REGULATORNI MOLEKULI RNK RNKbiolozi.bio.bg.ac.rs/files/biblioteka/3godina/Skripte/Molekularna... ·...
Transcript of REGULATORNI MOLEKULI RNK RNKbiolozi.bio.bg.ac.rs/files/biblioteka/3godina/Skripte/Molekularna... ·...
1
REGULATORNI MOLEKULI RNK — "SKRIVENI JEZIK
RNK"
Kod prokariota geni posredstvom molekula iRNK kodiraju proteine koji obavljaju
katalitičke, strukturne i regulatone funkcije, tako da su proteini jedini „izlazni signal“ njihovog
genetičkog sistema. Kod eukariota geni eksprimiraju dva nivoa informacija: iRNK, koje kodiraju
proteine, i regulatorne RNK. Proteini i regulatorne RNK formiraju složene regulatorne mreže
koje paralelno funkcionišu. Različite grupe regulatornih RNK formiraju skriveni nivo internih
signala koji kontroliše ekspresiju genoma u normalnim fiziološkim uslovima, tokom razvića ali i u
u patološkim stanjima, uključujući i odbranu od virusa. Esencijalne su u regulaciji svih nivoa
ekspresije genoma: regulišu epigenetičku memoriju, transkripciju, splajsovanje RNK, editovanje
RNK, translaciju, lokalizaciju i stabilnost iRNK. Istraživanja regulatornih RNK, može se reći
novog RNK sveta, u poslednjih desetak godina su dovela do neverovatnih otkrića, koja su
bitno izmenila naše shvatanje o funkcionisanju eukariotskog genoma. Smatra se da bi
regulatoran mreža RNK mogla određivati naše složene karakteristike i predstvljati neistraženi
svet genetičkih varijacija unutar i između vrsta.
Regulatorni molekuli RNK se dele u dve grupe: duge nekodirajuće RNK i male
regulatorne RNK. Duge nekodirajuće RNK su dužine od 50 do više od 100 000 nukleotida (nt),
ne sadrže konzervisani okvir čitanja i uglavnom učestvuju u regulaciji strukture hromatina i
transkripcije. Male regulatorne RNK su dužine oko 20 do 30 nt koje u interakciju sa proteinima
familije Argonaut regulišu ekspresiju genoma na skoro svim nivoima, učestvuju u odbrani od
virusa i regulišu transpozone. Familija proteina Argonaut je evoluciono visoko konzervisana i
njeni članovi imaju ključnu ulogu u biogenezi i funkciji malih regulatornih RNK. Dve velike
subfamilije proteina Argonaut su proteini AGO i proteini PIWI (eng. P-element induced wimpy
testis). Male regulatorne RNK svoju funkciju ostvaruju putem RNK interferencije (RNKi),
mehanizma represije ili utišavanja ciljnih RNK koje pokazuju homologiju sa malim regulatornim
RNK. Utišavanje ekspresije gena RNKi ostvaruje se degradacijom ciljne RNK, translacionom
represijom ili destabilizacijom ciljne iRNK, ili epigenetičkim utišavanjem. Postoji sve više
podataka da male regulatorne RNK putem RNKi mogu, takođe, stimulisati translaciju.
Prema široko prihvaćenoj podeli, male regulatone RNK se dele u tri klase, koje se
međusobno razlikuju po biogenezi (poreklu, tipu i načinu obrade prekursornog molekula od
kojeg nastaju), grupama famillije proteina Argonaut sa kojima stupaju u interakciju i načinima
regulacije ciljnih molekula RNK (tabela 1). Male interferirajuće RNK (eng. small interfering
RNA, siRNA) su dužine 21 nt, nastaju obradom dugog dvolančanog prekursora sa
ribonukleazom Dicer, stupaju u interakciju sa proteinima AGO i dovode do degradacije ciljne
RNK (slika 1). Dugi dvolančani preursori siRNK su ili egzogeno uneti (virusna RNK ili sintetička
RNK) ili endogeno sintetisani (uglavnom sa ponovljenih sekvenci u genomu). siRNK učestvuju u
odbrani od virusa i utišavaju hromatina. MikroRNK (miRNK) su dugačke 21 do 23 nt, nastaju
obradom jednolančanog prekursora RNK u obliku ukosnice ribonukleazama Drosha i Dicer,
2
stupaju u interakciju sa proteinima AGO i najčeše dovode do translacione represije ili
destabilizacije iRNK (slika 1). MikroRNK imaju ključnu ulogu u posttranskripcionoj regulaciji
ekspresije gena. Piwi RNK (eng. PIWI associated RNA, piRNK) su dugačke 24 do 32 nt,
nastaju od jako dugačkih jednolančanih prekursora čija obrada ne uključuje enzim Dicer,
stupaju u interakciju sa proteinima PIWI i dovode do degradacije ciljnih RNK (slika 1). piRNK su
karakteristične samo za metazoe i imaju ključnu ulogu u utišavanju transpozna i razviću i
diferancijaciji polnih ćelija. Predstavljaju najmanje izučenu klasu malih regulatornih RNK.
Tabela 1. Klase malih regulatornih RNK
Vrsta Dužina
(nt) Prekursor
Obrada prekursora
Familija Argonaut
Mehanizam delovanja Funkcija
siRNK 21 Egzogena ili endogena duga dvolančana RNK
Dicer AGO Degradacija ciljne RNK Odbrana od virusa Utišavanje hromatina
miRNK 21-23 Jednolančana RNK koja formira strukturu ukosnice
Drosha i Dicer
AGO
Translaciona represija Destabilizacija iRNK Degradacija ciljne iRNK Translaciona aktivacija
Regulacija ekspresije gena
piRNK 24-32 Duge jednolančane RNK
Nepoznati PIWI Degradacija ciljne RNK Transalciona represija Translaciona aktivacija
Utišavanje transpozona Regulacija ekspresije gena
nt – nukleotid
3
Slika1. Klase malih regulatornih RNK: biogenza i interkcije sa proteinima familije Argonaut. Objašnjenje u tekstu.
1. MIKRORNK (MIRNK)
Mikro RNK utišavaju ekspresiju velike frakcije eukariotskog transkriptoma, čak jedne
trećine transkripata koji kodiraju proteine, regulišući široki spektar bioloških procesa: razviće,
rast ćelije, deobu i diferencijaciju, apoptozu, odgovor na stres. Funkcija miRNK se vezuje i za
razna patološka stanja, na primer, maligne bolsti. Mutacije u putu miRNK dovode do pormećaja
razvića, i često su letalne za embrion.
Da bi obavile svoju funkciju u posttranskripcionoj regulaciji ekspresiju gena, miRNK
stupaju u interakciju sa proteinima AGO. Svaki kompleks miRNK-AGO stupa u interakciju sa
specifičnom iRNK, prepoznajući je preko komplementranog baznog sparivanja između miRNK i
4
sekvence iRNK u 3'-netranslatirajućem regionu (eng. untranslated region, UTR). Dugački
3'-UTR-ovi eukariotskih gena sadrže brojne regulatorne sekvence koje predstavljaju važna
mesta za asembliranje proteinskih kompleksa i kompleksa RNK-proteini koji utiču na
lokalizaciju, translaciju i stabilnost iRNK. Kompleksi miRNK-AGO regulišu ciljne RNK
reprimiranjem translacije i/ili promovisanjem degradacije iRNK. Iako široko prihvaćeni kao
represori translacije, miRNK mogu imati i funkciju aktivatora translacije, i to u zavisnosti od
stanja ćelijskog ciklusa, odnosno fizioloških uslova: kada se ćelija normalno deli imaju funkciju
represora, a kada je zarobljena u G1 fazi imaju funkciju aktivatora.
1.1. Geni za mikroRNK
Mikro RNK su kodirane genima koji su nezavisno raspoređeni u genomu ili su delovi
introna gena koji kodiraju proteine ili introna gena za nekodirajuće RNK (slika 2a). Opisani su i
primeri kada se geni za miRNK nalaze u netranslatirajućim i kodirajućim delovima gena za
proteine (slika 2a), a neke miRNK mogu poticati i od obrađenih pseudogena. Poznato je i da se
neki geni za miRNK mogu nalaziti u ponovljenim sekvencama genoma, pre svega u različitim
transpozonima. Kod biljaka, neki geni za miRNK imaju introne, alternativno se splajsuju, a mogu
sadržati i alternativne signale za poliadenilaciju.
Slika 2. Geni za mikroRNK: a) geni za miRNK se nalaze u različitim regionima gena za proteine i nekodirajuće RNK, i to najčešće u njihovim intronima; b) jedan prkursor miRNK može sadržati sekvence za jednu ili dve različite miRNK (sekvence označene crvenim i plavim slovima).
U prepisanom primarnom tanskriptu, deo koji je prekursor za miRNK zauzima
karaktrističnu sekundarnu strukturu ukosnice. Jedan prekursor za miRNK može sadržati
sekvence za jedan ili dva različita molekula miRNK (slika 2b). Karakteristična struktura ukosnice
omogućava da se bioinformatičkim predikacijama identifikuju nove miRNK i njihovi ciljni geni.
MikroRNK identifikovane na ovaj način se označvaju sa prefiksom miR i rednim brojem. Potvrda
5
da je predviđena sekvenca ćelijska miRNK podrazumeva njeno identifikovanje u ćelijama, kao i
utvrđivanje da ekspresija ciljnog gena zavisi od prisustva ispitivane miRNK. U bazi podataka za
miRNK, MiRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/), postoji preko 300 eksperimentalno potvrđenih
miRNK u genomu čoveka i njihovih pretpostavljenih ciljnih iRNK. 2011. godine u bazi su
postojale 15 172 sekvence koje odgovarju bioinformatički predviđenim prekursorima miRNK u
genomima 142 vrste, za koje se pretpostavlja da bi mogle eksprimirati 17 341 zrelu miRNK.
2012. godine u bazi postoji 18 226 sekvenci koje odgovaraju bioinformatički predviđenim
prekursorima miRNK u genomima 168 vrsta i koje bi mogle eksprimirati 21 643 zrelu miRNK
1.2. Biogeneza mikroRNK i formiranje utišavajućeg kompleksa RISC
Pregled (slike 1 i 3) — Funkcionalne miRNK su obično dugačke 21 do 23 nt i nastaju od
prekursornog molekula, primarne miRNK (pri-miRNK) koja ima strukturu ukosnice. Pri-miRNK
se transkribuje ili sa nezavisnih gena za miRNK ili je deo introna gena koje transkribuje Pol II. U
nukleusu, delovanjem ribonukleaze Drosha od pri-miRNK nastaje prekursor miRNK
(pre-miRNK), koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je u citoplazmi supstrat za Dicer,
čime nastaje dvolančana miRNK, koja stupa u interkaciju sa proteinima AGO. Kompleks
miRNK-AGO, sa dodatnim proteinima, formira utišavajući kompleks miRISC, koji reprimira iRNK
koja ima sekvencu komplementarnu sa miRNK. Neperfektno bazno sparivanje miRNK i ciljne
iRNK dovodi do translacionog utišavanja i destabilizacije iRNK, dok perfektno bazno sparivanje
miRNK i ciljne iRNK dovodi do endonukleolitičke degradacije iRNK.
Drosha i Dicer su endonukleaze iz familije RNaza III. Ova familija RNaza je specifična
za dvolančane RNK i pomoću dva simetrična RNazna domena seče oba lanca RNK tako da
ostavlja jednolančani 3'-kraj dužine 2 nt (eng. 3'-overhang) u nastalom dvolančanom RNK
produktu (slike 4 i 5). Oba enzima imaju vezivne domene za dvolančanu RNK (eng. double
strand RNA binding domains, dsRBDs), duge oko 65 aminokiselina, pomoću kojih prepoznaju
strukturu dvolančane RNK i vezuju se za dvolančanu RNK. Mesto sečenja selektuju merenjem,
a ne prepoznavanjem specifične sekvence RNK. Drosha sadrži još dva funkcionalna domena za
protein-protein interakcije: domen P, bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer sadrži još
tri funkcionalna domena. Domen PAZ specifično prepoznaje jednolančani 3'-kraj dužine 2 nt i
vezuje ga. Naziv je dobio po proteinima u kojima se nalazi (Piwi, Argonaute i Zwille). Funkcija
druga dva domena, DEAD-boks RNK helikaznog domena i domena DUF (eng. domain of
unknown function), nije poznata. Genomi biljka ne sadrže ortolog gena za Drosha, i svi koraci u
biogenezi miRNK kod Arabidopsis thaliana se obavljaju pomoću jednog od četri proteina sličnih
Diceru (eng. Dicer-like proteins). Kičmenjaci i C. elegans sadrže po jedan gen za Dicer, D.
melanogaster sadrži dva, dok biljke sadrže veći broj proteina sličnih Diceru, čiji proteinski
produkti obavljaju specijalizovane funkcije u kompleksu sa različitim proteinima koji se vezuju za
dvolančane RNK.
6
Slika 3. Biogeneza i put mikroRNK (miRNK): primarna miRNK (pri-miRNK), prepisana sa nezavisnih gena za miRNK obrađuje se u dva koraka ribonukleazama Drosha i Dicer. U nukleusu, delovanjem kompleksa Drosha-DGCR8 od pri-miRNK nastaje prekursor miRNK (pre-miRNK), koji se transportuje u citoplazmu. Pre-miRNK je supstrat za kompleskDicer-TRBP čime nastaje dvolančana miRNK, koja stupa u interkaciju sa proteinima AGO. Kompleks miRNK-AGO reprimira iRNK koje imaju sekvence komplementarne sa miRNK. Perfektno bazno sparivanje miRNK i ciljne iRNK dovodi do endonukleolitičke degradacije iRNK, dok neperfektno bazno sparivanje dovodi do translacionog utišavanja i/ili deadenilacije iRNK. Alternativni put biogeneze miRNK iz mirtrona - prekursora miRNK kodiranog intronom ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8 jer u potpunosti odgovara pre-miRNK.
Drosha i Dicer svoje funkcije obavljaju u kompleksu sa proteinima (kofaktorima). Partneri
Drosha su protein pasha kod D. melanogaster i protein DGCR8 (eng. DiGeorge syndrome
critical region gene 8) kod sisara, dok je partener Dicera produkt gena loquacious kod
Drosophile melanogaster i protein TRBP (eng. TAR RNA binding protein) kod sisara. Ovi
proteini, takođe, sadrže vezivne domene za dvolančanu RNK, a DGCR8 sadrži i WW domen za
interakcije proten-protein.
7
Slika 4. Domenska organizacija proteina koji učestvuju u biogenezi miRNK: svi proteini imaju jedan ili više dmena za prepoznavanje i vezivanje dvolančane RNK (plavi boksovi). Drosha i Dicer imaju simetrične katalitičke RNazne domene odgovorne za RNaza III endonukleolitičku reakciju. Drosha sadrži još dva funkcionalna domena za protein-protein interakcije - domen P, bogat Pro, i domen RS, bogat Arg i Ser. Dicer sadrži još tri funkcionalna domena. Domen PAZ, koji vezuje 3'-kraj pre-miRNK dugačak 2 nt, i domene nepoznate funkcije - DEAD-boks RNK helikazne domene i domen DUF. Protein DGCR8 sadrži i domen WW odgovoran za interakcije protein-protein.
Pri-miRNK se savija u dvolančanu strukturu oblika ukosnice koja sadrži dršku i kratku
jednolančanu petlju. Dvolančana bazno sparena drška je dugačka 33 bp (tri helijačna okreta u
dvolančanoj RNK) i sadrži samo nekoliko pogrešno sparenih baza (slika 5a). Region drške
ukosnice sadrži dva funkcionalna dela: donji deo drške, približne dužine 11 bp, i gornji deo
drške, približne dužine 22 bp (slike 5a i b). Na vrhu drške je petlja različite veličine (obično oko
10 nukleotida), čija sekvenca nije bitna za obradu.
U nukleusu, kompleks Drosha-DGCR8, poznat i kao mikroprocesorni kompleks, uvodi
dva prekida u pri-miRNK oslobađajući samu strukturu ukosnice, koja predstavlja pre-miRNK. Za
obradu kompleksom Drosha-DGCR8 neophodna je jednolančana RNK koja ograničava 5'- i
3'-krajeve drške i dvolančana drška. Granica jednolančane i dvolančane RNK u pri-miRNK u
velikoj meri određuje mesto sečenja, jer Drosha uvodi prekide na mestima koja su po 11 bp
udaljena od te granice, odnosno između gornjeg i donjeg funkcionalnog dela drške. Sa dva
uvedena prekida formira se pre-miRNK dugačka oko 65 do 70 nukleotida, koja je izgrađena iz
drške (dvolančanog regiona dužine 22 bp koji pravi dva helijačna okreta), petlje i jednolančanog
3'-kraja dužine 2 nt, koji je značajan za prepoznavanje pre-miRNK od stane Dicera (slika 5b).
Pored kanonskog puta biogeneze miRNK, opisani su i alternativni putevi. Neki introni
kod Cenorabditis elegans, D. melanogaster i sisara sadrže gen za miRNK koji u potpunosti
odgovara pre-miRNK u pogledu dužine i strukture, tako da obrada ovih gena za miRNK, pozatih
pod imenom mirtroni, ne zahteva učešće kompleksa Drosha-DGCR8, već se samim
iskrajanjem mirtrona splajsozomom formira pre-miRNK (slike 1 i 3). Takođe, neke klase malih
nukleolarnih RNK (snoRNK) obrađuju se do malih RNK koje deluju slično kao miRNK.
8
Slika 5. Biogeneza mikroRNK (miRNK): a) primarna miRNK (pri-miRNK) karakteristične strukture ukosnice u kome je dvolančani deo dugačak približno 33 bp, sa označenim mestima sečenja za Drosha i Dicer; b) Drosha se zajedno sa proteinom DGCR8 vezuje za pri-miRNK i uvodi dva jednolnčana prekida u dršci i to 11 nukleotida od granice jednolančane i dvolančane RNK, formirajući prekursora miRNK (pre-miRNK); c) Dicer ima oblik sekire, u kojoj dno drške sekire predstavlja domen PAZ, samu dršku region linker, dok je sečivo predstavljeno sa dva simetrična RNazna domena.
Pre-miRNK se transportuje u citoplzmu pomoću eksportina 5 (slike 1 i 3), gde dolazi do
druge reakcije sečenja RNK katalizovane Dicerom, koji se nalazi u kompleksu sa proteinom
TRBP. Po svojoj trodimenzionalnoj strukturi Dicer liči na sekiricu (slika 5c). Domen PAZ je na
kraju drške sekirice, gde formira vezivni džep za jednolančani 3' kraj dvolančanog dela
pre-RNK. Region između domena PAZ i RNaznih domena formira dršku sekirice, i sadrži
pozitivno naelektrisanu vezivnu površinu za RNK. Region na vrhu, označen kao "sečivo", sastoji
se od dva RNazna domena, raspoređenih kao simetričan dimer. Svaki RNazni domen sadrži
aktivno mesto i odgovoran je za sečenje jednog od dva lanca iz supstrata RNK. Dicer deluje
samo na dvolančanu RNK, bez obzira na njenu sekvencu, i kida je na udaljenosti od 22
nukleotida od njenog kraja.
9
Rezultat aktivnosti proteina Drosha i Dicer je dvolančana miRNK dužine od 21 do 23
bp, koja ima jednolančane 3'-krajeve dužine 2 nt (jedan nastao aktivnošću Droshe, a drugi
aktivnošću Dicera). Jedan lanac iz dvolančane miRNK se selektuje da bude funkcionalna
jednolančana zrela miRNK, i on je označen kao lanac "vodič", dok se drugi lanac degraduje, i
označen ja kao lanac "putnik". Po opštem pravilu, lanac čiji se 5'-kraj nalazi u termodinamički
manje stabilnom delu dvolančane miRNK se selektuje da bude Lanac "vodič". Sve je veći broj
primera da obe "ručice" iz pre-miRNK daju zrele miRNK, od kojih svaka ima svoj set ciljnih
iRNK.
MikroRNK formiraju ribonukleoproteinske čestice označene kao
mikro-ribonukleoproteinske čestice (miRNPs) ili utišavajući kompleksi miRISCs (eng.
miRNA-induced silencing complexes). Ključne proteinske komponente kompleksa miRISC i
puta RNKi su proteini AGO. Formiranje miRISC je dinamičan proces, obično povezan sa
obradom pre-miRNK pomoću Dicera, ali svi detalji procesa nisu poznati. Kratka dvolančana
miRNK nastala aktivnošću Dicera, se inkorporira u miRISC. Dvolančana RNK denaturiše kako
bi nastao lanac "vodič", dok lanac "putnik" ili biva degradovan proteinom AGO ili se kompletan
otklanja iz kompleksa RISC i zatim degraduje.
Proteini familije Argonaut su visoko-specijalizovani proteini za vezivanje malih
regulatornih RNK. Svoje ime su dobili po fenotipu AGO-knockout biljke Arabidopsis thaliana koji
podseća na krake hobotnice Argonauta argo. Familija proteina Argonaut je konzervisana u sva
tri domena živih organizama. Njihova uloga kod bakterija i arhea, koje nemaju put RNKi, nije
poznata. Interesantno je da model organizam Saccharomyces cerevisiae nema proteine
Argonaut i puteve RNKi.
Na osnovu homologije sekvence članovi familije proteina Argonaut dele se u dve velike
subfamilije. Jedna subfamilija se označava AGO po srodnosti sa proteinom AGO1
Arabidopsisa, a druga se naziva subfamilija PIWI po srodnosti sa proteinom PIWI Drosophile
(videti kasnije kod piRNK). Subfamilija proteina AGO kod sisara i čoveka sadrži četri člana:
AGO1, AGO2, AGO3 i AGO4. Oni se ubikvitno eksprimiraju i asociraju kako sa miRNK, tako i
sa siRNK.
Argonaut proteini su mali (~100 kD) i karakterišu ih domeni PAZ, PIWI i MID, a N-kraj
proteina pokazuje najveću heterogenost među članovima (slika 6). Poznate su kristalografske
strukture proetina Argonaut kod bakterija i arhea, ali ne i kod sisara. Domen PAZ, kao i kod
proteina Dicer, formira specifični džep koji vezuje 3'-jednolančani kraj dužine 2 nt lanca "vodiča"
iz dvolančane male regulatorne RNK. Domen PIWI je odgovoran za endonukleolitičku aktivnost
i podseća na bakterijsku RNazu H, koja specifično seče RNK u hibridu DNK-RNK. Dok nisu bile
poznate komponente miRISC kompleksa opisivalo se da on ima slicer aktivnost. Nakon otktića
domena PIWI proteina Argonaut postalo je jasno da je slicer aktivnost vezana za sam protein
Argonaut. Domen PIWI svih proteina Argonaut nije endonukleolitički kompetentan. Među
proteinima AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost. Domen MID se
nalazi između domena PAZ i PIWI. On formira specifičan džep koji vezuje 5'-fosfatni kraj male
regulatorne RNK.
10
Slika 6. Domenska organizacija proteina AGO i struktura kompleksa miRNK-AGO. Proteini Argonaut se karakterišu domenima PAZ, MID i PIWI, dok N-kraj pokazuje heterogenost između članova familije. Domen PAZ specifično prepoznaje 3'-kraj lanca "vodiča" miRNK i vezuje ga. Domen MID vezuje 5'-fosfatni kraj lanca "vodiča". Domen PIWI je sličan RNazi H i kod nekih članova poseduje endonukleolitičku aktivnost. Kompleks miRNK-AGO2 sisara - perfektno komplemntarno sparivanje miRNK i ciljne iRNK dovodi do endonukleolitičkog sečenja iRNK. AGO2 je jedini član subfamilije AGO sisara koji je endonukleolitički kompetentan.
Kompleks mala regulatorna RNK-Argonaut protein ima strukturu koja se sastoji iz dva
lobusa (slika 6). Jedan lobus formiraju Domen PAZ i N-terminalni domen, dok drugi lobus
fomriraju domeni MID i PIWI. Protein ostvaruje kontakt sa lancem "vodičem" uspostavljenjem
intrakcija sa šećrno-fosfatnom okosnicom, ostavljajući tako baze da se spare sa
komplemantarnim bazama u ciljnoj iRNK. Struktura kompleksa ukazuje da se ciljna iRNK
sparuje sa lancem "vodičem" barem u regionu semena (videti ksanije), ali da ne dodiruje
protein.
Pored proteina AGO, miRISC sadrže i dodatne proteine koji imaju funkciju u formiranju
miRNP ili imaju funkciju regulatora ili efektora u posredovanju represivne ili aktivirajuće funkcije
miRNK. Takvi proteini su, na primer, GW182 i FMRP. GW182 (proteinski marker P tela) stupa u
interkaciju sa proteinima AGO u miRNP i neophodan je za indukciju destabilizacije iRNK. FMRP
(eng. fragile X mental retardation protein) i njegov ortolog kod D. melanogaster, dFXR, koji
predstavljaju proteine koji se vezuju za RNK i deluju kao modulatori translacije, posebno u
neuronima, dovode se u vezu sa stimulacijom translacije od strane miRISC.
Formiran kompleks miRISC sa lancem "vodičem" je spreman da prepozna ciljnu iRNK i
pokrene njenu endonukleolitičku degradaciju, utišava njenu translaciju, dovede do njene
destabilizacije (deadenilacije i dalje egzonukleolitičke degradacije), ili da aktivira translaciju.
Sudbina ciljne iRNK određene je pre svega njenim stepenom komplemenatrnosti sa miRNK i
tipom asociranog proteina AGO.
11
1.3. Principi interakcije miRNK-iRNK
MikroRNK stupa u interakciju sa ciljnom iRNK posredstvom baznog sparivanja. Kod
biljaka, većina miRNK se skoro perfektno sparuje sa svojim ciljnim iRNK. Suprotno, miRNK
metazoa se uglavnom neperfektno sparuju sa ciljnom iRNK, prateći nekoliko pravila (slika 7).
Najznačajnije i najrigoroznije pravilo podrazumeva perfektno i kontinuirao bazno
sparivanje regiona miRNK između nukleotida 2 i 8 sa ciljnom iRNK. Ovaj region miRNK
označen je kao "seme", i preko njega započinje interakcija miRNK i iRNK. Adeninski ostatak u
iRNK naspram pozicije 1 miRNK, ili adeninski ili uracilski ostaci naspram pozicije 9 miRNK,
doprinose poboljšanju interakcije, iako nije neophodno da se bazno spare sa miRNK. Sledeće
pravilo je da pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu
dupleksa miRNK-iRNK. Na ovaj način se sprečava endonukleolitičko kidanje posredovano
proteinom AGO. Treće pravilo kaže da mora postojati razumna komplementarnost i u 3' polovini
miRNK, kako bi se interakcija sa iRNK stabilizovala. Pogrešno sparene baze i izbočine se u
ovom regionu uglavnom tolerišu, iako ispravno bazno sparivanje, posedno u regionu od
nukleotida 13 do 16 miRNK, postaje značajno kada podudaranje u regionu "semena" nije
optimalno.
Slika 7. Principi interakcije miRNK-iRNK: 1) region "semena" miRNK (od nukleotida 2 do 8) je ključan za interakciju sa ciljnom iRNK, 2) pogrešno sparene baze i izbočine mogu biti prisutne samo u centralnom regionu dupleksa miRNK-iRNK, 3) 3'kraj miRNK pokazuje razumnu komplementarnost sa ciljnom iRNK.
Faktori koji doprinose manjem struktuisanju 3'-UTR-ova i čine mesta vezivanja miRNK
dostupnijim, na primer regioni bogati parovima AU, mogu poboljšati interakciju miRNK i iRNK i
doprineti efikasnijoj represiji posredovanoj sa miRNK. Sa nekoliko izuzetaka, mesta vezivanja
za miRNK kod metazoa se nalaze u 3'-UTR-ovima i prisutna su većem broju kopija.
Značajno je da su višestruka vezivna mesta za istu ili različite miRNK neophodna za efikasnu
represiju. Kada se nalaze blizu jedno drugom (na udaljenosti od 10 do 40 nukleotida) ispoljavaju
kooperativno delovanje, što znači da njihov zajednički efekat prevazilazi sumu pojedinačnih
efekata.
12
1.4. Modeli utišavanja iRNK posredovan sa miRNK
Efekti miRNK na ciljne molekule RNK određen je stepenom komplementarnosti miRNK i
ciljne RNK: 1) ukoliko se miRNK perfektno sapri sa iRNK indukuje se degradaciju ciljne RNK
endonukleolitičkim kidanjem na sredini perfektnog dupleksa miRNK-iRNK; 2) ukoliko je
sparivanje miRNK i iRNK neperfektno dolazi do translacione represije i/ili destabilizacije iRNK.
1.4.1. Model endonukleolitičkog sečenja iRNK
Kod biljaka i, veoma retko kod životinja, protein AGO iz kompleksa miRISC indukuje
degradaciju ciljne iRNK endonukleolitičkim sečenjem. Lanac vodič iz kompeksa miRISC se
bazno sparuje sa ciljnom iRNK, a arhitektura kompleksa je takva da ovo vezivanje pozicionira
aktivno mesto domena PIWI na odgovarajući način da može da iseče ciljnu iRNK. Ova aktivnost
proteina AGO se često u literaturi označava kao slicer activity. Sečenje se dešava približno na
sredini dupleksa miRNK-iRNK, između nukleotida 10 i 11 miRNK (slika 6). Među proteinima
AGO sisara, samo AGO2 ima očuvanu endonukleaznu aktivnost, koji zbog ove osobine jedini
učestvuje i u putu RNKi posredovane sa siRNK.
1.4.2. Modeli utišavanja translacije destabilizacijom i degradacijom iRNK posredovani
sa GW1 182
Kod životinja, najveći broj miRNK je samo delimično komplementaran svojim ciljnim
iRNK. U velikom broju slučajeva proteini AGO nisu dovoljni da sami posreduju u reprimiranju
iRNK. U kompleksu sa proteinima familije GW 182 mogu dovesti do destabilizacije iRNK.
GW 182 stupa u interakciju sa proteinima AGO i proteinima koji se vezuju za poli(A) rep
(PABPC1). Smatra se da interakcija GW 182 sa PABPC1 doprinosi utišavanju na dva načina
(slika 9). Prema jednom modelu proteini GW 182 dovode do smanjenja efikasnosti translacije
interferirajući sa cirkularizacijom iRNK, što vodi destabilizaciji iRNK. Prema alternativnom
modelu interakcija GW 182-PABPC1 ubrzava deadenilaciju iRNK (koja može i ne mora biti
posledica narušavanja cirkularizacije iRNK). Usled deadenilacije iRNK smanjuje se efikasnost
translacije, dolazi do otklanjanja 5'-kape i egzonukleolitičke degradacije u smeru 5'3'. Da bi
razumeli ove modele potrebno je upoznati se sa domenskom organizacijom proteina PABPC1 i
GW 182.
Protein PABPC1 je visoko konzervisani protein eukariota koji se vezuje za poli-A rep
iRNK i služi kao platforma za vezivanje različitih proteina uključenih u regulaciji translacije i
degradacije iRNK. Ortolozi proteina PABPC1 se karakterišu sa sledećim domenima: četri
visoko-konzervisana motiva za prepoznavanje i vezivanje za jednolančanu RNK (eng. RNA
recognition motifs, RRM) na N-kraju, označena kao RRM1-RRM4, nestruktuisanim linkerom
bogatim prolinom, i konzervisanim domenom na C-kraju, označenom kao MLLE. Preko motiva
RRM, PABPC1 stupa i u interakciju sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G (eIF4G), koji
uspostavlja interakciju sa 5'-kapom iRNK za koju je vezan eIF4E. Interakcija PABPC1 i eIF4G
dovodi do cirkularizacije iRNK i stabilizuje vazivanje eIF4E za 5'-kapu (slika 8). Struktura
zatvorene petlje stimuliše translaciju iRNK i štiti krajeve iRNK od degradacije. Proteini koji
učestvuju u translaciji i degradaciji iRNK, a sadrže motive PAM1 i PAM2 (eng. PABP-interacting
13
N-GW M-GW C-GW
P-body targeting
motif 1 and 2) uspostavljau interakcije sa domenima na N- i C-krajevima proteina PABPC1,
redom.
Slika 8. Domenske organizacije proteina PABPC1 i GW 182: a) Ortolozi proteina PABPC1 se karakterišu sa: četri visoko-konzervisana motiva za prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motifs, RRM) na N-kraju, označena kao RRM1-RRM4, nestruktuisanim linkerom bogatim prolinom, i konzervisanim domenom na C-kraju, označenom kao MLLE. Preko motiva RRM na svom N-kraju, PABPC1 stupa u interakciju sa eukariotskim inicijacionim faktorom 4G (eIF4G), koji uspostavlja interakciju sa 5'-kapom iRNK za koju je vezan eIF4E. Ova interakcija PABPC1 i eIF4G dovodi do cirkularizacije iRNK i stabilizuje vazivanje eIF4E za 5'-kapu. Proteini koji učestvuju u translaciji i degradaciji iRNK, a sadrže motive PAM1 i PAM2 uspostavljau interakcije sa domenima na N- i C-krajevima proteina PABPC1, redom. b) Proteini GW 182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četri nestruktuisana regiona i dva strukturna domena. Nestruktuisani regioni uključuju regione N-GW, M-GW i C-GW, koji redom predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), kao i region bogat glutaminom (Q). Između ovih regiona nalaze se dva strukturna domena: centralni domen asociran sa ubikvitinom (domen UBA) i motiv za prepoznavanje RNK na C-kraju (domen RRM, eng. RNA recognition motif). U okviru regiona M-GW nalazi se motiv sličan motivu PAM2 (eng. PABP-interacting motif 2, PAM2), dok kraj regiona M-GW i regiona C-GW sadrže sekvencu nalik na motiv PAM1. Motivi PAM1 i PAM2 služe za interkacije sa PABPC1.
Proteini GW 182 imaju karakterističnu strukturu koja se sastoji iz četri nestruktuisana
regiona i dva strukturna domena (slika 8). Nestruktuisani regioni uključuju regione N-GW,
M-GW i C-GW, koji redom predstavljaju N-terminalni, središnji i C-terminalni region sa
ponovljenim motivima GW (Gly-Trp), kao i region bogat glutaminom (Q). Između ovih regiona
nalaze se dva strukturna domena: centralni domen asociran sa ubikvitinom (domen UBA) i
motiv RRM za prepoznavanje i vezivanje jednolančane RNK na C-kraju.
14
Dva regiona proteina GW 182 imaju esencijalnu ulogu u utišavanju translacije: 1)
N-terminalni region, koji sadrži veći broj ponovaka Gly-Trp (GW) (domen N-GW) direktno vezuje
protein AGO, i 2) bipartitni domen za utišavanje, koji obuhvata regione M-GW i C-GW i
promoviše translacionu represiju i degradaciju ciljnih molekula RNK. U okviru bipartitnog
domena za utišavanje nalaze se dva motiva koja mogu uspostaviti interkciju sa PABPC1. U
regionu M-GW nalazi se motiv koji pokazuje sličnost u sa PAM2, i vezuje se za domen MLLE na
C-kraju PABPC1. U zadnjem delu regiona M-GW i u regionu C-GW nalazi se manje definisana
sekvenca koja funkcionalno imitira motiv PAM1. Motiv sličan PAM1 posreduje u vezivanju
proteina GW 182 za motive RRM na N-kraju proteina PABPC1. Dakle, proteini GW 182 sadrže
dva različita domena preko kojih se vezuju za protein PABPC1: motiv sličan motivu PAM1 i
motiv PAM2. Sa druge strane, protein PABPC1 ima dva mesta vezivanja za proteine GW 182:
motive RRM na N-kraju (za PAM1) i domen MLLE na C-kraju (za PAM2) (slika 8).
Činjenica da bipartitni domen za utišavanje proteina GW 182 stupa u interakciju i sa N- i
sa C-terminalnim domenima PABPC1 ukazuje da GW 182 interferira sa funkcijom PABPC1 u
translaciji i/ili stabilizaciji iRNK preko barem dva različita modela (slika 9).
Slika 9. Translaciona represija i destabilizacija iRNK posredovana sa miRNK-AGO-GW 182 zasnovana je na interakcijama GW 182 sa proteinima PABPC1. Prema jednom modelu GW 182 uspostavlja interakciju sa domenom PABPC1 za koji se vezuju i eIF4G, tako da postoji kompeticija GW 182 i eIF4G za vezivanje za PABPC1. Kada se GW 182 veže za PABPC1 dolazi do narušavanja cirkularne strukture iRNK i utišavanja translacije. Prema drugom modelu GW 182 uspostavlja interakciju sa drugim domenom PABPC1, tako da se ne narušava cirkularna struktura iRNK, ali se formira platforma za vezivanje kompleksa CAF1-CCR4-NOT, koji dovodi do deadenilacije. Deadenilacija je dalje praćena
otklanjanjem 5'-kape pomoću DCP2 i egzonukleolitičkom degradacijom u smeru 5'3' pomoću proteina XRN1. Protein DCP2 zahteva dodatne proteine za potpunu aktivnost i/ili stabilnost, kao što su protein DCP1, pojačivač za otklanjanje 5'-kape 4 (eng. enhancer of decapping 4, EDC4) i RNK helikaza DDX6 (eng. DEAD-box protein 6).
Prema jednom modelu, za motive RRM na N-kraju PABPC1 kompetiraju proteini
GW 182 i eukariotski inicijacioni faktor 4G (eIF4G), koji se vezuje za 5'-kapu iRNK preko eIF4E.
Vezvianje eIF4G za PABPC1 dovodi do stvaranja strukture zatvorene petlje iRNK, koja
stimuliše translaciju. Vezivanje motiva sličnog motivu PAM1 proteina GW 182 za PABPC1
15
narušava kružnu strukturu iRNK, što smanjuje efikasnost translacije i olakšava njihovu
degradaciju (slika 9). Drugi model predviđa da dolazi do interkacije motiva PAM2 utišavajućeg
domena GW 182 sa domenom MLLE PABPC1, što ne utiče direktno na ciruklularizaciju iRNK,
ali izgleda interferira sa funkcijom PABPC1. Smatra se da bi ovakva interakcija GW 182 mogla
da redukuje afinitet PABPC1 za poli(A) rep. Ovo bi moglo indirektno interferirati sa
cirkularizacijom iRNK i učiniti poli(A) rep dostupan deadenilazama. Slično nekim drugim
proteinma koji poseduju motiv PAM2, i interakcija PAM2 motiva GW 182 sa PABPC1 bi mogla
stvoriti platformu za vezivanje kompleksa CAF1-CCR4-NOT, glavnog kompleksa za
deadenilaciju u citoplazmi. Deadenilacija je dalje praćena otklanjanjem 5'-kape pomoću proteina
za otklanjanje 5'-kape (DCP2), koji u ciklusima čini iRNK osetljivom na egzonukleolitičku
degradaciju u smeru 5'3' pomoću proteina XRN1 (slika 9).
1.4.3. Drugi modeli translacionog utišavanja pomoću miRNK
Eksperimentalni podaci ukazuju da efekat miRNK na sintezu proteina, pored
destabilizacije i degradacije iRNK u kojim posreduje protein GW 182, može biti ostvaren i
drugim mehanizmima represije translacije. Još uvek nije poznato da li se drugi mehanizmi
represije translacije ostvaruju tokom inicijacije translacije i/ili u koracima nakon incijacije. Za
sada najviše eksperimentalnih podataka podržava model represije transalcije u koraku
inicijacije.
Model po kome miRNK dovode do represije translacije u koraku inicijacije potiče iz
eksperimenata koji su pokazali da je struktura 5'-kape esencijalna za translaciono utišavanje sa
miRNK. Pokazano je da translacionoj represiji sa miRNK mogu podleći samo one one iRNK
koje sadrže funkcionalnu 5'-kapu. Poznato je da mnogi faktori koji se vezuju za 3'-UTR iRNK
ispoljavaju svoje inhibtorne efekte na incijaciju transalcije regrutovanjem proteina koji ometaju
interakciju eIF4E-eIF4G (na primer, proteina 4eBPs), ili direktnim vezivanjem za 5'-kapu.
Inhibitorni faktori koji se dirketno vezuju za 5'-kapu ne stupaju u interkaciju sa eIF4G i ne mogu
promovisati formiranje 40S inicijacionog kompleksa, a takve iRNK ne formiraju cirkularne
strukture. Nedavno je pokazano da centralni domen proteina AGO2 sadrži ograničenu
homologiju sa onim regionom proteina eIF4E koji se vezuje za 5'-kapu. Najznačajnije je da ova
homologija uključuje dva aromatična aminokiselinska ostatka (slika 10), koja su ključna za
vezivanje eIF4E za 5'-kapu, kao i za vezivanje drugih proteina koji stupaju u interakciju sa
5'-kapom.
Slika 10. Domenska organizacija proteina AGO2 čoveka. AGO2 sadrži domen DUF (nepoznate funkcije), domen PAZ (specifično prepoznaje i vezuje 3'-kraj lanca vodiča miRNK) i domen PIWI (domen sličan RNazi H koji je endonukleolitički kompetentan). Region koji razdvaja domene PAZ i PIWI sadrži dve aromatične aminokiseline (fenilalanin na pozicijama 470 i 505) u kojima mutacije sprečavaju translacionu represiju i vezivanje AGO2 za 5'-kapu iRNK.
16
Zbog ove osobine AGO2 i drugi srodni proteini bi mogli biti u kompeticiji sa eIF4E
za vezivanje za 5'-kapu, i na taj način reprimirati translaciju u koraku inicijacije (slika 11).
Ovakav model donekle objašnjava potrebu za većim brojem miRISC da bi se postigla značajna
represija pomoću miRNK. Naime, veći broj kopija miRISC, u okviru kojih se nalazi AGO protein
sa manjim afinitetom za 5'-kapu u odnosu na eIF4E, bi povećao verovatnoću asocijacije AGO
sa 5'-kapom. Ovaj model zahteva dalje ekspreimrntalnu verifikaciju.
Smatra se da bi kompleksi miRICS mogli reprimirati inicijaciju translaciju i sprečavanjem
vezivanja velike subjedinice ribozoma (60S) (slika 11).
Suprotno navedenim modelima, su rezultati studija koji pokazuju da i iRNK koje nemaju
poli-A rep mogu podleći translacionoj represiji.
Slika 11. Modeli delovanja miRNK: utišavajući kompleks miRISC vezan za 3'-UTR iRNK može pokrenuti deadenilaciju i degradaciju ciljne iRNK uz posredovanje proteina GW 182 (gornji levi deo slike). Alternativno, miRISC može reprimirati inicijaciju translacije bilo u koraku preoznavanja 5'-kape ili u koraku pridruživanja 60S subjedinice ribozoma (donji levi deo slike). iRNK reprimirana deadenilacijom ili u fazi inicijacije translacije se sklanja u citoplazmatićne RNK granule (na primer, P tela), gde će se degradovati ili dalje čuvati. Represija iRNK sa miRISC može da se desi i u fazama nakon inicijacije translacije usled usporene elongacije ili spadanja ribozoma (slika dole desno). miRNK može reprimirati produkciju proteina pokretanjem proteolitičke degradacije rastućeg polipeptida (slika desno gore). Proteaze koja bi učestvovala u ovom procesu je još uvek nepoznata.
Kosedimentacija značajne frakcije ćelijskih miRNK ili proteina AGO sa polizomima u
mnogim studijama podržava pretpostavku da bi translaciona represija sa miRNK mogla da se
ostvaruje i u koracima nakon inicijacije transalcije. Međutim na koji bi način miRNK mogle da
modulišu elongaciju ili terminaciju translacije još uvek nije poznato. Predloženi su modeli u
17
kojima dolazi ili do usporavanja elongacije transalcije ili do spadanja ribozoma sa iRNK (eng.
ribosome drop off) (slika 11). Represija ciljne iRNK sa jednom miRNK je generalno samo
parcijalna, tako da vezivanje jednog kompleksa miRISC za iRNK često nema nikakav efekat na
represiju. Stoga, kosedimentacija miRISC sa polizomima ne bi morala neophodno da ukazuje
na represiju nakon incijacije translacije, već bi mogla jednostavno odražavati asocijaciju miRISC
sa iRNK koja podeležu produktivnoj translaciji. Dalje, ukoliko se represija translacije dešava i
nakon koraka inicijacije, mehanizmi koji dovode do represije translacije u koraku inicjacije i
nakon inicijacije ne moraju međusobno da se isključuju. Moguće je da se represija inicijacije
transalcije uvek dešava, ali u slučavjevima kada se desi i represija na nivou elongacije, zastoj
ribozoma bi mogao maskirati efekat blokiranja inicijacije.
Asocijacija reprimiranih iRNK sa translaciono kometnentnim ribozomima je dovela do
prepostavke da se sa ovakvih iRNK polipeptidi kontinuirano sintetišu ali se ne akumuliraju, jer
miRISC regrutuju proteazu koja brzo degraduje rastuće polipetide (slika 11). Ovaj model za
sada ima najmanje ekperimentalnih dokaza. Pokazano je da inhibitori proteazoma nemaju
efekat na represiju posredovanu sa miRNK, tako da bi ovaj model uključivao neku još
neidentifikovanu proteazu.
1.5. MikroRNK kao aktivatori transalcije
Izgleda da se efekat miRNK na ekspresiju proteina ne ostvaruje samo različitim
načinima represije translacije, s obzrom da je pokazano da miRNK mogu stimulisati translaciju.
Drugim rečima, miRNK imaju dvostruku funkciju jer služe i kao represori i kao aktivatori
translacije ciljnih iRNK, i to u zavisnosti od stanja ćelijskog ciklusa, odnosno fizioloških uslova.
Kada se ćelija normalno deli imaju funkciju represora, a kada je zarobljena u G1 fazi imaju
funkciju aktivatora.
U kulturama ćelija sisara pokazano je da 3'-UTR iRNK za TNF-α (eng. tumor-nekrosis
factor α) stimuliše translaciju u uslovima nedostatka seruma, u kome se nalaze hranljivi sastojci
i faktori rasta, što dovodi do zarobljavanja ćelija u G1 fazu. Ova stimulacija translacije je zavisna
od miRNK miR369-3 i proteina AGO2. U odsustvu miR369-3 ne dolazi do stimulacije translacije.
U ostalim fazama ćelijskog ciklusa miR369-3 reprimira translaciju. Za let7 miRNK je, takođe,
pokazano da ima ulogu aktivatora translacije kada dođe do zarobljavanja ćelije u G1 fazi, dok u
fazama normalnog ćelijskog ciklusa ima dobro izčenu funkciju represora transalcije.
Smatra se da fiziološki uslovi utiču na regrutovanje regulatornih proteina koji mogu
promeniti efekat miRNK. Stimulacija translacije uključuje promenu proteina koji se regrutuju na
iRNK pomoću kompleksa miRNK-AGO (slika 12). Kada je ćelija zarobljena u G1 fazi ćelijskog
ciklus, kompleks miRNK-AGO regrutuje protein FXR1 i stimuliše se translacija. Da li se na
kompleks miRNK-AGO regrutuju i drugi aktivatori i da li represivni partneri, kao što je GW 182,
napuštaju kompleks nije poznato. Različitost proteina koji se regrutuju na iRNK pomoću
kompleksa miRNK-AGO dalje se proširuje velikim brojem članova familija proteina AGO, GW
182 i FXR, kao i njihovim nivoom ekspresije i postranslacionim modifikacijama. Dalje, efekat
miRNK-AGO kompleksa može biti modulisan proteinima koji se vezuju na drugim mestima u
3'-UTR-u ciljne iRNK. Aktivirajuća uloga miRNK kao odgovora ćelije na stres ukazuje da bi i
18
druge promene sredine mogle dovesti da neke miRNK ispolje takvu ulogu. S obzirom da se neki
proteini koji stupaju u interkaciju sa AGO, kao što je FXR1, takođe vezuju i RNK, može se
pretpostaviti da neke iRNK sadrže sekvence koje konstituitivno vezuju miRNK-AGO komplekse
koji dovode do aktivacije translacije.
Slika 12. Dvostruka funkcija miRNK: miRNK mogu reprimirati i aktivirati translaciju ciljne iRNK. Fiziološki uslovi utiču na regrutovanje regulatornih proteina, koji mogu promeniti efekat miRNK.
Male regulatorne RNK koje imaju funkciju i represora i aktivatora ekspresije ciljnih gena
mogle bi da obuhvate i druge vrste ovih molekula osim miRNK, kao što su siRNK i piRNK.
Pokazano je da specifične piRNK, pored toga što reprimiraju eksprediju gena, kod D.
melanogaster mogu i pojačati transkripciju. Takođe, neke dvolančene RNK, koje su
komplementarne sekvencama promotra, kada se unusu u ćelije sisara mogu povećati
ekspresiju gena.
1.6. Regulacija miRNK i proteina koji asociraju sa njima
MikroRNK i komponente kompleksa miRISC, kao i svi ostali regulatori, podležu
regulaciji. Pored regulacije koja uključuje prostornu i vremensku ekspresiju ovih molekula,
postoji još čitav niz mehanizama za regulisanje specifičnosti i funkcije komponenti kompleksa
miRISC.
Mali regulatorni molekuli RNK direktno ili indirektno utiču na skoro svaki biološki proces
u eukariotskim ćelijama. Da bi obavile takvu funkciju, ne samo da je potrebno da se određena
mala RNK eksprimira, već ona mora asocirati sa specifičnim efektornim kompleksom RISC.
Proteini AGO, koji su osnovne komponente kompleksa RISC, imaju specifičan obrazac
ekspresije, specifične partner proteine i biohemijske osobine. Veoma malo se zna o reguaciji
utišavajućeg kompleksa RISC, ali sve je više podataka da posttrasnlacione modifikacije
imaju ulogu u regulaciji osnovnih komponenti kompleksa RISC, kao što su AGO, PIWI, TRBP i
GW 182 proteini. Proteini AGO i GW 182 su fosfoproteini, ali na koji način bi posttranslacione
19
modifikacije mogle uticati na njihovu aktivnost nije poznato. Motiv PAM2 u proteinima GW 182
ukazuje na mogućnost da bi ovi proteini mogli biti ciljni molekuli za ubikvitniaciju preko E3
ubikvitin ligaze EDD (koja poseduje domen MLLE koji stupa u interakciju sa motivima PAM2).
Nije poznato da li proteini GW 182 mogu stupiti u interakciju sa EDD i da li ih ta interkacija čini
ciljnim molekulima za preteolitičku razgradnju posredovanu proteazomom.
Drugi aspekt regulacije malih regulatonih molekula RNK i AGO proteina koji se danas
intenzivno istražuje je šta određuje specifičnost interakcije određne regulatorne RNK sa
određenim proteinom AGO, odnosno kako se vrši sortiranje malih regulatornih molekula RNK u
odnosu na AGO proteine.
2. MALE INTERFERIRAJUĆE RNK (SIRNK)
Male interferirajuće RNK (siRNK) nastaju od dugog dvolančanog prekursora koji je ili
egzogen unet ili endogeno sintetisan, zbog čega u njihovoj biogenezi ne učestvuje protein
Drosha. Egzogene siRNK (egzo-siRNK) mogu nastati od virusnih RNK ili od eksprementalno
unetih dugih, perfektno komplementarnih dvolančanih RNK. Eksprimiranje endogenih siRNK
(endo-siRNK) je opisano kod biljaka i životinja, kao što su C. elegans, Drosophila i miš.
Dvolančani prekursori za endo-siRNK potiču od transkripata sposobnih da formiraju duge
dvolančane RNK. Takvi su transkripti prepisani sa ponovljenih sekvenci u genomu (transpozna),
antisense lanaca i pseudogena. Navedeno ukazuje da je jedna od mogućih uloga antisense
transkripata i transkripata prepisanih sa pseudogena regulacija ekspresije sense transkripata,
odnosno roditeljskih gena.
Dvolančani prekursor siRNK je supstrat za kompleks Dicer-TRBP. Nastale dvolančane
RNK, dugačke 21 nt, asociraju sa proteinma familije AGO i drugim komponentama utišavajućeg
kompleksa, kada dolazi do uklanjanja lanca "putnika". Formira se zreli utišavajući kompleks,
siRISC, sa lancem "vodičem", koji je vezan sa proteinom AGO. Lanac "vodič" siRNK je
uglavnom potpuno komplementaran ciljnoj RNK, tako da protein AGO katalizuje
endonukleolitičku degradaciju ciljne RNK. Gubitak funkcionalnog Dicera ili AGO2 dovodi do
smanjenja nivoa siRNK i povećanog nivoa ekspresije transpozona ili transkripata koji kodiraju
proteine a koji su komplementarni sa siRNK. siRNK su važne za antivirusnu odbranu, jer
destabilizuju intermedijere RNK nastale tokom životnog ciklusa virusa. Kod S. pombe je opisano
da endo-siRNK vrše transkripciono utišavanje gena, inicirajući stvaranje heterohromatina,
funkcija koja do sada nije opisana za miRNK. Egzo-siRNK se eksperimentalno koriste za
manipulisanje ekspresijom gena.
2.1. Transkripciono utišavanje gena used modifikacije hromatina pomoću siRNK
Mali regulatorni molekuli RNK, pored toga što posttrasnkripciono utišavaju ekspresiju
gena na nivou translacije, mogu delovati i na niovu transkripcije, tako što isključuju ekpsresiju
targetnih gena modifikacije hromatina. Ovaj mehanizam je najbolje izučen u utišavanju gena u
20
centromerama kod kvasca S. pombe. Naime, centromerni regioni S. pombe su organizovani u
hetrohromatin, i ovo utišavanje hromatina zahteva mehanizam RNKi.
Centromerni ponovci kod S. pombe imaju važnu ulogu u formiranju heterohromatina i u
utišavanju gena koji se nalaze u centromernim regionima. Represivni "potpis" modifikacija
histona su nizak nivo acetilacije i metilacija Lys 9 histona H3 (H3K9).
S. pombe ima po jedan gen za proteine Dicer i AGO. Gubitak funkcionisanja RNKi
dovodi do slabog rasta ćelija, ali i do poremećaja u segregaciji hromozoma. Bilo je iznenađenje,
kada je ustanovljeno da gubitak RNKi kod ove vrste kvasca dovodi do gubitka metilacije H3K9 i
utišavanja gena u centromernim regionima, s obzirom da se ovo utišavanje dešava
transkripciono, a ne posttranskripciono kako se do tada mislilo da deluje RNKi. Kako se dešava
utišavanje centromernog regiona kod S.pombe (slika 13)?
Slika 13. Utišavanje centromera kod S. pombe posredovano sa siRNK. Objašnjenje u tekstu.
Centromerni ponovci se bidirekciono transkribuju pomoću Pol II, dajući komplementarne
transkripte koji međusobno hibridizuju u dvolančanu RNK. Duga dvolnačana RNK je supstrat za
Dicer, koji generiše male dvolančane RNK, koje stupaju u interkciju sa proteinom AGO. Formira
se kompleks RITS (eng. RNA induced transcriptional silencing complex), koji se na još
nepoznat način usmerava ka centromerama i pokreće njihovo transkripciono utišavanje
21
formiranjem heterohromatina. U teoriji, siRNK bi se mogle spariti sa komplementarnim
sekvencama u DNK. Međutim, ovaj kompleks se komplemntarno sparuje sa rastućim
transkriptima koji se prepisuju sa centomernih ponovaka. Regrutovanje kompleksa RITS na
rastuće transkripte centromernih ponovaka pokreće metilaciju heterohromatina, koja se dalje
sama širi. Naime, RITS regrutuje proteine Clr4 i SWI6 koji lokalno modifikuju nukleozome
uvodeći H3K9 metilaciju. Subjedinica kompleksa RITS, ChpI, poseduje hromodomen pomoću
kojeg se vezuje za metilovane histone, što doprnosi stabilizaciji vezivanja RITS.
Interesantno je da je sastavni deo kompleksa RITS i RNK zavisna RNK polimeraza
(RdRP). Protein AGO u kompleksu RITS ima endonukleolitičku aktivnost, a nastali produkti su
supstati za RdRP, čime se generišu novi supstrati za Dicer, i značajno amplifikuje početni
represivni signal, po sistemu povratne sprege. Zbog ove osobine, utišavanje centromernog
regiona kod ove S. pombe je ekstremno efikasan proces. Interesantno je da homolog za RdRP
još nije otkriven u ćelijama sisara.
Dakle, transkripcija sama po sebi može dovesti do širenja heterohromatina, kada je sami
transkript ciljni molekul za RNKi. Smatra se da sličnim mehanizmom RNKi učestvuje barem
delom i u formiranju heterohromatina kod biljaka i vinske mušice. Utišavanje neželjene
transkripijce sa transpozona je, takođe, posredovano sa malim molekulima RNK, piRNK,
verovatno sličnim mehanizmom.