurestparticulièrementintéressant

danslecadredescommunautésbactériennestolérantesauselcarilaétédémontré

quedesbactériesnon-halophilespeuventenfaireusagepourobtenirunetolérance

aupressionsosmotiques(Jebbaretal.,1992).

2.4. BioprocédésUnbioprocédéestuneapplicationdescapacitésdemicroorganismespourla

productiondebiensoupourd’autresprocessusutiles.Cesapplications

biotechnologiquessontcourammentutiliséesdansunepanopliededomaines,

incluantlaproductionalimentaire,laproductiondemoléculespourutilisation

pharmaceutique,etc.

Lapurificationd’eauuséeimpliquesouventdesbioprocédés,dontles

systèmesdeboueactivée,quidépendentdel’activitédebiomasseenflocdansdes

réservoirsaéréspourpurifierl’eauquis’yretrouve(Roediger,1983).Les

bioréacteursmembranaires(«Membranebioreactor»enAnglais,ouMBR)

combinentunsystèmedeboueactivéeavecuneultrafiltrationpourpurifierdel’eau.

Cettetechnologiereprésenteunmarchéévaluéàdescentainesdemillionsde

dollarsetresteunsujetderechercheactif(Le-Clechetal.,2006,Wangetal.,2016).

Labiomasseutiliséedansunbioprocédépeutaussiêtrecultivéesousformede

biofilmfixéàunsupportàl’aided’unbioréacteuràlitfluidisé,commedanslecas

d’untraitementdelixiviatdansunedécharged’ordures(Hajipouretal.,2011)oude

dégradationdesubstanceshuileusesparunbiofilmfongique(Pakulaetal.,1996).

Cependant,lesbiofilmspeuventaussiêtreproblématiquesdanslesbioprocédés.

DansunMBR,laformationd’unbiofilmsurlamembranedefiltrationmèneàla

10

dégradationdecelle-ci.Ceciestconsidérécommeundesproblèmesprincipaux

dansledéveloppementdesMBR(Le-Clechetal.,2006).

Ladénitrificationpeutelleaussiêtreexploitéecommebioprocédé.Lenitrate

etlesautrescomposésintermédiairesdeladénitrificationreprésententtousdes

dangerspotentielspourl’environnementainsiquepourlasantéd’organismes

vivants,incluantleshumains.Pourcetteraison,ledéveloppementdeméthodesde

dénitrificationenbioréacteuresttrèsactif.Undomained’attentionparticulièreest

letraitementd’eaupolluéeparl’industrieagroalimentaire.Plusieursétudes

récentesontinvestiguél’efficacitédebioréacteursavecdifférentessourcesde

carbonesetunevariétédeparamètres.Lesrésultatsmontrentengénéralune

améliorationpotentielleaveccestechniquesparrapportsauxtechniquesde

traitementtraditionnelles(créationdezoneshumides,constructiondefossés

écologiques,etc)(Liangetal.,2015).

2.5. BiodômedeMontréalLeBiodômedeMontréalainstalléen1998unbioréacteuràlitfluidisépour

remédieràunniveaudangereusementélevédenitrate(environ15mM)dansl’eau

deleuraquariumd’eaumarine(Fig.2.3).Àl’intérieurduréacteurseretrouvaitun

biofilmdénitrifiantnourrideméthanoletformédebactériespréalablement

présentesdanslemilieu.L’espoirétaitquelebioréacteurpourraitgarderla

concentrationdunitratedissousàdesvaleursplussécuritaires,danslebutd’éviter

dessolutionsplusdrastiques,commeleremplacementd’eau.Lesystèmede

dénitrificaitonn’apuatteindrecesattentes,etdoncdeseffortsd’optimisationdela

performancedubioréacteurontétéentreprises.(Labbé,2007)

Ilaétédémontréqu’ilétaitpossibledegénérerunbiofilmcapablederéduire

uneconcentrationde50mgd’azoteparlitreàprèsde1mgd’azoteparlitre.Le

biofilmétaitformédebactériesprésentesdansl’eaumarinedumésocosmedu

FleuveSt-LaurentduBiodômeetétaitcultivéenmodecontinudansunréacteuràlit

11

fluidisé,maisàuneéchellepilote,beaucoupmoinsvolumineusequedans

l’aquariumoriginal.Ilaétéconcluquelebioréacteurdénitrifiantpourraitêtre

efficace,maisqueplusieursfacteurs(épaisseurdubiofilm,dégradationdesupports,

zonesmortes)quiétaientfacilesàcontrôlerenlaboratoiredevenaientdesobstacles

importantàl’applicationduprocédéàgrandeéchelle.(Labelleetal.,2005)

Figure2.3:BioréacteurdubiodômedeMontréal Bioréacteurdedésoxygénation(A)etdedénitrification(B)pourlemésocosmeduFleuveSt-LaurentauBiodômedeMontréal.Installéen1998.(Labbé,2007)

Parlasuite,lacompositionmicrobiologiquedubiofilmdubioréacteuraété

investiguée.Delabiomasseissuedubiofilmaétécultivéesurtroistypesd’agar

(TSA,R2AetWinogradsky).TroisisolatsontétéobtenusetleurADNribosomal16S

analysés,cequiapermisdedéterminerqu’ilsétaientdesα-protéobactériesdes

genresHyphomicrobium,Paracoccus,etd’unnouveaugenrebactérien.Lasouchedu

12

genreHyphomicrobiumaéténomméeNL23etaétécaractériséecommeundes

acteursprincipauxdel’activitédénitrifiante(Labbéetal.,2003).L’espècedu

nouveaugenreasubséquemmentétécaractériséecommenouvelleespèce

dénomméeNitratireductoraquibiodomus(Labbéetal.,2004).Lesbactériesnon-

cultivablesdubiofilmontétéétudiéesàl’aided’unegénothèqued’ADNribosomal

16Stotaldubiofilm.Ilaétédéterminéque70%desclonesgénérésavaientla

séquenced’uneγ-protéobactériedugenreMethylophaga.Lesautresprofils

indiquaientlaprésenced’unevariétédeséquencesreliéesàdesespèces

bactériennesdénitrifiantes.DesétudessubséquentesparFISH(«Fluorescentin

situhybridization»)ontconfirmél’abondancedominante(jusqu’à79%)desouches

appartenantaugenreMethylophagaetl’importancedugenreHyphomicrobium(7-

8%).Ilaaussiétédéterminéquelebiofilmincluaitenviron15espèces

bactériennes.(Labbéetal.,2003,Labbéetal.,2007)

Ilétaitsurprenantàl’époquequedesespècesdugenreMethylophaga

puissentcomposeruneaussigrandeproportiond’unbiofilmenconditions

anaérobies;legenreétaitjusque-làcaractérisépardesespècesstrictementaérobes.

Àl’aidedeméthanolmarquépardesisotopesdecarbone(14C)etd’analysedes

séquences16Sdanslesbactériesl’ayantassimilé,ilaétédémontréqu’uneespèce

dugenreMethylophagaétaithautementimpliquéedansleprocessusde

dénitrification.Unefoisisolée,cettesoucheaéténomméeJAM1;celle-ciaété

désignéecommeespècedistincteaprèsdesétudesdecaractérisationapprofondies

(voirsection2.6).LesgènesnarG1etnarG2ontaussiétécorrélésavecl’activitéde

réductiondenitratedelasoucheJAM1.Lesrésultatsd’analysesbioinformatiques

ontsuggéréuneoriginedetransferthorizontalpourlegènenarG1.(Auclairetal.,

2010)

13

2.6. MethylophaganitratireduscenticrescensLorsdesexpériencesexplorantladiversitémicrobienned’unbiofilm

provenantdel’aquariumdumésocosmeduFleuveSt-LaurentauBiodômede

montréal,ilfutdéterminéqu’unedessouchesbactériennesreprésentaitenviron

79%detoutelabiomasseprésente.L’identitédecettesouchen’étaitpasconnueà

l’époque,maisilavaitétédéterminéqu’elleétaitétroitementapparentéeaux

espècesdugenreMethylophaga.(Labbéetal.,2007)Suivantdesrecherchesplus

poussées,cettesouche,initialementnomméeJAM1,futdésignéecommenouvelle

espèceMethylophaganitratireduscenticrescens.(C.Villeneuveetal.,2013)

LegenreMethylophagaestunedivisiondesγ-protéobactériescaractérisée

pardesespècesbactériennesdeformebacille,typiquementlégèrementhalophiles.

Lesespècesmembresdugenresontaussidécritescommeconsommatricesde

composésàuncarbone(saufleméthane)dontleméthanol,qu’ellesassimilentà

l’aidedelavoiemétaboliqueduribulosemonophosphate.(Janvieretal.,1995)

Typiquement,lesespècesdugenreMethylophagasontdesespèceshabitantdes

milieuxmarinsoùellespeuventconsommerleméthanolabondammentproduitpar

desmicroorganismes(phytoplancton)(Minceretal.,2016).Plusieursespècesdu

genresontaussireportéesd’êtrecapabledelaproductiond’osmoprotecteur,

notammentl’ectoïne.CesespècesincluentM.thalassica,M.alcalica,M.murataet

autres(Doroninaetal.,2005,Mustakhimovetal.,2012,Mustakhimovetal.,2009).

LasoucheJAM1esttoléranteaumilieuxsalésjusqu’à8%deNaCl,malgréque

sacroissanceoptimaleestobtenuedansdesmilieuxd’environ3%deNaCl.Elleest

capabledecroissanceentredestempératuresde15˚Cà37˚Cmaispréfèreune

températureautourde30˚C.UnpHentre6et11permetlacroissance,maislepH

optimumestde8.ElleestauxotrophepourlavitamineB12,etrequiertdonc

l’inclusiondecettemoléculedanslemilieupourlacroissance.Surgélosedumilieu

1403(milieuadaptéauxsouchesbactériennesmembresdugenreMethylophaga),

sescoloniessontrondesetontenviron2mmdediamètre.Lasoucheestleseul

14

membredugenreMethylophagaàêtreanaérobefacultative,c’est-à-dired’être

capabledecroissanceenutilisantlenitrate(Auclairetal.,2010,C.Villeneuveetal.,

2013)etl’oxydenitreux(Mauffrey,résultatsnon-publiés)commeaccepteurs

d’électron,maispréférantl’oxygènedanscerôles’ilestdisponible.Ellepeut

égalementréduirel’oxydenitriteenoxydenitreux(Mauffrey,résultatsnon-publiés)

maispaslenitrite(Auclairetal.,2010).

2.7. HyphomicrobiumnitrativoransOutrelasoucheJAM1,uneautrebactériecomposaitunpourcentage

considérable(7-8%)delabiomassetotaledubiofilm.(Labbéetal.,2007)Celle-ci

futdésignéeNL23etparlasuitefutelleaussidécritecommeunenouvelleespèce,

Hyphomicrobiumnitrativorans.(Martineauetal.,2013)

LegenreHyphomicrobiumfaitpartiedesα-protéobactéries.Laparticularité

desespècesmembresestleurproductiond’hypheslorsdelareproduction.Les

bactériessontaussidécritescommebacillesauxboutspointus.Aussi,étantdonné

deleurfaibletoléranceauxenvironnementssalés,ellessontrarementretrouvées

dansdesmilieuxmarins.Plusieursmembresdugenreontétéimpliquésdansla

dénitrification,dontH.zavarziniietH.denitrificans,entreautres(Fesefeldtetal.,

1998,Martineauetal.,2015).Onretrouvecourammentcesbactériesdansles

bioprocédésdetraitementd’eauxusées.(Gliescheetal.,2005)

LasoucheNL23netolèrepasunmilieusalin,cequiestsurprenanten

considérantlecontextedesadécouverteetdesonactivité;lacroissancemaximale

estobtenueenconditionsde0-0,5%deNaCl.Presqueaucunecroissancen’est

possibleenmilieuxavecplusde1%deNaCl.LasoucheNL23peutcroîtreàdes

températuresentre15˚Cet35˚C,maispréfèreunetempératurede30˚à35˚C.LepH

optimalestentre7,5et8,5,maisunpHentre7et9,5estsuffisantpoursupporter

unecertainecroissance.CommelasoucheJAM1,lasoucheNL23estanaérobe

facultative,préférantlesenvironnementsoxygénésmaisétantcapabledecroissance

15

efficaceenutilisantlenitratecommeaccepteurd’électronspourgénérerdel’azote

gazeux.Surgélose,lescoloniesforméessontdepetitdiamètre(~1mm)etblanches.

LasoucheNL23peuttirersoncarboneduméthanol,delaméthylamineoudu

formate.(Martineauetal.,2013)

Figure3.1:LessouchesNL23etJAM1

LesespècesbactériennesHyphomicrobiumnitrativorans(soucheNL23,haut)etMethylophaganitratireduscenticrescens(soucheJAM1,bas)enmicroscopie.

2.8. Co-cultures,partagederessourcesÉtantdonnédelacomplexitédesconditionsdansunmilieunaturel,ilest

probablequelesprocessusdedénitrificationn’ysontnormalementpasperformés

pardesespècesuniquesmaisbienpardescommunautésvariéesimpliquantdes

partagescompliquésderessources.Unerelationsynergiqueentrebactériesestune

16

coopérationquiestbénéfiquepourtouteslesbactériesimpliquées.Ilexistedéjàdes

casdetellesinteractionsenco-culturesdénitrifiantesdocumentéesdansla

littératurescientifique.Parexemple,ilaétédémontréquel’espècebactérienne

Ralstoniapickettiauneactivitédénitrifiantede40à100foissupérieurelorsqu’elle

estcultivéeenprésencedel’espèceStreptomycesgriseus.L’aideétaitfourniepar

cettedernièresousformedeprotéasessecrétéesquiaugmentaientlaconcentration

d’histidinedanslemilieu.Cettehistidineaensuiteétéenmesured’augmenterle

tauxdedénitrificationdeR.pickettipourdesraisonsinconnues.(Takakietal.,2008)

Unautreexempledesynergieestlaco-culturedel’espèceAlcaligenesfaecalis

aveclasouchePseudomonasG9.Lapremièreestunebactériedénitrifiantequiest

incapablederéduirelenitrateennitrite,maisquiperformelesautresétapesdela

dénitrification.Àl’inverse,lasoucheG9exprimesanitrateréductase

constitutivement.Celle-ciperformeaussilesautresétapesdeladénitrificationmais

souffred’uneaccumulationtoxiquedenitriteenculturepure.Deplus,ellenepeut

pascroîtrelorsqu’elleestinoculéeenconditionsanaérobies.Enconditions

dénitrifiantes(anaérobies)avecseullenitratecommeaccepteurd’électronfourni,

chaquebactérieestincapablededémontrerunecroissanceenculturepure.Ila

pourtantétédémontréqu’uneco-culturedesdeuxbactériesaétécapablede

croissanceetd’activitédénitrifianteefficace.(VandePas-Schoonenetal.,2005)

17

2.9. HypothèseetobjectifsCertainesdescaractéristiquesuniquesàchaquesouche(NL23etJAM1)

laissentimaginerqu’ilpuisseexisteruncertainéchangederessources.Lasouche

JAM1nepeutpasréduirelenitrite,tandisquecettecapacitéestdisponibleàla

soucheNL23.Demême,lasoucheNL23nepeutexisterenprésencedehautes

concentrationsdesel;sepourrait-ilquelasoucheJAM1puissepartagerune

certaineosmoprotectiondelaquelleelledispose?Leportraitfinalseraitun

mutualismequiamélioreraitsubséquemmentl’efficacitédeladénitrification.

Donc:

Hypothèse:ilexisteunecoopérationentrelesNL23etJAM1enco-culturesous

formedepartagederessources(nitrate,nitrite,vitamineB12)oud’autresfacteurs

(ex:osmoprotection/ectoïne).

Objectifs:

• l’optimisationdesconditionsdelaco-culturedessouchesNL23etJAM1danslebutd’enfaciliterl’étude;

• lacaractérisationdesinteractionsentrelesdeuxsouches.

18

3. Matérieletméthodes

3.1. SouchesbactériennesLessouchesbactériennesdeceprojetontétéisoléesàpartird’unbiofilm

dontl’origineestlebioréacteurdénitrifiantdumésocosmeduFleuveSt-Laurentdu

BiodômedeMontréal.Celles-cisont:Methylophaganitratireducenticrescens

(soucheJAM1),Hyphomicrobiumnitrativorans(soucheNL23)(Fig.3.1).Plusieurs

échantillonsdechaqueespèceontétéconservéesà-80˚Cdansleursmilieuxde

culturerespectifscomplémentésde25%deglycérol.

3.1.1. Mutants

Enplusdesdeuxsouchesbactériennesci-dessus,troismutantsdetype

«knockout»delasoucheJAM1ontétéutilisés.Ceux-ciexhibenttousdes

déficiencesencequiconcerneleursenzymesdelanitrateréductase:JAM1ΔnarG1

estunmutantsanscopiedugènenarG1;JAM1ΔnarG2estunautresanscopiedu

gènenarG2;etJAM1ΔnarG1narG2estundouble-mutantnepossédantaucunecopie

desgènesnarG1etnarG2.Cessouchesontétécrééesparlaméthodedeladouble

recombinaisonparFlorianMauffrey,étudiantdedoctoratdanslelaboratoireduPr.

Villemur(Mauffreyetal.,2015).

19

3.2. Culturedesbactéries

3.2.1. MilieuoptimaldelasoucheJAM1LemilieuoptimalpourlacroissancedelasoucheJAM1telquedéterminé

danslestestsd’optimisationpréalables(Villeneuveetal.,2013)estlemilieuATCC

1403pourespècesdugenreMethylophaga.Unlitredumilieuliquidecontient:

NaCl----------------------------------------------24g

MgCl2·6H2O--------------------------------------3g

MgSO4·7H2O------------------------------------2g

KCl------------------------------------------------0,5g

CaCl2·2H2O--------------------------------------1g

Bis-Tris------------------------------------------0,5g

SolutionT-------------------------------------20ml

SolutiondeWolf-----------------------------10ml

Eaudistillée---------------------------------970ml

LasolutionTestunesolutionminéraledontlacompositionestlasuivante(pour1L

desolution):

KH2PO4--------------------------------------------7g

NH4Cl------------------------------------------100g

Bis-Tris----------------------------------------100g

(NH4)5Fe(C6H4O7)2------------------------------3g

Eaudistillée-------------------------------1000ml

20

LasolutiondeWolfestuneautresolutionminéraleenutilisationcourante.Unlitre

delasolutioncontient:

N(CH2CO2H)3-----------------------------------1,5g

MgSO4·7H2O------------------------------------3g

MnSO4·H2O------------------------------------0,5g

NaCl------------------------------------------------1g

FeSO4·7H2O-----------------------------------0,1g

CoCl2·6H2O------------------------------------0,1g

CaCl2---------------------------------------------0,1g

ZnSO4·7H2O-----------------------------------0,1g

CuSO4·5H2O---------------------------------0,01g

AlK(SO4)2·12H2O---------------------------0,01g

H3BO3------------------------------------------0,01g

Na2MoO4·2H2O-----------------------------0,01g

Eaudistillée-------------------------------1000ml

Suiteàl’ajoutdesminérauxlemilieuaétéajustéàunpHde7,3etautoclavéà121˚C

pendantaumoins15minutes.Avantutilisation,etseulementlorsquelasolutionest

àtempératuredelapièce,l’ajoutdevitamineB12etdeméthanolaétéeffectué.Pour

100mldemilieu,0,3mldeméthanolstériliséparfiltrationet0,1mldevitamineB12

(0,1mg/ml)(stérilisédelamêmefaçon)ontétéajoutés.

21

3.2.2. MilieuoptimaldelasoucheNL23

PourlasoucheNL23,lemilieudecroissanceoptimalestuneversion

modifiéedumilieuATCC337a,dontl’efficacitéaététestéelorsd’études

précédentes(Martineauetal.,2013).Danschaquelitredumilieuonretrouve:

KH2PO4------------------------------------------1,3g

Na2HPO4--------------------------------------1,13g

(NH4)2SO4---------------------------------------0,5g

MgSO4SO4·7H2O------------------------------0,2g

Solutiond’élémentstraces------------------5ml

Eaudistillée-------------------------------1000ml

Lasolutiond’élémentstracesestspécifiquementadaptéeaumilieu337a;unlitrede

lasolutionestcomposéde:

CaCl2·2H2O--------------------------------0,618g

FeSO4·7H2O-----------------------------------0,4g

Na2MoO4·H2O---------------------------------0,2g

MnSO4·4H2O------------------------------0,176g

Eaudistillé---------------------------------1000ml

Lasolutiond’élémentstracespouvaitcontenirunecertainequantitédeprécipité

suivantuncycleàl’autoclave,maiscecin’apasproduitd’effetsnotablessurla

croissancedesbactéries.Suiteàlacombinaisondesingrédients,lasolutionaété

ajustéeàunpHentre7,5et8etautoclavéeà121˚Cpendantaumoins15minutes.

DelavitamineB12(0,1mlà0,1mg/ml)etduméthanol(0,3ml)ontétéajoutés

avantl’utilisation.

22

3.2.3. Milieudecroissanceadaptéàlaco-culture

Avantledébutduprojet,ilétaitdéjàconnuquelessouchesNL23etJAM1,

ainsiqu’uneco-culturedesdeux,pouvaientsimplementcroitredansuneversion

diluée(15g/Laulieude30g/L)dumilieumarinartificiel«InstantOcean»

retrouvéauBiodôme.Lacompositionexacted’unlitredumilieu«InstantOcean»

pourco-cultureest:

Mélange«InstantOcean»------------------15g

NaNO3---------------------------------------1,214g

KH2PO4(ensolution32,67g/L)----------2,5ml

Solutiond’élémentstraces------------------1ml

Eaudistillée-------------------------------1000ml

Lemélanged’eausaléepouraquarium«InstantOcean»estacheté

commercialementetsacompositionexacteestdoncinconnue(«InstantOcean»est

lenomdufournisseur).

Lasolutiond’élémentstracesestspécifiqueaumilieu«InstantOcean»;unlitrede

lasolutionestcomposéde:

FeSO4·7H2O-----------------------------------0,9g

CuSO4·5H2O-------------------------------0,035g

MnSO4·H2O--------------------------------0,202g

Eaudistillée-------------------------------1000ml

Unefoisquelemilieuestcomplet,lepHaétéajustéentre7,8et8etautoclavéà

121˚Cpendantaumoins15minutes.Avantl’utilisation,0,1mldevitamineB12(0,1

mg/ml)et0,3mldeméthanolontétéajoutés.Laquantitédenitrateajoutéeau

milieuvarieselonlesbesoinsdel’expérienceetlesconnaissancesacquiseslorsdela

recherche.Cesdifférencessontindiquéesoùelless’appliquent.

23

3.2.4. Milieuxsousformedegéloses

Chaquevariétédemilieudécriteci-hautaétéprincipalementutiliséesous

formeliquidepoursoutenirdespopulationsdebactériesensuspensionoupour

permettrelaformationdebiofilmsursupportsadaptés.Cependant,cesmilieuxont

aussiétéutilessousformedegélosesenboîtesdePetri.Pourproduiredesgéloses,

lasolutionminérale(enconcentrationdouble)etlasolutiond’agar(3%)ontété

autoclavéesséparément,puiscombinéesavantd’êtrecouléesdanslesboîtesde

Petri.LavitamineB12etleméthanolontétéajoutésaprèsl’autoclavage.

3.3. Préparationdescultures

PuisquelessouchesJAM1etNL23ontdestempsdecroissancedifférents,la

culturedesbactériesadûsuivreunrégimerigoureux.Uneréserveàlongtermede

chaquesouchebactérienneaétéconservéeà-80˚C.Àpartirdecelle-ci,descolonies

distinctesontétéproduitessurgéloses;lacroissancesedéroulaitsurunepériode

d’environ10joursà30˚C,puiscesculturesétaientconservéesà4˚Cpourune

périoded’utilisationd’environunmois.Àpartirdecoloniesdistinctes,

préférablement,despetitsvolumes(environ15ml)decultureliquideontété

préparés,cequinécessitede2à3joursd’incubation.Cesculturesontàleurtour

étéconservéesà4˚Cpourunepérioded’utilisationde1-2semaines.Également,ces

culturesontétéutiliséespourcréerlesculturesenplusgrosvolumes(variables

selonlesbesoinsdel’expérience)quiservirontd’inoculumpourlesexpériences

elles-mêmes.Parexemple,ajouter0,6mldecultureliquideà10mldemilieu

optimalfraisapermislacroissancejusqu’àdensitémaximaledelasoucheJAM1en

24hetdelasoucheNL23en40h.Danslescasoùl’expérienceenvisagéeimplique

uneco-culture,lestempsd’ensemencementontétéplanifiéspourqueladensité

maximalesoitatteinteenmêmetempspourlesdeuxsouchesaudébutdeladite

expérience.

24

3.3.1. Ensemencement

Àl’ensemencement,ladensitéoptiquedesculturesbactériennesservant

d’inoculumaétémesuréeàunelongueurd’ondede600nm(DO600).Decette

façonlaconcentrationdelabiomasseapuêtreajustéeàunevaleurquiétait

toujourslamêmepourchaqueexpérience;danscecasleDO600viséétaitde0,1

danslacultureexpérimentale.Donc,danslecasd’uneco-culture,chaquesouche

individuelledevaitcontribuerunDO600de0,1danslaco-cultureexpérimentaleau

tempsinitial.Ceciapermisunecertaineconstancedansleprocessusexpérimental

quiaévitéquelesconcentrationsinitialesdebactériesaffectentlerésultatd’une

expérience.Deplus,danslescasoùunchangementdemilieuaeulieuaumoment

del’ensemencement(parexemple,uneco-cultureoùchaquebactériepassed’un

milieuoptimalàunmilieuaccommodantlesdeuxsouches),lesculturesde

l’inoculumontdûd’abordêtrecentrifugéespourendébarrasserlemilieuinitial

(8000rpm,10minutes,25˚C,deuxfois).

3.3.2. Conditionsdeculture

Lesbactériesontétécultivéesenconditionsaérobiesouanaérobies.Les

culturesaérobiesontétéfaitesenflaconsErlenmeyerouenplaquesmulti-puits,

selonlebesoin,etontrequisdel’agitationconstante(entre60et100rpm)pour

faciliterlacirculationd’oxygènedanslemilieu.Lesculturesanaérobiesontété

effectuéesdansdesfiolesdeborosilicatedanslesquellesl’oxygèneaétéévacuéà

l’aided’azotegazeux(Fig3.2).Danscesfioles,l’échantillonnageaétérendupossible

grâceàunbouchonenbutyledanslesquelspeuventêtreinsérésdesaiguilles.Dans

touslescas,lesculturesontétéincubéesàunetempératureconstantede30˚C.

25

Figure3.2:Exempledecultureenanaérobiose

Unefioleferméehermétiquementpourculturedebactériesenconditionsanaérobies.Uneculturecommecelle-cicontienttypiquement30mldemilieuliquideetestincubéeà30˚Cavecseringuedanslebouchonenbutyle.

3.4. Récoltededonnées

Pourprendreunéchantillon,lacultureaétéagitéepourassurerune

distributionégaledescellulesetdoncdelaconcentrationdansleliquide.En

anaérobie,uneseringueaétéinséréedanslebouchondebutylescellantlafiole,et

aumoins1mlaétéextrait.UnefoisquelamesuredeDO600aétépriseavecle

spectrophotomètre,l’échantillonaétéconservéà-20˚Cdanslebutd’effectuer

d’autrestests(principalementdelachromatographieionique).

26

3.4.1. Spectrophotométrie

Pourrécolterdesdonnéesutilessurcescultures,dessuivisdecroissances

ontétéeffectuéesavecplusieurscombinaisonsdeconditions.Enconditions

aérobies,lesuiviaétéeffectuéuniquementparmesuresdeDO600àl’aided’un

spectrophotomètre,ouparmesuresdeturbiditéàl’aided’unappareilautomatisé

d’analysedecroissance(«Bioscreen»).L’avantageprincipald’unappareil

automatiséaétélapossibilitédeprendredesmesuressimultanémentpourchaque

échantillondefaçonrapide,cequiapermisderécolterdesdonnéesàdesintervalles

detempsplusrapprochées.Enconditionsanaérobies,lesuiviaégalementété

effectuéparmesuresdeDO600(manuellesseulement).

3.4.2. Chromatographieionique

Lachromatographieioniqueaétéutiliséepourquantifierlaconsommation

denitrateetdenitritedanslemilieuparlesdeuxsouchesbactériennes.Les

échantillonsontétépréalablementcentrifugés(13000rpm,2min.)dansdes

microtubesdetypeEppendorfpourenretirerlesbactéries.Unefoisquelescellules

seretrouvaientaufonddutube,aumoins0,5mldusurnageantdechaque

échantillonaétéprélevépourêtreanalyséparchromatographieionique.

L’appareilutilisépourlaquantificationdunitrateetdunitriteétaitle850

ProfessionalICdeMetrohm,munid’unecolonneMetroseppAsupp5dedimensions

250X4mm.Lacolonneaétémaintenueà35˚Cdurantl’opération.Lesmesuresde

nitrateetdenitriteontétéeffectuéesparUV.L’éluantutiliséétaitcomposéde3.2

mmol/LdeNa2CO3etde1mmol/LdeNaHCO3.Ledébitétaitde0,7ml/min.

3.4.3. Extractiond’ADN

Labiomassed’intérêt(ensuspensionliquide)ad’abordétécentrifugéeafin

d’enretirerlemilieudeculture.Lescellulesrésultantesontensuiteétédispersées

dansunesolutiontamponTEN(10mMTris-Cl;1mMEDTA;1MNaCl)dansun

microtubedetypeEppendorfde1,5mLcontenant0,2mgdebillesdeverresde0,1

27

mm.Cemélangeasubséquemmentétéplacédansunhomogénéisateurpour

effectuerunbroyage:rapidementagiterlescellulesensuspensionpourqu’elles

éclatentcontrelesbillesdeverre.L’appareilutiliséétaitleFastPrep-24deMPBio.

L’ADNaétéextraitàl’aided’unmélangedephénol,dechloroformeetd’alcool

isoamylique(25:24:1).L’ADNapuensuiteêtreprécipitédansunemixture(9:1)

d’éthanolfroid(90%)etd’acétatedesodium.Letoutaétécentrifugé,etleprécipité

aétédissousdansl’eau.L’ADNaétéquantifiéparspectrophotométrie,cequia

égalementdonnéuneindicationdelapuretédelasolutionobtenue.Le

spectrophotomètreutilisélorsdecesétudesétaitleNanodrop2000deThermo

Scientific.

3.4.4. qPCR

Danslecadredecesétudes,l’applicationprincipalementintéressantedela

techniqueestlaquantificationdecopiesdegènesparticuliersprésentsdansuneco-

culture.Puisquelessouchesbactériennesétudiéesontchacuneleurpropreversion

uniquedelanitrateréductasedontlaséquencegénétiqueestconnue,ilaété

possibled’utiliserleqPCRpourmesurerlaquantitérelativedesbactériesdansle

mélange.Lesnitrateréductasesenquestionsontlanitrateréductasepériplasmique

delasoucheNL23(gènenapA)etunedesdeuxnitrateréductasesmembranairesde

lasoucheJAM1(gènenarG1).Donc,parexemple,siuneanalyseqPCRindiqueque

legènenarG1représente90%descopiesdegènesdenitrateréductase(narG1+

napA)dansl’échantillon,celaindiquequelasoucheJAM1comptaitneuffoisplusde

cellulesquelasoucheNL23danslaco-culture.

LatechniquedeqPCRutiliséelorsdecesétudesétaitleTaqMan.Danscette

variationduqPCR,deuxcourtesséquencesdenucléotidesserventd’amorces,tandis

qu’uneautrecourteséquencesertdesonde.Cettedernièreestconçuepour

s’apparieràunendroitentrelesdeuxamorces.Àlasondesontfixésun

fluorochromeetun«quencher».Lafluorescenceémiseparlefluorochromeest

dissimuléeparle«quencher»lorsquelesdeuxsontàproximité.Lapolymérase

Taqsemetalorsàajouterdesnucléotidesauxamorces,etquandellearriveàla

28

sonde,celle-ciestenlevéeestdégradée,libérantlefluorochromequiémetalorsune

fluorescencequantifiable.LeTaqManaétéutilisédansceprojetàcausedesoncoût

abordablecomparéauSYBRgreen,leprotocolequiétaitutiliséprécédemmentdans

lelaboratoire.Ilaaussiéténotéquedesproblèmesdedimèresd’amorcessont

aussiplusfréquentsavecleSYBRgreen.D’ailleurs,ilaétédéterminéqueleTaqMan

génèredesrésultatscomparablesauSYBRgreen(Blais,2014).

L’instrumentutilisépoureffectuerlesqPCRétaitleRotor-Gene6000de

CorbettLifeSciences(Qiagen).Chaquemicrotube(tubesspécialisés0,1mlavec

couverclesdeQiagen)contenait25µld’unmélangepréparéeenlaboratoire(voir

tableau3.1).L’ADNajoutéaumélangeaétéobtenugrâceàlaméthoded’extraction

décritedanslasection3.4.3.LeprogrammePCRétait:

i) 5minutesà95˚C

ii) 40cyclesdesétapessuivantes:

(1) 15secondesà95˚C



Tableau3.1:compositiondumélangedanschaqueréactiondeqPCR

Composante Volumeparréaction

H2O 14,88µl

Tampon10Xtaq«hotstart» 2,5µl

BSA(20µg/µl) 0,5µl

dNTP(10mM) 0,5µl

Amorce(f)(10mM) 0,5µl

Amorce(r)(10mM) 0,5µl

SondeTaqMan(5mM) 0,5µl

Taqpolymérase«hotstart»(5U/µl) 0,125µl

ADNgénomique(dilué1/5) 5µl

29

Tableau3.2:détailssurlatechniqueduqPCR

souche JAM1 NL23

gènes narG1 napA

Longueurdu

fragment157pb 130pb

amorces

CCCTGTACGCTCGATACCA(f) GGCAATGTGGGTGGAAAAGG(f)

GCCAGTACGCAAGGTTAAGC(r) GCGCTTCGAAAACTCCATGA(r)

Sondes

TaqManCGCAATGTGCCAGTACGCAAGGT CACGCATTTCTGGCACCAACTCGT

fluorochrome FAM(6-carboxyfluoresceïne)

«quencher» BHQ-1(«BlackHoleQuencher»)

Température

d’hybridation55˚C

30

4. Résultats4.1. Déterminationdesconditionsoptimalesdeculture

Lepremiervoletduprojetétaitconstituéd’expériencesvisantàdéterminer

quellesconditionsdeculturepermettraientlameilleurecroissancedessouches

JAM1etNL23.Unegrandepartiedutravailàcetégardétaitdéjàcomplétépardes

étudespréliminaires.Eneffet,laplupartdesparamètresdebase,incluantla

température,lepH,lasalinité,etlemilieudecroissanceavaientétéétablisavantle

débutdestravauxprésentésdanscemémoire.Lesconditionsoptimalesqu’ilrestait

àdéterminerimpliquaientprincipalementlesconcentrationsdenitrateetles

proportionsdesbactériesenco-cultures.

4.1.1. Suividecroissancepréliminaireenconditionsaérobies

Cespremierssuivisdecroissanceavaientpourbutdevaliderlechoixde

milieudecroissancepourlesco-culturesdessouchesJAM1etNL23ainsiquede

donnerunaperçudescourbesdecroissancetypiquesdecelles-ci.LessouchesJAM1

etNL23ontétécultivéesenconditionsaérobiesouanaérobies,soitsousformede

culturespuresouenco-cultures.Lemilieucommerciald’eaudemer«Instant

Ocean»aétéutilisépourcespremièresexpériencesenprésencedeprèsde40mM

d’azotesousformedenitrate.Ilaétédéterminéauparavantquelemilieu«Instant

Ocean»coupédemoitié(15g/L,aulieude30g/L)permettaitlacroissanceàlafois

dessouchesJAM1etNL23,lasoucheNL23étanttrèssensibleàlaconcentrationen

sel.

31

Figure4.1:Croissanceenconditionsaérobies(InstantOcean15g/L) LessouchesJAM1etNL23,cultivéesenculturespuresouenco-cultures,ontétéincubéspendant48heuresdanslemilieuInstantOceanajustéà15g/L.Lesmesuresdeturbiditéontétéeffectuéesautomatiquementàchaquedemi-heureparl’instrumentBioscreen.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennede8cultures.

Premièrement,desculturespuresdessouchesNL23etJAM1etdesco-

culturesdecelles-ciontétésuiviesparlamesuredeturbiditéàl’aided’unappareil

Bioscreen.Unemesureaétéeffectuéeautomatiquementàchaqueheurependant

unepériodededeuxjourscomplets.Lesrésultatsontconfirmélapertinence

d’utiliserlemilieu«InstantOcean»pourlesco-cultures(Fig4.1).Lesdeuxsouches

onteuunecroissanceappréciableenculturespures,tandisquelesco-culturesont

atteintuneturbiditénotammentplusélevéequelesdeuxculturespures.Ceci

pourraitêtreexpliquéparunecoopérationentrelesdeuxsouchesJAM1etNL23.

4.1.2. Suividecroissanceenconditionsanaérobies

Avantledébutduprojet,ilétaitdéjàconnuquel’activitéetlacroissancedes

souchesNL23etJAM1diffèrentsignificativementenanaérobiose.Enparticulier,les

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

Densitéoptique(600nm)

Temps(h)

JAM1

NL23

co-culture

32

nitrateréductasesdelasoucheJAM1sontbeaucoupplusefficaces,etcelle-ci

démontreunecroissanceinitialeplusélevée(Martineauetal.,2015,Mauffreyetal.,

2015).Lespremierssuivisdecroissanceenconditionsanaérobiesontdoncétéfaits

avecdifférentsratiosd’inoculumpourdéterminerlesconditionsd’ensemencement

lesplusfavorables.LessouchesNL23etJAM1requièrentlaprésencedenitrateet

sesdérivéescommesourced’accepteursd’électronspourcroîtreenanaérobiose.

Dansleursmilieuxoptimauxrespectifs,unequantitéinitialedenitrateoptimaleest

d’environ40mM(CélineVilleneuve,2012)(donnéesnon-publiéespourlasouche

NL23),donccetteconcentrationinitialeaétéchoisie.

Lessuivisdecroissanceontétéeffectuéssurunesériedeco-culturesavec

desvariationsdansleratioentrelesdeuxsouchesbactériennes.L’expérience,qui

comptaitégalementcommetémoinslessouchesNL23etJAM1enculturespures,a

étéeffectuéeavecdesco-culturesderatios(JAM1:NL23)1:1,1:2,1:5,et1:10.

Cesratiosréfèrentuniquementauxquantitésrelativesdessouchesaumomentde

l’ensemencement,telsquemesurésparDO600.Lacroissanceétantbeaucoupplus

lenteencesconditions,etàcausedeconsidérationspratiques,desmesuresde

DO600ontétéprisesmanuellementunefoisparjourjusqu’àcomplétiondusuivi.

L’appareil«Bioscreen»nepermetpaslesculturesenconditionsanaérobies.Les

échantillonsainsirecueillisontégalementservipourlaquantificationdenitrateet

denitrite.Leséchantillonnagesjournaliersontétéeffectuéssurunepériodedeprès

de200heures,aprèsquoilesculturesontétéconservéespourdesétudesparqPCR.

33

Figure4.2:Lacroissancedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Ljusqu’àl’atteinteduplateaudecroissanceou200heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.ChaquepointdanslegraphereprésenteleDO600moyende3cultures,mesuréparspectrophotomètrie.

LesuividuDO600estsouventpeuinformatifdanslecadred’uneexpérience

enconditionsanaérobies.Ceciestdûaucaractéristiquesdelacroissancedela

soucheJAM1.CettedernièreexhibedesDO600trompeursàcausedelaformation

defloc,desaggrégationsdecellulesvisiblesàl’oeilnu,etaussiàcaused’un

“éclaircissement”dumilieuInstantOcean,quiestnormalementtrouble.

Effectivement,aprèsnormalisationavecleDO600dumilieunon-inoculé,ilest

communderecueillirdesDO600àvaleursnégatives,ainsiqueded’obtenirdes

valeurstrèsdifférentespourlemêmeéchantillon.Ilestdoncpeuprobablequ’une

mesureduDO600reflètecequisepasseréellementauseind’uneculturesimplede

lasoucheJAM1oud’uneco-culture.Pourcetteraison,lesuivideDO600sert

-0.15

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 50 100 150 200

Densité

op+

que

Temps(h)

NL23

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

JAM1

34

principalementdeméthodepermettantd’observerqualitativementetrapidementle

progrèsdelacroissancedesbactéries.

Danslecasdecetteexpérience,cependant,ilestintéressantdenoterqueles

co-culturesavecunratiopluségal(lesco-cultures1:1et1:2)ontsuiviunecourbe

decroissancequiressemblebeaucoupauxculturespuresdelasoucheJAM1,tandis

quelesautresco-culturesontsuiviunecourbedecroissancequiressembleàcelle

desculturespuresdelasoucheNL23(Fig4.2).Cecipourraitréfletersimplement

quelecomportementtypedelasoucheJAM1devientmoinsvisibledanslesdonnées

lorsquecettedernièreestmoinsabondantedanslesco-cultures.Toutefois,ilest

aussipossiblequ’unedensitéplusimportantedesdeuxsouchesontpuse

développerenco-cultureslorsquel’inoculumdedépartdesoucheJAM1étaitmoins

important.Cetteexplicationseraitcompatibleavecl’hypothèsedudépart.Pour

approfondirlacompréhensiondelasituation,ilafalluinvestiguerauniveaudela

consommationdunitrateetdunitrite(Fig4.3et4.4).

35

Figure4.3:Consommationdenitratedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Ljusqu’àl’atteinteduplateaudecroissanceou200heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitratedans3cultures,mesuréeparchromatographieionique.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concen

tra+

ondenitrate(m

Md'azote)

Temps(h)

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

NL23

JAM1

36

Figure4.4:concentrationdenitritedanslesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enconditionsanaérobies Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétéincubéesdanslemilieuInstantOcean15g/Ljusqu’àl’atteinteduplateaudecroissanceou200heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitritedans3cultures,mesuréeparchromatographieionique.

Cequiestimmédiatementévidentdanslegraphederéductiondenitrate(fig.

4.3)estquepluslaconcentrationdelasoucheJAM1estélevéeinitialementdansles

co-cultures,plusletauxderéductiondunitrateestrapide.Ladeuxième

observationqu’onpuissefaireestqu’aucunedesco-culturesneparvientàréduire

complètementlenitrate.Danslecasdesco-culturesàconcentrationsélevéesen

soucheJAM1,laconsommationdunitrates’arrêtebrusquementaprèsenviron75

heuresavec5-15mMd’azoterésiduel.Quantauxco-culturesmoinsabondantesen

soucheJAM1,ilsemblequ’ellessoienttroplentespourréduireentièrementle

nitrateavant200heures,laduréedel’expérience.Iln’estpasclairdanslesdonnées

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150 200

concen

tra+

ondenitrite

(mMd'azote)

Temps(h)

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

NL23

JAM1

37

recueilliessilaréductionauraitpucontinuerjusqu’àépuisementdesréservesde

nitrate.

Lesuividelaconsommationdunitritecorroborel’hypothèse:Lesco-

cultures1:1et1:2ontaccumulélenitriterapidementpendant50-100heures

avantdeplafonner(entre18et26mMd’azote)indéfiniment.Lesco-cultures1:5

ontatteintunniveaudenitritemaximum(environ17mMd’azote)àenviron120

heurespourredescendreverslafindusuivi.Finalement,lesco-cultures1:10n’ont

démontréqu’unepetiteaccumulationdenitritetarddansl’expérience(170heures).

Lestempsoùlespointsmaximauxd’accumulationdenitritesontatteintssemblent

correspondreàpeuprèsàceuxd’arrêtd’activitéderéductiondenitrate.

38

Figure4.5:Concentrationd’azotetotaledanslesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobie Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Ljusqu’àl’atteinteduplateaudecroissanceou200heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationd’azotetotaldans3cultures.L’azotetotalestcalculéàpartirdesconcentrationsdenitrateetdenitriteetcorrespondàlacombinaisondecesdeuxmesures.

L’aspectquiresteleplusintéressantestlesuivideconsommationd’azote

total;c’est-à-direlacapacitédesco-culturesàconsommerlenitrateetlenitrite(Fig.

4.5).Pourlesdonnéestellesqueprésentéesici,l’azotetotalestcalculésimplement

parl’additiondesconcentrationsdenitrateetdenitrite.Lecalculdel’azotetotalest

utileparcequ’ilpermetdecombinerlaréductiondunitrateetcelledunitritepour

visualiserlaperformancetotaledesco-cultures,cequiestplusinformatifdansle

cadredeladénitrificationcomplète.Parexemple,enconditionsoptimales,la

soucheJAM1enculturespuresexhibeuneréductiontrèsrapidedunitratemais

aucuneréductiondel’azotetotal(cequiestnormal,étantdonnéqu’ellenepossède

aucungènederéductiondunitrite).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concentrationd'azotetotale(m

Md'azote)

Temps(h)

co1:1

co1:2

co1:5

co1:10

NL23

JAM1

39

Pourlaprésenteexpérience,lesco-cultures1:5ontdémontrélaplusgrande

consomptiond’azote,suividesco-cultures1:10.Ilfautnoterquecesdeuxco-

culturesontconsomméplusrapidementlenitrateetlenitritequelesculturespures

delasoucheNL23,cequipourraitêtreunindicedelacoopérationbénéfiquedes

deuxsouchesdanscesco-cultures.Parcontre,lesco-cultures1:1et1:2ontété

moinsefficacesquelasoucheNL23enculturespures.Aucunedesco-culturesn’a

démontréuneréductioncomplètedel’azotetotaleavant200heuresdesuivide

croissance.

Malgrélacroissanceréussiedesdeuxsouchesenculturespuresetenco-

cultures,cessuivisontsoulevéuneproblématiqueimportante:lesco-culturesne

sontjamaisarrivéesàréduirecomplètementlenitrateleurétantfourniaudépart,ni

l’azotetotal.Eneffet,lesco-culturesàratiosplusinégauxontsimplementdémontré

uneréductiontrèslentedunitrate.Lesco-culturesàratiospluségauxsesont

comportéesdefaçonpresqueidentiqueàlasoucheJAM1enculturepure:une

réductionrapide(maisincomplète)dunitratesuivid’unestagnationd’activité

dénitrifiante,incluantuneaccumulationdenitrite,ceciendépitdelaprésencedela

soucheNL23,quialacapacitéderéduirecenitrite.Uneexplicationprobableadonc

étéformulée:étantdonnéquelenitriteestparticulièrementtoxiqueaux

organismesvivants(DeRoosetal.,2003),sonaccumulationenimportante

concentrationinhiberaitlacroissancedelasoucheNL23.CommelasoucheJAM1

estbeaucoupplusrapidepourréduirelenitratequelasoucheNL23,ilestprobable

quecelle-ciaitétéresponsabled’uneaccumulationdenitritesupérieureàcequela

soucheNL23peutsupporter.Enconséquence,sil’abondancedunitritepouvaitêtre

limitée,lasoucheNL23pourraitavoirlachancederéduirecenitriteàmesurequ’il

soitproduit.

40

4.1.3. Variationsproblématiques

Touslessuivisdecroissanceprécédentsontétéréalisésentriplicata.Les

donnéesreprésentéesdanslescourbesdecroissancesontlamoyennedesvaleurs

obtenuespourlestroiséchantillons,tousrecueillisenmêmetemps.Cependant,des

grandesvariationsdevaleursauseindeséchantillonspourlesco-cultures1:5et1:

10ontcausédesécartsélevésdansleursmoyennes,cequiestvisibledanslegraphe

sousformedetrèsgrandesbarresd’erreurs(Fig.4.2à4.5).Ceproblèmeméritait

d’êtreexaminédeplusprès;doncchaqueréplicataétéanalysédefaçon

individuelle.

Figure4.6:Consommationdenitratepourchaqueréplicatdesco-cultures1:5 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:5(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationdenitratetellequemesuréeparchromatographieionique.Chaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concentrationdenitrate

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

41

Figure4.7:Concentrationdenitritepourchaqueréplicatdesco-cultures1:5 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:5(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationdenitritetellequemesuréeparchromatographieionique.Chaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience.

Figure4.8:Concentrationd’azotetotalpourchaqueréplicatdesco-cultures1:5 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:5(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationd’azotetotal.L’azotetotalestcalculéàpartirdesconcentrationsdenitrateetdenitriteetcorrespondàlacombinaisondecesdeuxmesuresChaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience.

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150 200

concentrationdenitrite

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concentrationd'azotetotal

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

42

Danslecasdesco-cultures1:5,deuxdestroisculturesontsuiviunecourbe

deréductiondenitratequasimentidentiquequirappellelecomportementdela

soucheJAM1:uneréductionrapidedunitratesuivid’unarrêtbrusqueà5mM

d’azoteaprèsenviron75heuresdecroissance(Fig.4.6).L’autrecultureaétéplus

lentedanslaréductiontotaledunitrate.D’ailleurs,cettedernièreestlaseuledes

troisquifinitparégalementréduirecomplètementlenitrite(Fig.4.7)etàaccomplir

uneconsommationcomplètedel’azotetotal(Fig.4.8).Lenitrites’yestaussi

accumulépluslentement.Ilsemblaitdoncquelarapiditéàlaquellelenitrite

s’accumulepourraiteffectivementjouerunrôledanslaperformanced’uneco-

culture.

Figure4.9:Consommationdenitratepourchaqueréplicatdesco-cultures1:10 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:10(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationdenitratetellequemesuréeparchromatographieionique.Chaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concentrationdenitrate

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

43

Figure4.10:Concentrationdenitritepourchaqueréplicatdesco-cultures1:10 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:10(JAM1:NL23)ontétéincubéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationdenitritetellequemesuréeparchromatographieionique.Chaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience.

Figure4.11:Concentrationd’azotetotalpourchaqueréplicatdesco-cultures1:10 Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde

1:10(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Chaquepointdanslegraphereprésenteuneconcentrationd’azotetotal.L’azotetotalestcalculéàpartirdesconcentrationsdenitrateetdenitriteetcorrespondàlacombinaisondecesdeuxmesuresChaquecourbedanslegraphereprésenteuneculture.Lesdésignationsdesco-culturesindividuellesdanslalégendesontarbitraires;chaquecultureareçulemêmetraitementlorsdel’expérience

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150 200

concentrationdenitrite

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 50 100 150 200

concentrationd'azotetotal

(mMd'azote)

temps(h)

co-culture1

co-culture2

co-culture3

44

Danslegroupedesco-cultures1:10,c’estleproblèmeinversequis’est

manifesté:seuleunedesco-culturesapuréduiretotalementlenitrate,tandisque

lesdeuxautresontététroplentespouryarriveravant200heures.Deplus,une

augmentationdenitriten’aétéobservéequedanslaco-culturelaplusefficaceà

partird’environ100heures(Fig.4.9et4.10).Malgrécetteaccumulation,cette

dernièreadémontréunréductiond’azotetotallégèrementplusrapidequelesdeux

autres,maisquin’atoutdemêmepasatteint0mMd’azoteavantlafindusuivi(Fig.

4.11).

Pourliercesrésultatsàlaquantitérelativedesdeuxsouchesdanslesco-

cultures,desessaisenqPCRontétéeffectués.Envisantdesgènesquisontpropres

àchaqueespèce,ilaétépossibledequantifierl’abondancedechaquesoucheen

pourcentageparrapportaunombretotaldegènesdétectés.

Figure4.12:QuantitésrelativesdesgènesnapAetnarG1danslesco-cultures1:5 Troisco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:5(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Àlafindecesuivi,labiomassetotaledechacunedesculturesaétérecueillie.L’ADNgénomiquedecettebiomasseaensuiteétéextraitetsoumisàdeuxprocessusdeqPCR:unepourquantifierl’abondancedugènenapAetl’autrepourquantifierl’abondancedugènenarG1.Lespourcentagessurlesbandesreprésententlaproportiondechaquegènedanslaquantitétotaledegènesquantifiés(napA+narG1)Dansuncasparticulier,laco-culture3aétéaccidentellementperduelorsdemanipulationsenlaboratoire.

45

Figure4.13:QuantitésrelativesdesgènesnapAetnarG1danslesco-cultures1:10 Troisco-culturesdessouchesNL23etJAM1dontleratioinitiald’inoculumétaitde1:10(JAM1:NL23)ontétécultivéespendantprèsde200heures.Àlafindecesuivi,labiomassetotaledechacunedesculturesaétérecueillie.L’ADNgénomiquedecettebiomasseaensuiteétéextraiteetsoumiseàdeuxprocessusdeqPCR:unepourquantifierl’abondancedugènenapAetl’autrepourquantifierl’abondancedugènenarG1.Lespourcentagessurlesbandesreprésententlaproportiondechaquegènedanslaquantitétotaledegènesquantifiés(napA+narG1)

Lesfigures4.12et4.13illustrentpourchaqueréplicatdesco-culture1:5et

1:10lacompositionentermedeproportiondessouchesNL23(indiquéparlegène

napA)etJAM1(indiquéparlegènenarG1).Laco-culture2(1:5)quiaréduitle

nitratemoinsrapidementmaisapuréduirelenitritecomplètement,avuune

proportiondelasoucheNL23100foisplusélevée(3.89%)quelaco-culture1(1;5)

(0,04%).Cettedernièren’apufaireuneréductiontotaledel’azotetotal.Danslecas

desco-cultures1et2(1:10),laproportiondelasoucheNL23étaitbeaucoupplus

élevé(12.26%et31,24%).Cesco-culturessontcellesquin’ontpasaccumuléde

nitrite.Danslecasdelaco-culture3(1:10),avecaccumulationdenitrite,la

proportiondelasoucheNL23(1,89%)étaitde6à16foismoinsélevéquelesdeux

autresréplicats.

Lesrésultatssuggèrentqu’uneco-culturerequiertun«justemilieu»de

proportionsdessouchesNL23etJAM1pourmaximiserl’efficacitédelaréduction

46

dunitrateetdunitritetoutenévitantlatoxicitédunitrite.Malheureusement,il

s’estavérédifficiled’obtenirceparfaitmélangedefaçonassezconstantepour

produiredesrésultatsentriplicata,etlavariabilitéimprévisibledesrésultatsa

empêchéleprogrèsduprojetdanscettedirection.

4.1.4. Réductiondelaquantitéinitialedenitrate

Unenouvellestratégieaétéétabliepourcontournerleproblème

d’accumulationdenitrite.L’idéeétaitdediminuerlaconcentrationinitialede

nitratedanslemilieu«InstantOcean»pourréduirel’accumulationmaximalede

nitrite.Danslesessaisprécédents(Auclairetal.,2010),ilsemblaitêtrepossible

pourlesco-culturesdetoléreruncertainniveaudenitrite(jusqu’àenviron15mM

d’azote)avantd’éprouverdesdifficultés.L’hypothèseaétéémisequ’une

accumulationdenitritesousceniveauéviteraitleproblèmedetoxicité.

Pourvalidercettenouvelleapproche,l’expérienceprécédente(voirsection

4.1.2)aétérépétéeentriplicata,maisavecdumilieu«InstantOcean»contenant

environ15mMdenitrateaulieude40mM.Aveccettequantitéinitialedenitrate,

laconcentrationmaximalethéoriquepossibledenitriteestd’environ15mM.De

plus,cetteconcentrationcorrespondà-peu-prèsauniveaumaximalobservédansle

mésocosmedufleuveSaint-Laurentaubiodôme(Labbéetal.,2003).

47

Figure4.14:Consommationdenitratedesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enconditionsanaérobies Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantenviron130heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitratedans3cultures,mesuréeparchromatographieionique.

Figure4.15:Concentrationdenitritedanslesco-culturesdessoucheNL23etJAM1enanaérobie Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétéincubéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantenviron130heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitritedans3cultures,mesuréeparchromatographieionique.

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120 140

concentration(mMd'azote)

temps(h)

NL23

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120 140


temps(h)

NL23

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

48

Touteslesco-culturesontdémontréuneréductioncomplètedunitrateetdu

nitriteenmoinsde150heures(Fig.4.14et4.15).Encequiconcernelenitrate

spécifiquement,touteslesco-culturesenavaientterminélaréductionenmoinsde

60heures(aumoins2foisplusrapidementquelaculturepuredelasoucheNL23);

cellesplusabondantesensoucheJAM1étantprogressivementplusrapides.Aussi,

bienquetouteslesco-culturesaientdémontréuneaccumulationdenitrite,ilaété

complètementréduitdanstouslescas.Lenitritenes’estjamaisaccumulédansles

culturespuresdelasoucheNL23.

Figure4.16:Concentrationd’azotetotaldanslesco-culturesdessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies Desco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantenviron130heures.Lesco-culturesavaientdesratiosd’inoculumsdifférents.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationd’azotetotaldans3cultures.L’azotetotalestcalculéàpartirdesconcentrationsdenitrateetdenitriteetcorrespondàlacombinaisondecesdeuxmesures.

Lesuividelaconcentrationd’azotetotalcomporteaussid’importantes

révélations(Fig.4.16).Malgréuneréductiondunitrateplusrapide,lesco-cultures

nesemblentpasêtrenécessairementplusefficacesquelasoucheNL23pourles

deuxpremièresétapesdeladénitrificationdanscesconditions.Lesco-cultures1:

0

2

4

6

8

10

12

14

0 20 40 60 80 100 120 140


temps(h)

NL23

co-culture1:1

co-culture1:2

co-culture1:5

co-culture1:10

49

5et1:10ontdémontréiciuneréductionlégèrementplusrapide.L’étapelimitante

danscesystèmeestdonclaréductiondunitriteparlasoucheNL23.Ilsemble

probablequesontauxdeconsommationdunitriten’estpasouestpeuaccélérépar

laprésencedelasoucheJAM1ouuneréductionaccéléréedunitrate.

Pourtouteslesexpériencesdesuividecroissancesubséquentes,lesco-

culturesontétépréparéesavecunratioinitialde1:5(JAM1:NL23)etenviron15

mMdenitrateinitial.

4.2. CaractérisationdelarelationentrelessouchesNL23etJAM1

4.2.1. Croissancedeculturespuresenprésencedesurnageant

Enplusdupartagedunitrate/nitrite,ilaétéintéressantdechercherdes

indicesdecoopérationentrelessouchesNL23etJAM1.Lapremièretentativede

trouverunetelleinteractionavaitpourbutdedéterminers’ilyavaitexistencede

moléculessécrétéesdanslemilieuparchaquesouchequipouvaientaiderla

croissancedel’autre.L’expérienceaétéexécutéecommesuit:

- DesculturespuresdessouchesNL23etJAM1ainsiquedesco-culturesdes

deuxontétéeffectuéesenconditionsaérobiesdanslemilieu«Instant

Ocean»15g/L.

- Unefoisquelacroissancemaximaleaitétéatteinte,cesculturesontété

centrifugéespourrecueillirlesurnageant.Lescellulesrestantesdansce

surnageantontensuiteétéenlevéesàl’aided’uneseringuemunied’unfiltre.

- Chaquesoucheaétéinoculéedanslesurnageantrécoltédelasouche

opposée(soucheNL23danslesurnageantdelasoucheJAM1etvice-versa).

- Chaquesoucheaaussiétéinoculéedanssonpropresurnageant,dansle

surnageantdelaco-culturedesdeuxsouches(àproportionségales)etd’un

surnageanttémoinnégatif(milieunon-inoculé).

50

- 50µldechacundecessurnageantsensemencésaensuiteétémélangéà150

µldemilieu«InstantOcean»frais.

- LesDO600ontétérécoltéespendantlacroissancedesculturesrésultantesà

l’aidedel’instrumentBioscreenàchaquedemi-heurependant48heures.

Lesessaisdevaientêtrefaitsavecdesculturespurespouréviterl’addition

desdeuxsouchesdanslesmesuresdesDO600.

Figure4.17:CroissanceenconditionsaérobiesdelasoucheNL23enprésencedesurnageant LasoucheNL23aétécultivéeenconditionsaérobiesdansplusieursconditionspendant48heures.LesmilieuxutilisésétaienttouscomposésdeInstantOcean15g/Làlabase,maischaquevariationcontenaitaussilesurnageantd’unecultureparticulière.LacroissancedelasoucheNL23danssonmilieuoptimal(337a)estaussiincluspourcomparer.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeturbiditéde8cultures,mesuréparl’appareilBioscreenàtouteslesdemi-heures.

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

DensitéOptique(600nm)

Temps(h)

milieuoptimal

srngt.JAM1

srngt.contrôle

srngt.co-culture

51

Lesrésultatsdémontrentclairementqu’en48heureslasoucheNL23a

atteintunDO600nettementplusélevéeenprésencedusurnageantdelasouche

JAM1qu’enprésencedusurnageantdutémoinnégatif(Fig.4.17).Lesurnageant

desco-culturessembleavoireuuneffetpotentielégalement,maismoinssignificatif.

Étantdonnéquelacroissancedesculturesdutémoinnégatifetdusurnageantdes

co-culturesn’avaitpasatteintsonplateau,ilestpossiblequecesdernièresauraient

éventuellementatteintunDO600semblableàcelledelacultureavecsurnageantde

lasoucheJAM1.LacroissancelasoucheNL23enprésencedesonpropre

surnageantadémontréàpeuprèslamêmecourbequeletémoinnégatifetn’estpas

inclusdanslegraphetelqueprésentéici.L’autreélémentdugrapheestlacourbe

decroissancedelasoucheNL23danssonmilieuoptimal(337a)sansmodifications.

Leprofildecroissanceenmilieu337as’alignepresqueparfaitementavecceluidela

culturedanslesurnageantdelasoucheJAM1.Ainsi,lasoucheNL23cultivéeen

milieu«InstantOcean»(quin’estpasunmilieuoptimal)enprésencedusurnageant

d’uneculturedelasoucheJAM1aétécapabled’atteindreunniveaudecroissance

quiressembleàceluidesacultureenmilieuoptimal.Puisquelemilieu337aestun

milieuminéralnon-salin,cecilaissepeut-êtreentrevoirlerôled’unosmoprotecteur.

52

Figure4.18:CroissanceenconditionsaérobiesdelasoucheJAM1enprésencedesurnageant LasoucheJAM1aétécultivéeenconditionsaérobiesdansplusieursconditionspendant48heures.LesmilieuxutilisésétaienttouscomposésdeInstantOcean15g/Làlabase,maischaquevariationcontenaitaussilesurnageantd’unecultureparticulière.LacroissancedelasoucheJAM1danssonmilieuoptimal(1403)estaussiincluspourcomparer.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeturbiditéde8cultures,mesuréparl’appareilBioscreenàtouteslesdemi-heures.

LessuivisdecroissancedelacultureJAM1sontbeaucoupplusdifficilesà

expliquer.Mêmes’ilyavaitdesséparationsévidentesentrelesdiversescourbes

danslafigure4.18,lesrésultatssemblentaléatoires.D’abord,lasoucheJAM1en

présencedusurnageantdelasoucheNL23(courbeenrouge)adémontréunephase

decroissanceexponentielleretardéedeprèsde10-20heuresparrapportautémoin

négatif(courbeenvert).Cecisembleindiquerqu’unaspectinconnudela

compositiondusurnageantdelasoucheNL23aiteuunimpactnégatifsurla

croissancedelasoucheJAM1.Pourcompliquerd’avantagelasituation,le

surnageantdelaco-culture(courbeenmauve)sembleavoireul’effetopposé,

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0

Absorbance

Temps(h)

1403

IO+srngt.NL23

IO+srngt.contrôle

IO+srngt.co-culture

IO+srngt.JAM1

53

puisquelaphaseexponentielledeJAM1estarrivéelégèrement(environ5heures)

plustôtensaprésence.Bienquecerésultatsoitsurprenant,ilpourraitêtre

expliquéparlapossibilitéquelasoucheJAM1émetdesparticulesdurantsa

croissancequiluisontbénéfiques,tandisquelacroissancedelasoucheNL23

résulteenlasécrétiondeparticulesquisontnéfastesàsacroissance.Lacroissance

delasoucheJAM1enprésencedesonpropresurnageant(courbeenbleupâle)

semblaitcorroborer,enpartie,cettehypothèse,maisaatteintunedensitémaximale

notammentinférieureauxautrescultures.Lestroisautresculturesontatteintun

plateauàpeuprèségal,etlaculturedelasoucheJAM1enmilieuoptimal(1403)

(courbeenbleufoncé)aatteintunDO600quienestdeuxfoissupérieures.Malgré

lanatureinconnuedesdétails,unechoseétaitcertaine:lasoucheNL23nesemble

pasfournird’aideàlacroissancedelasoucheJAM1enconditionsaérobies.

4.2.2. Recherched’unosmoprotecteur

CommelasoucheJAM1estadaptéeàdesconditionsdemilieuxsalins,une

despossibilitésintéressantesdanssoncasseraitlaproductionpotentielled’un

osmoprotecteur,unemoléculecapabledeprotégerunebactériecontrelesstress

osmotiques(parexemple:unehauteconcentrationensel).Avantledébutdece

projet,desrecherchesbioinformatiquesontmontréquelegénomedelasouche

JAM1contientdesgènespermettantlaproductiond’ectoïne,unemolécule

osmoprotectrice.LasoucheNL23aunerésistancelimitéeauxenvironnements

salés,doncl’existencedecettemoléculedansuneco-cultureseraitd’une

importancesignificativepourlacompréhensiondelarelationentrelesdeux

espèces.L’ectoïnepourraitaussiexpliquerenpartiel’aidedecroissancequela

soucheJAM1fournitàlasoucheNL23,tellequ’observédansl’expériencedela

sectionprécédente.

Uneexpérienceadoncétédéveloppéepourvérifierl’existenced’une

protectionosmotiquedelapartdelasoucheJAM1enverslasoucheNL23.Le

protocoled’expérienceaétébasésurleprocessusde«BacterialMilking»(Saueret

al.,1998),quiajustementétédéveloppéepourlarécoltedesolutésincluant

54

l’ectoïne.LasoucheJAM1ad’abordétécultivéedansuneversionmodifiéedeson

milieuoptimal(1403),oùletauxdesalinitéaétéaugmentéà6%NaCl(aulieude

2,4%).Lesculturesontensuiteétécentrifugées,etlesculotsdispersésdansle

milieuoptimaldelasoucheNL23(337a).L’espoirétaitquelaproductionde

moléculesosmoprotectricesinduiteparlemilieuhautementsalinrésulteenla

présencedecesparticulesdanslenouveaumilieu.Aprèsenviron6heuresdansle

milieu337a,lescellulesontétécentrifugéesdenouveau,etcettefoislesurnageanta

étéconservé.Celui-ciaétéséparéenplusieurstubesdanslesquelsdesquantités

progressivementcroissantesdeselontétéajoutées.

Tableau4.1:concentrationdeNaClpartubedanslarecherched’unosmoprotecteur

tube PourcentageNaCL(masse)1 0%(0,00g)2 1%(0,05g)3 1,5%(0,075g)4 2,0%(0,10g)

LasoucheNL23aensuiteétéinoculéedanschacundesnouveauxmilieux,etles

culturesontétésuiviesàl’aidedel’appareilBioscreenpendant48heures.La

soucheNL23aégalementétécultivéedanslemilieu337anon-modifié(pasexposé

auxcellulesdelasoucheJAM1)àtitredecomparaison(Fig.4.19à4.22).

55

Figure4.19:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(0%deNaCl) LasoucheNL23aétécultivéeenconditionsaérobiespendant48heuresdanssonmilieuoptimal(337a)avecaucunselajouté.Lemilieudénommé337a-JAM1danslalégendecomporteenplusdesmétabolitesdelasoucheJAM1récoltésparuneméthodede«bacterialmilking».Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeturbiditéde8cultures,mesuréparl’appareilBioscreenàtouteslesdemi-heures.

Figure4.20:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(1%deNaCl) LasoucheNL23aétécultivéeenconditionsaérobiespendant48heuresdanssonmilieuoptimal(337a)avec1%desel.Voirlégendedelafigure4.19.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0


Temps(h)

337a-JAM1

337a

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0


Temps(h)

337a-JAM1

337a

56

Figure4.21:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(1,5%deNaCl) LasoucheNL23aétécultivéeenconditionsaérobiespendant48heuresdanssonmilieuoptimal(337a)avec1,5%desel.Voirlégendedelafigure4.19.

Figure4.22:CroissancedelasoucheNL23enprésencedemétabolitesdelasoucheJAM1(2%deNaCl) LasoucheNL23aétécultivéeenconditionsaérobiespendant48heuresdanssonmilieuoptimal(337a)avec2%desel.Voirlégendedelafigure4.19.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

337a-JAM1

337a

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0

337a-JAM1

337a

57

LesculturesdelasoucheNL23danslemilieu337amodifiéontmontréune

croissanceplusrapidequeletémoinauxconcentrations0%,1%et1,5%deNaCl.

Cetteobservationauraitpuporteràconfusion,maisuneexpérienceprécédentede

ceprojetavaitdéjàdémontréquelasoucheNL23pouvaitcroîtreplusrapidement

enprésenced’unsurnageantdelasoucheJAM1(voirsection4.2.1).Cetaspectdu

résultatn’estdoncpassurprenant.Cequiétaitréellementlepointmajeurdansles

donnéesrecueilliesétaitl’absencedecroissancedanslegraphepourla

concentration2%(Fig.4.22).Eneffet,cecomportementestexactementdequoion

s’attendaitsilasoucheJAM1n’offraitaucuneprotectionosmotique.Toutefois,ilest

possiblequeleprotocoleutilisénepermettaitpasderécolterdesmolécules

osmoprotectrices.Unerépétitiondel’expérienceaconfirmélesrésultatsjusqu’à

uneconcentrationdeselde2,5%.

4.2.3. Caractérisationapprofondiedelaconsommationdunitrate/nitriteà

l’aidedemutantsdelasoucheJAM1

Lorsd’étudesenparallèlesaveccelles-ci,desmutantsdelasoucheJAM1ont

étédéveloppéspouraideràlacaractérisationdesonprofildedénitrification

(Mauffreyetal.,2015).Lestroismutantsenquestionétaienttousrendusdéficients

dansleurhabiletéderéduirelenitrate:

- LasoucheJAM1ΔnarG1(AbsencedusystèmeNar1)

- LasoucheJAM1ΔnarG2(AbsencedusystèmeNar2)

- LasoucheJAM1ΔnarG1narG2(doublemutant)

Commelenitrateestprincipalementimportantdanslecontextedela

dénitrification,l’applicationexpérimentaledesmutantsétaitsurtoutintéressanteen

conditionsanaérobies.Leplanétaitdoncdefaireunsuividecroissancedesco-

culturesdelasoucheNL23avecchacundesmutantsetdelasoucheJAM1non

mutante(ainsiquedesculturespuresdechaquesoucheimpliquéecommetémoin).

Lesco-culturesdelasoucheNL23avecledoublemutantallaientêtre

particulièrementinformatif,puisquel’effetdelasoucheJAM1surlaperformancede

58

lasoucheNL23seraitvisibledanslesuividedénitrificationparchromatographie

ionique.Leratiod’inoculumdedépartpourtouteslesco-culturesétaitde1:5

(nitrate:nitrite),basésurdesrésultatsprécédents(voirsection4.1.2).Lesuivia

étéeffectuésurunepérioded’environ225heuresetleséchantillonsontété

mesurésenDO600etenconcentrationsdenitrateetdenitrite(Fig.4.21à4.23).

Cependant,seulslesrésultatsdelachromatographieioniquesontprésentés,carle

suiviparDO600nerévèlepasbeaucoupd’informationssurl’activitédescultures.

59

Figure4.23:Consommationdunitrateparlesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies) Desco-culturesdelasoucheJAM1etsesmutantsaveclasoucheNL23ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantprèsde225heures.JAM1ΔnarG1:laversiondelasoucheJAM1quiestmutantedanslegènenarG1.JAM1ΔnarG2:laversiondelasoucheJAM1quiestmutantedanslegènenarG2.JAM1ΔnarG1narG2:laversiondelasoucheJAM1quiestmutantedanslesgènesnarG1etnarG2enmêmetemps.Lesco-culturesavaientunratioinitialde1:5(JAM1:NL23).Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitratede3cultures,mesuréeparchromatographieionique.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 50 100 150 200

concen

tra+

ondenitrate(m

Md'azote)

temps(h)

NL23

JAM1

JAM1∆narG1

JAM1∆narG2

JAM1∆narG1narG2

co-cultureNL23/JAM1

co-cultureNL23/JAM1∆narG1


co-cultureNL23/JAM1∆narG1narG2

60

Figure4.24:Concentrationdenitritedanslesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies) Desco-culturesdelasoucheJAM1etsesmutantsaveclasoucheNL23ontétécultivéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantprèsde225heures.Voirlalégendedelafigure4.23.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationdenitritede3cultures,mesuréeparchromatographieionique.LacourbedelaculturepuredelasoucheJAM1ΔnarG2aétéomisepourdesraisonsdevisibilité.Celle-cidémontraituneaccumulationdenitritesimilaireàlacourbedelasoucheJAM1.

0

2

4

6

8

10

12

0 50 100 150 200

concentrationdenitrite(m

Md'azote)

temps(h)

NL23

JAM1∆narG1narG2

co-cultureNL23/JAM1


co-cultureNL23/JAM1ΔnarG1

co-cultureNL23/JAM1ΔnarG2

JAM1

JAM1ΔnarG1

61

Figure4.25:Concentrationd’azotetotaldanslesco-culturesdessouchesJAM1non-mutantesoumutantesaveclasoucheNL23(conditionsanaérobies) Desco-culturesdelasoucheJAM1etsesmutantsaveclasoucheNL23ontétéincubéesdanslemilieuInstantOcean15g/Lpendantprèsde225heures.Voirlalégendedelafigure4.23.Chaquepointdanslegraphereprésentelamoyennedeconcentrationd’azotetotalde3cultures.L’azotetotalestcalculéàpartirdesconcentrationsdenitrateetdenitriteetcorrespondàlacombinaisondecesdeuxmesures.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 50 100 150 200

concentrationd'azotetotal(mMd'azote)

temps(h)

NL23

JAM1∆narG1

co-cultureNL23/JAM1




JAM1∆narG2

JAM1∆narG1narG2

JAM1

62

Lepremieraspectintéressantdesrésultatsestlecomportementdela

dénitrificationdessouchesmutantes.Ledoublemutant(JAM1ΔnarG1narG2)était

évidemmentlemoinsperformantenréductiondunitrate,puisquecelui-cine

possèdepasdenitrateréductasesfonctionnelles(Fig.4.23).Lalégèrebaissede

concentrationdenitrateetd’azotetotalepourraitêtredueàdesfluctuations

causéesparlechromatographe.LemutantJAM1ΔnarG1avaitunprofilderéduction

denitratetrèssimilaireàlasoucheNL23,tandisquelemutantJAM1ΔnarG2aun

profilderéductiondenitratequiressembleplutôtàceluidelasoucheJAM1.Ces

observationsétaientprévisibles;desexpériencesantérieuresavaientdéjà

déterminéquelegènenarG1estleplusactifdelapaire(Mauffreyetal.,2015).

Ilestintéressantdeconstaterquetouteslesco-culturesontréduitlenitrate

plusrapidementquelasoucheNL23enculturespures(Fig.4.23).Pourlesco-

culturesNL23/JAM1,cerésultatn’étaitpasnouveau,puisquecerésultatavaitdéjà

étéobtenu.ÉtantdonnéquelasoucheJAM1ΔnarG2performeexactementcomme

saversionnonmutante,lerésultatpourlesco-culturesNL23/JAM1ΔnarG2n’était

pasétonnantnonplus.Lesco-culturesNL23/JAM1ΔnarG1étaientplusrapidesdans

laréductiondunitratequelemêmemutantenculturespures.Cetauxderéduction

plusélevépourraitêtreattribuéàl’additiondel’activitédeNapAetdeNar2.

Toutefois,cecinepourraitpasexpliquerlemêmecomportementchezlesco-

culturesNL23/JAM1ΔnarG1narG2.Eneffet,ilsemblequelasimpleprésencedela

soucheJAM1double-mutanteaitpermisàlasoucheNL23d’augmentersonactivité

deréductiondenitrate.Ilexisteraitdoncunfacteurd’aideinconnufourniparla

soucheJAM1.Ilestimpossibleparcetteexpériencededéterminercequ’estla

naturedecefacteur.Celui-cipourraitêtrereliéàl’aidedecroissanceobservéeen

conditionsaérobiesdansuneexpérienceprécédente(voirsection4),uneprotection

osmotique,ouunautreélémentjusqu’iciinconnu.

Danslegraphedeconcentrationsdenitrite(Fig.4.24),onvoitquelesseules

co-culturesàavoiraccumulédunitriteétaientlesco-culturesNL23/JAM1et

NL23/JAM1ΔnarG2.Cecirenforcel’idéequelemutantJAM1ΔnarG2secomporte

63

largementcommelasoucheJAM1non-mutante.Aucunesdesautresco-cultures

n’ontaccumulédenitrite.

Commed’habitudelesplusgrandesdécouvertessetrouvaientdanslegraphe

dusuividelaréductiond’azotetotal(Fig.4.25).Premièrement,lesrésultats

corroborentlanotionquelesco-culturesNL23/JAM1nesontpasbeaucoupplus

efficacesàcetégardquelasoucheNL23enculturespures.Deuxièmement,toutes

lesco-culturesavecdesmutantsontréduitl’azotetotalplusrapidementquela

soucheNL23enculturespuresetlesco-culturesNL23/JAM1.Ceciétaitunrésultat

trèssurprenant,surtoutdanslecasdesco-culturesNL23/JAM1ΔnarG1narG2,qui

necomptaientabsolumentpassurlacapacitéderéductiondenitratedelasouche

JAM1.Pourtant,celles-ciontatteint0mMd’azotetotalplusde20heuresavantles

co-culturessansmutantoulasoucheNL23enculturespures.

UnedernièreobservationnotableestquelasoucheJAM1etlemutant

JAM1ΔnarG2ontsembléréduirel’azotetotal.Commeilyapeud’ammoniumdans

lemilieuInstantOcean,l’assimilationdel’azotedoitsefairevialaréductiondu

nitrateennitriteparlavoieassimilatriceprésentedanslasoucheJAM1(Mauffreyet

al.,2016).

64

5. Discussion

5.1. Paramètresoptimauxpourlacroissancedesco-culturesdes

souchesNL23etJAM1

Avantledébutduprojet,unepartiedelarecherchepréliminairesurles

conditionsdesco-culturesdessouchesNL23etJAM1avaitdéjàétéfaite.Lemilieu

InstantOcean15/Lavaitdéjàétédécouvertcommeétantapteàsupporterla

croissancedesdeuxbactériesenculturespuresouenco-cultures.Deplus,la

plupartdesautresparamètresimportants,dontlatempératured’incubation,lepH

dumilieuetlesélémentstracesajoutésétaientdéjàétabliscommeétantlesmêmes

quepourlaculturedubiofilmoriginal.Laproblématiquerestanteétaitsurtoutaxée

surlarecherched’unesolutionauproblèmed’accumulationtoxiquedenitrite.

Lapremièresolutiontentéeétaitd’ajusterlesratiosdebactériesdanslesco-

culturesaumomentdel’ensemencement.Cettesolutionétaitlogiquemaiselleavait

aussiétéutiliséeavecsuccèsensituationdeco-culturesdeClostridiumbutyricumet

Rhodobactersphaeroides.Eneffet,dépendantduratiodesdeuxbactériesdans

l’inoculum,ilpouvaityavoiraméliorationdel’efficacitédelaphotoproduction

d’hydrogènegazeuxparlesco-cultures.Enlimitantl’abondancedeC.butyricum,qui

démontreunecroissancenettementplusrapidequesonhomologue,unéquilibre

bénéfiqueaétéatteint.(Laurinavicheneetal.,2016).Ainsi,pluslaproportiondela

soucheJAM1dansl’inoculumdedépartétaitimportante,plusletauxderéduction

denitrateétaitrapide,étantdonnéquelasoucheJAM1estplusefficacepourréduire

lenitratequelasoucheNL23.Toutefois,enréduisantlaquantitérelativeinitialede

lasoucheJAM1parrapportàlasoucheNL23,ilaétépossibledanscertainscas

d’éviterleniveaufataldenitrite.Lesrésultatsdanscesessaisétaientsouvent

difficilesàreproduireetàanalyserparlasuiteàcausedevariabilitésconsidérables

etimprévisibles.Laplupartdesexpériencescomportaientdestriplicatsdans

lesquelslesculturesavaientuncomportementcomplètementdifférentmalgrédes

65

conditionsdecultureidentiques.Lacausedecettevariabilitédemeureinconnue,

maispourraisêtreattribuéàunparamètretropdifficileàcontrôler,cequiest

parfoislecasdansdessystèmesbiologiques.Desrésultatspréliminairesont

suggéréqueleratioentrelessouchesNL23etJAM1doittendreversuncertain

équilibrepoureffectuerunedénitrificationefficace.Évidemment,lacapacitéde

reproduiredesrésultatsavecconstanceestdésirable.Iladoncétéconcluque

l’ajustementduratioinitialdesbactériesdansl’inoculumnepouvaitêtrequ’une

partiedelasolutionauproblème.

Ladeuxièmesolutionauproblèmed’accumulationdenitriteétaitde

simplementbaisseràuntierslaconcentrationdenitrateinitialedanslemilieude

croissance.Lebutétaitdelimiterlaquantitémaximalepossibledenitriteaccumulé.

Deplus,lesconcentrationsdenitrateobservéesdanslanatureoudansles

aquariumsd’oùprovientlaproblématiquen’approchentjamais40mMd’azotetel

quedanscesexpériences,etleseffetstoxiquessurlesanimauxsontressentisàdes

concentrationsnettementinférieures(DeRoosetal.,2003,Labbé,2007).L’impact

decetteactionaétédécisif.Avecunequantitémoindredenitrateàsadisposition,

lesco-culturesn’ontjamaispuaccumulerassezdenitritepourquelaconcentration

deviennenocive.Touteslesexpériencessubséquentesavaientdoncunratioinitial

de1:5(JAM1:NL23)etenviron15mMdenitrateaulieude40mM,ainsi

combinantlesrésultatsdesdeuxsolutions.

66

5.2. Profildeconsommationdenitrateetdenitritelorsdela

dénitrification

Unegrandepartiedesexpériencesvisantàoptimiserlesconditionsde

culturesaaussipermislacaractérisationduprofildeconsommationdenitrateetde

nitritedesco-culturesdessouchesNL23etJAM1(Fig.5.1à5.3).Lescourbes

généréesdurantl’expériencederéductiondenitratereprésententtrèsclairementle

comportementtypiqued’uneco-cultureréussie(enconditionsanaérobies)des

souchesJAM1etNL23:unebaissedeconcentrationrapidedunitrateavecune

accumulationdenitriteassociée,suivied’uneréductiondecenitrite(Fig5.3).

Figure5.1:ProfildeconsommationdunitrateetdunitriteparlasoucheNL23lorsdeladénitrification ExempleducomportementdelasoucheNL23enconditionsanaérobies.Legrapheaétégénéréàpartirdevraiesdonnéesmaisn’estqu’unereprésentationgénéraleduprofildelasoucheNL23lorsdeladénitrification.

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120 140

concentrationdenitrateou

nitrite(mMd'azote)

temps(h)

NL23nitrate

NL23nitrite

67

Figure5.2:ProfildeconsommationdunitrateetdunitriteparlasoucheJAM1lorsdeladénitrification ExempleducomportementdelasoucheJAM1enconditionsanaérobies.Legrapheaétégénéréàpartirdevraiesdonnéesmaisn’estqu’unereprésentationgénéraleduprofildelasoucheJAM1lorsdeladénitrification.

Figure5.3:Profildeconsommationdunitrateetdunitriteparuneco-culturedessouchesNL23etJAM1lorsdeladénitrification Exempleducomportementd’uneco-culturedessouchesNL23etJAM1enconditionsanaérobies.Legrapheaétégénéréàpartirdevraiesdonnéesmaisn’estqu’unereprésentationgénéraleduprofild’uneco-culturelorsdeladénitrification.

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120 140


nitrite(mMd'azote)

temps(h)

JAM1nitrate

JAM1nitrite

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120 140


nitrite(mMd'azote)

temps(h)

co-cultureNL23/JAM1nitrate

co-cultureNL23/JAM1nitrite

68

Cegenredeprofilpouruneco-cultureadéjàétéobservélorsd’études

antérieures.Deschercheursontcultivédesco-culturesdePseudomonas

denitrificans(effectuetouteslesétapesdeladénitrification)etBacillussubtilis(ne

réduitquelenitrate)enconditionsanaérobies.Ilsontmesuré,entreautres,la

consommationdenitrateetdenitrite(Fig5.4).Leprofildeconsommationde

nitrateetdenitriteestremarquablementsemblableàceluid’uneco-culturedes

souchesNL23etJAM1(Maraziotietal.,2003).Cecirenforcel’idéedelanitrite

réductasecommeétantuneétapelimitantedansladénitrification.Ilserait

potentiellementintéressantdecultiveruneco-cultureoùlesdeuxespèces

bactériennesréduisentlenitrite,maisoùiln’yaqu’unenitrateréductase,pourvoir

sicelapourraitoffrirunprofildifférent.

Figure5.4:Profildeconsommationdunitrateetdunitriteparuneco-culturedesespècesBacillussubtilisetPseudomonasdenitrificanslorsdeladénitrification LesunitésnesontpasenmM,donclacomparaisondesvaleursestdifficile,maislaformedescourbesresteintéressante.(Maraziotietal.,2003)

69

Lorsdel’expérienceaveclesmutantsdelasoucheJAM1,ilyavaitaussi

l’occasiondecorroborerdesnotionsreliéesauxdeuxnitrateréductases(Nar1et

Nar2)delasoucheJAM1.IlaétéconfirméquelanitrateréductaseNar1estla

principaleresponsabledelaréductiondunitrate.Eneffet,unesouchemutantede

lasoucheJAM1oùladeuxièmenitrateréductase(Nar2)aétédésactivée(doncNar1

actifseulement)reproduitpresqueexactementlemêmetauxderéductiondu

nitratequelasouchesauvage.DanslecasinverseoùNar1estinactivé,lesrésultats

ontdémontréquelasouchemutanteavecNar2actifseulementaunedynamiquede

réductiondunitrateéquivalenteàlasoucheNL23quipossèdeunenitrateréductase

detypeNap.

L’aspectleplusimportantengénéraldecetteoptiqueétaitl’efficacitéd’une

co-culturepourréduirel’azotetotal,c’estàdirelavitesseàlaquellelenitrateetle

nitritesontréduitsàzéro.Unedeshypothèsescentralesduprojetétaitquelesdeux

espècessontplusefficacesensemblesqu’individuellement.Incidemment,

l’améliorationdurendementmétaboliqueparl’applicationdeco-culturesestlebut

deplusieurseffortsderecherche(ex:laproductiond’hydrogèneparuneco-culture

deC.butyricumetR.sphaeroides,(Laurinavicheneetal.,2016).Lespremiers

résultatsàcetégardn’étaientpasencourageants:Lesco-culturesnesemblaientpas

êtrenécessairementplusefficacespourréduirel’azotetotal,prenantàpeuprès

autantdetempsquequelasoucheNL23enculturepurepourleréduireàzéro.Les

seulesco-culturesquiontdémontréuneaméliorationdecetaspectétaientcelles

aveclasoucheNL23avecuneversionmutantedeJAM1quiavaitNar1désactivé.

CombinéaveclanotionquelasoucheJAM1fournituneaidedecroissanceàla

soucheNL23(expliquéplusbas),cecipourraitindiquerquelasoucheNL23est

négativementaffectéeparl’activitédénitrifiantedelasoucheJAM1,mais

positivementaffectéeparsaprésence.

70

5.3. LessouchesNL23etJAM1enbiofilm

Unedesgrandesquestionsaudébutduprojetétaitlerôledelastructuredu

biofilmdansl’interactiondesbactériesNL23etJAM1,surtoutdanslecasde

l’osmoprotectiondelasoucheNL23danslesmilieuxconcentrésenNaCl(plusque

1.5%).Ladécisionadoncétéprisedetenterlacréationd’unbiofilmcomposéde

chacunedessouchesNL23etJAM1ouen«co-biofilm».Lacréationetl’observation

d’unbiofilmconsistaientdéjàunprocessusconnudanslelaboratoire.Desétudes

précédentesportaientsouventsurlacompositionetlaperformancedubiofilm

originalrecueilliauBiodômedeMontréal.Lesméthodesdecréationdubiofilm

développéesdanscesétudesprécédentesonttoutdemêmeservid’exempledansla

méthodeemployéeici(unedescriptiondecetteméthodeestdisponibleenannexe).

Unbiofilmcommecelui-ciauraitpuservirdansplusieursexpériences

différentes,maisl’idéeinitialeétaitd’étudierunrôlepossibledelastructuredu

biofilmdanslaprotectiondelasoucheNL23enmilieusalé.Lebiofilmoriginal(au

biodômeetenlaboratoire)étaitcultivéenmilieuavec3%desel.LasoucheNL23

étantunedesespècesprincipalesdecesystème,elledevaitnécessairementrecevoir

uneaideextérieure.CetaidepourraitprovenirdelasoucheJAM1,parexemplepar

l’entremisedel’osmoprotecteurectoïne;ilaétédocumentépourd’autresco-

culturesquel’aided’unosmoprotecteurn’estefficacequ’enbiofilm.Dansunesérie

d’expériences,unesouchebactériennehalophiledugenreChromohalobacteraété

cultivéeenco-cultureavecuneespècehalotolérantedugenreDietza.L’espèce

halophilenedémontreaucunecroissanceenmilieuxcontenantmoinsde5%desel,

tandisquel’espècehalotolérantenedémontreaucunecroissanceenmilieux

contenantplusde12%desel.Enco-culturesplanctoniques(ensuspensionliquide),

iln’yavaitpasd’effetprotecteurd’uncôtéoudel’autre;seulesdescellulesde

l’espècehalotoléranteontétédétectéesdanslemilieusanssel,etseulesdescellules

del’espècehalophileontétédétectéesdanslemilieude15%desel.Quandles

espècesétaientcultivéesen«co-biofilm»,l’espècehalotoléranten’apportaitaucune

71

aideàl’autrebactérieenmilieusanssel.Cependant,unequantitéàpeuprèségale

desdeuxespècesontétédétectéedansle«co-biofilm»à15%desel.Les

chercheursontsuggérélerôledesosmoprotecteursectoïneetglutamatedansle

résultat(Plakunovetal.,2008).Malgrétout,ilneseraitpassurprenantquela

protectiondanslecasdessouchesNL23etJAM1provienneplutôtdirectementdela

structuredubiofilmetdesEPSquilecompose,étantdonnélagrandevariétéde

fonctionsquiluisontattribué.

L’expérienceplanifiéeétaitdecultiverlebiofilmenmilieuInstantOceanavec

1,5%deNaCl,puisdeletransférerdanslemêmemilieuà3%deNaCl,pourune

autresériedetransferts.Lasurvie(ounon)delasoucheNL23,encomparaison

avecuneco-cultureliquide,auraitalorsétéuneindicationduniveaudeprotection

offertparlebiofilm.Uneautreindicationdelaprotectionauraitétéletaux

dénitrification.SilacultureenbiofilmdanslemilieuInstantOcean(3%NaCl)était

arrivéeàréduirelenitrite,celaauraitétéunsigned’activitédelapartdelasouche

NL23.

Figure5.5:Supportenplastiquegarnid’unbiofilm Dessupportsenplastiquecommecelui-ciontétéutiliséspourfournirunesurfaced’accrochageausoucheNL23etJAM1pourlacréationd’unbiofilm.Lessupportssonassezpetitspourêtrefacilementinsérésetretirésdesfiolesdeculture.

72

Pourdesraisonsqu’onignore,nilessouchesindividuelles,nilaco-culture

dessouchesNL23etJAM1n’ontdémontrélacapacitédeformerunbiofilm.Les

raisonsexactesdecerésultatsontévidemmentinconnues,maisonpeutdévelopper

deshypothèses.L’échecpourraitêtredûàl’absenced’uneespècecolonisatrice

importante,puisquedescaractéristiquesspécifiquessontrequispourfaciliter

l’adhérencedecellulesàuneparoi.Lesfacteursassociésauxstagesinitiauxdela

formationd’unbiofilmpourE.coli,parexemple,incluentlamotilité(ex.:flagelles),

laprésencedefimbriae,laprésencedecurlietlaproductiondecertainsEPSclés,

dontlepolysaccaridePGA(β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine)(VanHoudtetal.,2005).

Lacapacitédeformationdebiofilmpeutvarierénormémententreespècesetmême

entresouchesdelamêmeespèces,commeilaétédémontrépourCronobacter

sakazakii(Yeetal.,2015).Ilestaussidocumentéquelaformationdebiofilmpour

certainesespècesestfacilitéeparlacolonisationinitialed’unesurfaceparuneautre

espèce.L’espècebactérienneSphingomonasnatatoriaestcapabledeformerdes

biofilmsfragilesenculturepure,maiselleformedesbiofilmsplusrobustes

lorsqu’elleestexposéeàunesurfacerecouvertedebactériesdel’espèceMicrococcus

luteus.Ceciestdûàune«coagrégation»,unereconnaissanceetunattachement

spécifiqueentrelesdeuxbactéries(Minetal.,2009).

Lebiofilmoriginalestunecommunautécomplexedebactériesetd’autres

organismes;ilestpossiblequ’unouplusieursdeceux-ciagissentcomme

spécialistescolonisateursdesurfacesetsontdoncnécessairesàlaformation

efficaced’unbiofilm.Dansunedesanalysesdubiofilmoriginal,ilavaitéténoté

qu’unegrandevariétédecelluleseucaryotescomposaientuneproportion

importante(20%)delabiomasseaudébutdudéveloppementdubiofilm;ces

cellulesdevenaientmoinsabondantesparlasuite(5-6%)(Labbéetal.,2007).Ceci

pourraitêtreindicatifd’unrôledecolonisationounon,maislechangement

dramatiquedelacompositiondelabiomassedubiofilmestcertainementune

indicationquecertainesbactériessontresponsablesdedifférentsélémentsdelavie

microbienneenbiofilm,incluantlacolonisation.Ilestentièrementpossiblequeles

souchesNL23etJAM1nesoientpasaxéessurcettepartiedudéveloppementd’un

73

biofilm.Ilestaussipossiblequelesconditionsdanslesquellesl’expériences’est

dérouléen’étaientpasoptimales.Lasurfaceenplastiquedessupportsn’étaitpeut-

êtrepasapteaubiofilm;dessurfacesenverreontététestéeségalement,sansplus

derésultat.

Éventuellement,cetaspectduprojetaétéabandonnéavecleverdictquela

formationd’unbiofilmcomposédessouchesNL23etJAM1n’estpaspossibleavec

lesméthodesutilisées.

5.4. Échangederessources

Lesexpériencesontdémontréqu’ilyavaitaumoinsexistenced’uneaide

bénéfiquedecroissanceetd’activitédénitrifiantedanslesco-culturesdelapartde

lasoucheJAM1.Eneffet,ilsemblequ’ilexisteunfacteurinconnuquiaidelasouche

NL23àcroîtreplusrapidement(démontréenconditionsaérobies)etàréduirele

nitrateplusrapidement(démontréenconditionsanaérobies).L’identitédece

mécanismeresteindéterminée;Ilpourraits’agird’uneparticuleajoutéeou

transférée,oualorsl’enlèvementd’unélémentlimitant.Deplus,ilseraitpossible

queplusieursfacteurssoientprésents,etmêmequedifférentsfacteurssoient

responsablesdesaméliorationsobservéesenaérobioseetenanaérobiose.L’aspect

unidirectionneldecetaideaaussiétédémontré;lasoucheJAM1n’ayantjamais

montrélamoindreindicationdeprofiterdelaprésencedelasoucheNL23,voire

mêmesaprésencepouvantêtrenocive.Dansl’étudemenéeparTakakietal.(2007)

(voirsection2.8),l’espèceStreptomycesgriseusfournissaituneaidede

dénitrificationàRalstoniapickettiiparl’entremisedeprotéasesrelâchéesdans

l’environnement.Pourarriveràcetteconclusion,leschercheursontpremièrement

cultivéR.pickettiienprésencedesurnageantdeS.griseusenconditionsanaérobies.

Cetteastuceaétéutiliséeiciégalement,maisseulementenconditionsaérobies.

Pourconfirmerquec’estbienunemoléculesecrétéeoul’absenced’unélément

limitantquiestresponsabledel’améliorationdeladénitrificationdelasouche

NL23,ilfaudraitrépéterl’expérienceenconditionsanaérobies.Deuxièmement,le

74

surnageantdeS.griseusaétésoumisàuneultracentrifugationpourcréerune

séparationdescomposantesparmassemolaire.Entestantl’effetdechaquefraction

demoléculesséparément,ilestdevenupossibled’identifierlesplusmassives

commeétantresponsablesdutauxsupérieurdedénitrification,cequiamenéà

l’hypothèsedesprotéases.Ceciestunestratégiequipourraitêtreintéressantepour

identifierlanaturedufacteurd’aidedelasoucheJAM1.Deplus,cettemêmeétudea

concluquel’histidinejouaitpeut-êtreunrôledansl’améliorationdel’activité

dénitrifiante.CecipourraitêtrerapidementtestéaveclasoucheNL23également.

Uncandidatd’unfacteuraidantlasoucheNL23estl’ectoïne.Ilétait

connuquelasoucheJAM1possèdelesgènesnécessairesàlaproductiond’ectoïne,

uneparticuleosmoprotectrice.Ilaétérécemmentdéterminédanslelaboratoire

quelasoucheJAM1produisaitdel’ectoïnedanslemilieudeculture(donnéesnon-

publiées).Lorsdeceprojet,leseffortspourdémontrerl’effetd’osmoprotectionde

lasoucheJAM1ontéchoué(voirsection4.3.2),maiscelaneprouvepasquel’ectoïne

nejouepasderôle.Dessolutionspossiblesseraientdetrouverunmoyende

quantifierl’ectoïnedirectementoudeconcentrerl’ectoïneproduitparlasouche

JAM1pourinduiresoneffet.Ilseraitaussipossiblequel’ectoïnen’estpas

responsabledeseffetsobservésdanslessituationsplanctoniques.Dansuneétudeà

cesujet,ilaétédéterminéquel’ectoïneétaitsimplementtropdiluéedansune

cultureensuspensionliquidepouravoiruneffetnotable(Plakunovetal.,2008).

Danscecas,l’effetdel’ectoïnenepourraitêtreobservéquesiuneméthodeétait

trouvéepourproduireunbiofilmaveclessoucheNL23etJAM1.

75

6. Conclusion

Desconditionsoptimalesdeco-culturesdessouchesNL23etJAM1ontété

développées,cequiapermisd’optimiserlesétudessuivantes.Laproblématique

d’accumulationdenitriteparlaréductiontroprapidedunitrateaétécontournée

parlabaissedenitrateinitialedanslemilieuetl’ajustementduratiodessouchesau

momentdel’ensemencement.Lesmêmesexpériencesontaussidévoiléplusieurs

aspectsducomportementdesdeuxsouchesenconditionsaérobiesetanaérobies,

oùcelles-ciperformentladénitrification.

Ilaétédémontréquelesco-culturesdessouchesNL23etJAM1n’étaientpas

nécessairementplusrapidesendénitrificationquelasoucheNL23encultures

pures.Toutefois,ilaégalementétédémontréquelesco-culturesdelasoucheNL23

aveclessouchesmutantesdeJAM1quiontlanitrateréductaseNar2désactivée

étaientcapablesd’unedénitrificationplusrapidequelasoucheNL23encultures

pures.

Lestentativesdeformationsd’unbiofilmuniquementcomposédessouches

NL23etJAM1ontéchoué.Ilsemblequedanslesconditionsimposées,cesdeux

espècesbactériennesnepeuventpasdévelopperdebiofilm.

IlaétédémontréquelasoucheJAM1apporteuneaidedecroissanceàla

soucheNL23enconditionsaérobiesetuneaidederéductiondenitrateen

conditionsanaérobies.LasoucheNL23n’apasfaitdemêmepourlasoucheJAM1

danslesconditionsd’expérience.Cependant,iln’apuêtredémontréquelleestla

naturedecetaide.

76

Annexe

Protocoledecréationd’unbiofilm

Certainesexpériencesontrequislaformationd’unbiofilm.Pourcefaire,des

supportsenplastiquesontétéinsérésdanslesfiolesdecultureenprésencede

bactériesensuspension.Cesensemencementssontensuiteincubésenconditions

anaérobies.Puisqueledéveloppementd’unbiofilmapuprendreplusieurs

semaines,lemilieudanslequelsetrouvaitlacultureadûêtrerégulièrementchangé

pouryéviterladéplétiondesressources.Lessupportsontdoncététransférés

régulièrementdansunenouvellefiolecontenantdumilieufrais.Pourlesco-

culturesdessouchesJAM1etNL23,lapériodedetempsentrelestransfertsétait

d’environunesemaine.

Pourtransférerlessupportsenévitantlacontaminationexterneetentreles

échantillons,touslesoutilsutilisésontdûêtrestérilesetletravailadûêtrefaitdans

lahottebiologique.Lessupportsontétéenlevésdesfiolesàl’aidedepincespuis

insérésdanslesnouvellesfiolespréalablementautoclavées.Celles-ciontensuiteété

ferméeshermétiquementetl’oxygèneàl’intérieuraétéenlevépourcréer

l’environnementd’anaérobiose.Danslecasdeceprojet,leprocessusaétérépété

jusqu’àcequ’ilestdevenuévidentqu’iln’yauraitpasformationdebiofilm(4

semainesouplus).

77

Figure7.1:Schémadelaméthodedecréationd’unbiofilm Leprocessusdecréationdubiofilmimpliqueletransfertàrépétitiondesupportscoloniséspardesbactériesenanaérobies.

78

Listedesréférences

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Relation entre les deux souches bactériennes principales d ...composant de fertilisants agricoles...

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