Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar

Tesis Doctoral

Regulación del splicing alternativoRegulación del splicing alternativoen plantas. Efectos de la luz poren plantas. Efectos de la luz por

señales retrógradas y de la metil-señales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5transferasa de proteínas PRMT5

Petrillo, Ezequiel

2011

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.

Cita tipo APA:

Petrillo, Ezequiel. (2011). Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz porseñales retrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5. Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Petrillo, Ezequiel. "Regulación del splicing alternativo en plantas. Efectos de la luz por señalesretrógradas y de la metil-transferasa de proteínas PRMT5". Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.

T

Direc

Cons

Labo

Buen

REGU

Tesis presen

ctor de Tesi

sejero de Es

oratorio de F

nos Aires, 20

Departa

ULACIÓN

Efecto

la m

ntada para o

s: Alberto R

studios: Alb

Fisiología y 

011 

UNIVER

Facultad de

amento de F

N DEL SP

os de la lu

metil‐tran

optar al títu

área d

Lic. E

R. Kornbliht

erto R. Korn

Biología Mo

RSIDAD DE 

e Ciencias E

Fisiología, B

PLICING A

uz por señ

nsferasa d

 

ulo de Docto

de Ciencias 

 

Ezequiel 

 

tt 

nblihtt 

olecular, IFI

BUENOS AI

Exactas y Na

Biología Mol

ALTERNA

ñales retró

de proteína

or de la Uni

Biológicas

Petrillo

IBYNE‐CON

RES 

aturales 

lecular y Ce

ATIVO EN

ógradas y 

as PRMT5

versidad de

ICET, FCEyN

elular 

N PLANTA

de  

5 

e Buenos Ai

N‐UBA 

AS 

res en el 

Índice 

RESUMEN  9 

PALABRAS CLAVE  10 

ABSTRACT  11 

KEYWORDS  12 

AGRADECIMIENTOS  13 

ABREVIATURAS MÁS USADAS  25 

PUBLICACIONES Y FINANCIAMIENTO  26 

INTRODUCCIÓN GENERAL  27 

EL SPLICING Y SUS ALTERNATIVAS  28 

I.  BIOGÉNESIS DE UN MENSAJERO, LA TRANSCRIPCIÓN Y EL PROCESAMIENTO  28 

II.  EL PROCESAMIENTO DE LOS MENSAJEROS, CORTES Y EMPALMES  30 

III.  LA REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN, EFECTOS SOBRE EL SPLICING  33 

IV.  EL FIN DE LA VIDA DE LOS MENSAJEROS, LA DEGRADACIÓN Y EL SPLICING ALTERNATIVO  37 

LAS PLANTAS Y EL SPLICING  38 

HIPÓTESIS GENERAL  41 

PRÓLOGO DEL CAPÍTULO I  42 

CAPÍTULO I  44 

REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 POR LA LUZ  44 

INTRODUCCIÓN  44 

1.  FOTOSÍNTESIS  45 

EL CLOROPLASTO Y LOS FOTOSISTEMAS  45 

2.  LA LUZ COMO SEÑAL  49 

I.  LOS OJOS DE LAS PLANTAS, LOS FOTORRECEPTORES  49 

II.  UN TERCER OJO, EL CLOROPLASTO  52 

3.  EL LENGUAJE DEL CLOROPLASTO  54 

I.  EXPRESIÓN GÉNICA DEL PLÁSTIDO  54 

II.  VÍA DE LOS TETRAPIRROLES  56 

III.  VÍA DE LOS AZÚCARES  56 

IV.  ESTADO DE ÓXIDO‐REDUCCIÓN DE LOS COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO 

FOTOSINTÉTICO  57 

V.  ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO COMO SEÑALES RETRÓGRADAS  60 

RESUMEN DE LOS ANTECEDENTES  62 

OBJETIVO GENERAL (CAPÍTULO I)  64 

OBJETIVOS PARTICULARES (CAPÍTULO I)  64 

METODOLOGÍA (CAPÍTULO I)  65 

MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO  65 

FUENTES DE LUZ Y TRATAMIENTOS LUMÍNICOS  67 

TRATAMIENTOS CON DROGAS Y AZÚCARES  67 

CORTES (SIN EMPALMES) DE LAS PLÁNTULAS. DISECCIONES.  69 

ANÁLISIS DE SPLICING ALTERNATIVO  69 

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN  74 

ENSAYO DE GUS  74 

ANÁLISIS DE ALTA RESOLUCIÓN DE SPLICING ALTERNATIVO: PANEL DE RT‐PCR  74 

RESULTADOS  75 

1.  LA LUZ Y SU EFECTO SOBRE EL PROCESAMIENTO DE RCA Y RSP31  75 

2.  LA INTENSIDAD DE LA LUZ ‐Y NO SU CALIDAD‐ INFLUYE SOBRE EL PATRÓN DE SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 

Y RCA  81 

3.  EL CLOROPLASTO PERCIBE LA LUZ Y TRANSMITE LA SEÑAL AL NÚCLEO GENERANDO EL CAMBIO EN LA 

ABUNDANCIA RELATIVA DE ISOFORMAS DE RSP31  85 

4.  LA SEÑAL VIAJA DE LA HOJA A LA RAÍZ  86 

5.  IDENTIFICACIÓN DE LA SEÑAL QUE TRANSMITE EL CLOROPLASTO QUE PROVOCA EL CAMBIO EN LA EXPRESIÓN Y 

EL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31  88 

A)  VÍA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Y VÍA DE LOS TETRAPIRROLES.  88 

B)  VÍA DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO.  89 

C)  FOTOSÍNTESIS Y AZÚCARES.  92 

D)  ESTADO DE ÓXIDO‐REDUCCIÓN DEL POOL DE PLASTOQUINONAS Y EXPRESIÓN GÉNICA DEL CLOROPLASTO.  94 

6.  EXTENSIÓN DEL ANÁLISIS:  97 

¿CUÁNTOS EVENTOS DE SPLICING ALTERNATIVO PUEDEN SER MODULADOS POR TRANSICIONES DE        

LUZ/OSCURIDAD?  97 

ALGUNAS PARTICULARIDADES DEL EVENTO ESTUDIADO  100 

DISCUSIÓN (CAPÍTULO I)  103 

LA LUZ Y SU EFECTO SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO  103 

EL CAMBIO EN EL PATRÓN DE SPLICING DE RSP31 SE EVIDENCIA EN DIFERENTES TEJIDOS DE LA PLANTA Y EN 

DIFERENTES ESTADIOS DE DESARROLLO  105 

LOS FOTORRECEPTORES, CRIPTOCROMOS Y FITOCROMOS, NO ESTÁN INVOLUCRADOS EN LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN 

LUMÍNICA QUE CAMBIA LA ABUNDANCIA RELATIVA DE ISOFORMAS DE RSP31  106 

¿HAY ALGUNA DIFERENCIA EN EL EFECTO CAUSADO SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 CUANDO SE 

UTILIZAN CALIDADES DE LUZ INCIDENTE DISTINTAS?  107 

LOS CAMBIOS INDUCIDOS POR LA LUZ EN EL PATRÓN DE SPLICING ALTERNATIVO DE RSP31 SON MODULADOS POR 

LA INTENSIDAD DE LA LUZ INCIDENTE  108 

EL CLOROPLASTO ESTÁ INVOLUCRADO EN LA RESPUESTA DEL GEN RSP31 A LAS TRANSICIONES DE LUZ/OSCURIDAD

  108 

CARACTERIZACIÓN DE LA SEÑAL GENERADA EN EL CLOROPLASTO  110 

INTERMEDIARIOS DE LA BIOSÍNTESIS DE CLOROFILA Y EXPRESIÓN GÉNICA DEL PLÁSTIDO  112 

ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ROS)  113 

SEÑALIZACIÓN POR AZÚCARES  115 

ESTADO REDOX DE LA CADENA DE TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTÉTICO: POOL DE PLASTOQUINONAS  117 

GLOBALIDAD DEL EFECTO DE LA LUZ SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO  119 

CONSIDERACIONES FINALES  121 

PRÓLOGO DEL CAPÍTULO II  122 

CAPÍTULO II  124 

REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO POR LA METIL‐TRANSFERASA PRMT5  124 

INTRODUCCIÓN  124 

1.  LOS RITMOS BIOLÓGICOS  125 

I.  LOS RITMOS CIRCADIANOS Y EL RELOJ BIOLÓGICO  126 

II.  DIFERENTES ORGANISMOS, ¿DIFERENTES RELOJES?  128 

III.  EL RELOJ BIOLÓGICO DE ARABIDOPSIS  129 

2.  METILACIÓN DE PROTEÍNAS  132 

I.  METILACIÓN DE ARGININAS Y SUS PROTAGONISTAS  132 

II.  LAS PRMTS EN LAS PLANTAS Y EL ROL DE PRMT5  135 

METODOLOGÍA (CAPÍTULO II)  138 

MATERIAL VEGETAL Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO  138 

Fuentes de luz y tratamientos lumínicos  138 

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA  139 

Medición por PCR en Tiempo Real (qPCR)  139 

ANÁLISIS GLOBAL I: MICROARREGLOS DE EXPRESIÓN EN A. THALIANA  139 

ANÁLISIS GLOBAL II: PANEL DE RT‐PCR DE ARABIDOPSIS  140 

ANÁLISIS GLOBAL III: TILING‐ARRAYS  140 

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE LAS SECUENCIAS DADORAS DE SPLICING  141 

DETECCIÓN DE SPLICING POR PCR RADIACTIVA Y QPCR  141 

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS Y WESTERN BLOT  142 

RESULTADOS  143 

1.  INTRODUCCIÓN AL CONOCIMIENTO DE PRMT5 Y SU FUNCIÓN:  143 

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN INICIAL DE LA MUTANTE PRMT5‐5  143 

2.  CARACTERIZACIÓN DE LA MUTANTE PRMT5‐5,              

  SU EFECTO SOBRE LA TRANSCRIPCIÓN Y EL SPLICING ALTERNATIVO  147 

a.  Análisis inicial, los primeros blancos del efecto de prmt5‐5.  147 

b.  Regulación de la transcripción y del splicing.  149 

c.  Regulación circadiana del splicing alternativo por PRMT5.  152 

d.  Alcances de la regulación del splicing alternativo por PRMT5.  155 

3.  DESCIFRANDO EL MECANISMO DE ACCIÓN DE PRMT5 SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO (PARTE I).  159 

4.  EVIDENCIAS DE UN ROL CONSERVADO: DROSOPHILA MELANOGASTER.  161 

5.  DESCIFRANDO EL MECANISMO DE ACCIÓN DE PRMT5 SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO (PARTE II).  164 

DISCUSIÓN (CAPÍTULO II)  166 

PRMT5 Y LA REGULACIÓN DEL SPLICING  166 

1.  ESPECIFICIDAD  166 

2.  PRMT5 NO AFECTA LOS CAMBIOS SOBRE EL SPLICING ALTERNATIVO GATILLADOS POR TRANSICIONES DE 

LUZ/OSCURIDAD  167 

3.  EFECTOS DE PRMT5 SOBRE EL TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS THALIANA  168 

4.  EFECTOS CIRCADIANOS DE PRMT5  168 

5.  PRMT5 Y SU RELACIÓN CON LOS SITIOS 5’ DADORES DE SPLICING  171 

6.  PRMT5, LOS 5’SS Y LAS PROTEÍNAS SM  174 

7.  POR SI LAS MOSCAS… EVIDENCIAS DE UN ROL CONSERVADO.  177 

CONCLUSIÓN GENERAL  180 

CONCLUSIONES (CAPÍTULO I)  180 

CONCLUSIONES (CAPÍTULO II)  181 

BIBLIOGRAFÍA  183 

APÉNDICE DE TABLAS  193 

APÉNDICE DE FIGURAS  214 

APÉNDICE DE PRIMERS  219 

PRIMERS DEL PANEL DE RT‐PCR  220 

 

P á g i n a  | 9  

 

REGULACIÓN DEL SPLICING ALTERNATIVO EN PLANTAS 

Efectos de la luz por señales retrógradas y de  

la metil‐transferasa de proteínas PRMT5 

 

 

Resumen 

Como organismos sésiles,  las plantas superiores se caracterizan por un alto grado de 

plasticidad en el desarrollo en  respuesta a  las  señales ambientales, optimizando así  sus 

funciones  de  una  manera  que  maximiza  sus  posibilidades  de  supervivencia  y 

reproducción. Son capaces de detectar la calidad, cantidad y dirección de la luz, y utilizarla 

como  una  señal  externa  para  optimizar  su  crecimiento.  Por  otra  parte,  el  splicing 

alternativo es un mecanismo esencial para aumentar la plasticidad del transcriptoma que 

juega  importantes roles en varios aspectos del desarrollo de  los metazoos. Sin embargo, 

poco se conoce del proceso en plantas y de las consecuencias del mismo. 

Aquí demostramos que el splicing alternativo de varios genes de Arabidopsis thaliana 

está regulado por transiciones de luz/oscuridad. Para el caso particular de RSp31 (un gen 

que  codifica  para  una  proteína  reguladora  de  splicing  o  SR)  es  la  intensidad  de  la  luz 

incidente  la  que  tiene  un  efecto  directo  sobre  su  transcripción  y  procesamiento.  El 

cloroplasto percibe la luz y genera una señal (retrógrada) capaz de viajar por la planta que 

provoca  los  cambios  observados  en  la  abundancia  relativa  de  isoformas  de  RSp31.  Las 

plastoquinonas, componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético, serían 

un lugar de integración de diferentes señales y una pieza clave en la respuesta de RSp31 a 

la luz. 

P á g i n a  | 10  

 

Por  otra  parte,  demostramos  que  la  metil‐transferasa  de  proteínas  PRMT5  es  un 

importante  regulador del proceso de  splicing alternativo en Arabidopsis  thaliana y está 

involucrada  en  la  generación  de  respuestas  circadianas  en  esta  planta.  Reunimos 

evidencia que apunta a un efecto sobre el reconocimiento de  los sitios dadores (5’ss) de 

splicing en el mecanismo por el  cual PRMT5 ejerce  su modulación  sobre el proceso de 

splicing  alternativo.  Tal mecanismo  estaría  conservado  en Drosophila melanogaster.  En 

este organismo, al igual que en Arabidopsis, PRMT5 regula la expresión y los patrones de 

splicing  alternativo  de  numerosos  genes.  Sin  embargo,  si  bien  controla  la  actividad 

locomotora  (una  respuesta mediada por el  reloj),  su  vínculo  con el oscilador  central es 

más difuso.  

 

 

 

 

 

 

Palabras clave 

Transiciones  luz/oscuridad,  spliceosoma,  cloroplasto,  fotosíntesis,  plastoquinona, 

Arabidopsis  thaliana,  reloj  circadiano,  PRMT5,  metilación  de  proteínas,  splicing 

alternativo, Drosophila melanogaster. 

   

P á g i n a  | 11  

 

ALTERNATIVE SPLICING REGULATION IN PLANTS 

Effects of light‐triggered retrograde signaling and the arginin 

methyltransferase PRMT5 

  

 

Abstract 

As  sessile  organisms,  higher  plants  are  characterized  by  a  high  degree  of 

developmental plasticity  in  response  to  environmental  signals,  thereby optimizing  their 

developmental  patterns  in  a  manner  that  maximizes  their  chances  of  survival  and 

reproduction. Plants are able to detect the quality, quantity and direction of  light and to 

use it as an external cue to optimize their growth. On the other hand, alternative splicing 

is an essential mechanism to increase transcriptome’s plasticity that plays important roles 

in various aspects of metazoan development. However, little is known of this process and 

its consequences in plants.  

Here we  show  that  alternative  splicing  of  several  genes  of  Arabidopsis  thaliana  is 

regulated by  light/dark  transitions. For  the particular  case of RSp31  (a gene encoding a 

splicing  regulator  or  SR  protein)  it  is  the  intensity  of  light what  leads  to  the  effect  on 

transcription and processing. The chloroplast senses  light and creates a retrograde signal 

that travels through the plant that causes the observed changes in the relative abundance 

of RSp31’s  isoforms. The plastoquinone pool, from the photosynthetic electron transport 

chain, would be a place for integration of different signals and a key factor responsible for 

RSp31 responses to light. 

P á g i n a  | 12  

 

We  also  identified  the  protein‐arginine methyltransferase  PRMT5  as  an  important 

splicing  regulator  in  Arabidopsis  thaliana which  is  involved  in  circadian  responses. We 

raised evidence pointing at an effect on the recognition of the splicing donor sites  (5'ss) 

underlying  the mechanism  by which  PRMT5  regulates  the  alternative  splicing  process. 

Such  a  mechanism  would  be  conserved  in  Drosophila  melanogaster.  However,  while 

controlling locomotor activity in this organism (a response mediated by the clock), the link 

to the central oscillator appears more diffuse. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Keywords 

Light/dark  transition,  spliceosome,  chloroplast,  photosynthesis,  plastoquinone, 

Arabidopsis  thaliana,  circadian  clock,  PRMT5,  protein methylation,  alternative  splicing, 

Drosophila melanogaster. 

 

 

 

P á g i n a  | 13  

 

Agradecimientos 

Tanto… TAAAANTO para agradecer…  

Me  será  imposible  hacer  justicia  en  esta  sección,  debería  tener  varios  tomos  de 

muchas páginas cada uno y aún así dudo de mi capacidad para  impartirla. Sin embargo, 

intentaré plasmar en ella un reflejo de mis sentimientos para con  los que tanto me han 

dado a lo largo de la vida y la carrera hasta llegar aquí, a hoy.  

Debo comenzar con ustedes,  las que  fueron por diferentes  circunstancias de  la vida 

mis mamás por elección y debieron también cumplir con el rol de padre, hermana, tía y 

abuela. A vos mamá y abuela Rosa  (la gran Argentina  Italia), y a vos mamá y tía Lily,  les 

agradezco profundamente todo el esfuerzo que han hecho durante toda mi vida  (y gran 

parte de la de ustedes) para que no flaquee frente a cualquier obstáculo, no me caiga por 

cualquier tropiezo, y me levante después de cualquier caída. Junto al abuelo Alfredo, ese 

gordito callado que se  fue abriendo con el tiempo, me han dado todo  lo que tengo. Les 

debo, sí,  les debo! haber  llegado hasta aquí. No sé si habré  llegado muy  lejos, supongo 

que dependerá de los estándares de cada uno, pero llegué a ver cumplidos la mayoría de 

mis deseos de niño. Todo esto gracias a vos Rosa y a vos Lily. Espero que mi vida haga 

justicia a  sus esfuerzos,  sé que mi  felicidad es y  será  siempre para ustedes moneda de 

cambio para el pago de  todo  lo que me han dado. Gracias por  romperse  todo por mí, 

gracias  por  no  pedir  nada  a  cambio,  gracias  por  haber  estado  siempre,  gracias  por 

quererme y entenderme, gracias por los “suerte, suerte, suerte” antes de cada prueba (sin 

los cuales seguramente no hubiese podido aprobar), gracias por desdoblarse en miles de 

funciones distintas para mi desarrollo completo como ser humano, gracias por enseñarme 

tanto, gracias por haberme enseñado a perdonar, gracias por haberme dado mucho más 

de lo que teníamos, gracias, GRACIAS! Si el día de mañana junto a Gri podemos brindarle a 

nuestros hijos  la mitad de  todo esto estoy  seguro que  los haremos muy  felices.  Si hay 

alguien al que un párrafo, o una carilla, o un par de hojas de agradecimientos  le queda 

chico es a cada una de ustedes. Las quiero mucho, mil gracias. 

P á g i n a  | 14  

 

Mi vida comenzó con mi abuela, mi abuelo y mi tía en Naón, un pueblo muy chiquito, 

con gente muy muy grande, como vos Gordito querido, amigo del alma, hermano mío. Vos 

Juancito  (también conocido como “el  facha” entre otros apodos) has estado siempre, al 

pie del cañón  junto a mí. Si bien la carrera y el trabajo nos alejo físicamente, desde 9 de 

Julio seguís estando tan presente en mi vida como siempre. Sos una gran persona y sabés 

que te deseo lo mejor. Te agradezco haber sido cómplice de mi reencuentro con mi papá y 

mi mamá,  aunque  la  palabra  cómplice  te  queda medio  chica,  ya  que  fuiste  el  autor 

intelectual y material que permitió que me  reúna con ellos. Te agradezco el cariño que 

siempre  me  tuviste.  Les  agradezco  a  vos  y  a  tu  familia  haberme  ayudado  tanto  y 

reservarme siempre un lugar en su casa para cuando quiero visitar los pagos. Gracias por 

tu amistad! Gracias por compartir conmigo tu inmensa sabiduría innata, de la vida. Gracias 

por  tu  “quiero  que  sepas  que  voy  a  estar  ahí  para  lo  que  quieras,  que  la  distancia,  el 

trabajo  lo  que  sea!,  no  es  impedimento  para  que  podamos  comunicarnos.  Loquito  te 

quiero un montón! un abrazo enorme!”. Graciasssss!!! 

En Naón hay mucha gente que me ayudó mucho, desde mi  infancia hasta el día de 

hoy,  le agradezco al pueblo, al gran Carlos María Naón, abrazando así a todos. De Naón 

me  fui a Bragado, ahí cursé mis estudios secundarios en el Colegio Nacional de Bragado 

(hoy  EEM  N°2).  Innumerable  la  cantidad  de  gente  que me  tendió  una mano  en  esta 

ciudad,  y  sobre  todo,  en  la  escuela.  Gracias  a  los  profes,  Palermo,  Maffa,  Descalzo, 

Hipólito, Amalia!!! Fue allí donde cursé las primeras materias del CBC gracias al sistema de 

UBA XXI. Sin embargo, el párrafo aparte es para  los amigos que coseché en esta ciudad, 

los que sigo viendo hoy (aunque sea poco) y  los que casi no veo. Mauri, Juanqui, Nacho, 

Diego G., Diego O.,  Fer, Cricky, Chicky,  Rolo,  Chino,  Boquera,  Fischi  (que me  diste  una 

ahijada)… a toda la banda, que me sigue aguantando a pesar de los desplantes, a pesar del 

abandono, a pesar de  las ausencias. Los quiero un montón aunque a veces no parezca. 

Gracias por regalarme su amistad, compartir conmigo su alegría, estar cuando hace falta. 

Es por ustedes también que en algún momento escribí: "la p@@@!!! son lo más lindo que 

tengo  en  el  mundo"  en  algún  mail  enviado  desde  el  viejo  mundo,  en  un  estado  de 

abstracción y lejanía del cariño que ustedes son tan hábiles para mostrar. Mil gracias. 

P á g i n a  | 15  

 

Y continúo entonces con más amigos, la llegada a la facu, la gente nueva de la capital. 

Una de  las primeras personas que  conocí  fue Belén, una  loca,  típica  porteña…  jajajaja, 

quién hubiese dicho que serías como una hermana tiempo más tarde. Gracias a vos cursé 

las materias! Vos y tu familia, que prácticamente me adoptó, me ayudaron mucho en los 

comienzos en la gran ciudad. Gracias por tu amistad de fierro y por haberme anotado en 

cada materia y hacerme estudiar y rendir… Gracias. Junto a vos conocí más tarde a Fede 

(Jamiroquai), Boris, Guido, San y  las bestias humanas de Gaby y Lau. También  llegaría el 

turno  de  conocer  a  Juan,  Naty,  Irene,  Leti,  el  gran  y  mágico  Michan.  Todos  juntos 

formamos  un  grupo  muy  heterogéneo  que  se  mantiene  hasta  hoy  a  pesar  de  los 

diferentes  caminos que hemos  ido eligiendo.  Los adoro  locoooos!!! Todo mbututu,  son 

una  masa.  La  carrera  sin  ustedes  hubiese  sido  como  un  asado  sin  vino!  Son  los 

responsables de que haya querido  ir  todos  los días a  la  facu! Son una de  las cosas más 

hermosas que me dio la carrera. Gracias a Gaby y a Lau por los mimos en forma de charla 

y torta. Gracias a Fede por las charlas, siempre duras y profundas, siempre interesantes y 

vivas.  Gracias  a  vos  Guadita  por  tanto  amor,  a  vos  y  a  Dani  por  la  sobrinita  que me 

regalaron  para mi  cumple,  gracias  por  tanta  dulzura  y  tantas  lágrimas  antes  de  cada 

parcial!  Y  muchas  más  gracias  por  tus  resúmenes  y  tu  responsabilidad.  Gracias  a 

michifuxido por tanto amor, sos una bestia Nico, un grosso, tenés  la capacidad de hacer 

sentir a cualquiera como la persona más copada del mundo pero esa sos vos! Entre estos 

encontraría  un  hermano más,  quizás  el más  hermano  porque  fuiste  con  quien  conviví 

varios años durante mis estudios. El Lava, otro grande si  los hay. Gracias por  tu humor, 

gracias por haberme dado un techo en épocas de crisis, gracias por haberme hecho parte 

de tu familia y haber introducido en mi vida a Romina (el desastre con interior más bueno 

que he conocido) para que aprenda con ella que el caos no es tan terrible (Gracias Romi!) 

pero sí incontrolable. Lavita, te agradezco muchísimo tu cariño, te doy gracias por ser tan 

sincero, honesto, y de buen corazón, has sido un pilar en mis años de vida (algo) adulta. 

Gracias Man! No te agradezco tu manejo autoritario del control remoto ni la música punk 

que mis oídos han tenido que soportar por tu culpa. Sos un gran amigo. 

P á g i n a  | 16  

 

Y de la facu llegamos al labo, allí llegaría de la mano de Fede P (o Félix, o Pelisch). Un 

grosso  (sobre  todo  ahora).  Un  tipo  que  cuando  se  saca  la  careta  de  recio  y  cabrón, 

muestra  el  relleno  suave  del  que  está  hecho  (tontorrón!).  Gracias  por  llevarme  al  lab 

(mentira!). Gracias por abrir  tus  sentimientos y compartir  tu amistad conmigo  (verdad). 

Gracias por hacer del laboratorio un mejor lugar para los Petry (y peor para los Manolos). 

Gracias  porque  cuando  querés  combinás  conmigo  tu  buena  onda,  para  elevarnos  a  la 

máxima  potencia  y  así  cantar,  gritar,  y  pelear!!!  quemando  el  estrés  del  día  a  día.  La 

entrada al laboratorio fue sencilla, todos hicieron que así lo fuera, y por eso les agradezco 

muchísimo. Yo  llegaba  repleto de miedos y vacío de conocimientos…  si bien no cambio 

mucho  la  situación,  ahora  tengo menos miedo  y  sé  algunas  cosas más.  En  este  punto 

tengo,  debo,  y  quiero,  agradecerle  a  Kornflit,  al  ARKido,  a Alberto. Gracias  ARK  por  la 

oportunidad  que me  diste  de  laburar  en  esto  que  tanto me  gusta  (la mayor  parte  del 

tiempo). Pero más te agradezco por tu humanidad, por la libertad que me diste siempre y 

por haberte tirado sin paracaídas conmigo a un tema nuevo para ambos (a pesar de que 

podías quedarte en la seguridad y el confort de tu campo conocido). Sos un gran maestro. 

Gracias también por tu humor (tan afín al mío en algunos momentos), por tu latín, por tus 

críticas, por  tus halagos, por  tu  ternura, por  el pagARK  y  la masterARK  (chiste,  chiste). 

Gracias, mil gracias por preocuparte por el bienestar personal de cada uno de nosotros.  

En el laboratorio tendría que trabajar con Fededa… un desconocido para mí. En pocos 

días  descubrimos  que  habíamos  sido  hechos  de  la misma madera  y,  como  dos  niños, 

trabajamos  y  jugamos  juntos  desde  entonces  hasta  su  partida  a  Europa.  Gorrrrdo!!! 

Gracias por  tanta enseñanza  a  la que me  sometiste  (sí,  sometiste). Gracias por el duro 

trabajo que te tomaste para enseñarme como trabajar (duro). Gracias por mostrarme que 

se pueden hacer un millón y medio de experimentos a la vez (cosa que no logro del todo 

sin vos),  leer mil artículos y  tener  tiempo para  la amistad,  la  familia, y aún más, poder 

generar más ideas y mejores, para más experimentos, y nuevas preguntas y… una bestia, 

eso sos. Gracias por compartir tus pensamientos conmigo, por cuidarme, por enseñarme, 

por  los  juegos, por  las cervezas a  las dos de  la mañana en el  labo! Gracias por cuidarme 

con la gran Maru que tenés al lado. Gracias por ser un ejemplo, un modelo a seguir, una 

P á g i n a  | 17  

 

nueva pregunta a cada minuto. Gracias por ser una oreja amiga y una boca confidente. Ni 

siquiera  en  los  primeros momentos me  hiciste  sentir menos  que  vos  y  de  inmediato 

abriste tu trabajo y me permitiste discutir sobre él como si hubieran pasado mil años de 

trabajo juntos. Gracias capo!  

Si bien Juan F. merece su párrafo aparte por haber sido mi mentor, no es el último al 

que  le  tengo que agradecer mucho en el  labo. De entrada me  topé con  la presencia de 

Mariano, un pibe con el que en principio competía por un lugar. Como bien lo planteaste 

en  tu  tesis hermanito mayor  (¡!), el destino haría que  los dos  trabajemos en el mismo 

lugar, generemos una amistad, y hasta vivamos juntos. Gracias loqui por enseñarme tanto 

de amistad. Gracias por gastar toda esa cantidad de energía  increíble que gastas en que 

charlemos, cenemos, veamos una peli, juguemos un partidito. Gracias por distraerme del 

día  a  día,  por  darme  una  nueva  pasión  (el  fútbol  y  el  rojo  –pero  también  boca‐),  por 

ayudarme a que esté menos  inmerso en  la vorágine del trabajo. Gracias por obligarme a 

buscar algo más. Gracias por haber compartido lágrimas y risas conmigo, y gracias por tu 

Agustín  que  ahora  también  es mi  hermano,  como  tu  familia  es mi  familia. Gracias  por 

compartir nuestros primeros pasos en este camino. Fue durante esos primeros pasos en el 

labo  que me  encontré  con Manolo, Manu,  Vale…  qué  decir  si  no  es  gracias, muchas 

gracias. A vos Vale porque estás detrás de cada uno de nosotros como una madre, porque 

tenés una increíble capacidad de trabajo que se derrama y nos contagia, porque sos capaz 

de  cualquier  cosa para que  todo esté bien. Gracias por  tus mimos en  forma de mates, 

abrazos y sabias palabras. Gracias por tu empuje. Gracias por haber formado con Tincho 

una  familia  que  todos  soñamos  tener. Gracias  por  Tincho .  A Manu…  qué  te  puedo 

agradecer?... no se me ocurre… las ideas no, nunca tuviste “buenas ideas”, la onda no, sos 

re jodido… no sé. Eso te puedo agradecer, esa humildad pampeana que te caracteriza y te 

hace creer por momentos  tan chiquito. Gracias por  las charlas,  te acordás cuando entre 

los dos no sumábamos 1 gana? (Gracias Fede por esta frase). Gracias por el cariño, gracias 

por  la ayuda, gracias por  las discusiones  científicas, gracias por  ser una gran persona  y 

abrir tu corazón conmigo. Gracias por tu sonrisa aún cuando tu mente no está presente, 

gracias por estar. Lo mejor para vos y tus nenas . Para contrarrestar con la buena onda 

P á g i n a  | 18  

 

de este pampeano hacía falta un porteño de ley, por eso el labo contaba ya con Manolo. 

Un  desastre,  tipo  Pomelo  el  personaje  de  Capusotto.  Un  rockero  (que  hace  pop) 

desalineado que hacía ciencia (pop), quizás un loco… pero me cebaba unos buenos mates 

que lo acercaban a mi mundo provinciano y con los que se fue construyendo un lugar en 

mi  corazón.  Gracias  Nolo  por  tu mal  humor,  por  tus  frases  desubicadas,  por  tu  buen 

humor. Gracias por  la confianza. Gracias por  las charlas, gracias por  la magia con  la Play. 

Gracias  porque  aún  en  tu  locura  de  algunos  momentos,  escuchabas.  Gracias  por  tu 

amistad. En esa época, como ahora, compartíamos el labo con el grupo de Anabella. En su 

grupo  “pipeteaban”  Fede  (el  grosso  tipo  Fort)  y Mati  Blaustein.  A  Anabella  tengo  que 

agradecerle mucho  también. No  sos mi  “jefa”  pero  siempre  has  estado  bien  dispuesta 

conmigo (jeje, no podía faltar el doble sentido al que acostumbra nuestra relación), está 

claro que sos una amiga más y te lo agradezco. Gracias por tu paciencia, tu confianza y tus 

consejos. Y a vos Mati, gracias por  las gaviotas, gracias por obsequiarme una pizca de tu 

sabiduría cada tanto, gracias por tu revolución, gracias por tu lucha, gracias por tu amistad 

de  oro,  gracias  por  tu  inocencia,  bondad  y  honestidad. Gracias  también  por  darme  un 

techo en alguna oportunidad! 

Fueron pasando los años en el labo y llegaría gente nueva a medida que se iban otros. 

Nacho llegó casi junto a Mariano y a mí. Al principio manteníamos cierta distancia, con el 

tiempo nos fuimos acercando y nos peleábamos bastante. Creo que yo soy lo negro y vos 

lo blanco del ying y el yang. Pero encontramos un equilibrio, un balance y cosas en común 

que derivaron en una amistad. Gracias por el “ekeko!!!”, gracias por tu canto, gracias por 

tu música. Gracias por estar siempre dispuesto a analizar (con una lógica impecable) cada 

resultado o cada situación. Más tarde  llegarían otros, el Guille encabeza  los primeros de 

esta  tanda  junto  al  Rasco.  Dos  bestias.  Dos maestros.  Hoy  devenidos  en muy  buenos 

amigos. Gracias en conjunto por toda la onda que pusieron en el labo y en mi vida. Gracias 

por la alegría. Gracias Risso por la birra y la guitarra, y el vino y las empanadas, y el fernét 

y  las noches de  fogón. Gracias Rasco por  tu corazón puro y  tu amistad. El Rasco se  iría, 

Guille seguiría entre nosotros, y vendría más gente… Celi, una  ídola, por momentos una 

autómata  implacable que resuelve cualquier dilema físico/matemático y cualquier puzzle 

P á g i n a  | 19  

 

que  le  pongan  adelante.  De  a  ratos  una  devoradora  de  Danettes.  Todo  el  tiempo,  un 

corazón a flor de piel, un ser humano excelente. Gracias Celi por defenderme aún cuando 

soy  indefendible! Gracias por estar, gracias por  las  charlas y discusiones. Gracias por el 

querido! Finalmente  llegarían  las niñas… Mica, que  seguiría mi  línea e  iba a  sufrir estar 

bajo mi  “mandato”…  “enseñanza”… o algo de eso. De entrada  le puso  toooda  la garra. 

Gracias  por  tu  optimismo  tan  importante  en  esta  profesión! Gracias  por  tus  cookies  y 

demás mimos  en  forma  de  dulces  horneados.  Gracias  por  intentar  aprender  de mí  y 

emprolijarme  al  mismo  tiempo.  Lu,  palabras  mayores,  otra  bestia.  Muy  buen  onda, 

muchas  ganas  de  laburar, mucho  empuje.  De  inmediato  desarrollamos  una  excelente 

relación, vos con  tus mates, yo con mis ganas de  tomarlos. Compartimos mucho en  tus 

comienzos  y disfruté mucho  trabajar  con  vos. Estoy obligado  a  agradecerte que  te  rías 

después  de  cada  chiste  mío  (la  mayoría  pésimos),  y  que  te  preocupes  tanto  por  mi 

bienestar. Gracias Lucha por tu buen humor, tu simpatía y tu cariño . Por esa época de 

renovación de  la sangre  laboratoril y de recambio, también  llegaría  la sonrisa y  la alegría 

de Ana F. Gracias flaca! Más tarde se nos unieron Nico (a nuestro lab) y Anita Q. y Berta (al 

lab de Anabella). Unos grossos! Con Anita es con  la que más acercamiento tuve. Gracias 

loca por compartir unos buenos tintos conmigo, gracias por tu alegría, gracias por confiar 

en mí, gracias por ayudar y permitir que te ayuden, gracias por  las charlas que, en poco 

tiempo, fueron muchas. A vos Berta, gracias por hacerme correr para que baje la pancita. 

Junto  a  la  gente  que  fui  conociendo  en mi  labo,  fueron  apareciendo  personas  que 

alegraron mis días  y me dieron una mano  (o me hicieron  sentir útil) en otros  labos. El 

grupo de Archie me daría grandes amig@s. Destaco a Dami y a Mati por su ancianidad, y 

por más tiempo compartido. Gracias a los dos por la buena onda, las charlas, los mates y 

por hacer de mis días en el  lab algo más terrenal. Dami, gracias por haberme hecho dar 

cuenta que  lo mío era  la psicología! A Anita F. y a Refo también debo destacarlos. A vos 

Ana te agradezco todo el amor y a vos Refo,  la falta de él. A  los más nuevos como Jime, 

José, Marianita, Andrés  y María, gracias por  la buena onda  (sobre  todo a  vos  Jime!). A 

todo  el  grupo,  Gracias  porque  también  son  parte  de  esto.  En  especial  a  vos Marian 

(Pancha), por  tu  cariño  sincero, por  tu  amistad  y por haberme presentado  a mi  futura 

P á g i n a  | 20  

 

esposa  (en noviembre parece). El grupo de Omar,  con Sol,  Juli  y  la  ídola Dai. Gracias a 

ustedes  también.  Gracias  a  vos  Omar  porque  con  el  tiempo me  di  cuenta  cuánto  te 

preocupas  por  todos  nosotros  y  por  tus  chistes  obvio.  A  Bernon,  María,  Lidia,  los 

schszucupkakapak! A  los Uchiteles, Marion y Euge! Mil gracias a todo el grupo por tener 

siempre a mano algo que necesito, una herramienta, un mate, una ayuda. A Ramona por 

los cafecitos y el cariño, gracias! Líneas aparte para la persona que se ocupa de que el labo 

funcione más o menos bien, Andrada, jugador de toda la cancha. Gracias por tus palabras, 

por tu  locro, tus asados y tus empanadas. Gracias por tu cariño Orlando. Gracias Leonor 

por todos tus mimos y preocupación por nosotros. Al grupo Colman, donde tengo grandes 

amigos. Gracias Ale por contagiarme tu emoción, por ser un niño que disfruta tanto pero 

tanto  de  la  ciencia  que  apasiona.  A  vos  Rodri,  gracias  por  tu  amistad,  gracias  por  tu 

confianza, gracias por abrir tu corazón conmigo y poder charlar de todo. Gracias también 

por tu compañía fuera de la facu, por el fútbol, la play, el boxeo, el trago, los P.U.B. . A 

vos Lu por tus valores y por las charlas. A vos Alan por la onda inagotable fuera del lab y tu 

amor por los “copetines” en los congresos. A vos Mati por las gaviotas. 

 En paralelo a  lo que  iba viviendo dentro de  los muros de exactas, también tuve una 

vida en el exterior (o casi una vida). Parte de esta vida, sobre todo el orden mental de la 

misma  se  lo  debo  a mi  amigo Oscar,  un  blusero  que  una  vez  fue mi  terapeuta.  A  los 

amigos de Campomar, INGEBI y el IFEVA. Gracias Pablo C. por tu ayuda desde el comienzo. 

Gracias Marcelo por haber sido un co‐director en todo esto. Gracias Sabri por el aguante, 

la voluntad y la garra de siempre. Gracias Sandra, Briardo y demás personas de los Salad 

Bar,  por  haber  generado  un  espacio  para  nosotros  los  plantólogos  con  problemas 

moleculares. Fabio y Sara, gracias mil millones de gracias por todo el oído que pusieron, 

toda  la  voz  y  energía  con  que  siempre me  respondieron.  Al  fútbol  y  a Marcial  como 

representante del grupo de gente, de amigos que me han dado  tanta  felicidad con una 

pelotita y una cancha  sintética. Marcial gracias por  tu cariño y  tu bondades. A Mariano 

Michat, naonense viejo y peludo, gracias por los libros y los consejos, gracias por la guía en 

todo momento de mi carrera. A la familia Citro, a los Bidegain, a los Costa y a tantos otros 

que me  ayudaron  para  que  pueda  estudiar. Gracias  a  Craig  Simpson,  a  John  Brown,  a 

P á g i n a  | 21  

 

Andrea Barta y a Maria Kalyna. A vos Maria Сп０ＸＦ１о Ｅ０ в０шу дＷуＤ１у. A vos Craig thanks 

for your friendship. Nada de esto hubiera sido posible sin la ayuda y la existencia de cada 

uno de ustedes. 

Finalmente,  vuelvo  a  la  familia,  donde  empezó  todo.  Gracias  Tere  y  María,  por 

dejarme conocerlas, por conocerme, por convertirse rápidamente en mis dos hermanas, 

como  si  hubiésemos  estado  juntos  toda  la  vida. Gracias  por  el  cariño  y  la  aceptación. 

Gracias Mariaqui por tu amor. Por hacer tanta fuerza para que me acerque más y más a 

los tuyos. A vos papá por dejar que nos conociéramos. Por afrontar  la situación y por el 

abrazo que me diste ese primer día que te vi. Gracias a  los 4 por ser mi familia también. 

Gracias a vos Cesáreo porque sos una masa! Excelente cuñado. Y a vos Pedro te agradezco 

que me hayas remarcado que engordé en los últimos tiempos. A los Regueiro y los Lisazo 

por las Navidades y los años Nuevo con tanta alegría. 

A mi  vieja.  Te  agradezco  porque  un  día  te  llegó  una  carta,  la  leíste  y  permitiste  la 

relación que hoy tenemos. Gracias por hacerme un  lugar en tu familia, por tu frescura y 

por comportarnos (en complicidad) como si nunca hubiera pasado nada. Tenemos tanto 

de que hablar! Gracias por estar ahí ahora. Gracias a mis más nuevos herman@s, el gran 

Pablito,  la Tony y Gisela. Gracias a Alberto por  los  cuidados y el  cariño que  les diste, y 

gracias por recibirme en tu casa como uno más. 

A Gri. A vos hermosa, tengo tantas cosas que agradecerte, tantas! Pero voy a empezar 

por agradecerle al  laboratorio, porque un día abrí  la puerta del mismo y allí estabas vos, 

una preciosura. No pude evitar exclamar hacia Fede: “ME CASO!”. Desde ese momento 

deseé no separarme más de vos, y si bien pasaron menos de 3 años desde aquel día, antes 

de que este año termine cumpliré el deseo detrás de mi exclamación. Me parece increíble 

cuánto  llegaste  a  conocer de mí en este  tiempo,  creo que  ya  sabés más de mí que  yo 

mismo. Parecés entender la manera en que funciono aún sin palabras. Gracias por todo el 

amor  que me  das,  por  ser  un  cable  a  tierra  en  mi  vida,  por  borrar  el  mundo  y  las 

preocupaciones  con  un  abrazo  o  un  beso,  por  burlarte  de mis  pavadas  y  obsesiones 

generando  que  ponga  los  pies  en  la  tierra,  por  ser  una  excelente  compañera,  por 

P á g i n a  | 22  

 

preocuparte por mi bienestar, por despertarme con un beso  (y hacer que me  levante… 

cosa muy difícil últimamente), por recordarme cosas importantes que de otra forma se me 

pasarían. Gracias por hacer que cada día comience y termine bien, a tu lado. Gracias por 

las caricias y  los masajes, por hacerme sentir el mejor del mundo, el único, por mirarme 

como  lo hacés, por aceptarme como soy. Gracias por ser una razón en sí misma, quiero 

por y para vos. Por darle real significado a  la  frase “Te Amo”. Gordita preciosa,  te amo. 

Gracias por enseñarme el valor de la simpleza, de la honestidad, del valor mismo. Espero 

seguir aprendiendo de vos cada día. Te agradezco también por tu  familia. A  los suegros, 

Efrén y Grego, gracias porque inmediatamente me hicieron sentir querido. Gracias por los 

mimos,  las comidas, por estar siempre y desear que estemos bien. Al grosso del cuña y 

compañía. Néstor, Nahu y Marina, gracias a  los 3 por tanto amor y tanta alegría. Gracias 

sobrinito! Gracias a todos ustedes porque también fueron importantes, sobre todo en los 

últimos  momentos  de  esta  tesis  y  durante  la  fatigante  escritura.  Gracias  Gri  por 

compartirlos conmigo. Gracias Gri por el aguante, porque a veces desaparezco  (o estoy 

pero no parece) y vos me lo hacés notar con cariño, con caricias. Gracias por haber leído 

gran parte de esta tesis y corregir muchos detalles, sobre todo siendo que el tema te gusta 

bastante poco! Gracias por  ser mi mujer  y hacerme  tu hombre.  Te  adoro  con  todo mi 

corazón.  Gracias  también  por  Cielo.  Pero  más  allá  de  todo  esto,  gracias  por  los 

agradecimientos que  van a  venir, gracias por hacer de mi  futuro un  lugar  tan hermoso 

para vivir, teniéndote a mi lado. Gracias por acompañarme en este camino. 

 

 

   

P á g i n a  | 23  

 

Aquí debería ir una frase buena, excelente… a falta de una frase así se

me ocurre sólo una palabra…

GRACIAS!

P á g i n a  | 24  

 

A Rosa, Lily y Gri

   

P á g i n a  | 25  

 

Abreviaturas más usadas 

ADN: ácido desoxirribonucleico 

ARN: ácido ribonucleico 

ARNr: ácido ribonucleico ribosomal 

ARNm: ácido ribonucleico maduro, mensajero 

Pol: ARN polimerasa 

ATP: adenosina trifosfato 

GTP: guanosina trifosfato 

snRNP: complejos nucleares pequeños ribo‐núcleo‐proteicos 

PQ: plastoquinona 

RCA: Rubisco activasa 

DCMU: 3‐(3,4‐diclorofenil)‐1,1‐dimetilurea 

DBMIB: 2,5‐dibromo‐3‐metil‐6‐isopropil‐benzoquinona 

Col: Columbia (ecotipo de Arabidopsis thaliana) 

Osc: oscuridad 

PCR: reacción en cadena de la polimerasa 

RT: retrotranscripción 

qPCR: PCR en tiempo real 

L y C: isoformas larga y corta respectivamente, en general, refieren a RCA 

mRNA3 y mRNA1: isoformas de RSp31 

GUS: glucuronidasa 

PRMT: metil‐transferasa de residuos arginina en proteínas   

P á g i n a  | 26  

 

Publicaciones y financiamiento 

Para la realización de la presente tesis de doctorado conté con una beca otorgada por 

la Universidad de Buenos Aires. El laboratorio del Dr. Alberto R. Kornblihtt, donde realicé 

mis  estudios,  recibió  financiamiento  de  diversas  instituciones  a  lo  largo  de  esos  años: 

Agencia  Nacional  de  Promoción  Científica  y  Tecnológica,  CONICET,  UBA,  Fundación 

Antorchas, EURASNET y Howard Hughes Medical Institute. 

Los hallazgos que  relato en el capítulo  II  forman parte de una publicación en  la que 

comparto la primera autoría con la licenciada Sabrina Sanchez: 

A  methyl  transferase  links  the  circadian  clock  to  the  regulation  of  alternative  splicing. Sanchez, S. E.*, Petrillo, E.*, Beckwith, E. J., Zhang, X., Rugnone, M. L., Hernando, C. E., Cuevas, J. C., Godoy Herz, M. A., Depetris‐Chauvin, A., Simpson, C. G., Brown, J. W., Cerdan, P. D., Borevitz, J. O., Mas, P., Ceriani, M. F., Kornblihtt, A. R. y Yanovsky, M. J. Nature. 468. 2010.  

Lo expuesto en el capítulo  I será parte de un trabajo en preparación: Petrillo, E., Kalyna, M., Godoy Herz, M., Barta, A. y Kornblihtt, A.R. 

  También durante  la  realización de esta  tesis, colaboré en  los  trabajos de diferentes 

integrantes del  laboratorio del Dr. Alberto R. Kornblihtt y de  la Dra. Anabella Srebrow, y 

como resultado participé de las siguientes publicaciones: 

The serine/arginine‐rich protein SF2/ASF regulates protein sumoylation. Pelisch, F., Gerez, J., Druker, J., Schor, I.E., Muñoz, M.J., Risso, G., Petrillo, E., Westman, B.J., Lamond, A.I., Arzt, E., and Srebrow, A. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107(37). 2010. 

Control of alternative  splicing  through  siRNA‐mediated  transcriptional  gene  silencing. Alló M., Buggiano V., Fededa J.P., Petrillo E., Schor I., de la Mata M., Agirre E., Plass M., Eyras E., Elela S.A., Klinck R., Chabot B., and Kornblihtt A.R. Nature structural & molecular biology. 16(7). 2009. 

A polar mechanism coordinates different regions of alternative splicing within a single gene. Fededa J.P., Petrillo E., Gelfand M.S., Neverov A.D., Kadener S., Nogués G., Pelisch F., Baralle F.E., Muro A.F., and Kornblihtt A.R. Molecular cell. 19(3). 2005.    

 

 

Intr

L

inesp

espe

(~400

Yu  e

múlt

falta 

comp

tend

trans

que 

distin

med

alter

y Lee

facto

Figur

Depe

inclu

* Not

la ed

y em

roducción

La  secuenc

peradament

cies), no m

000) [Conso

et  al.,  2002

iples transc

de  correla

plejidad  fen

encia  haci

scriptos a m

no  existe 

ntos metazo

iados  de  1

rnativo en e

e, 2007]. Re

ores están in

ra I1: gráfic

endiente de l

usión de azar e

ta de no-traduc

dición de una p

mpalme de difer

n genera

ciación  de 

te  bajo  de 

mucho mayo

ortium, 199

2].  Se  sugir

criptos a pa

ación  entre

notípica  [K

a  una  ma

medida que

una  difere

oos [Brett e

990  hasta 

el genoma h

esulta enton

nvolucrados

os del porce

la cobertura

en la cobertur

cción: se denom

película, de man

rentes regiones

al 

los  geno

genes  cod

or que el d

98; Lander e

rió  al  splici

artir de un 

e  el  númer

im  et  al., 

ayor  propo

e aumenta 

ncia  signifi

et al., 2002; 

la  actualid

humano pas

nces import

s en su regu

entaje de ge

de pequeñas

ra de los ESTs

mina splicing al

nera análoga, s

de un ARN dur

omas  hum

dificantes  d

de un nema

et al., 2001;

ing*  altern

solo gen, c

ro  total  de

2007].  La  f

orción  de 

la “complej

cativa  de 

Kim et al., 

dad,  la  frec

so del 5 %  a

tante deter

ulación, y q

enes con spls secuencias

. Adaptado de

l proceso de co

se usa la misma

rante su “madu

mano  y  de

de  proteína

atodo  (~190

; Goff et al.

nativo,  un  m

omo una p

e  genes  de 

figura  I1  m

genes  con

jidad  fenot

los  niveles 

2007]. A pe

cuencia  est

l 60 o 74 %  

rminar cóm

ué estímulo

plicing alterna

expresadas (

e [Kim et al., 2

orte y empalme

a palabra en bio

uración”.

e  ratón  r

s  (cerca  de

000) y men

, 2002; Wat

mecanismo

posible solu

un  organi

muestra  que

n  splicing 

típica”. Otro

de  splicing

esar de esta

imada  de  e

dependien

o se regula 

os lo modul

ativo en dife

(ESTs) y B) c

2007].

que se efectúa

ología para def

P á g

eveló  un 

e  25000  en

nor que el d

terston et a

o  capaz  de 

ción a  la pa

ismo  y  su 

e  existe  un

alternativo 

os autores 

g  alternativ

as diferencia

eventos  de

ndo del anál

 dicho proc

an. 

erentes euca

con minimiza

sobre una cint

finir un proceso

i n a  | 27 

número 

n  las  dos 

del arroz 

al., 2002; 

generar 

aradójica 

nivel  de 

na  cierta 

de  sus 

postulan 

vo  entre 

as, desde 

e  splicing 

lisis [Xing 

ceso, qué 

riotas. A)

ación por

a durante

o de corte

P á g i n a  | 28  

 

El splicing y sus alternativas 

En el principio todo era confusión y no había nada en la tierra.

Génesis 1.1

Para  conocer  todos  los  actores  (detrás  y  delante  de  escena)  involucrados  en  los 

diferentes niveles de  la vida de un mensajero, y  las  funciones de  cada uno de ellos, es 

importante que comencemos desde el principio.  

 

I. Biogénesis de un mensajero, la transcripción y el procesamiento 

Debido  al  alto  nivel  de  conservación  que muestran  los  procesos  bioquímicos  que 

conducen al flujo de  la  información genética en todos  los dominios de  la vida, es que se 

postuló el “dogma central” de  la biología molecular [Crick, 1970]. El mismo  indica que  la 

información presente en la molécula heredable y replicable de ADN (los genes) da lugar a 

una molécula de ARN  (los mensajeros) que  tiene  la misma  información, por un proceso 

denominado  transcripción;  la  información  contenida en dicho mensajero es  luego  leída 

por  la maquinaria  de  síntesis  de  proteínas  (los  ribosomas)  en  un  proceso  denominado 

traducción.  

La  transcripción es  llevada a cabo por enzimas con actividad ARN polimerasa. Todos 

los  eucariotas  poseen  tres  ARN  polimerasas  (pol)  nucleares  dependientes  de  ADN 

[Archambault y Friesen, 1993]. La pol  I que  transcribe el ARN ribosomal  (ARNr),  la pol  II 

que transcribe la mayoría de los genes (incluyendo los que codifican proteínas)  y la pol III 

que transcribe ARN de transferencia y ARNr (5S). En el 2005 se descubrió que las plantas 

tienen una  cuarta polimerasa nuclear  (pol  IV) que es necesaria para  la  síntesis de ARN 

pequeño de  interferencia  (de 24 bases) y  la  formación de heterocromatina  [Onodera et 

al., 2005].  

P á g i n a  | 29  

 

En  los procariotas  la  transcripción genera moléculas de ARN mensajero  (ARNm) que 

son, por su  localización y estructura, sustrato directo de  la maquinaria de traducción. En 

cambio,  en  los  eucariotas,  el metabolismo  del  ARN  involucra  un  conjunto mucho más 

complejo  de  pasos  y  mecanismos  regulatorios.  En  primer  lugar,  la  maduración  del 

mensajero  requiere una  serie de pasos de procesamiento del ARN precursor  (pre‐ARN, 

también llamado transcripto primario): el agregado de un nucleótido GTP modificado en el 

extremo 5’ (capuchón o cap); un corte hacia el extremo 3’ del transcripto y la adición de 

varios  nucleótidos  de  adenina,  generando  un  extremo  3’  definido  (corte  y  poli‐

adenilación);  generalmente,  un  acortamiento  por  reacciones  de  corte  y  empalme  de 

segmentos  internos (splicing); y, en algunos casos,  la modificación de ciertos nucleótidos 

(edición). En segundo lugar, mientras que la transcripción y el procesamiento tienen lugar 

en  el  núcleo,  la  traducción  ocurre  en  el  citoplasma,  por  lo  que  se  hace  necesaria  una 

maquinaria de exportación de mensajeros. Cada uno de estos eventos, aunque genere un 

gasto  energético,  aumenta  las  posibilidades  de  regulación  sobre  la  expresión  génica  y 

confiere  la  capacidad de obtener diferentes  resultados a partir de un mismo molde. Es 

decir,  tanto  la  transcripción  como  el  procesamiento  del  ARN  pueden  contribuir  a  la 

generación  de  variantes  proteicas,  a  través  de  eventos  de  inicio  de  la  transcripción 

alternativos [Quelle et al., 1995], de corte y poli‐adenilación alternativo [Gautheret et al., 

1998] o de splicing alternativo  [Black, 2000; Filichkin et al., 2010]. La  información con  la 

que contamos hoy en día muestra que, de todos ellos, el splicing alternativo es el mayor 

contribuyente a la generación de variabilidad proteica. En Drosophila un sólo gen, Dscam, 

genera un transcripto primario que puede ser alternativamente spliceado para dar origen 

a 38000 mensajeros distintos  [Graveley, 2001]. Aproximadamente el 70  %  de  los genes 

humanos,    y  cerca  del  42  %   en  Arabidopsis  thaliana,  poseen  un  evento  de  splicing 

alternativo como mínimo [Fededa et al., 2005; Filichkin et al., 2010].  

 

 

 

 

 

II.

P

nece

proce

célul

[Beye

en 

micro

trans

sobre

II  tra

los  g

secu

trans

llama

secu

elem

pose

cono

cons

facto

Fig

fac

siti

El proce

Para  enten

esario  descr

eso de splic

as.  En  198

er  y  Osheim

análisis 

ografía  ele

scriptos,  qu

e transcript

anscribe  (fig

genes  eucar

encia:  las 

scripto mad

adas  intron

encias deb

mentos que 

een  en  los 

ocidas  com

ervación  es

ores  de  la

gura I3: Regio

ctores que las

ios 5’ y 3’ de s

esamiento 

nder  el  sp

ribir  primer

cing norma

88  un  traba

m,  1988]  d

ultra‐estruc

ectrónica  d

ue  el  proce

tos nacient

g.  I2). Al  an

riotas  se  di

que  esta

duro o ARN

nes.  Los  int

en  ser  reco

las definan 

límites  en

o  dador  (e

s  variable  e

a  maquina

ones del ARN q

s reconocen. E

splicing (5’ss y

de los me

plicing  alt

ro  cómo  se

al, o constit

ajo  de  Beye

demostraba

ctural  a 

de  genes 

eso  de  spl

es a medid

nalizar  la  e

iferencian  d

arán  prese

m, que se 

trones  son 

onocidas po

[Black, 200

ntre  exone

en  el  5’) 

en  los  dist

ria  basal 

que participa

El esquema d

y 3’ss). Adapt

ensajeros, c

ernativo  e

e  produce  e

tutivo, en  la

er  y  Osheim

a,  basándos

través  d

activament

licing  ocurr

da que  la po

structura d

dos  tipos  d

ntes  en  e

denominan

eliminados

or  la maqu

03]. En parti

es  e  intron

y  aceptor 

intos  eucar

de  splicin

an en el proce

destaca dos ex

tado de [Mani

Figura

gen sie

Drosopde los a

[Beyer y

cortes y em

es 

el 

as 

m 

se 

de 

te 

re 

ol 

de 

de 

el 

n exones; y 

s  por  splicin

inaria de  la

icular, los ev

nes  secuen

de  splicing

riotas  (fig. 

ng  (como 

eso de splicingxones flanque

iatis y Tasic, 2

I2: A) micro

endo transcr

phila, B) esqu

autores sobre e

y Osheim, 198

mpalmes 

las que no

ng.  Para  qu

a  célula  com

ventos de s

cias  conse

g  (en  el  3

I3).  Estos 

por  ejem

ng en eucariota

eando un intr

2002].

P á g

ografía electr

ipto en un

uema de la in

el molde y los

88].

o estarán pr

ue  esto  suc

mo  tales, n

splicing con

nso  caract

3’),  cuyo  g

elementos 

plo  los  co

as y algunos d

rón. Se aclara

i n a  | 30 

rónica de un

embrión de

nterpretación

s transcriptos

resentes, 

ceda,  las 

necesitan 

stitutivo, 

erísticas, 

grado  de 

reclutan 

omplejos 

de los

an los

 

 

ribon

reco

acep

cons

Las 

inter

1999

intró

como

splice

sínte

proce

dand

núcle

confo

Figur

exón

difer

suced

proc

[Hou

nucleoprote

nocimiento

ptores, para 

ervación de

plantas,  co

rmedia,  y  a

9].  En  cualq

ón  llevada a

o  spliceosom

eosoma (lla

esis.  Allí,  se

eso  asistido

do  lugar  fin

eo  para  “

ormación c

ra I4: Defi

nica. El esq

rentes comp

diendo en los

eso de spliuse y Lynch, 2

eicos,  cono

o  de  los  int

permitir qu

e  los sitios 

on  intrones

mbos meca

quiera  de  l

a cabo por 

ma. Cada u

amados: U1

e  asocia  a  u

o  por  otras

nalmente  a

“conformar”

atalítica de

nición intró

quema mues

plejos que s

s primeros pa

licing. Adapta

2008]. 

cidos  como

trones  y  ex

ue la reacció

p

in

e

re

in

q

tí

ti

c

e

m

la

de splicing

s  más  cort

anismos  po

as  situacio

un mega‐co

uno de  los 

, U2, U4, U5

un  anillo  d

s  proteínas

  las  snRNP

”  el  splice

l spliceosom

ónica y

tra los

se van

asos del

ado de

o  snRNPs) 

xones,  y  el 

ón de splicin

Dos  mo

plantean pa

ntrones:  

exónica  (fig

econocen 

ntrón,  apar

que  debe 

ípicamente 

ienen  intro

onservados

ucariotas  c

mamíferos, 

a  gran  lo

, recurriénd

os  que  los

odrían  func

nes,  el  aco

omplejo de

pequeños 

5 y U6) deb

e  proteínas

,  como  el 

Ps.  Las mism

eosoma  [Pe

ma no exist

y  factores 

apareamie

ng ocurra e

odelos  alte

ra explicar 

la  definici

g.  I4).  En 

ambos  siti

reándose  lo

ser  elim

en  organis

ones  cortos

s.  Por  el 

con  genom

la definició

ngitud  de 

dose por  lo

s  mamífero

cionar  al m

ontecimient

e  ribo‐núcle

ARN nucle

be ser expor

s  Sm  (B/B′,

complejo  S

mas  son,  p

ellizzoni  et

e de novo e

auxiliares, 

nto  entre  l

en forma pre

ernativos 

el reconoci

ón  intróni

el  primero

os  de  splic

os  dos  extr

inada,  lo 

smos  como

  y  con  siti

contrario

mas  más  co

ón  intrónica

los  intro

o  tanto a  la

os,  estarían

ismo  tiemp

to  clave  es

eo‐partícula

ares  (snRNA

rtado al cito

, D1, D2, D

SMN  (Surviv

posteriorme

t  al.,  2002

en su estruc

P á g

que  prom

los  sitios  d

ecisa y efici

[Berget,  1

miento de 

ca  y  la  d

o  de  los  c

cing  en  un

remos  de  l

que  se 

o  las  levadu

os  de  splic

o,  en  org

omplejos,  c

a es complic

ones  y  la

 definición 

n  en  una  s

po    [Simpso

s  la  elimina

as  (snRNP) c

A) que  com

oplasma lue

D3,  E,  F  y G

val Motor 

ente,  impor

2;  Kiss,  20

ctura final, 

i n a  | 31 

ueven  el 

adores  y 

ente.  

1995]  se 

exones e 

definición 

casos  se  

n  mismo 

a  región 

observa 

uras  que 

cing muy 

ganismos 

como  los 

cada por 

  menor 

exónica. 

situación 

on  et  al., 

ación  del 

conocido 

mpone el 

ego de su 

G)  en  un 

Neuron), 

rtadas  al 

004].  La 

sino que 

 

 

se  fo

2008

C

apar

secu

de  e

proce

lleva

algun

cons

prese

intró

(Exon

(fig. 

�

C

de sp

¿por 

posib

este 

orma en un

8]. 

Cualquier  in

eamiento d

encias del c

structuras 

esos, puede

r a  la  inhib

nas  veces 

tituye  el  p

encia  de  si

ónica,  distin

n skipping),

I5). 

Cabe pregun

plicing inefi

  qué  estas 

ble sería qu

estado de 

n proceso m

nterferencia

de  los  comp

consenso, p

secundaria

e provocar 

ición total 

el  sitio  de

principio  de

tios  alterna

ntos  tipos  d

, sitios dado

ntarse por q

cientes. Si s

mutacione

ue  los exon

baja eficien

muy dinámi

a  con  el  r

plejos de  s

por aument

s o por un

una dismin

de dicho ev

e  splicing  i

el  splicing

ativos  cerca

de  splicing

ores  (5’ss)

qué existen 

son originad

es  no  son  e

es alternat

ncia de incl

co sobre el

reconocimie

nRNPs, ya 

o en la long

ión de pro

ución de le

vento de sp

implicado  s

alternativo

anos  y  de 

alternativo

o aceptore

en los orga

dos por mu

eliminadas 

tivos surgen

usión corre

l pre‐ARNm

ento  de  lo

sea por  cam

gitud de exo

teínas que 

 eficiencia d

plicing, en m

sea  utilizad

o.  Dependie

la  preemin

o  pueden  s

s  (3’ss) alte

�

anismos euc

utaciones de

por  selecc

n a partir d

esponde a u

F

e

c

p

i

s

(

b

a

m  [Black, 20

s  sitios  de

mbios de b

ones o intro

interfieran

del splicing

muchos me

do  y  otras 

endo  del  s

nencia  de  d

ser  observa

ernativos, o

�

cariotas est

e sitios de s

ión  negativ

e secuencia

un período 

Figura I5: Se

esquemática

clases de splicpueden presen

indicando en

sustrato (pre-

(ARNm) result

b) dador al

alternativo; y

P á g

003; House 

e  splicing  o

bases que a

ones, por fo

n  con  los d

. Si bien est

ensajeros ca

veces  no,

itio  mutad

definición  e

ados:  exón 

o  intrones r

os casos de

splicing más

va? Una  ex

as  intrónica

de prueba. 

muestran d

los distintos

icing alternati

ntar en un tr

n todos los

ARNm) y los

tantes. a) exón

lternativo; c)

d) retención d

i n a  | 32 

y Lynch, 

o  con  el 

alejen  las 

ormación 

iferentes 

to podría 

ausa que 

,  lo  que  

o,  de  la 

xónica  o 

cassette 

retenidos 

e eventos 

s fuertes, 

plicación 

as, y que 

Durante 

de manera

s tipos o

ivo que se

ranscripto,

casos el

productos

n cassette;

) aceptor

de intrón.

P á g i n a  | 33  

 

tal  período,  además  de  producirse  la  nueva  variante,  se  sigue  produciendo  la  variante 

antigua.  La  evolución  podría  luego  favorecer  la  adquisición  del  nuevo  evento  o  su 

eliminación.  Según  esta  explicación,  los  eventos  de  splicing  alternativo  serían  estados 

transitorios  de  exones  que  serán  eliminados  o  se  harán  constitutivos  [Ermakova  et  al., 

2006]. 

 Sin embargo, la conservación de muchos eventos de splicing alternativo en diferentes 

especies  sugiere  que  al  menos  otra  explicación  existe.  Una  alternativa  a  la  hipótesis 

anterior es que para  la célula resulta de gran utilidad mantener  la capacidad de generar 

distintos productos a partir de un único gen. Así, el  splicing alternativo  sería una  forma 

económica  de  aumentar  la  diversidad  proteica  de  la  célula.  Se  ha  propuesto  que  en 

muchos  casos,  los  eventos  de  splicing  alternativo  provienen  de  eventos  de  splicing 

constitutivo  por  aparición  de  un  sitio  de  splicing  competidor  [Koren  et  al.,  2007].  La 

situación en la cual este hecho representa una ventaja para la célula es aquella en la que 

el  proceso  de  splicing  alternativo  puede  ser  regulado.  Se  sabe  que  los  exones  que 

muestran regulación específica de tejido poseen un alto grado de identidad de secuencia 

entre especies y un gran sesgo hacia  longitudes que sean múltiplos de 3, sugiriendo una 

relevancia funcional para esta situación regulatoria [Xing y Lee, 2005].  

III. La regulación de la transcripción, efectos sobre el splicing 

Diversas  evidencias  apoyan  la  co‐transcripcionalidad  del  splicing  in  vivo,  desde  la 

observación en el microscopio electrónico de  la  formación de  los  lazos  intrónicos en  los 

ARN  que  están  siendo  transcriptos  (fig.  I2)  [Beyer  y  Osheim,  1988]  hasta  la  co‐

inmunoprecipitación  de  proteínas  que  participan  en  el  splicing  y  de moléculas  de ARN 

procesado asociadas a la cromatina en genes transcripcionalmente activos [Gornemann et 

al., 2005; Listerman et al., 2006] o de factores de splicing asociados a la ARN polimerasa II 

[Das et al., 2007]. Se ha mostrado in vivo que la ARN pol II recluta factores de splicing a los 

focos de transcripción  [Misteli y Spector, 1999]. También se ha trabajado en sistemas  in 

vitro,  donde  se  puede  estudiar  mecanísticamente  la  relevancia  funcional  de  este 

acoplamiento.  Estos  trabajos  han  mostrado  que,  en  general,  el  reclutamiento  co‐

P á g i n a  | 34  

 

transcripcional de proteínas de splicing, cuando  la transcripción es  llevada a cabo por  la 

ARN pol II, aumenta en gran medida la eficiencia del splicing y la estabilidad del mensajero 

[Das  et  al.,  2007],  aunque  hay  evidencias  de  que  en  ciertas  condiciones,  la  co‐

transcripcionalidad  no  es  suficiente  para  aumentar  la  eficiencia  del  splicing  [Lazarev  y 

Manley, 2007]. Lo que  sí está claro es que  la eficiencia de  splicing no es alta cuando  la 

transcripción es llevada a cabo por otras polimerasas, como la ARN pol I, la pol III o la ARN 

polimerasa del fago T7, en lugar de la ARN pol II. 

Una  consideración  a  ser  tenida  en  cuenta  es  que  la  co‐transcripcionalidad  no  es 

estricta,  en  el  sentido  que  no  todos  los  intrones  son  eliminados  a  medida  que  son 

transcriptos, ni todos son eliminados antes de que la transcripción finalice. Puede darse el 

caso  de  un  mismo  gen  en  el  cual  algunos  intrones  sean  procesados  co‐

transcripcionalmente  y otros post‐transcripcionalmente. Por ejemplo, en el  gen de BR1 

(Balbiani  ring  1)  en  Drosophila  el  intrón  3  es  procesado  casi  siempre  en  forma  co‐

transcripcional, mientras  que  el  intrón  4  sólo  lo  es  en  el  10  %   de  los  casos  [Bauren  y 

Wieslander,  1994].  Inclusive,  el  orden  de  eliminación  de  los  intrones no  tiene  por  qué 

seguir la dirección de la transcripción [de la Mata et al., 2010]. 

Si  bien  la  co‐transcripcionalidad  del  splicing  es  un  pre‐requisito  para  que  haya 

influencia  funcional  entre  los  dos  procesos,  no  implica  por  sí  sola  la  existencia  de  una 

interacción.  Evidencias  acumuladas  a  lo  largo  de  los  años  llevaron  al  planteo  de  dos 

modelos posibles, que no son excluyentes y podrían actuar en conjunto, para explicar  la 

influencia que podría tener la transcripción sobre el splicing alternativo [Kornblihtt, 2007]: 

El modelo de reclutamiento, plantea que la maquinaria transcripcional recluta 

factores  de  splicing  o  co‐activadores  transcripcionales  con  funciones 

regulatorias  sobre  el  splicing  del  ARNm  naciente.  Este  reclutamiento  podría 

darse en  forma diferencial en distintos contextos celulares, dando así  lugar a 

diferentes resultados de los eventos de splicing.  

P á g i n a  | 35  

 

El modelo  cinético, plantea que  la  velocidad de elongación de  la polimerasa 

afecta  el  momento  en  el  cual  diferentes  sitios  de  splicing  ‐que  pueden 

competir‐ son presentados, favoreciendo o desfavoreciendo el reconocimiento 

de  los  factores que  se unen a  los mismos,  según  la  “fortaleza” de  cada  sitio 

respecto al consenso. 

Si consideramos al splicing como un proceso co‐transcripcional y a la vez dinámico, las 

elecciones que  la maquinaria de splicing tome dependerán de  los elementos con  los que 

cuenta  en  un momento  dado.  Dado  que muchos  de  esos  elementos  corresponden  a 

secuencias del ARN que está siendo transcripto, el tiempo en el cual se transcriban influirá 

en  su  disponibilidad  para  la maquinaria  de  splicing.  En  conclusión,  la  regulación  de  la 

transcripción por la ARN pol II, ya sea por factores que se le unan y regulen su actividad o 

por la propia naturaleza del molde transcripto, tendrá repercusiones sobre las decisiones 

que se toman durante el procesamiento.  

La ARN pol II posee una particularidad que la diferencia de las otras polimerasas hasta 

aquí mencionadas. El dominio carboxi‐terminal (CTD) de su subunidad mayor es un arreglo 

inherentemente desestructurado pero conservado evolutivamente. En hongos, plantas y 

animales, está  compuesto por 25 a 52  repeticiones en  tándem de  la héptada  consenso 

YSPTSPST    y  puede  ser  altamente  fosforilado  cambiando  su  afinidad  por  diferentes 

factores que  involucrados en el procesamiento de  los mensajeros [Phatnani y Greenleaf, 

2006]. 

Si bien la ARN pol II es una enzima característicamente muy procesiva (puede recorrer 

un molde  de  varias  kilobases  en  forma  completa  sin  desprenderse),  siendo  capaz  de 

transcribir  genes  de  hasta  cerca  del millón  de  bases,  es  también  propensa  a  pausas  y 

arrestos  transcripcionales que determinarán  la  tasa de elongación  (velocidad medida en 

cantidad promedio de nucleótidos añadidos por unidad de tiempo) media observada. Las 

pausas  transcripcionales  son  eventos  normales  en  la  transcripción  de  todas  las  ARN 

polimerasas  dependientes  de  ADN  y  tendrían  funciones  regulatorias  de  la  elongación 

transcripcional [Sims et al., 2004]. Se supone que están causadas por un des‐alineamiento 

P á g i n a  | 36  

 

entre el extremo 3’ del ARN naciente y el sitio activo de  la polimerasa, son reversibles y 

están  reguladas por  la participación de diversos  factores de elongación,  tanto positivos 

como negativos [Conaway et al., 2000].  

Además de  los  factores que  se unen directamente a  la maquinaria  transcripcional y 

modifican su actividad, el estado del molde que se está transcribiendo también  la puede 

alterar. La transcripción en un molde cromatinizado es fuertemente regulada por factores 

que, no actuando directamente sobre  la polimerasa, modifican  la estructura cromatínica 

[Narlikar  et  al.,  2002].  Esto  puede  ocurrir  de  dos  formas  distintas,  una  mediada  por 

complejos  remodeladores  de  la  cromatina,  y  la  otra,  por  proteínas  que  producen 

modificaciones  post‐traduccionales  en  las  histonas,  especialmente  en  sus  colas  N‐

terminales [Johnson et al., 2005; Lee et al., 2005; Berger, 2007; Cottingham, 2008; Hou et 

al., 2008; Liu et al., 2010].  

Los  complejos  remodeladores  de  la  cromatina,  formados  por  un  número  de 

subunidades  proteicas  que  puede  superar  la  decena,  causan  el  desplazamiento  de 

nucleosomas con gasto de energía en  forma de ATP  [Flaus y Owen‐Hughes, 2001]. Esto 

podría  liberar  secuencias  de  ADN  importantes  y  también  ayudar  a  la  polimerasa  a 

atravesar los nucleosomas.  

Las  modificaciones  post‐traduccionales  que  pueden  observarse  en  el  dominio  N‐

terminal de las histonas incluyen, acetilación, metilación, fosforilación, glicosilación, ADP‐

ribosilación, ubicuitinación y sumoilación. Una de las modificaciones más estudiadas es la 

metilación  de  histonas  en  lisinas  o  argininas.  Distintas  metilaciones  pueden  estar 

involucradas tanto en activación como en represión de la transcripción, no existiendo una 

tendencia clara como en el caso de la acetilación [Schneider et al., 2004; Berger, 2007]. Si 

incorporamos estas modificaciones al concepto tras el modelo cinético se hace evidente 

que las modificaciones que generen (como la metilación) una estructura más compacta de 

la  cromatina,  causarán  una  menor  tasa  de  elongación;  y  aquellas  que  generen  una 

estructura más  laxa  (acetilación  por  ejemplo),  darán  lugar  a  tasas  de  elongación más 

 

 

eleva

et al.

 

IV.

 

L

sínte

estab

euca

ada  (fig.  I6)

., 2009; Kor

El fin de

Los niveles c

esis   nuclea

bilidad  de 

riotas [Guh

Figura I6: M

alta (ej.: cro

cromatina

según los s

del mismo p

) generando

rnblihtt et a

e la vida de

citoplasmát

r, procesam

los  distin

haniyogi y B

Modelo cinétic

omatina laxa

compacta –

itios que com

para con la se

o patrones 

l., 2009; Sc

e los mens

He vist

ticos de un m

miento  y ex

ntos  mensa

Brewer, 200

co. Se esquem

– acetilación

metilación). E

mpiten. La fue

ecuencia cons

de procesa

hor y Kornb

sajeros, la d

to un carac

mensajero 

xportación 

ajeros  pres

01]. En levad

matiza una situ

n) y otra en la

El resultado d

rza relativa d

senso.

amiento dif

blihtt, 2009;

degradació

col. Se desli

Marl

responden 

del núcleo

senta  trem

duras, la vid

uación en la c

a cual la tasa

del splicing d

de cada sitio e

erentes  [Ko

; Schor et a

ón y el spli

izaba por el

lon Brando

a un balanc

,  y  la  tasa 

mendas  flu

da media d

cual la tasa de

a de elongació

difiere para c

está asociada

P á g

ornblihtt, 20

l., 2010]. 

icing altern

filo de una

o, Apocalips

ce entre las

de degrada

uctuaciones 

e los mensa

elongación e

ón es baja (ej

cada situación

a la identidad

i n a  | 37 

007; Alló 

nativo  

a navaja.

sis Ahora

 tasas de 

ación.  La 

en  los 

ajeros va 

es

.:

n

d

P á g i n a  | 38  

 

desde  los 5 a  los 60 minutos. En  los vertebrados, varía entre 20 minutos y 24 horas. En 

consecuencia, diferencias de 1000 veces en  la abundancia de un ARNm, pueden resultar 

de una diferencia pequeña en la estabilidad [Brennan y Steitz, 2001]. Por consiguiente, los 

procesos que regulan  la vida media de  los mensajeros pueden afectar el crecimiento de 

una célula, cómo responde a su entorno y cómo se diferencia [Ross, 1995]. 

La  degradación  regulada  de  un  ARNm  es  llevada  a  cabo  por  la  interacción  de 

componentes estructurales del mensajero con factores proteicos específicos [Guhaniyogi 

y  Brewer,  2001].  Un  ejemplo  es  la  degradación mediada  por  codones  de  terminación 

(stop)  prematuros  (NMD,  nonsense‐mediated  decay),  un  mecanismo  conocido  de 

vigilancia  y  chequeo  de  los ARNm,  y  una  de  las  formas  que  tienen  los  eucariotas  para 

controlar  la calidad de sus mensajeros. El NMD elimina aquellos  transcriptos que darían 

productos  proteicos  truncados  [Maquat,  2004;  Shyu  et  al.,  2008]. Más  de  1/3  de  los 

eventos de splicing alternativo en humanos generan un codón de terminación prematuro 

que conllevaría la degradación del mensajero por NMD [McGlincy y Smith, 2008; McGlincy 

et al., 2010]. 

Las plantas y el splicing 

La organización exón‐intrón de plantas  superiores es  similar  a  la de  vertebrados; el 

splicing es catalizado en ambos sistemas por el spliceosoma, que está conformado por las 

snRNPs y proteínas auxiliares. Como en otros eucariotas, el proceso de splicing  también 

utiliza  un  gran  número  de  proteínas  no‐snRNP,  que  incluye  a  proteínas  ricas  en 

Serina/Arginina  (SR).  Sin  embargo hay  algunas diferencias  significativas:  los  intrones de 

plantas  son  generalmente  más  cortos  y  los  requerimientos  para  su  reconocimiento 

también difieren (las células de plantas en general fallan en procesar ARNs heterólogos). 

La  diferencia más  importante  radica  en  la  alta  riqueza  de  los  intrones  de  plantas  en 

nucleótidos UA o U, en comparación con la que presentan los intrones de  vertebrados y 

levaduras. Estas secuencias, distribuidas a lo largo de todo el  intrón, son requeridas para 

el eficiente procesado del mismo y la elección del sitio de splicing (Lorković et al., 2000). 

Además, se postula en las plantas la existencia de un proceso activo de reconocimiento de 

P á g i n a  | 39  

 

intrones  en  lugar  del  proceso  de  definición  exónica  postulado  para  los  vertebrados, 

aunque existen  trabajos que  implicarían a este último en algunos casos  (Simpson et al., 

1999).  

Se piensa que el splicing alternativo sería un evento menos común en plantas que en 

otros eucariotas superiores, sin embargo, análisis bioinformáticos en Arabidopsis thaliana 

han comenzado a cuestionar esta idea (Kazan, 2003) y actualmente se sabe que cerca del 

42 %  de los genes que tienen intrones en Arabidopsis sufren splicing alternativo [Filichkin 

et al., 2010]. La retención intrónica es el evento de splicing alternativo más frecuente en 

plantas  (fig.  I7).  Se  diferencia mecanísticamente  de  las  otras  posibilidades  en  que  no 

involucra una competencia entre distintos sitios dadores y aceptores de splicing (fig.  I5). 

Los  mensajeros  parcialmente  procesados  probablemente  sean  retenidos  en  el  núcleo 

dado que la presencia de intrones representa un desafío para el transporte nuclear, en el 

sentido de que varios puntos de control deben ser traspuestos para que el transcripto sea 

transportado  al  citoplasma  [Black,  2003];  aunque  en  circunstancias  específicas,  como 

sucede en la biología de los retrovirus, factores codificados por la célula logran sortear la 

barrera impuesta por el aparato de exportación núcleo‐citoplasma. Aproximadamente un 

30 %  de genes de Arabidopsis que sufren splicing alternativo presenta retención de intrón 

según análisis computacionales (fig. I7), de los que al menos un porcentaje fue confirmado 

por  transcripción  reversa  seguida  de  la  reacción  en  cadena  de  la  polimerasa  o  RT‐PCR 

[Ner‐Gaon y Fluhr, 2006; Kim et al., 2007]. De forma similar a lo que sucede en humanos, 

la gran mayoría de genes  con  splicing alternativo en Arabidopsis  codifica proteínas  con 

funciones  regulatorias.  Además,  los  genes  asociados  a  respuestas  frente  a  estrés  son 

particularmente  propensos  a  poseer  splicing  alternativo,  tanto  en  plantas  como  en 

animales (Kazan, 2003). Los pre‐ARN de los genes de Arabidopsis que codifican proteínas 

SR, una familia conservada de reguladores de splicing, sufren gran cantidad de eventos de 

splicing  alternativo  produciendo  95  mensajeros  diferentes  a  partir  de  sólo  15  genes 

[Palusa et al., 2007]. 

P á g i n a  | 40  

 

 

Actualmente  en  PubMed  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)  se  pueden 

encontrar  más  de  600  publicaciones  que  relacionan  los  temas  splicing  alternativo  y 

plantas; para el momento en que comenzaba esta tesis, por el 2005, apenas llegaban a la 

mitad. Esto implica, que en los últimos años se ha avanzado mucho en este campo y en el 

conocimiento del modo en que las plantas regulan el procesamiento de los transcriptos, si 

repiten estrategias de  los  animales  y/o presentan novedades en  su  regulación  y  cuáles 

son. Esta última frase, resume las razones que motivaron la realización de la presente tesis 

y de los experimentos que discutiremos en las próximas secciones. 

   

Figura I7: Distribución de los diferentes tipos de splicing alternativo en distintos

eucariotas (extraído de [Kim et al., 2007]).

 

P á g i n a  | 41  

 

Hipótesis general  

 

Si bien cada capítulo contará con sus propios objetivos y estrategias, expondré aquí la 

hipótesis detrás de  toda  la  tesis debido a que  la misma  tiene un alcance general y es  la 

motivación que nos llevó a trabajar en Arabidopsis thaliana. 

 

El splicing alternativo es un mecanismo fisiológicamente relevante en las 

plantas que  les permite adaptarse a  los cambios en  las condiciones de su 

entorno, como son aquellas relacionadas a la luz incidente. 

 

   

P á g i n a  | 42  

 

Prólogo del Capítulo I  (de lo personal y emocional) 

¿Quién te quita lo bailado?

Las Sabrosas Zariguellas

Paréntesis  personal:  Mi  director  de  tesis,  un  gran  consejero  y  una  gran  persona,  con 

acciones y modos que generan admiración en los que llegamos a conocerlo siempre logra 

–a pesar de  sus preocupaciones que no  suelen  ser muy pocas‐  “hacerse unos minutos” 

para charlar a nivel científico, académico y/o personal. Hay una frase que no se cansa de 

repetir: “El producto de la tesis doctoral es el becario”. Con esta quiere decir que más allá 

de los resultados obtenidos, del éxito o fracaso a nivel publicaciones, de las frustraciones y 

de la suerte (o más común, la ausencia de ella); es el trabajo que vamos haciendo a diario, 

los  reportes  que  leemos,  que  estudiamos,  que  discutimos;  los  cursos,  el  día  a  día  con 

nuestros compañeros, un aprendizaje en sí mismo que se ve reflejado en nuestro propio 

saber, en la capacidad de generar nuevas preguntas e hipótesis y en las herramientas que 

adquirimos para responderlas. ¿Quién nos quita lo bailado? 

Antes  de  finalizar mis  estudios  de  grado,  discutimos  con Alberto  sobre  el  futuro  y 

sobre  lo que yo planeaba hacer.  Los dos dejamos en  claro que nos parecía  interesante 

probar  suerte  en  el  mundo  de  las  plantas.  Alberto  es  por  definición  un  botánico 

sistemático fanático, cualquiera que haya paseado por un lugar con al menos 1 planta con 

él puede dar  fe de estas palabras.  Sin embargo, el  camino que eligió para  su  actividad 

científica,  lejos  estaba  de  estos  verdes  organismos.  Mucho  más  lejos  estaba  el 

conocimiento que  tenía yo de  los mismos  (apenas un aficionado de  la biología vegetal). 

Pero a ambos nos  tentaba  la  idea de abrir esa nueva puerta  con  los  riesgos que podía 

implicar.  Tan  sólo  un  día  después  de  la  charla  que mantuvimos  con  Alberto, Marcelo 

Yanovsky dio una clase en la materia de Sara Maldonado, que yo estaba cursando en ese 

momento. Me  pareció  increíble  lo  que  él  estudiaba  y  de  inmediato  establecimos  una 

colaboración… durante el  recreo. Se organizó una  reunión para que pudiéramos charlar 

P á g i n a  | 43  

 

los 3 con tranquilidad y comencé a transitar el camino de esta tesis. Más tarde caminaría 

también con la ayuda de Pablo Cerdán, Santiago Mora, Sara Maldonado, Noemí Colombo, 

Fabio Causín, Mercedes Rivero, Gus‐Gudesblat (entre otros Iusem), Maria Kalyna, Andrea 

Barta,  la gente de  los  laboratorios de Pablo, Marcelo y Jorge Casal, y ya no habría vuelta 

atrás. Los primeros congresos en que pude entrar en contacto con la gente del mundo de 

la  fisiología y  la biología molecular de  las plantas,  terminarían definiendo que el camino 

elegido era, gracias a ellos, cómodamente transitable.  

Decididos,  escribimos  el  proyecto  de  tesis. No  sabía  en  ese  entonces  lo  poco  que 

sabía, incluso menos que ahora. 

La  idea era comenzar con 1 gen, uno cualquiera que tuviera al menos 2 variantes de 

splicing,  ver  si  existía  alguna  regulación mediada por  la  luz  sobre  el  evento de  splicing 

alternativo, y empezar a buscar el mecanismo detrás de esa regulación. Era OBVIO que iba 

a estar involucrado 1 fitocromo… o 1 criptocromo… no había otra posibilidad… ¿no? 

No iba a ser esta la última vez que me equivoque, ni la peor equivocación, sólo sería 

otra hipótesis  incorrecta, uno más de esos “resultados negativos” que muchas veces no 

forman parte de ningún trabajo y no integran la tesis pero, en definitiva, junto a la gente 

que nos ayuda a interpretarlos y a sobreponernos son los que “nos hacen”.  

Me  parecía  injusto  (sobre  todo  hacia mi  persona)  comenzar  directamente  con  la 

introducción teórica, los resultados y sus conclusiones, sin “introducirlos” previamente en 

el  contexto  en  que  fueron  generadas.  Puede  ser  interpretado  como  un  intento  de 

acercarlos  a  los  razonamientos  detrás  de  cada  afirmación,  o  –a  un  nivel  personal‐,  un 

paréntesis que permitió reafirmarme y dejar por sentado el concepto detrás de “quién te 

quita lo bailado”. 

 

 

P á g i n a  | 44  

 

Capítulo I  

Regulación del splicing alternativo de RSp31 por la luz 

 

Introducción  

La naturaleza se ha planteado el problema de cómo atrapar la huidiza luz que llega

hasta la Tierra y cómo almacenar en forma consistente la más volátil de las energías

Julius Robert Mayer, 1842

La mayor parte de la energía libre consumida por los seres vivos proviene en primera 

instancia de la energía de la luz solar. Los organismos capaces de utilizar directamente esa 

energía, conocidos como foto‐autótrofos, son la base de la vida en nuestro planeta (junto 

a  los  litó‐trofos, que obtienen  la energía por oxidación de compuestos  inorgánicos). Las 

plantas,  que  son  organismos  foto‐autótrofos,  generan  energía  química  a  partir  de  la 

lumínica  por medio  de  una  serie  de  reacciones  que  se  dan  lugar  durante  un  proceso 

conocido como fotosíntesis: 

           H2O + CO2  (CH2O) + O2           Ecuación básica de la fotosíntesis 

P á g i n a  | 45  

 

En  la ecuación de arriba  (CH2O) representa un azúcar  formado por  la asimilación del 

dióxido de carbono atmosférico gracias a  la energía de  la  luz. Anualmente se almacenan 

unas  1010  toneladas de  azúcares  y otros  compuestos orgánicos,  aproximadamente  1017 

kcal de energía libre almacenadas por la fotosíntesis (cerca de 2 x 1014 Big Mac).  

Debido a que las plantas son organismos sésiles y a que dependen completamente de 

la  energía  de  la  luz  solar  para  vivir  es  necesario  que  puedan  detectar  la  intensidad,  la 

calidad y la dirección de éste factor ambiental para responder apropiadamente al mismo 

optimizando su crecimiento y desarrollo [Batschauer, 1999].  

Volviendo  a  la  frase  de  Mayer  que  abre  el  capítulo  y  esta  introducción  ¿cómo 

resolvieron  las  plantas,  o  la  naturaleza,  el  problema  de  atrapar  la más  huidiza  de  las 

energías? 

1. Fotosíntesis 

No es  la  idea de  la  introducción  rememorar  cada uno de  los pasos que  se  suceden 

durante el proceso de fotosíntesis y que pueden ser leídos con profundidad suficiente en 

distintos libros de texto; pero sí deseo resaltar las características del sistema que tuve en 

cuenta y fueron útiles en mis estudios. 

El cloroplasto y los fotosistemas 

Desde  su  origen  evolutivo  como  una  cianobacteria  endosimbionte  hace 

aproximadamente 1‐1,5 mil millones de años, el cloroplasto se  integró completamente y 

definió a los eucariotas fotosintéticos. Conceptualmente podemos dividir la fotosíntesis en 

dos fases que ocurren enteramente en esta organela. Por un lado, la fase de las reacciones 

dependientes de  la  luz que  tiene  lugar en  la membrana de  los  tilacoides. En dos de  los 

diferentes complejos proteicos  integrados a  la membrana tilacoidal, el fotosistema  I y el 

fotosistema  II, unos pigmentos  llamados clorofilas absorben energía de  la  luz e  inician el 

flujo de electrones generando ATP y poder reductor. Por otro lado, esa energía química es 

utilizada  en  el  estroma  del  cloroplasto  en  una  segunda  fase,  independiente  de  la  luz, 

P á g i n a  | 46  

 

donde el CO2 es asimilado por  la  ribulosa‐1,5‐bifosfato carboxilasa/oxigenasa  (RUBISCO) 

generando azúcares. La figura I8 esquematiza las diferentes etapas. 

La interacción entre el fotosistema I, que puede ser excitado por radiación de longitud 

de onda  inferior a los 700 nm generando un reductor fuerte que conduce a la formación 

de NADPH (NADPH + H+) y el fotosistema II, que puede excitarse con longitudes de onda 

menores a los 680 nm produciendo un oxidante fuerte que conduce a la formación de O2, 

establece  un  gradiente  de  protones  a  través  de  la  membrana  del  tilacoide  y  la 

consiguiente  formación de ATP por  la  fosforilación  fotosintética o  fotofosforilación  (ver 

Figura I8). 

El  fotosistema  II  cataliza  la  transferencia  de  electrones  entre  el  agua  y  la 

plastoquinona, en la dirección termodinámicamente desfavorable, utilizando energía libre 

de  la luz. Cuando absorbe dos electrones y dos protones cedidos por el fotosistema II, la 

plastoquinona  se  convierte  en  plastoquinol  (estado  reducido),  pasa  a  formar  parte  del 

pool*  de  plastoquinona/plastoquinol  (PQ/PQH2)  de  la membrana  del  tilacoide  y  puede 

transferir sus electrones al siguiente aceptor de  la cadena [Chain, 1985]. El complejo del 

citocromo  b6f  cataliza  la  transferencia  de  electrones  desde  el  plastoquinol  a  la 

plastocianina [Illerhaus et al., 2000] y bombea protones (H+) concomitantemente a través 

de  la membrana  tilacoidal  hacia  el  lumen  del  tilacoide. Hasta  aquí  se  ha  generado  un 

gradiente  de  protones  por  la  acción  conjunta  del  fotosistema  II  y  el  complejo  del 

citocromo  b6f.  Además,  se  redujo  a  la  plastocianina.  Esta  última,  cede  luego  sus 

electrones a un aceptor que forma parte del fotosistema I, el fotosistema absorbe luz y es 

capaz de transferir los electrones en estado excitado a la ferredoxina que los cederá, por 

la  acción  de  la  ferredoxina‐NADP  reductasa,  al  NADP+  formando  NADPH.  Como  esta 

reacción ocurre del lado del estroma, la toma de un protón (H+) de ese lado para reducir al 

NADP+, también contribuye con la generación del gradiente de protones. La disipación de 

este gradiente a través de la ATP sintetasa sirve para generar ATP [Nakamoto et al., 2008]. 

* Nota de no-traducción: no encontré una traducción al español que comunique lo mismo que la palabra pool en

inglés por lo que decidí utilizarla así, aunque en cursiva para resaltar su origen en otra lengua. Lo más cercano al

concepto en español sería una mezcla de: grupo, banco y reserva.

 

 

E

poste

este 

1,5‐b

dos 

resol

rege

asim

L

adem

2007

cont

u  ox

origi

Figura

dentro

El  poder  re

eriores que

grupo de r

bifosfato pa

moléculas 

lviera  el m

nera  la  rib

ilando, por 

La asimilació

más de ATP

7]  son  prot

ienen dos r

xidado.  Dos

nalmente  c

I8: esquema

del cloroplas

eductor  y 

e permiten 

reacciones y

ara dar un i

de  3‐fosfo

ecanismo  d

ulosa‐1,5‐b

lo tanto, 6 

ón de CO2 

P y poder re

teínas  de 

residuos de 

s  tiorredoxi

como  regul

del proceso f

sto (adaptado

el  ATP  ha

la generac

ya que es  la

ntermediar

oglicerato. 

de  las  reac

ifosfato,  da

CO2 [Bassh

sólo ocurre

eductor, se

unos  12  k

cisteína ce

nas  (TRX)  c

adores  dep

fotosintético y

de [Meyer et

sta  aquí  g

ión de azú

a que catal

rio de seis c

El  ciclo  de

cciones  de 

ará  como  r

am et al., 1

e durante e

ñales regul

Da  present

rcanos, los 

cloroplástic

pendientes 

y la fosforilac

al., 2009]).

generados, 

cares.  La R

iza  la conde

carbonos qu

e  Calvin  (lla

la  “fase  os

resultado  u

950; Portis 

el día, esto 

adoras. Las

tes  en  tod

mismos pu

cas,  TRX  f  y

de  la  luz  d

ción fotosinté

son  utiliza

UBISCO es 

ensación de

ue se hidrol

amado  así 

scura”  de  la

na  hexosa 

y Parry, 200

se debe a 

s  tiorredoxi

dos  los  org

eden estar 

y  TRX m,  f

de  varias  e

ética en la me

P á g

ados  en  re

la enzima 

el CO2 con 

liza rápidam

en  honor 

a  fotosínte

luego  de  6

07]. 

que  la  luz 

nas  [Lemai

ganismos  vi

en estado 

fueron  iden

nzimas  del 

embrana del t

i n a  | 47 

eacciones 

clave de 

ribulosa‐

mente en 

a  quién 

esis),  que 

6  vueltas 

produce 

re et al., 

ivos  que 

reducido 

ntificadas 

ciclo  de 

tilacoide

P á g i n a  | 48  

 

Calvin. La forma reducida o sulfhidrilo de las TRX mencionadas es la más abundante en luz 

y  es  capaz  de  reducir  puentes  disulfuros  que  controlan  la  actividad  de  enzimas 

biosintéticas.  A  través  de  estrategias  proteómicas  se  han  identificado  varios  blancos 

cloroplásticos para las TRX [Balmer et al., 2003; Wong et al., 2004; Bartsch et al., 2008]. La 

TRX oxidada es reducida por la ferredoxina en una reacción catalizada por la ferredoxina‐

tiorredoxina reductasa. De esta manera las actividades de la fotosíntesis están controladas 

en luz y oscuridad por el poder reductor de la ferredoxina y más tarde de la tiorredoxina. 

La actividad de  la RUBISCO  también está  controlada por  la  luz.  La noción de que  la 

regulación de su actividad es un proceso espontáneo controlado por los cambios en el pH 

del estroma y el Mg++ debidos a  la  iluminación persiste en  los  libros de texto a pesar de 

que se ha acumulado evidencia de  lo contrario  [Portis  Jr y Salvucci, 2002]. La activación 

depende  de  otra  enzima  denominada  RUBISCO  activasa  (RCA),  que  hidroliza  ATP 

promoviendo  la    disociación  de  azúcares‐fosfato  inhibitorios  (2‐carboxiarabinitol  1‐

fosfato) que se unen a  la RUBISCO, permitiendo así  la reapertura de su sitio activo. RCA 

consiste  usualmente  de  dos  isoformas  generadas  a  partir  del  splicing  alternativo  de  su 

mensajero.  Su  actividad  está  regulada  por  la  relación  ADP/ATP  y  la  respuesta  a  esta 

relación es modulada en la isoforma proteica larga (la más activa) por cambios redox (de 

óxido‐reducción) mediados por TRX  f. Esto permite  la modulación de  la RUBISCO por  la 

intensidad de la luz [Houtz y Portis, 2003]. 

En resumen, la luz absorbida en los fotosistemas es convertida en energía química en 

la  forma  de  NADPH  y  ATP,  que  sirven  de  co‐sustratos  en  la  reducción  del  CO2  a 

carbohidrato  por  las  enzimas  del  ciclo  de  Calvin.  Además  la  luz  cumple  otra  tarea 

fundamental:  es  un  elemento  regulatorio.  La  luz  activa  vías  anabólicas  fotosintéticas  y 

desactiva  vías  catabólicas  requeridas  en  oscuridad,  evitando  así  ciclos  fútiles  que 

ocurrirían si reacciones opuestas tienen  lugar al mismo tiempo. Podemos sumarle a esto 

el hecho de que  la  luz varía en  intensidad  (cantidad) y en  longitud de onda  (calidad),  lo 

que generó en  las plantas  la evolución de complejas redes de regulación para ajustar su 

P á g i n a  | 49  

 

metabolismo a las condiciones cambiantes del entorno y optimizar así el aprovechamiento 

de la energía lumínica. ¿Cómo es que perciben estas diferencias? 

2. La luz como señal 

I. Los ojos de las plantas, los fotorreceptores 

La mayoría de  los procesos del desarrollo  a  lo  largo de  la  vida de  las plantas están 

influenciados por  la  luz: germinación de semillas, desarrollo de  la plántula, detección de 

plantas  vecinas,  fototropismo  y  floración.  La  luz  es  percibida  por  diferentes 

fotorreceptores  que  detectan  diferentes  aspectos  del  espectro  de  luz  solar.  Estos 

fotorreceptores incluyen a los fitocromos (Phy), responsables de la detección de luz roja y 

roja  lejana,  y  a  los  criptocromos  (Cry),  responsables  de  detectar  luz  azul  junto  a  las 

fototropinas [Batschauer, 1999; Gyula et al., 2003].   

Los  fitocromos son apo‐proteínas codificadas por una pequeña  familia de genes que 

en Arabidopsis thaliana cuenta con 5 miembros (PHYA  a PHYE). Todos ellos existen como 

dímeros compuestos de dos polipéptidos de 125 kDa unidos, cada uno, covalentemente a 

un  cromóforo  tetrapirrol.  Son  sintetizados  en  oscuridad  en  la  forma  fisiológicamente 

inactiva que absorbe luz roja (R) conocida como Pr. Seguido a la absorción de un fotón, la 

forma inactiva Pr es convertida en la fisiológicamente activa que puede absorber luz roja 

lejana (FR), llamada Pfr, y volver nuevamente a la forma Pr. Además de inducir un cambio 

conformacional en  la estructura de  los  fitocromos,  la  luz  causa  la auto‐fosforilación del 

PHYA [Yeh y Lagarias, 1998] y de otras proteínas blanco de los fitocromos [Sineshchekov y 

Fankhauser,  2004],  y  modula  la  distribución  núcleo‐citoplasma  de  los  fitocromos  de 

manera dependiente de la calidad e intensidad. En el núcleo los fitocromos se concentran 

principalmente  en  estructuras  denominadas  speckles*  que  exhiben  un  patrón  de 

formación regulado por ciclos de luz/oscuridad [Kircher et al., 2002]. Los speckles son sub‐

estructuras nucleares poco definidas y poco “entendidas” en las plantas. En las células de 

animales  se  los  reconoce  como  lugares asociados a  factores de procesamiento de ARN, 

factores de transcripción, proteínas asociadas a la exportación de los mensajeros, etc. 

* Nota de no-traducción: nuevamente he preferido conservar la palabra en su idioma de origen por la falta de una

traducción adecuada, podría haberla reemplazado quizás por gránulos nucleares.

P á g i n a  | 50  

 

 

Los criptocromos (CRY1 y CRY2 en Arabidopsis thaliana) son flavoproteínas presentes 

en diferentes  taxones  [Cashmore et al., 1999] que se cree evolucionaron a partir de  las 

fotoliasas. A diferencia de estas últimas, los criptocromos carecen de actividad reparadora 

del ADN. CRY2 se localizan principalmente en el núcleo, lo mismo vale para CRY1 al menos 

en oscuridad, y los estudios recientes demuestran que la regulación de la expresión génica 

sería el mecanismo más importante en la vía de señalización de los criptocromos. Además, 

CRY2 interactuaría físicamente con PHYB estando asociados a los speckles nucleares [Lin y 

Shalitin, 2003]. También se postula que  la percepción de  luz azul por  los CRY gatillaría  la 

rápida  desactivación/degradación  de  COP1  (Constitutive  Photomorphogenesis),  un 

regulador negativo de  la fotomorfogénesis, que actuaría como una E3‐ligasa provocando 

la degradación de ciertas proteínas en oscuridad. Uno de sus blancos sería HY5 (elongated 

Hypocotyl  in  light 5), un  factor de  transcripción que activa  la expresión de varios genes 

“río abajo” de los fotorreceptores [Gyula et al., 2003].  

La figura I9 resume los conceptos expuestos hasta aquí y muestra también los eventos 

que  regulan  las  distintas  vías  de  señalización  a  nivel  fisiológico.  Se  puede  apreciar  lo 

compleja que  es  la  situación  y  la  cantidad de  actores  en  el  desarrollo de  la  trama,  sin 

embargo  a  esta  historia  le  falta  otro  punto  de  vista  ¿puede  existir  otro  “ojo”  en  las 

plantas? 

 

 

 

Figur

2003

 

ra I9: esquema

3]).

a de las vías dde señalizació

 

ón de los diferentes fotorreeceptores (ada

P á g

aptado de [Gy

i n a  | 51 

yula et al.,

 

P á g i n a  | 52  

 

II. Un tercer ojo, el cloroplasto  

En biología nada tiene sentido excepto a la luz de la evolución

Theodosius Dobzhansky

Lynn  Margulis  parafrasea  a  Dobzhansky  en  un  artículo  (Vol.  31  Nov.  2004, 

www.socgenmicrobiol.org.uk/pubs/micro_today/pdf/110406.pdf)  de  “Microbiology 

Today” diciendo que: “actualmente, en biología molecular nada tiene sentido si no es a la 

luz  de  la  historia  evolutiva  de  los  organismos  en  sus  paleo‐ambientes  específicos”.  Sin 

hacer caso omiso a estas palabras, deseo comenzar esta sección aclarando que se asume 

en  la  actualidad  que  el  cloroplasto  evolucionó  por  la  endosimbiosis  de  una  bacteria 

fotosintética con un eucariota ancestral  [Margulis, 1975; Margulis y Bermudes, 1985]. El 

genoma ancestral de la bacteria contenía presumiblemente toda la información necesaria 

para la vida de tal organismo. Con el paso del tiempo evolutivo, la relación endosimbiótica 

que  llevó  a  la  aparición  de  las  algas  verdes,  y  posteriormente  a  las  plantas,  redujo  la 

capacidad codificante de ese genoma. Muchos genes que no son necesarios para  la vida 

en simbiosis se pueden haber perdido y una gran mayoría fueron transferidos al huésped. 

En  la actualidad, el genoma de un plástido de plantas superiores contiene menos de 100 

marcos de lectura abiertos, y el resto de los más de 3000 polipéptidos que se encuentran 

en un cloroplasto, son codificados por genes alojados en el núcleo [Abdallah et al., 2000]. 

Complejos  fotosintéticos y metabólicos esenciales del cloroplasto están compuestos por 

subunidades codificadas por distintos genomas (nuclear y plastídico)  lo que obliga a una 

coordinación ajustada en la expresión de los mismos. El núcleo codifica la mayoría de los 

genes  requeridos  para  la  expresión  génica  del  cloroplasto,  y  en  adición  a  tal  control 

“anterógrado” es que han evolucionado mecanismos de regulación “retrógrada”. A través 

de éstos, el estado funcional y de desarrollo del cloroplasto puede modular  la expresión 

de  genes  nucleares  que  codifican  para  proteínas  de  localización  plastídica  [Nott  et  al., 

P á g i n a  | 53  

 

2006]. Podemos agrupar estas  señales  retrógradas en dos grandes categorías:  i) control 

biogénico, el control a nivel de desarrollo de la biogénesis de la organela tiene que darse 

en  la  fase  apropiada  y  las  subunidades  y  cofactores  necesarios  para  el  ensamblado 

correcto deben estar presentes en  la estequiometría  correcta; y  ii)  control operacional, 

para mantener la producción óptima y reparar los daños inducidos por el estrés oxidativo 

son  necesarios  cambios  rápidos  en  el  metabolismo  energético  que  se  ajusten  a  las 

condiciones del entorno y de desarrollo [Pogson et al., 2008].  

Me  enfocaré  en  las  vías  de  señalización  retrógrada  bajo  las  cuales  el  cloroplasto 

controla la expresión de genes nucleares. La primera evidencia de un rol del cloroplasto en 

el  control  de  la  expresión  nuclear  provino  de mutantes  de  cebada  y  Pelargonium  con 

defectos  en  los  ribosomas  plastídicos.  En  esos  mutantes,  varias  enzimas  del  ciclo  de 

Calvin,  codificadas  nuclearmente,  se  vieron  afectadas  en  su  expresión.  Utilizando 

Norflurazón (un herbicida) y luz de alta intensidad se genera un daño a los cloroplastos, en 

estas  condiciones  se  observó  que  la  expresión  de  varios  genes  que  codifican  proteínas 

relacionadas con la fotosíntesis disminuye. Si bien se propuso un único “factor plastídico” 

o señal, en la actualidad sabemos que son múltiples vías las que controlan la expresión de 

los genes nucleares en función de  los requerimientos del cloroplasto [Beck, 2005]. Se ha 

acumulado evidencia experimental que permite definir al menos cinco vías de señalización 

retrógrada:  una  de  ellas  relacionada  a  intermediarios  de  la  biosíntesis  de  clorofila  o 

tetrapirroles; otra, es  inducida por  la  inhibición de  la expresión génica del plástido; una 

tercera,  tiene que ver con una  señalización por azúcares;  la cuarta es controlada por el 

estado  redox  de  la  cadena  de  transporte  electrónico  fotosintético;  y  una  quinta  que 

emplea  especies  reactivas  de  oxígeno  (o  ROS)  [Zhang  et  al.,  2010].  La  figura  I10 

esquematiza las distintas vías propuestas. ¿Qué sabemos de cada vía? 

 

 

Figura I1

experime

modelos p

los interm

3

A

entre

expe

I.

S

inhib

inhib

(inhi

una 

0: esquema d

ntal. Se detall

propuestos pa

mediarios que

3. El lengu

A continuac

e  el  clorop

erimentos re

Expresió

Si  tratamos

bidores de  l

be  la ARN  p

bidores de 

falla  en  la

de las vías de

la además a lo

ara la vía de l

llevan la seña

uaje del c

ión resumir

plasto  y  el 

ealizados du

ón génica d

  a  las  plan

la expresió

polimerasa 

la traducció

  inducción 

e señalización

os azúcares, p

los tetrapirrol

al entre el clor

loroplasto

ré el estado

núcleo  hac

urante mi d

del plástid

ntas  en  los

n de  los ge

del  clorop

ón del cloro

de  la  exp

n retrógrada q

producto de la

les o intermed

roplasto y el n

o 

o actual del

ciendo  hinc

doctorado.

do 

s  primeros 

enes plastíd

lasto)  o  los

oplasto y ta

presión  de 

que han sido

a fotosíntesis.

diarios de la c

núcleo.

 conocimie

capié  en  lo

3  días  de 

dicos como 

s  antibiótic

ambién de l

genes  nucl

descriptas y

Las dos flech

clorofila. Se co

nto acerca

os  puntos  r

su  desarr

la  toxina  t

os  lincomic

a mitocond

leares  que 

P á g

que poseen c

has violetas in

onoce muy po

de la comu

relevantes 

ollo  con  d

agetina  (to

cina  o  clora

dria), el resu

se  expresa

i n a  | 54 

cierto asidero

ndican los dos

oco acerca de

unicación 

para  los 

iferentes 

xina que 

anfenicol 

ultado es 

an  en  el 

o

s

e

 

 

desa

(ej.: 

que e

L

biosí

(pho

nucle

aisla

norfl

impli

las P

plást

prom

 

rrollo norm

LHCB1.2) o

existe una v

La vía de PG

íntesis  de 

tobleaching

eares como

r  diferente

urazón. Un

icada en  la 

PPR  (Pentat

tido.  El  fac

motores de 

mal,  como  a

o  la subunid

vía dependi

GE también 

carotenoi

g), es decir, 

o LHCB1.2. 

es  mutante

na de estas

vía de PGE

tricopeptide

tor  de  tran

los genes re

aquellos qu

dad pequeñ

ente de la e

se ha inves

des  que

“quema” lo

Esta caract

es  que  ex

s mutantes,

E (fig. I11). G

e Repeat)  y

nscripción  A

egulados en

 

ue  codifican

ña de  la RU

expresión g

stigado con

al  infiltrar

os cloroplas

terística o  f

xpresan  es

,  llamada g

GUN1 es un

y  sensaría  e

ABI4  actúa

n el núcleo [

n para  subu

BISCO  [Pog

énica del pl

n el uso de 

rse  en  pla

stos. Su uso

fenotipo mo

stos  genes

gun1  (genom

na proteína

el  estado  tr

a  “río  abajo

[Koussevitz

Figura

PGE, la

su pos

de la

situació

cloropl

la der

sucede

expresi

El pas

(ProtoIX

(Mg-Pr

la que

conform

El facto

coordin

en el

[Pogson

unidades d

gson et al., 

lástido (PGE

norflurazón

antas  caus

o reprime la

olecular  fue

  aún  bajo

mes uncoup

a que perte

ranscripcion

o”  de  GUN

ky et al., 20

P á g

I11: esquema

a vía de los te

ible interacci

izquierda

ón “normal

lasto funciona

recha muest

cuando in

ión de genes

saje del prot

X) a su form

rotoIX) está c

latasa de Mg

mada por GU

or de transcr

na los efectos

núcleo (a

n et al., 2008]

el  complejo

2008]. Esto

E).  

n, un inhibid

sa  fotobla

 expresión 

e aprovecha

o  tratamie

pled) mues

nece a la fa

nal/traducc

N1  pegándo

007].  

i n a  | 55 

a de la vía de

etrapirroles y

ión. El panel

muestra la

l” con un

al, el panel de

tra lo que

nhibimos la

del plástido.

to-clorofilido

ma con Mg++

atalizado por

g++ (fig. I10)

UN4 y GUN5.

ripción ABI4

de éstas vías

adaptado de

]).

o  antena 

o  implica 

dor de la 

nqueado 

de genes 

ada para  

nto  con 

tra  estar 

amilia de 

ional del 

ose  a  los 

y

a

P á g i n a  | 56  

 

II. Vía de los tetrapirroles 

La  primera  evidencia  para  postular  la  vía  de  los  tetrapirroles  provino  de  estudios 

realizados en el alga verde Chlamydomonas  reinhardtii. Cuando se  trataba a  las mismas 

con inhibidores de los últimos pasos de la síntesis de tetrapirroles, fallaba la inducción de 

genes  nucleares  como  LHCB  (codifica  para  una  subunidad  del  complejo  antena). 

Posteriormente,  se encontró que  las mutantes gun2, gun3, gun4 y gun5 de Arabidopsis 

thaliana  que  continúan  expresando  LHCB  aún  en  tratamiento  con  norflurazón,  tienen 

defectos en  la vía de síntesis de  los tetrapirroles. Particularmente, GUN4 y GUN5 operan 

en  la “rama de magnesio” de  la biosíntesis de tetrapirroles que es  la que lleva a clorofila 

[Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003]. Para explicar  la señalización por esta vía hay 

varias hipótesis. Una de  las posibles  interpretaciones sería que el nivel de un  tetrapirrol 

específico  se  transmite,  directa  o  indirectamente,  al  citosol  [Pesaresi  et  al.,  2007]. 

También  se  ha  postulado  que  GUN1  podría  participar  de  esta  vía  [Koussevitzky  et  al., 

2007]. Cómo y cuándo actúa esta señal requiere de  futuras  investigaciones pero se cree 

que ABI4, un factor de transcripción  involucrado en  la vía de respuesta a  la fitohormona 

ácido abscísico (ABA),  parecería participar de la vía de los tetrapirroles tanto como de la 

de  PGE  (fig.  I11).  El  89  %   de  los  genes  que  no  son  reprimidos  por  el  tratamiento  con 

norflurazón en  las mutantes gun1 y gun5  son  los mismos, y muchos de ellos contienen 

elementos de respuesta a ABA [Pogson et al., 2008]. 

III. Vía de los azúcares 

En plantas con flor  los azúcares controlan el crecimiento y el desarrollo a  lo  largo de 

todo  el  ciclo  de  vida,  y  actúan  como moléculas  que  sirven  de  señal  para modular  la 

expresión  de  genes  involucrados  en  fotosíntesis, metabolismo,  respiración,  síntesis  de 

azúcares y otros procesos. Niveles elevados de glucosa o sacarosa  (los productos  finales 

de  la  fotosíntesis), reprimen  la expresión de genes  fotosintéticos  [Rolland et al., 2006] y 

este  fenómeno permitió buscar y aislar mutantes  insensibles a  la glucosa. Una de estas 

mutantes, gin2 (glucose insensitive 2) junto a mutantes puntuales que codifican versiones 

de la proteína con escasa actividad quinasa, permitieron estudiar el rol de la hexoquinasa 

1  (HXK1) de Arabidopsis  thaliana.  Las hexoquinasas  son enzimas que  fosforilan hexosas 

P á g i n a  | 57  

 

(azúcares de 6 carbonos) y, por  lo tanto,  las preparan para su posterior degradación. Se 

creía que la mayoría de los efectos de la glucosa eran metabólicos pero se ha demostrado 

que  la  HXK1  tiene  una  función  dual,  y  que  mutantes  prácticamente  inactivos 

catalíticamente  son  capaces  de  funcionar  en  la  vía  de  señalización,  en  tanto  que  la 

mutante nula (sin proteína detectable) gin2 no lo hace [Moore et al., 2003].  

Sin embargo, la represión de algunos genes en oscuridad en presencia de glucosa sigue 

activa en la mutante gin2, lo que indica la presencia de vías independientes de HXK1. Esto 

motivó  la búsqueda y el hallazgo de otras vías de  las que  se puede destacar a  la de  las 

quinasas  de  proteínas  KIN10  y  KIN11  que  controlarían  e  integrarían  la  reprogramación 

transcripcional en respuesta a factores como oscuridad, azúcar y estrés [Baena‐Gonzalez 

et al., 2007].  

Además,  el  aislamiento  de mutantes  para  las  respuestas  a  azúcar  ha  revelado  una 

interacción  entre  estas  vías  y  las  de  respuesta  a  hormonas  (ej.:  ABA).  Para  citar  un 

ejemplo, la mutante abi4, también presenta un fenotipo de insensibilidad al azúcar que le 

ha valido su re‐aislamiento bajo  los nombres de: gin6, sun6 (sucrose uncoupling 6) y sis5 

(sugar insensitive 5); todos ellas, mutantes para el gen que codifica al ya mencionado ABI4 

[Rolland et al., 2006; Huang et al., 2010]. 

No pretendo  ir más allá por el camino del azúcar, ya que es muy extenso, presenta 

numerosos desvíos y sólo serviría de mera distracción para  los propósitos de  la presente 

introducción. Propongo que continuemos nuestra lectura tomando una vía diferente... 

IV. Estado de óxido‐reducción de los componentes de la cadena de transporte 

electrónico fotosintético 

El  transporte  electrónico  fotosintético  lineal  comienza  en  el  fotosistema  II,  los 

electrones  son  entregados  luego  al  complejo  del  citocromo  b6f  a  través  del  pool  de 

plastoquinona  (fig.  I8).  La  plastocianina  media  el  transporte  desde  el  complejo  del 

citocromo  b6f  hacia  el  fotosistema  I.  Desde  allí,  los  electrones  son  transferidos  a  la 

ferredoxina y entregados  finalmente al NADP+ generando NADPH  [Nott et al., 2006]. El 

 

 

Figura

sobre

estad

para 

inhib

isopr

utiliz

mod

inhib

gene

fotos

(PQ)

(PQH

mayo

a I12: esquem

su funcionam

do redox de

el  origen 

bidores  del

ropil‐benzo

zando  longi

ular  así  el 

bidores  del

erador de  la

sistema II h

.  El  DBMIB

H2) al comp

or reducció

ma del transpo

miento (adapta

el pool de p

de  señales

l  transport

quinona  (D

itudes  de  o

estado  red

  transporte

a  señal  (fig

acia la plas

B  actúa  bloq

lejo del cito

n [Surpin et

orte electrónic

ado de [Meyer

plastoquino

s  redox  de

te  electrón

DBMIB)  y 

onda  que  e

dox  del  po

e  electróni

g.  I12). El D

stoquinona,

queando  la

ocromo b6f

t al., 2002].

co fotosintétic

r et al., 2009]

ona (PQ) ha

el  cloroplas

nico  fotosin

el  3‐(3,4

excitan  pre

ol  de  PQ  [

ico  fotosint

DCMU bloqu

, dejando e

a  transferen

f, dejando a

  

o y los efectos

).

a sido suger

sto.  Esto  h

ntético  com

‐diclorofen

dominante

[Piippo  et 

tético  perm

uea el  tran

l pool en un

ncia  de  ele

al pool de p

s de los herbic

rido como u

a  sido  dem

mo  el  2,5‐

il)‐1,1‐dime

mente  a  u

al.,  2006]. 

mite  localiz

sporte de e

n estado m

ectrones  de

plastoquino

P á g

cidas DCMU

un fuerte c

mostrado  u

‐dibromo‐3

etilurea  (D

n  fotosiste

La  respues

zar  el  com

electrones 

mayormente

esde  el  plas

ona en un e

i n a  | 58 

y DBMIB

andidato 

utilizando 

3‐metil‐6‐

CMU)  y 

ma  para 

sta  a  los 

mponente 

desde el 

e oxidado 

stoquinol 

stado de 

P á g i n a  | 59  

 

Se creía que el estado redox del pool de PQ es uno de los mayores determinantes de 

las señales retrógradas derivadas del transporte electrónico fotosintético. La afirmación se 

sostiene sobre evidencias experimentales como el hecho de que genes cuya expresión es 

inducida  por  tratamientos  con  alta  intensidad  de  luz  (que  llevaría  al  pool  de  PQ  a  un 

estado PQH2 principalmente) también son inducidos por agregado de DBMIB en ausencia 

de  alta  irradiancia,  e  inhibidos  por  tratamiento  con  DCMU  [Nott  et  al.,  2006].  En  los 

últimos  años,  se  ha  sugerido  que  la  regulación  por  la  vía  de  la  plastoquinona  sería 

funcional  sólo  en  exposiciones  prolongadas  a  condiciones  ambientales  contrastantes,  y 

por consiguiente, se ha planteado que es poco probable que el estado redox del pool de 

PQ  tenga un rol primario en  los experimentos realizados a tiempos cortos  [Piippo et al., 

2006]. Trabajos recientes muestran que al analizar  las vías de regulación de un grupo de 

2000 genes modulados por luz, más de 50 de ellos (un 2,5 % ) son estrictamente regulados 

por el estado redox de la PQ [Fey et al., 2005]. También ponen en evidencia la importancia 

de  la  “vía  redox”  como  fuente  de  señales  retrógradas,  ya  que  cerca  de  300  genes  (de 

aproximadamente  3000  analizados)  estarían  directamente  regulados  por  señales 

generadas en el transporte electrónico fotosintético [Nott et al., 2006].  

Lo que sí está claro es que  la señal dependiente del estado redox del pool de PQ es 

insuficiente para explicar el número de respuestas de aclimatación de la planta, de hecho, 

el mismo  cambio  en el  estado del  pool de PQ  se  asocia  a diferentes  respuestas. Otras 

señales que podrían estar involucradas incluyen a la relación ATP/ADP, el estado redox de 

componentes del estroma,  las  tiorredoxinas  y  los azúcares  (tratados más arriba).  Se ha 

demostrado que las TRX interactúan con la señalización vía PQ para regular la actividad de 

una quinasa y es posible pensar que lo hagan para regular otros blancos [Walters, 2005]. 

Además  de  los  cambios  en  el  estado  redox  de  sus  componentes,  el  transporte 

electrónico fotosintético también genera especies reactivas de oxígeno (ROS). El O2 puede 

aceptar  electrones  del  fotosistema  I  en  lugar  del NADP+,  formando  superóxido  que  es 

convertido  en  peróxido  de  hidrógeno  (H2O2)  por  la  superóxido  dismutasa.  Además,  la 

clorofila excitada puede transferir energía al O2 para generar O2 singulete que vuelve a su 

P á g i n a  | 60  

 

estado  no‐excitado  luego  de  transferir  la  energía  a  algún  antioxidante  como  los 

carotenoides  [Nott  et  al.,  2006].  ¿Son  capaces  las  ROS  de  formar  parte  de  una  vía  de 

señalización desde el cloroplasto? 

V. Especies reactivas de oxígeno como señales retrógradas 

Dado que las reacciones fotoquímicas en el cloroplasto generan ROS es posible pensar 

en éstas como una señal. El H2O2 y el oxígeno singulete son generados en el cloroplasto 

por  exposición  a  alta  intensidad  de  luz.  Debido  a  su  naturaleza  altamente  reactiva,  la 

mayoría del oxígeno singulete parece encontrarse exclusivamente dentro del cloroplasto; 

sin embargo, el exceso de H2O2 no eliminado por  las peroxidasas puede difundir hacia el 

citoplasma  [Nott et  al., 2006]. Cuando  se exponen hojas de Arabidopsis  thaliana a  alta 

intensidad de luz, el gen APX2 que codifica para una peroxidasa se activa. La infiltración de 

una catalasa (otra enzima capaz de eliminar H2O2) en hojas expuestas a alta intensidad de 

luz  inhibe  la  inducción  de  APX2.  Además,  el  tratamiento  exógeno  con  H2O2 activa  la 

expresión de APX2 [Karpinski et al., 1999]. Si consideramos estos resultados en conjunto, 

es  lógico  concluir  que  el  H2O2,  una  especie  reactiva  de  oxígeno,  puede  modular  la 

expresión de ciertos genes nucleares (fig. I13). 

En  la  mutante  flu  de  Arabidopsis  thaliana,  se  acumula  un  intermediario  de  la 

biosíntesis  de  clorofila  en  la  oscuridad.  El  mismo  actúa  como  fotosensibilizador.  Por 

consiguiente, cuando estas plantas son expuestas a  la  luz generan una gran cantidad de 

oxígeno singulete, que a pesar de estar confinado al cloroplasto,  induce  la expresión de 

genes nucleares diferentes a los modulados por el H2O2 [Pesaresi et al., 2007]. El efecto de 

la producción de oxígeno  singulete a nivel de  la expresión génica nuclear  fue analizado 

con microarreglos que representan el 95  %  del genoma de Arabidopsis  thaliana y como 

resultado, se encontraron 70 genes inducidos y 9 reprimidos por esta especie reactiva de 

oxígeno [Beck, 2005]. 

Trabajos  recientes  han  propuesto  una  interacción  entre  las  señales  dirigidas  por  el 

oxígeno  singulete  y  el  peróxido  de  hidrógeno  que  tendría  lugar modulando  el  estado 

redox  del  pool  de  PQ.  Se  ha  demostrado  que  el  tratamiento  con  H2O2  promueve  la 

 

 

oxida

flujo 

trata

cloro

parti

Valle

a con

los n

de tr

y un

han 

 

ación del ac

de  electr

amiento con

oplasto  [Do

cipan en la 

e, 2008]. El e

ndiciones d

niveles de N

ransporte e

a  concomit

adaptado 

ceptor prim

ones  desd

n metil‐viol

onahue  et 

síntesis de

estrés oxida

desfavorable

NADP+. Esto

lectrónico f

tante dismi

a  estas 

mario de ele

e  el  fotos

ógeno (MV

al.,  1997]

 sacarosa y

ativo puede

es. Los dife

 genera un

fotosintétic

nución de 

situacione

 

Figura I13:

enfoca en l

oxígeno inc

(MV). De

integradas y

varios gene

[Nott et al.,

ectrones de

istema  II  [

V ‐ paraquat

y    el  estr

 almidón, y

e estar gene

rentes tipo

a sobre‐red

o, debido a

los niveles 

es  activand

transportad

ferredoxina

cianobacte

resistencia 

2006].  Es 

cloroplasto

por  el  esta

habita  la  p

esquemátic

señalizació

: esquema de

los procesos q

cluyendo el ag

alguna ma

y llegan al nú

es como por e

2006]).

l pool de PQ

[Laloi  et  a

t) en  luz ca

rés  oxidativ

y de la degra

erado como

os de estrés

ducción de 

a la baja dis

de  ferredo

do  la  exp

dor  elect

a) y  la  sobr

erias  en  pla

a varias cla

decir  que

o pueden se

ado  del  des

planta.  La  f

ca  lo  exp

n dependie

e la vía de señ

que generan l

gregado exóg

anera las se

úcleo donde m

ejemplo APX2

Q (llamado 

al.,  2007]. 

usa acumu

vo  reprime

adación de 

o consecuen

s biótico y a

los compon

ponibilidad

oxina.  Los m

presión  de 

trónico  is

re‐expresió

antas  les  c

ases de est

e  las  seña

er modulad

sarrollo  y  e

figura  I13 

puesto  has

ente de ROS

P á g

ñalización po

as especies re

geno de metil-

eñales gener

modulan la exp

X2 y LHCB (ad

QA) aumen

Por  otra  p

lación de R

e  varios  ge

almidón [S

ncia de la ex

abiótico dis

nentes de la

 del último 

microorgan

flavodoxi

sofuncional 

n de  la pro

onfiere  un

trés  [Togne

ales  oxidat

das de algun

el  ambiente

resume  de

sta  aquí  s

S.   

i n a  | 61 

or ROS. Se

eactivas de

-viológeno

radas son

presión de

daptado de

ntando el 

parte,  el 

ROS en el 

enes  que 

carpeci y 

xposición 

sminuyen 

a cadena 

aceptor, 

ismos  se 

nas  (un 

a  la 

oteína de 

a  mayor 

tti et al., 

tivas  del 

na forma 

e  en  que 

 manera 

sobre  la 

P á g i n a  | 62  

 

Hace casi 30 años se propuso la existencia de un factor generado en el cloroplasto que 

puede  gatillar  una  vía  de  señalización  retrógrada.  Actualmente,  a  partir  de  estudios 

genéticos  y  bioquímicos  en  diferentes  organismos  está  claro  que  hay  varias  vías  de 

comunicación entre el cloroplasto y el núcleo [Nott et al., 2006].  

 

 

Resumen de los antecedentes  

La fotosíntesis es la conversión de la energía radiante a energía química y es llevada a 

cabo por plantas, algas y ciertas especies de bacterias. Estos organismos soportan la vida 

en  la  tierra  al  cosechar  la  luz  solar  poniendo  en movimiento  los  ciclos  del  carbono,  el 

nitrógeno y el oxígeno [Puthiyaveetil et al., 2008]. Además de ser una fuente de energía, la 

luz  es  para  las  plantas  una  fuente  de  información  acerca  de  su  entorno.  Fitocromos, 

criptocromos, fototropinas y la familia de fotorreceptores zeitlupe, capturan estas señales 

del ambiente que proveen información temporal y espacial para el control del desarrollo y 

el crecimiento [Strasser et al., 2010]. Resulta adaptativo que el cloroplasto, el lugar donde 

ocurre  la  fotosíntesis en  las plantas, controle y coordine  la expresión de aquellos genes 

nucleares  cuyos  productos  van  a  cumplir  funciones  en  el  plástido. Desde  su  comienzo 

evolutivo  como una bacteria  fotosintética  endosimbiótica, el  cloroplasto ha  tenido que 

desarrollar  vías  de  comunicación  retrógrada  que  le  permitan  controlar  la  expresión  de 

aquellos genes que ha cedido al genoma nuclear [Jarvis, 2007].  

Para mi  tesis doctoral he deseado evaluar si estas señales, ya sean  las mediadas por 

fotorreceptores  o  por  las  vías  de  señalización  con  origen  en  el  cloroplasto,  pueden 

modular  los  patrones  de  splicing  alternativo  de  algunos  transcriptos  en  Arabidopsis 

thaliana.  No  es  ilógico  pensar  que  los  fotorreceptores  puedan  regular  el  proceso  de 

splicing.  Los mismos  forman  parte  de  los  speckles  y,  al menos  en  células  de  animales, 

estos gránulos nucleares son reservorios o sitios de acumulación de diversos factores de 

P á g i n a  | 63  

 

splicing  y  procesamiento  del  ARN  [Kircher  et  al.,  2002;  Lamond  y  Spector,  2003].  Sin 

embargo,  la  posibilidad  de  que  el  cloroplasto  cuente  con  la  capacidad  de  regular  un 

proceso  ajeno,  como  es  el  splicing  para  un  organismo  procariótico,  es  como mínimo, 

menos parsimoniosa. Por este hecho, deseo  finalizar esta  introducción con un dato: hay 

2245  loci  anotados  del  genoma  de  Arabidopsis  thaliana  en  la  base  de  datos  tair 

(www.arabidopsis.org) que están asociados al cloroplasto y que tienen 3099 transcriptos 

diferentes  asociados.  Estos  números  implican  que  varios  de  los  genes  cuyos  productos 

cumplen alguna función en el plástido sufren splicing alternativo. Por lo tanto, tampoco es 

ilógico pensar en la evolución de mecanismos que puedan controlar el proceso de splicing 

para ajustarlo a las necesidades del cloroplasto.     

 

   

P á g i n a  | 64  

 

Objetivo general (Capítulo I) 

Evaluar  la  existencia  de  eventos  de  splicing  alternativo  regulados  por  la  luz  en 

Arabidopsis  thaliana  e  identificar  la  vía  de  señalización  y  los  posibles  mecanismos 

involucrados en la modulación de tal proceso.  

A partir de este objetivo general se desprenden una serie de objetivos particulares que 

detallo a continuación: 

Objetivos particulares (Capítulo I) 

Evaluar  la existencia de genes de Arabidopsis thaliana que posean eventos de 

splicing alternativo regulados por la luz. 

Analizar  el  rol  que  cumplen  los  fotorreceptores  en  el  mecanismo  de 

modulación del procesamiento por luz. 

Evaluar  la capacidad de diferentes calidades e  intensidades de  luz de modular 

los patrones de splicing de los transcriptos analizados. 

Determinar  si  existe  una  señal  retrógrada  (cloroplasto  a  núcleo)  que  forme 

parte  de  los  mecanismos  de  regulación  del  splicing  de  los  transcriptos 

estudiados. 

Identificar esa señal y componentes de la vía de señalización. 

Evaluar  la globalidad de  los eventos de splicing alternativo  regulados por esa 

vía de señalización. 

   

P á g i n a  | 65  

 

Metodología (Capítulo I) 

Material vegetal y condiciones de crecimiento  

Para la realización de la tesis se utilizaron mayormente líneas de Arabidopsis thaliana 

del  ecotipo  Columbia  (col).  A  menos  que  se  indique  lo  contrario,  se  sembraron 

aproximadamente 30 o 40 semillas equidistantes en cajas plásticas transparentes (40 x 33 

mm, 15 mm altura)  conteniendo alrededor de 4 ml de agar‐agua al 1‐1,5  %   (p/v),  y  se 

incubaron  por  3‐4  días  a  4  ºC  en  oscuridad.  En  algunos  casos  se  utilizó  un medio  de 

crecimiento de plantas (sales Murashige & Skoog –MS‐, MES, pH 5,7). Cuando se trabajó 

con plantas adultas, se crecieron en macetas plásticas de 110 cm3 conteniendo una mezcla 

de  perlita,  vermiculita  y  turba  (1:1:0,5),  y  el  riego  se  realizó  con  solución  nutritiva 

(Hakaphos  Rojo,  Compo)  durante  el  período  de  crecimiento.  La  temperatura  en  las 

cámaras  fue mantenida en 22‐24 ºC. Las condiciones  lumínicas en término de tiempos e 

irradiancia,  si  bien  varían  para  cada  experimento  y  se  detallarán  según  corresponda, 

estuvieron regidas por dos protocolos principales: 

El  paso  común  a  los  dos  protocolos  es  el  crecimiento  de  las  plantas  antes  de  los 

tratamientos. Primero se  incuban  las plantas/plántulas en  luz continua por 1‐2 semanas. 

En el caso de las plántulas, 1 semana de luz continua desde la germinación. 

1. Pasan a oscuridad, o continúan en  luz, por diferentes períodos de tiempo. En 

los  experimentos  de  intensidad  de  luz  y  de  calidad,  en  vez  de  pasar  las 

plántulas a luz/oscuridad, se las incuba en la condición correspondiente. 

2. Pasan  todas  a  oscuridad  por  48  hs.  Luego  de  ese  período  las  plántulas  son 

incubadas en  luz/oscuridad por diferentes tiempos  (de 3 a 6 hs ya se ve una 

diferencia  significativa  en  los  efectos  estudiados  por  lo  que  en  general  he 

usado estos tiempos). 

La figura M1 esquematiza los protocolos para aclarar las diferencias entre ellos. 

P á g i n a  | 66  

 

El protocolo  1  es útil para  analizar diferencias de base,  como diferentes  genotipos, 

diferentes  condiciones de  crecimiento,  etc.  Fue utilizado un protocolo de  este  tipo  (en 

general  con un período de oscuridad de 48 hs) para  los experimentos  cuyos  resultados 

muestran  las figuras R2, R4, R5, R7, R9, R10, R13, R17, R18, R20, R21, R22, R24, R25 y  la 

tabla R1. 

El protocolo 2 en cambio se adapta mejor a los experimentos que involucran drogas y 

requieren tratamientos más cortos. Fue utilizado este protocolo para la generación de las 

figuras R11, R12, R14, R15, R16, R23 y R26. 

Además de semillas de Arabidopsis ecotipo col, también utilizamos:  las  líneas salvaje 

Wassilewskija (ws) y Landsberg erecta (Ler), las sobre‐expresantes de flavodoxinas cedidas 

por  el  grupo  de  Néstor  Carrillo,  la  mutante  de  Kin10  (KIN10‐)  y  la  sobre‐expresante 

(KIN10+)  cedidas por el Dr. Filip Rolland,  las  líneas mutantes obtenidas del SALK: phyA‐

211, phyB (SALK_069700), cry1 (SALK_069292), cry2‐1, y las cedidas por el grupo de Jorge 

Figura M1: Esquema de los protocolos utilizados en los diferentes experimentos del Capítulo I de la tesis.

Aislamiento del ARN

P á g i n a  | 67  

 

Casal como hy5, hy4, y las dobles hy5‐hy4 y cry1‐cry2, las mutantes gun1 y gun5 cedidas 

por el grupo de J. Chory, y la mutante de hexoquinasa 1 gin2 cedida por Jong‐Seong Jeon, 

entre otras. 

Fuentes de luz y tratamientos lumínicos 

La  luz  blanca  fue  provista  por  tubos  fluorescentes  Philips  o  similares.  Para  los 

experimentos  en  que  se  estudian  los  efectos  de  longitud  de  onda  incidente  sobre  el 

splicing, utilicé diodos que emiten  luz en  la  longitud de onda deseada  (Cavadevices). Se 

usaron 3 módulos distintos de LEDs que emiten en luz blanca, de 470 nm y de 660 nm (luz 

azul y roja, respectivamente). La intensidad de los mismos es cercana a los 100 µmoles de 

fotón/m2seg  a  una  distancia  de  5‐10  cm  de  los  LEDs.  Para  los  experimentos  de 

intensidades de luz se utilizaron las fuentes ya descriptas y se dispusieron hojas blancas de 

papel sobre las cajas de Petri con plántulas. A mayor cantidad de hojas, menor intensidad 

de luz que llega a las plantas. Las intensidades fueron medidas con un luxómetro genérico 

(mide en luxes) y con un fotómetro Li‐cor para evaluar los µmoles de fotón/m2seg. 

Tratamientos con drogas y azúcares 

Tratamiento con actinomicina D (ActD) 

Medio de crecimiento 

1A Micro + ½ macro componentes (Duchefa)                2,2 g/l 

1x MS + vitaminas (Sigma)         1 ml 

MES (Duchefa)                         0,5 g/l 

1 %  (p/v) sacarosa                   10 g/l 

pH 5,7 

Agar (Duchefa)                        7 g/l 

 

Se  utilizaron  40  semillas  por  placa  de  Petri  de    15  cm  con  60  ml  de  medio  de 

crecimiento.  Las plántulas  fueron  crecidas  con  la placa apoyada  sobre  su  circunferencia 

por 7 días en  luz continua a ~200 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C. Luego de ese período 

P á g i n a  | 68  

 

fueron  incubadas por 48 hs en oscuridad,  tras  lo  cual  se  las  trató  con  la droga y  se  las 

incubó en  luz u oscuridad por 3  y 6 hs más. Para efectuar el  tratamiento  las plántulas 

fueron transferidas a placas de cultivo (de 12 pocillos de 6,9 ml) con 4 ml de medio líquido 

con 0,5 X MS, 1 %  (p/v) sacarosa, pH 5,7 y DMSO (vehículo) o 100 µg/ml ActD (A1410 de 

Streptomyces sp., Sigma). Se aplicó vacío con un desecador y una bomba de agua por 10 

min para acelerar la entrada del inhibidor transcripcional.  

Tratamiento con actinomicina DCMU y DBMIB  

Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de base rectangular (ver arriba) por 7 

días en luz continua a ~100 µmoles de fotón/m2seg a 22 °C. Luego de ese período fueron 

incubadas por 48 hs en oscuridad, tras lo cual se las trató con la droga y se las incubó en 

luz u oscuridad por 6 hs más. Para efectuar el tratamiento las plántulas fueron transferidas 

a placas de cultivo (de 6 pocillos) con 4 ml de H2O con etanol (vehículo) o  la cantidad de 

droga necesaria. DCMU y DBMIB (Sigma). 

 Tratamiento con azúcares 

Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de 10 cm por 7 días en luz continua a 

~100 µmoles  de  fotón/m2seg  a  22  °C  en medio  agar‐(MS + MES  +  sorbitol o  sacarosa) 

(cantidades requeridas por el experimento). Luego de ese período  fueron  incubadas por 

48  hs  en  oscuridad,  o  permanecieron  en  luz  como  control  (protocolo  1).  También 

utilizamos el “Protocolo 2”, para  lo que  las plántulas fueron crecidas en agar‐agua sobre 

un papel de filtro,  incubadas en oscuridad por 48 hs, y transferidas posteriormente a un 

nuevo medio agar‐(MS + MES + Sorbitol/Sacarosa) donde se  las  trató con  luz/oscuridad 

por 6 hs. 

Tratamiento con H2O2 

Las plántulas fueron crecidas en placas de Petri de base rectangular (ver arriba) sobre 

un papel de  filtro por 7 días en  luz continua a ~100 µmoles de  fotón/m2seg a 22  °C en 

medio agar‐agua. Luego de ese período  fueron transferidas a un nuevo medio con agar‐

P á g i n a  | 69  

 

H2O2  o  agar‐agua  e  incubadas  por  48  hs  en  oscuridad,  o  permanecieron  en  luz  como 

control  (protocolo 1). También utilizamos  la  técnica de spray directo sobre  las plántulas 

sin transferirlas de un medio a otro. Se utilizó agua oxigenada genérica que se  llevó a  la 

concentración deseada para los experimentos. 

Cortes (sin empalmes) de las plántulas. Disecciones. 

Para  los  experimentos  en que  evaluamos  los patrones  de  splicing  en  los  diferentes 

tejidos de la planta (fig. R9), la disección se realizó con hojas quirúrgicas sobre un papel de 

aluminio con  la cara basal expuesta a una atmósfera gaseosa proveniente de nitrógeno 

líquido. 

Para  los experimentos en que evaluamos el transporte de  la señal (fig. R15 y R16)  la 

disección se efectuó directamente sobre el agar. Para esto las plántulas fueron crecidas en 

placas de 10 cm en posición vertical (apoyadas sobre su circunferencia). 

Análisis de splicing alternativo  

Para evaluar la abundancia relativa de isoformas o la expresión de un determinado gen 

el primer paso es la extracción del ARN total de las plántulas. La misma se llevó a cabo con 

diferentes métodos  según  correspondiera.  Utilizamos  RNeasy  Plant minikit  (Qiagen)  y 

TRIzol  (Invitrogen) o TRI‐Reagent  (MRC). Se  siguieron  las  instrucciones provistas por  los 

fabricantes. El primer paso es llevar el material vegetal a un fino polvo en un mortero con 

nitrógeno  líquido.  El  ARN  purificado  se  sometió  (en  algunas  oportunidades)  a  un 

tratamiento con DNasa, empleando la enzima RQ1 RNase‐Free Dnase (Promega). A partir 

de 1 µg de ese ARN (medido por fluorometría con Qubit de Invitrogen), se sintetizó ADNc 

utilizando  la  enzima MMLV‐RT  o  la  SuperScript  III  (Invitrogen),  y  oligo‐dT  como  primer 

según el siguiente protocolo: 

Transcripción Reversa 

‐ Desnaturalización a 65 °C por 5 min de 1 µg de ARN en 5 µl de H2O.  

‐ Pasaje rápido a hielo. 

‐ Agregado de 15 µl de la mezcla de reacción a cada tubo. 

P á g i n a  | 70  

 

La mezcla está compuesta por: 

   4 µl de buffer 5X de RT (Invitrogen)  

0,2 µl de DTT 100 mM 

0,25 µl de dNTPs 25 mM 

0,5 µl de RNase OUT 40 U/µl (inhibidor de RNAsas de Invitrogen) 

1,5 µl de enzima (MMLV‐RT 200 U/µl, Invitrogen) 

H2O hasta completar 15 µl 

‐ Incubación a 35‐37 °C por 1 hora para que proceda la retrotranscripción. 

‐ 95 °C por 5 min o 75 °C por 10 min para detener  la reacción desnaturalizando  la 

enzima. 

El producto de esta reacción es el ADN copia o (ADNc) que servirá de molde para  las 

siguientes reacciones de PCR. 

Para cuantificar la relación de isoformas de RSp31 y RCA utilizamos, en un comienzo, la 

técnica de PCR semi‐cuantitativa  (con  radiactivo). La  idea detrás de esta  técnica es muy 

similar  a  la  de  la  PCR  competitiva  [Zentilin  y  Giacca,  2007;  Zentilin  y  Giacca,  2010]. 

Brevemente,  los  primers  utilizados  son  capaces  de  amplificar  las  diferentes  isoformas 

derivadas de un gen, se establece entonces cierta competencia de los moldes para con los 

primers, por la cual más abundante será el producto de PCR específico de una isoforma en 

particular cuanto más abundante sea como molde en la muestra (fig. M2). Posteriormente 

pusimos  a punto  PCRs  en  Tiempo Real  (qPCR) para  los  transcriptos  derivados  de  estos 

genes.  Con  esta  técnica  es  necesario  amplificar  cada  isoforma  como  un  ARNm 

independiente, evitando contaminaciones cruzadas con las otras (fig. M2). 

 

 

P á g i n a  | 71  

 

Para obtener los patrones de splicing de los diferentes genes utilizando estas técnicas 

seguimos los siguientes protocolos:    

PCR radiactiva 

A 2‐4 µl de ADNc resultante de la reacción de retrotranscripción se le agregan 48‐46 µl 

de la siguiente mezcla de reacción de PCR: 

‐ 5 µl de buffer de PCR 10 X sin MgCl2 

‐ X µl de MgCl2 50 mM 

‐ 2 µl de primers (directo y reverso) 20 µM  

‐ 1 µl de dNTPs 10 mM 

Figura M2: Esquema de las estrategias utilizadas para cuantificar la abundancia relativa de isoformas de un

evento de splicing alternativo. Se representan las estrategias de PCR radiactiva, dónde un mismo par de

primers (flechas naranjas) amplifica el ADNc derivado de las dos isoformas al mismo tiempo, los productos

deben ser posteriormente separados por una electroforesis para cuantificar la radiactividad de cada una de

las bandas (producto de PCR) y obtener las abundancias relativas de las isoformas en la muestra; y la PCR en

Tiempo Real, que utiliza diferentes pares de primers (flechas celestes y rojas) para amplificar el ADNc

derivado de cada isoforma por separado, obteniendo su abundancia (relativa a la curva patrón) en la

muestra.

P á g i n a  | 72  

 

‐ 0,3 µl de Taq polimerasa 5 U/µl (Invitrogen) 

‐ 0,1 µl de [α‐32P]dCTP 10 µCi/µl, actividad específica de 3000 Ci/mmol 

‐ H2O hasta completar volumen final de 50 µl 

La  cantidad  de magnesio  (X)  se  ajusta  para  cada  par  de  primers  (ver  Apéndice  de 

primers), es decir, para cada PCR. Para RSp31 utilizo 3 µl de MgCl2 y para RCA 1 µl. De la 

misma  forma que varía  la  cantidad de magnesio a utilizar en  cada PCR, varía el  ciclado 

térmico al que se somete la mezcla de reacción. Abajo detallo los programas a seguir para 

una PCR que evalúe la abundancia relativa de isoformas para RSp31 y RCA que son las más 

comunes a lo largo de la tesis. 

Ciclado para RSp31 

‐ 95 °C por 3 min 

‐ 95 °C por 30 seg 

‐ 63 °C por 30 seg 

‐ 72 °C por 1 min 

‐ 72 °C por 10 min 

‐ 15 °C hasta retirar los tubos 

Ciclado para RCA 

‐ 95 °C por 3 min 

‐ 95 °C por 30 seg 

‐ 56 °C por 30 seg 

‐ 72 °C por 45 seg 

‐ 72 °C por 10 min 

‐ 15 °C hasta retirar los tubos 

Al  finalizar  la  reacción  de  PCR  radiactiva,  se  procede  a  separar  los  productos 

corriéndolos en un gel de poliacrilamida 6‐8 %  nativo. Luego de  la corrida se seca el gel 

sobre un papel Whatmann, se le colocan orientadores fluorescentes y se lo expone a una 

película para generar una autorradiografía. De esta manera se pueden observar las bandas 

correspondientes  a  los  diferentes  productos  de  PCR  que  son  generados  por  la 

amplificación del ADNc de  las diferentes  isoformas. Para  cuantificar estos productos  se 

orienta  la  película  sobre  el  gel  ayudándonos  con  las  marcas  generadas  por  los 

orientadores  fluorescentes,  se  recortan  las bandas  correspondientes a  los productos de 

interés, y se cuenta la radiactividad que poseen utilizando un contador beta. Debido a que 

utilizamos el isótopo 32P, que es un emisor beta de alta energía, podemos evitar el uso de 

líquido de centelleo para amplificar  la señal, y contamos  la  radiactividad con el método 

Cerenkov, que es en seco.  

X 30 veces X 30 veces

P á g i n a  | 73  

 

PCR en tiempo real o qPCR 

Mezcla de reacción de PCR que se agrega a una dilución del ADNc: 

‐ 2,5 µl de buffer de PCR 10 X sin MgCl2 

‐ X µl de MgCl2 50 mM 

‐ 2 µl de primers (directo y reverso) 20 µM  

‐ 0,5 µl de dNTPs 10 mM 

‐ 0,15 µl de Taq polimerasa 5 U/µl (Invitrogen) 

‐ 0,025 µl de SyBR Green (Roche) dilución 1/30 en DMSO del stock 

‐ H2O hasta completar volumen final de 25 µl 

Nuevamente  el  magnesio  se  ajusta  para  cada  par  de  primers  (ver  Apéndice  de 

primers).  Para  RCA,  tanto  la  isoforma  larga  (L)  como  la  corta  (C)  y  el mensajero  total 

utilizan 2,5 µl de MgCl2 50 mM  (la  cantidad X de  la mezcla de  reacción), es decir, una 

concentración  5 mM.  Para  RSp31  utilizo  una  concentración  3 mM  para  cada  isoforma 

(mRNA3  y mRNA1)  y  5 mM  para  el  total.  Además  se  utiliza  una  curva  de  calibración 

preparada con diluciones  seriadas  (1/2) de una mezcla de  todos  los ADNc que  se van a 

utilizar en la qPCR. El ADNc de cada muestra es diluido 30‐50 veces para que entre en el 

rango de diluciones de  la  curva.  Se utilizan  5 µl de ADNc diluido  como molde de  cada 

reacción. Luego relativizo  la expresión de una  isoforma a  la otra. El ciclado se realiza en 

una máquina Eppendorf Mastercycler ep realplex y un programa típico sería  el siguiente: 

 

El  rayo  representa  la  lectura  de 

fluorescencia y el δ la curva de melting. 

P á g i n a  | 74  

 

Esta es la clase de ciclado térmico que utilizamos para las diferentes qPCRs para RCA y 

RSp31.  

Análisis de expresión  

Para las mediciones de expresión (mensajero total)  utilizamos la técnica de qPCR. En 

este  caso  se  debe  relativizar  a  un  control  externo  la  expresión  del  gen  estudiado.  Los 

elegidos  para  tal  fin  fueron,  Ef1c  (un  factor  de  elongación  ribosomal), Ubi  (ubicuitina), 

Act8  (actina),  que  tienen  niveles  de  expresión  elevados  y  prácticamente  constantes  en 

todas  las  condiciones  probadas.  Los  detalles  de  la  técnica  son  los mismos  que  para  la 

determinación del patrón de isoformas (ver ítem anterior).  

Ensayo de GUS 

Se  utilizaron  líneas  transgénicas  independientes  de  Arabidopsis  thaliana  con  la 

construcción promotor de RSp31 – GUS. Las plántulas fueron fijadas en acetona al 80%  en 

el hielo durante 30 min, se lavaron en solución de tinción de GUS (0,5 mM de ferricianuro 

de potasio, 0,5 mM de  ferrocianuro potásico, 100 mM de buffer  fosfato de potasio, pH 

7,0), a continuación, se las sumergió en la solución de tinción de GUS con 1 mM 5 ‐bromo‐

4‐cloro‐3‐indolil‐β‐D‐GlcU A,  se  incubaron a 37 ºC durante 24 hs. La clorofila  se eliminó 

mediante la sustitución de la solución de tinción con diferentes tiempos de inmersión en 

etanol al 70%  hasta que el  color verde desapareció y  la  coloración azulada de GUS era 

claramente visible. 

Análisis de alta resolución de splicing alternativo: panel de RT‐PCR 

Se utilizaron plántulas  crecidas en placas de 10  cm  con el protocolo de  tratamiento 

con  azúcares.  Se  partió  de  ~100 mg  de material  para  la  extracción  de  ARN  con  el  kit 

RNeasy  de Qiagen.  Posteriormente  se  realizaron  las  reacciones  de RT‐PCR  siguiendo  el 

protocolo descripto por Craig  Simpson  y  su  colaboradores  [Simpson et  al., 2008]. En el 

Apéndice detallo los primers utilizados (lista de primers del panel). 

   

 

 

Res

1.

E

que, 

más 

de  lu

activ

inten

mens

Por  l

crece

de RT

la rel

Figura

gener

sultados 

La Luz y

El gen RCA s

al ser trad

corto (C en

uz; en camb

var a  la RUB

nsidad  de 

sajero de  la

lo  tanto, ex

erlas en luz 

T‐PCR perti

lación de iso

a R1: Esquema

ra las dos isofo

y su efecto

se transcribe

ucidos, gen

n la fig. R1) s

bio, el mens

BISCO ya  se

luz  u  oscu

a  isoforma 

xpusimos  la

continua d

inentes pud

oformas L/C

a de la forma

ormas.

o sobre el

e para dar d

neran prote

se traduce e

sajero más 

ea en  luz o

uridad  era 

que da  la p

as plántulas

durante 1 se

dimos obser

C es mayor 

en que la elec

l procesam

dos mensaj

eínas con p

en una prot

largo (L en

o en oscurid

probable 

proteína qu

s a  luz y osc

emana. Tras

rvar que, ef

(fig. R2). 

cción alternat

miento de

eros con dif

ropiedades

teína que só

n  la fig. R1) 

dad. Razona

que  se  ge

e es activa 

curidad por

s aislar el A

fectivament

tiva de los siti

e RCA y RS

ferente tam

s muy difere

ólo es activ

genera una

amos que e

enerara,  e

en cualquie

r diferentes

RN total y h

te, a las 48

os de splicing

P á g

Sp31 

maño en nuc

entes. El m

va en alta in

a proteína 

en  respuest

n  proporci

er condició

s tiempos, 

hacer las re

horas en o

g 5’ en el ARN

i n a  | 75 

cleótidos 

mensajero 

ntensidad 

capaz de 

ta a baja 

ón,  más 

n,  la “L”. 

luego de 

eacciones 

oscuridad 

N de RCA

 

 

P

Mari

gen R

thalia

cond

alter

más 

alter

RSp3

Figura R

la proteí

(es decir

idioma o

Por ese ento

a Kalyna de

RSp31 que c

ana. Sus res

diciones  de

rnativo  (fig.

arriba para

rnativo de R

31  es  inclus

0

0,5

1

1,5

2

L/C

R3: esquema d

ína funcional.

r que son tan

original. 

onces come

el Instituto 

codifica par

sultados ind

e  luminosid

 R3) en nu

a  el  caso d

RSp31 tamb

so más pro

0 0,5

Tie

Lu

del procesamie

. Los nombres

n originales co

enzábamos 

Max F. Per

ra una de la

dicaban que

dad  por  lo 

estras man

de RCA,  fuim

bién era mo

nunciado q

1

empo (hs)

RCA

uz Oscuridad

ento de los tra

s de las isofor

omo ARNm 1

una colabo

utz de Vien

as proteínas

e la transcri

que  decid

nos. Hacien

mos  capace

odulado po

que para RC

24 48

anscriptos de

mas fueron p

, 2 y 3). Por

 

oración con 

na. Ellas trab

s SR (regula

ipción de es

dimos  ver 

do uso del

es  de  obser

r  la  luz  (fig

CA. Para  el

Figura

larga y

tiempo

Las bar

réplica

y el d

resulta

RSp31. Sólo l

puestos en idio

razones histó

el grupo de

bajan hacie

dor de splic

ste gen cam

qué  suced

 mismo pro

rvar  que  el

g. R4). El efe

  análisis de

R2: relación

y corta de RCo de incubació

rras correspo

as (placa de P

esvío estánda

do de 1 exper

la isoforma “m

oma inglés, dó

óricas conserv

P á g

e Andrea Ba

endo estudio

cing) de Ara

mbiaba en d

día  con  su 

otocolo que

l patrón  de

ecto observ

e  los  camb

n entre las

CA (L/C) en fu

ón en luz u

onden a la m

Petri con ~30

ar (DE). Se m

rimento repre

mRNA1” codifi

ónde ARNm e

varé el nombr

i n a  | 76 

arta y de 

os con el 

abidopsis 

iferentes 

splicing 

e detallé 

e  splicing 

vado con 

ios  en  la 

isoformas

unción del

oscuridad.

media de 3

plántulas)

muestra el

esentativo.

ica para

es mRNA

re en su

P á g i n a  | 77  

 

relación de  isoformas  (fig. R3) sólo considero 2 de ellas,  llamadas “mRNA3” y “mRNA1”, 

debido a que la conocida como “mRNA2” es poco abundante en nuestro sistema (además, 

actualmente sabemos que se degrada activamente por nonsense mediated decay o NMD 

[Kim et al., 2009]). 

Con el objetivo de verificar si este efecto de ausencia de luz era específico de algunos 

mensajeros  o  se  debía  a  un  déficit  generalizado  en  el  splicing  causado  por  la  larga 

exposición  a  oscuridad,  probamos  qué  sucedía  con  los  patrones  de  splicing  de  otros 

transcriptos. En la figura R5 muestro lo que sucede en el caso de RSZ33, gen que codifica 

para otra proteína SR. La misma, al ser sobre‐expresada, causa cambios en el splicing de 

RSp31  [Simpson  et  al.,  2008]  lo  que  la  convierte  en  un  control  interesante.  Como  se 

observa,  el protocolo  de  luz/oscuridad  utilizado  no  genera  cambios  significativos  en  su 

patrón  de  splicing.  Lo  mismo  sucede  con  AtPP5  (que  codifica  para  una  fosfatasa  de 

proteínas) entre otros transcriptos evaluados (resultados no mostrados). 

 

Figura R4: relación entre las isoformas

mRNA3/mRNA1 de RSp31 en función del

tiempo de incubación en luz u oscuridad.

Las barras corresponden a la media de 3

réplicas ± DE. Se muestra el resultado de

1 experimento típico.

 

Figura R5: relación entre las

isoformas larga y corta (L/C) de

RSZ33 en función del tiempo de

incubación en luz u oscuridad.

Las barras corresponden a la

media de 3 réplicas ± DE. Se

muestra el resultado de 1

experimento representativo.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 0,5 1 24 48

mR

NA

3/m

RN

A1

Tiempo (hs)

RSp31Luz Osc

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0 0,5 1 24 48

L/C

Tiempo (hs)

RSZ33

P á g i n a  | 78  

 

Figura R6: relación entre las isoformas

mRNA3 y mRNA1 de RSp31 luego de 51

hs de incubación en luz u oscuridad

(barras blanca y gris respectivamente) y

pasaje a luz por 3 hs luego de 48 hs de

oscuridad (barra con gradiente gris). Las

barras corresponden a la media de 3

réplicas ± DE. Se muestra el resultado de

1 experimento tipo.

 

En resumen, la abundancia relativa de isoformas de RCA y RSp31 es diferente en luz y 

en oscuridad. Esto no es general ya que otros eventos de splicing alternativo evaluados no 

presentan  cambios.  Se  necesita  una  incubación  prolongada  (de  48  horas 

aproximadamente) en oscuridad para observar efectos significativos.  

 

La  necesidad  de  una  incubación  prolongada  en  oscuridad  planteó  una  serie  de 

interrogantes: ¿Es reversible el efecto? ¿La cinética es la misma al pasar de luz a oscuridad 

que de oscuridad  a  luz? Como dije  antes,  temíamos que el  tratamiento prolongado de 

oscuridad  causara efectos  artefactuales.  Si probáramos que  se puede  revertir el efecto 

luego  del  período  de  oscuridad,  al  menos  podríamos  saber  que  no  eliminamos  las 

respuestas a luz de la planta. Entonces decidimos crecer las plántulas en luz continua por 

1 semana,  incubarlas 48 horas en oscuridad,   transferirlas a  luz por diferentes tiempos y 

extraer el ARN para ver  las abundancias  relativas de  las  isoformas de RCA y RSp31.    La 

figura R6 muestra  lo que  sucede en RSp31  (algo  similar  sucede  con RCA  aunque no  se 

muestra).  Luego  de  48  horas  de  oscuridad,  la  exposición  a  luz  por  3  horas  revierte  el 

efecto  de  la  oscuridad  en  la  acumulación  relativa  de  las  isoformas.  Es decir,  si  bien  se 

necesitan 48 horas de oscuridad para que se haga visible un efecto a nivel de abundancia 

de mensajeros, el pasaje de oscuridad a  luz provoca  cambios más veloces. Entonces,  la 

cinética  no  es  la  misma.  Pero,  ¿a  qué  se  debe?  Lo  primero  que  pensamos  es  en  la 

posibilidad de que se tratara de un efecto transcripcional. En dicho caso, tomando a RSp31 

como modelo,  sería necesario que en oscuridad hubiera menos  transcripción del gen  y 

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Luz 51hs Osc 51hs Osc 48hs/Luz 3hs

mR

NA

3/m

RN

A1

Tratamiento

RSp31

P á g i n a  | 79  

 

Figura R7: muestran la expresión de RSp31 (A) y RCA (B) en luz y oscuridad relativizadas al

transcripto de la ubicuitina. Plántulas crecidas en luz continua por 1 semana y transferidas a

oscuridad por 48 horas o en luz como control. Barras: media y error estándar (n=3).

que la relación de isoformas se fuera alterando poco a poco (por degradación preferencial 

de una isoforma sobre otra). En luz, debería aumentar significativamente la transcripción y 

se debería generar, en proporción,  más mRNA1 que mRNA3 para alcanzar la abundancia 

relativa  típica  de  esta  condición  en  pocas  horas  (en  luz  el  cociente  de  isoformas 

mRNA3/mRNA1  es bajo). Para poner  a prueba  esta hipótesis  fue necesaria  la puesta  a 

punto de PCR’s en tiempo real para RCA, RSp31 y genes de expresión constitutiva con los 

cuales relativizar.   Como se puede observar  (fig. R7 B) para RCA  lo antedicho es posible; 

cumple al pie de  la letra con el modelo estipulado más arriba. La cantidad de transcripto 

de RCA es baja en oscuridad y aumenta más de 10 veces en luz. Sin embargo, no es éste el 

caso de RSp31 (fig. R7 A). A diferencia de lo que sucede con RCA, la expresión de RSp31 es 

mayor en oscuridad y menor en luz. Esto último también es apoyado por el hecho de que 

al generar plántulas de Arabidopsis thaliana con una construcción reportera que tiene al 

promotor de RSp31 fusionado al ADN que codifica para la glucuronidasa (GUS) se observa 

mayor  actividad  ‐y más  diseminada‐ de  esta  enzima  en  oscuridad  (fig. R8).  Inclusive  se 

puede  observar  que,  si  bien  en  los  cotiledones  parece  haber  expresión  guiada  por  el 

promotor de RSp31 en plántulas  crecidas en  luz  y oscuridad, en  los primordios  foliares 

sólo  hay  expresión  en  oscuridad.  Por  lo  tanto,  un  cambio  en  expresión  como  el  que 

propongo más arriba podría explicar lo que acontece con RCA pero no con RSp31.  

A  BRSp31

Luz Oscuridad0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5LuzOscuridad

Exp

resi

ón r

elat

iva

a U

bicu

itina

RCA

Luz Oscuridad0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5LuzOscuridad

Exp

resi

ón r

elat

iva

a U

bicu

itina

P á g i n a  | 80  

 

 

En este punto nos preguntamos si  las diferencias en el patrón de splicing alternativo 

de  RSp31  se  podían  explicar,  en  lugar  de  por  diferencias  de  expresión,  por  splicing 

alternativo específico de tejido. ¿Qué quiere decir esto? ¿Cómo explicaría  las diferencias 

observadas?  Podríamos plantear  el  siguiente  escenario:  en  el  cotiledón  la  expresión  es 

constante y el cociente mRNA3/mRNA1 es bajo. En luz (donde sólo se detecta  expresión 

en  los cotiledones), al aislar el ARN de toda  la plántula observamos un cociente bajo; en 

cambio,  en  oscuridad  se  expresa  también  en  los  primordios  foliares  o  en  las  “hojas 

nuevas”  donde  el  cociente mRNA3/mRNA1  es  alto  y  se  ve  una  relación  intermedia  –la 

abundancia  relativa de  las  isoformas observada en  la plántula entera  será un promedio 

pesado del cociente en cada tejido y su nivel de expresión‐. ¿Es ésta la base de los efectos 

que  observamos?  Para  responder  la  pregunta  realizamos  una  disección  de  la  plántula 

previa  al  aislamiento del ARN  separando  los  cotiledones del  resto de  la plántula.  En  la 

figura R9 se observa que el efecto del cambio en  la abundancia relativa de  las  isoformas 

de  RSp31  es  común  a  los  diferentes  tejidos  de  la  plántula.  Esto  indica  que  los  efectos 

observados no se deben a diferencias en el cociente de cada tejido y  la expresión en  los 

mismos. 

Figura R8: La coloración azulada

característica de la expresión de

glucuronidasa a partir del reportero

promotor-RSp31:GUS en una plántula

de 1 semana crecida en luz (A) u

oscuridad (B). Fotos de Maria Kalyna.

 

A B

P á g i n a  | 81  

 

En  conclusión,  el  cambio  en  el  cociente  mRNA3/mRNA1  de  RSp31  se  da  en  las 

diferentes partes de la plántula en respuesta a la incubación a luz o a oscuridad. 

2. La intensidad de la luz ‐y no su calidad‐ influye sobre el patrón de 

splicing alternativo de RSp31 y RCA 

Hasta  aquí  demostramos  que  la  luz  tiene  un  efecto  sobre  la  transcripción  y  el 

procesamiento de RSp31 y RCA,  sin embargo, no está claro cómo  la plántula percibe el 

estímulo  y  lo  traduce  en  esos  cambios. Dado  que  los  efectos  son  a  nivel  de  expresión 

nuclear,  lo primero que pensamos  es que  la  luz debería  estar  siendo percibida por  los 

fotorreceptores,  fitocromos  y/o  criptocromos.  Con  el  objetivo  de  probar  si  los 

fotorreceptores  son  los  encargados  de  “ver”  la  luz  y  transducir  la  señal  al  núcleo, 

utilizamos mutantes de los mismos que deberían comportarse como “ciegas” en respuesta 

a la luz.  Esto, que pareció muy sencillo en su concepción, fue bastante difícil de realizar. 

Los mutantes de fotorreceptores causan problemas en el desarrollo de las plántulas y en 

sus respuestas a la luz [Mazzella et al., 2001]. Sus efectos son pleiotrópicos y por lo tanto 

difíciles de controlar. A pesar de esto, repetimos la suficiente cantidad de veces el análisis 

como para tener confianza en los resultados. La figura R10 muestra lo que sucede con el 

patrón  de  splicing  alternativo  de  RSp31  en  respuesta  a  luz  en  plántulas  con 

fotorreceptores mutados. Podemos observar que se comportan como la planta salvaje, es 

decir,  son  capaces  de  “ver”  la  luz  y  transducir  esta  señal.  Esto  implica  que  de  los 

fotorreceptores;  los fitocromos A   y B, y los criptocromos 1 y 2; no estarían relacionados 

Figura R9: la abundancia relativa de las

isoformas de RSp31 es diferente en cada

tejido, sin embargo, el efecto “luz vs.

oscuridad” es visible en cada parte de la

plántula. Plúmula: parte de la plántula que

corresponde a los primordios foliares. Las

barras representan la media de 3 réplicas ±

DE. Se muestra el resultado de 1 experimento

típico.

0,33

3,83

0,13

1,74

0,12

1,86

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

luz osc

mR

NA

3/m

RN

A1

RSp31plúmula plántula sin plúmula cotiledón

P á g i n a  | 82  

 

Figura R10: A) Muestra la abundancia relativa de las isoformas de RSp31 en mutantes de fitocromo B (phyB9),

doble mutante de fitocromos (phyAB) y la mutante del criptocromo 1 (cry1) en el entorno genético salvaje

Columbia (Col). B) Ídem (A) para mutantes de criptocromo1 (hy4), un factor de transcripción de la vía de

fitocromo A (hy5) y la doble entre ellos; en el entorno genético salvaje Wassilewskija (ws). C) Ídem (A) con doble

mutante de criptocromos 1 y 2 en entorno salvaje Landsberg erecta (Ler). Las barras corresponden a la media de

3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento representativo.

con  la señalización  lumínica que altera  la abundancia relativa de  isoformas de RSp31 en 

respuesta a transiciones de luz/oscuridad.  

En  vista  de  que  los  efectos  de  la  luz  parecen  ser  independientes  de  los 

fotorreceptores,  decidimos  ver  qué  sucede  con  diferentes  calidades  de  luz 

fotosintéticamente activas. Para ello, utilizamos como fuente de  iluminación módulos de 

LEDs  que  emiten  en  longitudes  de  onda  acotada  (470  nm  o  azul  y  660  nm  o  rojo).  Es 

importante destacar que si el efecto de  la  luz blanca se reprodujera exclusivamente con 

luz  roja,  nos  llevaría  a  establecer  una  relación  entre  la  luz  y  el  splicing  por medio  de 

RSp31

Col phyB9 phyAB cry10.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

LuzOscuridad

genotipo

mR

NA

3/m

RN

A1

RSp31

ws hy5 hy4 hy5 hy40.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 LuzOscuridad

genotipo

mR

NA

3/m

RN

A1

RSp31

Ler cry1-cry20

1

2LuzOscuridad

genotipo

mR

NA

3/m

RN

A1

A

B

C

P á g i n a  | 83  

 

fitocromos,  en  cambio  si  se  reprodujera  sólo  con  luz  azul,  se  relacionaría  con  los 

criptocromos. Al exponer las plántulas a las diferentes longitudes de onda y comparar con 

el control de luz blanca, fuimos capaces de determinar que ambas calidades de luz (las dos 

longitudes de onda) causan el mismo efecto en el splicing de RSp31 (fig. R11). Dado este 

resultado  decidimos  que  era  interesante  ver  qué  sucedía  en  un  experimento  que 

combinara los mutantes de receptores lumínicos y los LEDs. Principalmente, nos resultaba 

interesante ver qué ocurre con  las plántulas mutantes de  fitocromos al exponerse a  luz 

roja y con  las de criptocromos al  incubarse con  luz azul. Como se puede observar en  la 

figura R12,  las  luces roja y/o azul, causan el mismo efecto que  la blanca en  las plántulas 

salvajes y en las mutantes. En resumen, el efecto de las transiciones luz/oscuridad sobre el 

procesamiento de  los  transcriptos de RSp31 no es exclusivo de una  calidad de  luz y no 

requiere la presencia de los fitocromos A y B, y los criptocromos 1 y 2.  

Para  RCA  fuimos  capaces  de  establecer  que  las  plántulas  salvajes  responden  de  la 

misma manera a luz blanca, que a roja o azul, con respecto a la abundancia relativa de  las 

isoformas L y C (no mostrado). 

Figura R11: el efecto de la luz blanca (barra

blanca) sobre la abundancia relativa de las

isoformas de RSp31 es el mismo con luz azul

(barra azulada) y/o con luz roja (barra roja)

frente a oscuridad (barras grises). Las barras

corresponden a la media de 3 réplicas ± DE.

Se graficó el resultado de 1 experimento

típico.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

mR

NA

3/m

RN

A1

Calidad de Luz

RSp31

P á g i n a  | 84  

 

 

Dado que  la  calidad de  la  luz  (a  longitudes de onda perceptibles y utilizables por  la 

planta) no tiene un efecto crucial sobre los cambios en los patrones de splicing alternativo 

de  los eventos estudiados, nos preguntamos qué sucedía con  la  intensidad de  la  luz y el 

splicing  alternativo  de  RSp31  y  RCA.  Con  el  objetivo  de  determinar  si  diferentes 

intensidades lumínicas causan efectos distintos en la abundancia relativa de las isoformas 

de  los  genes  mencionados,  expusimos  las  plántulas  a  diferentes  intensidades  de  luz 

blanca.  Los  resultados  de  tal  experimento  (fig.  R13)  nos  indican  que  a medida  que  la 

intensidad de luz disminuye el cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 o L/C de RCA se hacen 

más parecidos a los de oscuridad pero de manera “dosis dependiente”, siendo la “dosis” o 

la cantidad de fotones que inciden en una superficie en un dado tiempo, lo que determina 

la cantidad que hay de una isoforma y otra de RCA y RSp31.  

En resumen,  la  intensidad de  la  luz  incidente (y no  la calidad) es  lo que determina el 

patrón de  splicing  alternativo de RCA  y RSp31.  Junto  al  análisis que  realizamos  con  los 

mutantes, es posible  agregar que  la  vía  regular de  transducción de  señales  lumínicas  a 

cargo de  los  fotorreceptores no es necesaria para explicar el efecto de  la  transición de 

luz/oscuridad sobre la expresión y el procesamiento de RCA y RSp31. 

 

Figura R12: el efecto de la luz blanca

sobre la abundancia relativa de las

isoformas de RSp31 es el mismo con

luces de diferente longitud de onda y

en diferentes mutantes. NM: No Medido. Las barras corresponden al

promedio de 3 réplicas ± DE. Se

muestra el resultado de 1

experimento representativo.

Genotipos ídem fig. R10.

0

2

4

6

8

10

12

Col phyB9 phyAB cry1

mRNA3/m

RNA1

Genotipo

RSp31Blanca Roja Azul Oscuridad

NM NM NM

P á g i n a  | 85  

 

Figura R13: efecto de la intensidad de la luz sobre el patrón de splicing alternativo de RSp31 y RCA. La intensidad de

luz creciente está representada en la escala de grises de las barras. Las barras corresponden a la media de 3 réplicas y

el error estándar. Se muestra el resultado de 1 experimento representativo.

   

3. El cloroplasto percibe la luz y transmite la señal al núcleo generando 

el cambio en la abundancia relativa de isoformas de RSp31 

Los  resultados  anteriores  indicarían  que  debemos  dejar  fuera  a  los  fotorreceptores 

como  los principales sospechosos detrás de  la vía de señalización  luminosa que estamos 

investigando.  Entonces  nos  preguntamos  qué  otro  “receptor”  lumínico  podría  estar 

funcionando  para  esta  vía. Un  candidato  fuerte  es  el  cloroplasto  debido  a  que,  como 

sabemos,  percibe  la  luz  y  la  transforma  en  energía  química  a  través  del  proceso  de 

fotosíntesis, y además tiene  la capacidad de generar señales que alteran  la expresión de 

genes nucleares [Koussevitzky et al., 2007]. Con el objetivo de evaluar si el cloroplasto es 

el  responsable  del  efecto  que  observamos  en  el  cambio  de  splicing  sobre  RSp31 

comenzamos a utilizar drogas que alteran  la funcionalidad del mismo. El diurón o DCMU 

(3‐(3,4‐diclorofenil)‐1,1‐dimetilurea) es un herbicida que  inhibe el  transporte electrónico 

fotosintético  absorbiendo  los  electrones  del  fotosistema  II  antes  del  pool  de 

plastoquinonas. Al tratar plántulas de Arabidopsis thaliana con esta droga y someterlas al 

protocolo de luz/oscuridad, se observa una inhibición del efecto de la luz sobre el cociente 

RSp31

0.2 1 2.2 14 800

1

2

3

mol fotón/m 2 seg

mR

NA

3/m

RN

A1

RCA

0.2 1 2.2 14 800.0

0.5

1.0

1.5

mol fotón/m 2 seg

L/C

 

 

mRN

oscu

L

de  la

relat

 

4.

D

alter

que é

prev

camb

espe

luz/o

NA3/mRNA1

ridad (fig. R

La conclusió

a  señal  lum

iva de las is

La seña

Debido  a  q

rnativo de R

ésta no pos

ia al aislam

bio  se  daba

rábamos, 

oscuridad au

1 de RSp31

R14) a medi

ón del resul

mínica  que 

soformas de

al viaja de

que  los  clo

RSp31, es c

see cloropla

miento del A

a  sólo  dond

en  la  raíz 

unque con u

. En particu

da que aum

tado anteri

posteriorm

e RSp31.  

e la hoja a

oroplastos  s

oherente e

astos. Decid

ARN, para s

de  hay  clo

también 

una cinética

ular, el  coc

menta la con

ior indica q

mente  es  tr

a la raíz 

serían  los 

esperar que

dimos enton

separar  las 

roplastos. O

hay  un  ca

a diferente 

Fig

del

de

bar

rép

1 e

ciente de  lu

ncentración

ue el cloro

raducida  en

responsabl

e tal efecto 

nces hacer 

raíces de  la

Observamo

ambio  en 

(fig. R15). 

gura R14: efe

l agregado de

splicing alte

rras correspo

plicas ± DE. Se

experimento tí

uz  se hace 

n de droga u

plasto sería

n  el  cambio

es  del  cam

no se obse

una disecci

a parte verd

os  que,  a  d

respuesta 

P á g

ecto dosis de

DCMU sobre

rnativo de Ronden a la m

e graficó el res

ípico. * p<0,0

más pareci

utilizada.  

a el sensor/

o  en  la  abu

mbio  en  el

erve en  la r

ión de las p

de y así def

iferencia  d

a  la  trans

i n a  | 86 

ependiente

e el patrón

RSp31. Las

media de 3

sultado de

05.

ido  al de 

/receptor 

undancia 

  splicing 

raíz dado 

plántulas, 

finir si el 

e  lo  que 

ición  de 

P á g i n a  | 87  

 

Figura R15: efecto del tratamiento de luz/oscuridad en hojas y raíces separadas después del mismo. Las

barras corresponden a la media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento

representativo.

Este  resultado  plantea  2  escenarios  posibles. Uno  de  ellos  involucraría  a  un  factor, 

independiente del cloroplasto, capaz de percibir la luz en la raíz y generar los efectos que 

observamos. Otro escenario posible es que  la señal de  luz que se está generando en  los 

cloroplastos  sea,  de  alguna manera,  capaz  de moverse  por  la  planta,  llegar  a  la  raíz  y 

producir allí un efecto  similar en el patrón de  splicing alternativo de RSp31 que el que 

tiene  lugar  en  las  hojas.  De  ser  esta  la  explicación  sería  esperable  que,  si  la  raíz  es 

separada del resto de la planta antes del tratamiento de luz/oscuridad, no se visualice un 

cambio  en  ésta  (dado  que  el  tejido  dónde  se  origina  la  señal  sería  incapaz  de 

transferírsela). Efectivamente, esta es lo que observamos al realizar el experimento; como 

se ve en la figura R16, al separar las raíces del resto de la planta antes del tratamiento de 

luz  u  oscuridad  por  diferentes  tiempos,  no  se  evidencia  un  cambio  en  la  abundancia 

relativa de  las  isoformas de RSp31 en  la raíz como sucedía cuando se trataba  la plántula 

entera (fig. R16). 

 

En resumen, se puede concluir que la luz es captada en las hojas de Arabidopsis por los 

cloroplastos, éstos generan una señal que se  traduce en un cambio en  la expresión y el 

procesamiento de RSp31 en el núcleo. Esta misma señal (u otra generada también en el 

tejido  verde)  es  capaz  de  viajar  y  transmitir  la  información  de  las  transiciones  de 

luz/oscuridad a  la raíz y  los núcleos de sus células. Si se  interrumpe  la conexión entre el 

0,00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

2hr 4hr 6hr

mR

NA

3/m

RN

A1

Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)

RaícesRSp31 (disección post-tratamiento)

Luz Oscuridad

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

2hs 4hs 6hs

mR

NA

3/m

RN

A1

Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)

HojasRSp31 (disección post-tratamiento)

Luz Oscuridad

P á g i n a  | 88  

 

órgano  que  genera  la  señal  y  un  órgano  que  no  la  genera,  se  anula  el  efecto  de 

luz/oscuridad sobre el splicing alternativo en el último. 

 

5. Identificación de la señal que transmite el cloroplasto que provoca el 

cambio en la expresión y el splicing alternativo de RSp31 

Con la idea de identificar qué señal generada por el cloroplasto en repuesta a luz está 

causando los cambios a nivel de transcripción y procesamiento de RSp31, comenzamos a 

analizar las diferentes vías de señalización retrógrada conocidas (Introducción Capítulo I, 

El lenguaje del cloroplasto). 

a) Vía de la expresión génica y vía de los tetrapirroles. 

El  laboratorio  de  Joanne  Chory  aisló  en  los  últimos  años  un  grupo  de  mutantes 

llamadas gun por “genomas desacoplados” (genomes uncoupled) que presentan grandes 

disrupciones  en  la  señalización  cloroplasto‐núcleo  [Surpin  et  al.,  2002;  Jarvis,  2007]. 

Decidimos probar estos mutantes bajo nuestro protocolo de luz/oscuridad.  

 

 

Figura R16: efecto del tratamiento de luz/oscuridad en hojas y raíces separadas antes del mismo. Las

barras corresponden a la media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1 experimento

representativo.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

2hs 4hs 6hs

mR

NA

3/m

RN

A1

Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)

HojasRSp31 (disección pre-tratamiento)

Luz Oscuridad

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

2hr 4hr 6hr

mR

NA

3/m

RN

A1

Tiempo de Tratamiento (Luz/Osc)

RaícesRSp31 (disección pre-tratamiento)

Luz Oscuridad

P á g i n a  | 89  

 

Como  se  observa  en  la  figura  R17,  los mutantes  gun1  y  gun5  presentan  el mismo 

efecto luz/oscuridad sobre el splicing alternativo de RSp31 que las plantas salvajes, por lo 

tanto, GUN1 y GUN5 no están  relacionadas  con  la  transducción de esta  señal  lumínica. 

Además, probamos lo que sucedía en la mutante abi4 (ABI4 es un factor de transcripción 

“río abajo” de la señalización de los GUN) obteniendo resultados similares (no mostrado).  

 

En resumen, la vía de señalización retrógrada defectuosa en las mutantes gun1 y gun5 

no estaría involucrada en la transducción de la señal luminosa que altera la abundancia de 

isoformas de RSp31. GUN 5 está relacionado con la vía de biosíntesis de  la clorofila o vía 

de  los  tetrapirroles.  GUN1  en  cambio,  estaría  involucrado  en  la  vía  retrógrada  de 

respuesta a la expresión génica del cloroplasto. Es interesante destacar aquí que el uso de 

Tagetina  (inhibidor  de  la  ARN  polimerasa  III,  presente  en  cloroplastos)  no  provocó 

diferencias en respuesta al tratamiento de luz/oscuridad (no mostrado).  

En conclusión,  las vías de  los tetrapirroles y de  la expresión génica del cloroplasto no 

son necesarias para  la  señalización  lumínica que  genera  los  cambios  a nivel de  splicing 

alternativo de RSp31. 

b) Vía de las especies reactivas de oxígeno. 

De  las  señales  que  emite  el  cloroplasto  (ver  Introducción,  fig.  I10),  continuamos 

estudiando  la posibilidad de que  la causante de  los efectos hasta aquí descriptos,  fuera 

alguna  señal  relacionada  a  reacciones  de  óxido‐reducción  o  a  especies  reactivas  de 

Figura R17: respuesta de mutantes gun en

el patrón de splicing de RSp31. Barras

claras, luz; barras grises, oscuridad. Las

barras corresponden a la media de 3

réplicas ± DE. Se muestra el resultado de 1

experimento representativo.

0

2

4

6

8

col gun 1 gun 5

mR

NA

3/m

RN

A1

Genotipo

RSp31Luz Oscuridad

P á g i n a  | 90  

 

oxígeno que  son  generadas normalmente  en  la  cadena de  electrones  fotosintética.    La 

primera aproximación para probar esta posibilidad consistió en tratar a  las plántulas con 

peróxido de hidrógeno (H2O2) con dos métodos de aplicación distintos (fig. R18) bajo un 

protocolo en el que las plántulas crecieron 7 días en luz continua y fueron luego expuestas 

a  oscuridad,  con  o  sin  peróxido  por  48  hs.  Después  de  ese  tiempo  las  transferimos 

nuevamente a  luz  ‐o permanecieron en oscuridad‐ hasta su procesamiento para aislar el 

ARN (aproximadamente 6 hs).  

 

La figura R18 muestra que la presencia de H2O2 en oscuridad simula el efecto de la luz, 

provocando  que  los  cocientes  mRNA3/mRNA1  de  oscuridad  con  tratamiento  sean 

similares a  los de  luz. Podemos concluir que el agregado de H2O2  simula el  tratamiento 

con  luz  sugiriendo  un  posible  rol  de  esta molécula  en  la  transmisión  de  la  señal  que 

estamos estudiando. 

Si bien el peróxido de hidrógeno, que se puede generar a partir de superóxido de una 

manera poco controlada durante el proceso de  transporte de electrones  fotosintético o 

respiración [Neill et al., 2002], puede actuar como molécula señalizadora es, además, uno 

de  los responsables principales del daño oxidativo. Esto último hace evidente que pueda 

causar  efectos  a  varios  niveles,  y  por  esta  capacidad  pleiotrópica  decidimos  seguir 

investigando  sobre  esta  hipótesis.  Para  tal  fin  utilizamos  plántulas  de  Arabidopsis  que 

Figura R18: efecto del peróxido de

hidrógeno en el patrón de isoformas

de RSp31. Barras blancas, luz; barras

grises, oscuridad. H202: spray de

peróxido 1 % (v/v) sobre plántulas.

H2O2 W: peróxido 0,5 % (v/v) en el

agar. Las barras corresponden a la

media de 2 réplicas ± DE. Se muestra

el resultado de 1 experimento.

0

1

2

3

4

5

- H2O2 H2O2 W

mR

NA

3/m

RN

A1

RSp31

P á g i n a  | 91  

 

sobre‐expresan  flavodoxinas  [Tognetti  et  al.,  2007] bacterianas que nos  fueron  cedidas 

por el Dr. Néstor Carrillo y su grupo. Las líneas utilizadas acumulan las flavodoxinas en el 

cloroplasto,  las  cuales  tienen  la  capacidad  de  disminuir  la  cantidad  de  ROS  frente  a 

diferentes  estímulos  y/o  estreses,  comparadas  con  una  planta  salvaje  [Tognetti  et  al., 

2006].  

Expusimos  plantas  salvajes  (Col)  y  plantas  sobre‐expresantes  de  flavodoxina  (fld)  a 

nuestro  protocolo  de  luz  y  oscuridad. Como  se  ve  en  la  figura R19,  no  hay  diferencias 

mayores entre el comportamiento de diferentes  líneas sobre‐expresantes y el de plantas 

salvajes con respecto al cambio en la abundancia de las isoformas de RSp31. 

 

En resumen, plántulas con una mayor capacidad de eliminar ROS se comportan frente 

al efecto de  la  luz, de manera similar a  las salvajes por  lo que es poco probable que  las 

ROS generadas en el cloroplasto en  respuesta a  la  luz  tengan un efecto sustancial en el 

patrón de splicing de RSp31. Esto es consistente con lo observado al usar metil‐viológeno 

(MV), una droga capaz de generar grandes cantidades de especies  reactivas de oxígeno 

dentro del cloroplasto. La  idea era generar H2O2 directamente en  la organela para ver el 

efecto  del mismo  en  el  lugar  que  se  originaría  en  respuesta  al  tratamiento  de  luz.  Su 

utilización no provocó cambios significativos en  la respuesta de RSp31 a  la  intensidad de 

luz (datos no mostrados). 

Figura R19: efecto de la sobre-

expresión de flavodoxinas bacterianas

en el cociente mRNA3/mRNA1 de

RSp31. Las barras corresponden a 1

planta (n=1) por condición. Todas las

líneas fld sobre-expresan flavodoxinas.

Col es la salvaje o no sobre-expresante. 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Col fld 18.18 fld 18.27 fld 19 fld 42

mRNA3/m

RNA1

RSp31Luz Osc

P á g i n a  | 92  

 

En  conclusión,  el  agregado  exógeno  de H2O2,  bajo  ciertas  condiciones,  produce  un 

efecto sobre el splicing alternativo de RSp31 que es similar al que produce el tratamiento 

de  luz. Sin embargo, por  lo visto más arriba, no podemos descartar  la posibilidad de que 

se trate de un efecto indirecto.  

c) Fotosíntesis y azúcares. 

Dado que  los productos  finales de  la  fotosíntesis suelen modular  la velocidad de  las 

reacciones  bioquímicas  en  el  cloroplasto  modificando  la  expresión  y  actividad  de  las 

enzimas  involucradas,  decidimos  enfrentar  a  las  plantas  al  protocolo  de  luz/oscuridad 

agregando  azúcares  exógenamente.  Así  podríamos  evaluar  si  estos  productos 

fotosintéticos  están  implicados  en  las  variaciones  de  expresión  y/o  procesamiento  de 

RSp31.   

Como muestra la figura R20, si crecemos las plántulas de Arabidopsis directamente en 

sacarosa 7 %  (p/v), el efecto de las transiciones luz/oscuridad sobre el splicing de RSp31 se 

ve  inhibido. El cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 en oscuridad en plántulas crecidas en 

sacarosa es similar al cociente observado en luz (con o sin sacarosa). Un efecto similar se 

observa si  las plántulas crecen en un medio sin azúcares, y se  las transfiere al momento 

del  tratamiento de  luz/oscuridad, a un medio nuevo  con o  sin azúcares  (no mostrado). 

Todo  esto  implica  que  el  agregado  de  sacarosa  simula  el  tratamiento  con  luz  en  las 

condiciones de ensayo. 

Figura R20: efectos del agregado de

sacarosa en el cociente mRNA3/mRNA1 de

RSp31. Las plántulas fueron crecidas en

sacarosa 7 % (p/v), sacarosa 3,5 % (p/v) y

sorbitol 1,8 % (p/v) o sorbitol 3.6 % (p/v)

como control de osmolaridad. Las barras

corresponden a la media de 3 réplicas ± DE.

Se graficó el resultado de 1 experimento

representativo. 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

Sorbitol ~3,6% Sor~1,8%  + Sac~3,5% Sacarosa ~7%

mRNA3/m

RNA1

RSp31

Luz Osc

P á g i n a  | 93  

 

 Dado que se cuenta en  la actualidad con varias  líneas mutantes y sobre‐expresantes 

de  genes  involucrados  en  las  vías  de  señalización  por  azúcares,  decidimos  que  era 

pertinente probar si alguna de ellas interfería con la señal que pretendemos describir. Las 

proteína‐quinasas  KIN10  y  KIN11,  muy  conservadas  evolutivamente,  regulan  la 

transcripción  en  respuesta  a  oscuridad,  azúcares  y  estrés  en  ciertas  condiciones.  Por 

ejemplo,  la  sobre‐expresión  de  KIN10  confiere mayor  tolerancia  al  hambreado  [Baena‐

Gonzalez et al., 2007]. Decidimos entonces enfrentar líneas sobre‐expresantes y mutantes 

para KIN10  a nuestro protocolo de  luz/oscuridad.  La  figura R21 muestra  los  resultados 

obtenidos.  Como  es  posible  observar,  no  hay  un  comportamiento  diferencial  de  las 

plantas  transgénicas en  comparación  a  la planta  salvaje, es decir,  la proteína KIN10 no 

está involucrada en la vía de señalización que produce el cambio en el patrón de splicing 

de RSp31 en respuesta a transiciones luz/oscuridad. 

 

En  las  plantas,  cuyas  vidas  giran  en  torno  a  la  producción  de  azúcar  a  través  de  la 

fotosíntesis, la glucosa se ha convertido en un regulador clave de muchos procesos vitales, 

incluyendo  la  germinación,  el  desarrollo  de  las  plántulas,  la  fotosíntesis,  la  floración, 

respuestas de estrés, etc. La hexoquinasa 1 (HXK1) tiene una función única en un amplio 

espectro de respuestas de glucosa  [Moore et al., 2003]. La mutante glucose  insensitive2 

(gin2‐1)  de  Arabidopsis    ayudó  a  definir  las  funciones  de  señalización  y  fisiológicas  de 

Figura R21: efectos de la sobre-expresión

y de la mutación de KIN10 sobre el

cociente de isoformas de RSp31. Ler es la

línea salvaje o control, Kin10(-) es la

mutante de KIN10 y Kin10(+) la sobre-

expresante. Las barras corresponden a la

media de 3 réplicas ± DE. Se muestra el

resultado de 1 experimento

representativo. 0

2

4

6

8

Ler Kin10(‐) Kin10(+)

mRNA3/m

RNA1

RSp31 Luz Osc

P á g i n a  | 94  

 

HXK1.  Aquí  nos  valemos  de  la misma  para  determinar  si  la  vía  de  la  señalización  por 

hexoquinasas  está  involucrada  en  la  regulación  del  splicing  alternativo  de  RSp31  en 

Arabidopsis thaliana. Como se puede observar en  la figura R22,  la mutante se comporta 

de  la misma forma que el control, es decir, el efecto de las transiciones de  luz/oscuridad 

sobre RSp31 es independiente de la HXK1. 

La conclusión hasta aquí es que el agregado de sacarosa, en condiciones de oscuridad, 

produce un efecto similar al del tratamiento con  luz. Al agregar sacarosa al 7 %   (p/v) se 

inhibe parcialmente el efecto  sobre el  splicing de RSp31 que  causan  las exposiciones  a 

transiciones de luz/oscuridad. 

 

d) Estado de óxido‐reducción del pool de plastoquinonas y expresión génica 

del cloroplasto. 

Hasta aquí descartamos 2 vías de señalización  (relacionadas a  la expresión de genes 

del  cloroplasto  y  a  la  biosíntesis  de  clorofila)  y  tenemos  sospechas  de  un  rol  en  la 

regulación del splicing alternativo de RSp31 para otras 2 (relativas a las especies reactivas 

de oxígeno y a los azúcares). De estas últimas he presentado evidencias algo encontradas 

sobre su papel en la señalización lumínica. No podemos negar que el agregado de H2O2 y 

el de sacarosa, generan un cambio sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. Sin 

embargo no  fuimos  capaces de encontrar evidencias que  sugieran un efecto directo de 

estos compuestos sobre  la regulación que ejerce  la  luz sobre RSp31. Sabemos que estos 

Figura R22: comportamiento de la mutante

gin2 de la HXK1 sobre el cociente de

isoformas de RSp31. Ler es la línea salvaje o

control, gin2 es gin2-1 la mutante de HXK1.

Las barras corresponden a la media de 3

réplicas ± DE. Se muestra el resultado de un

experimento típico.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

Ler gin2

mRNA3/m

RNA1

Genotipo

RSp31Luz Osc

P á g i n a  | 95  

 

compuestos  interactúan modificando  el  estado  redox de diferentes  componentes de  la 

cadena de  transporte electrónico  fotosintético  [Tognetti et  al., 2006;  Laloi et  al., 2007; 

Jeong  et  al.,  2010].  Por  consiguiente,  quizás  sus  efectos  sean  consecuencia  de  dicha 

cadena.  

De lo expuesto hasta aquí surgió el interrogante de si el pool de plastoquinonas es el 

responsable principal en  la  cascada de  señalización que  intentamos  caracterizar.¿Cómo 

abordamos esta posibilidad? 

Anteriormente describí los efectos del DCMU o diurón sobre el splicing alternativo del 

mensajero de RSp31 y cómo actuaba el herbicida sobre el cloroplasto (fig. R14). Existe otra 

droga,  llamada  DBMIB  (2,5‐dibromo‐3‐metil‐6‐isopropilbenzoquinona)  que  inhibe  el 

transporte electrónico fotosintético como el DCMU pero en un punto diferente. Su acción 

es  posterior,  en  la  cadena  de  transporte  electrónico  fotosintético,  al  pool  de 

plastoquinonas y ocasiona que el mismo quede reducido al no poder ceder sus electrones 

al complejo del citocromo b6/f (ver Introducción fig. I12).   

Si el estado redox del pool de plastoquinonas está relacionado al efecto de la luz sobre 

el  splicing  alternativo del mensajero de RSp31 es de esperar que el DCMU  y el DBMIB 

tengan efectos distintos. El DCMU debería  inhibir el efecto de  la  luz,  lo que ya sabemos 

que sucede  (fig. R14) y el DBMIB debería exagerar el efecto de  la  luz o no  tener efecto 

aparente. Esto es efectivamente  lo que  sucede  si  sometemos plántulas al protocolo de 

luz/oscuridad tratadas o no con DCMU y DBMIB (fig. R23 A). 

 Este resultado es  indicativo pero no comprueba por sí mismo de modo fehaciente  la 

posibilidad de que el pool de plastoquinonas esté involucrado en la regulación del splicing 

de RSp31. Algunos controles realizados nos indican que el resultado es correcto ya que el 

DBMIB  estaría  funcionando.  Esta  droga  reprime,  de  la misma manera  que  lo  hace  el 

DCMU,  la  inducción  por  luz  del  gen  PORc  (Protochlorophyllide  Oxidoreductase  c)  cuyo 

producto está  involucrado en  la síntesis de clorofila  [Oosawa et al., 2000]  (fig. 23 B). Es 

 

 

inter

espe

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

L

PQ e

Figu

la e

conc

resu

resante  des

ramos obse

La conclusió

es el respons

ura R23: efecto

xpresión de

centración de

ultado de 1 exp

stacar  que 

ervar un efe

ón hasta aq

sable de los

o de las droga

PORc (B). A-

e cada droga (

perimento rep

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

mRNA3/m

RNA1

A 

B 

dado  que

ecto en esta

uí, sugerida

s cambios g

as DCMU y D

-B) Se repres

(µM). Las barr

presentativo. B

e  en  oscuri

a condición.

a por la evid

atillados po

DBMIB sobre e

senta el contr

ras correspon

B) Ubi, ubicui

RSp3Luz

idad  no  ha

. 

dencia de la

or la luz en l

el patrón de srol/vehículo (

nden a la medi

itina. * p<0,1.

31Osc

ay  transpo

a figura R23

la expresión

splicing altern

(-) y las can

ia de 3 réplica

.

P á g

rte  electró

3, es que e

n de RSp31.

nativo de RSpntidades creci

as ± DE. Se m

i n a  | 96 

ónico,  no 

l pool de 

.  

p31 (A) y

entes de

muestra el

P á g i n a  | 97  

 

6. Extensión del análisis:  

¿Cuántos eventos de splicing alternativo pueden ser modulados por 

transiciones de luz/oscuridad? 

Con el fin de conocer el alcance de las señales de luz sobre la modulación del splicing 

alternativo  en  Arabidopsis  thaliana  decidimos  someter  los  ARN  derivados  de  nuestro 

protocolo de tratamiento en luz/oscuridad a un análisis de alta resolución en colaboración 

con el laboratorio de John Brown y Craig Simpson en Dundee, Escocia. Utilizando su panel 

de  RT‐PCR  [Simpson  et  al.,  2008]  evaluamos  96  eventos  de  splicing  alternativo  en 

muestras derivadas de plántulas expuestas a luz u oscuridad, con sacarosa o sorbitol como 

control energético y de osmolaridad.  

Aproximadamente  el  40  %   de  los  eventos  de  splicing  alternativo  evaluados mostró 

diferencias en respuesta a las transiciones luz/oscuridad (tabla R1 y Apéndice, tablas A‐C). 

Un porcentaje mínimo de  los que cambian, el 4  % ,  lo hacen  sólo en  sacarosa o sólo en 

sorbitol. El hecho de que más del 80 %  de los eventos afectados cambien tanto en sorbitol 

como  en  sacarosa  indica  que  la  mayoría  de  los  eventos  de  splicing  alternativo  que 

responden a transiciones de luz/oscuridad, lo hacen respondiendo a la presencia/ausencia 

de ese estímulo  independientemente del nivel de azúcares, o del nivel energético de  la 

plántula.  

Para el caso de RSp31, donde el panel no  fue conclusivo,  la RT‐PCR  radiactiva  indica 

que la sacarosa al 7 %  (p/v) inhibe parcialmente las diferencias entre luz y oscuridad (fig. 

R22), y a un 3,5 %  (p/v) de sacarosa el efecto ‐si bien más bajo‐ se observa perfectamente. 

Entonces, a pesar de que la sacarosa es capaz de anular los efectos de las transiciones de 

luz/oscuridad,  no  sería  un  efecto  de  hambreado  de  las  plántulas  lo  que  causa  esas 

diferencias, dado que es posible seguir viendo un efecto aún en presencia de sacarosa al 

3,5 %  (p/v).  

   

P á g i n a  | 98  

 

Tabla R1: análisis global de splicing alternativo con un panel de RT-PCR. Para la confección de la tabla tomamos

como parámetros de cambio una diferencia entre el cociente “isoforma X/isoformas posibles” (dónde X es la

isoforma más pequeña) de luz y de oscuridad, mayor al 5 % (en valor absoluto) y con un valor p < 0,1. De los 96

eventos del panel se eliminaron los dos constitutivos del análisis y se desglosaron aquellos eventos múltiples

(combinaciones de 5’ss, 3’ss, retención de intrón, y/o exones cassette -o salteado exónico-) dando lugar a 100

eventos totales.

Tabla R1  N° de 

eventos 

Sin 

cambio 

Cambian en 

las dos 

condiciones 

Sólo cambian 

en Sorbitol 

Sólo cambian 

en Sacarosa 

Cambian 

entre 

Sorbitol y 

Sacarosa 

Cambian 

en 

alguna 

condición 

5'ss  28  17  10  1 0 4  11

3'ss  48  27  18  2 1 2  21

Retención 

de intrón 

12  9  1  1 1 0  3

Exón 

cassette 

12  6  4  1 1 0  6

Total  100  59  33  5 3 6  41

 

Sería interesante ver qué sucede con los eventos que cambian entre luz y oscuridad si 

agregamos  DCMU  y  DBMIB,  para  determinar  cuántos  cambian  en  respuesta  a  señales 

retrógradas  y,  particularmente,  cuántos  son  regulados  por  la  vía  de  señalización 

relacionada el estado redox del pool de PQ.  

A pesar de que estos  resultados  requieren análisis  futuros, podemos en este punto 

extraer dos conclusiones muy importantes para nuestros hallazgos sobre la regulación del 

splicing  alternativo  en  Arabidopsis  thaliana  en  respuesta  a  las  transiciones  de 

luz/oscuridad. Una  de  ellas  es  que  el  protocolo  utilizado  no  altera  profundamente  las 

respuestas de la planta, sólo causa efectos sobre algunos eventos de splicing particulares y 

éstos no dependen, en su mayoría, del estado energético o de  reservas de  la planta. La 

 

 

otra 

difer

meca

T

mod

camb

respu

pued

alter

 

 

 

Fi

al

re

un

va

pa

ag

O

conclusión

rencias  en 

anismo sea 

Trabajaremo

ulados  por

bios sutiles 

uestas con 

dan afectar

rnativo con 

igura R24: (A

lternativo en

egulador de spn 3’ss alterna

aría en respu

ara KIN11, el

gregado de sa

Osc, sacarosa o

n  que  dese

varios  even

relevante p

os  en  los  p

r  diferentes

en las cond

el estado e

. La  figura 

cambios en

A-C) diferente

respuesta a

splicing) y pre

ativo que es d

uesta a luz/osc

evento es un

acarosa. Sor L

oscuridad. Bar

eo  destacar

ntos  de  sp

para tales re

próximos  a

s  vías  de  s

diciones de 

nergético d

R24  (A‐D) m

n respuesta 

es ejemplos d

a la luz/oscur

esenta un 3’ss

diferencialme

curidad pero

5’ss que varí

Luz, sorbitol y

rras, media ±

r,  es  que  la

plicing  abrie

espuestas.

años  para 

eñalización

iluminación

de la planta 

muestra dif

a transicion

de genes que

ridad. A) Ats alternativo q

ente seleccion

no lo hace c

a en su selecc

y luz; Sac Luz

ES (n=3). * p<

as  transicio

endo  lugar 

identificar 

n,  ajustando

n del ambie

y con los d

ferentes eje

nes de luz/o

presentan d

t1g09140, co

que cambia en

nado en luz/os

cuando de ag

ción en respue

z, sacarosa y

<0,05. Ver apé

ones  de  luz

a  la  posib

grupos  de 

o  la  respue

ente y, quizá

iferentes ti

emplos de 

oscuridad d

diferencias en

difica para S

n respuesta a

scuridad. C) Arega sacarosa

esta a luz/oscu

luz; Sor Osc,

éndice de prim

P á g

z  oscuridad

bilidad  de  q

eventos  q

esta  de  la 

ás, integran

pos de estr

eventos de

e diferente

n sus patrones

SRp30 (una

luz. B) At4g1At5g35680, o

a. D) At3g29uridad y adem

, sorbitol y os

imers.

i n a  | 99 

d  causan 

que  éste 

que  sean 

planta  a 

ndo estas 

és que la 

e splicing 

s genes. 

s de splicing

proteína SR,

12790, posee

otro 3’ss que

9160, codifica

más varía por

scuridad; Sac

g

P á g i n a  | 100  

 

Figura R25: efecto de la intensidad de la luz

sobre la abundancia de transcriptos totales

de RSp31. Se normaliza con respecto a

Ef1C como gen constitutivo (House-Keeping). La intensidad de luz creciente

está representada en la escala de grises de

las barras. Las barras corresponden a la

media de 3 réplicas y el desvío estándar

(DE) correspondiente. Se muestra 1

experimento representativo.

Algunas particularidades del evento estudiado 

Debido  a  que  la  abundancia  del  mensajero  total  de  RSp31  es  mayor  a  menor 

intensidad de luz (fig. R25) ‐lo opuesto a lo que sucede con el mensajero de RCA, dato no 

mostrado‐,  que  este  hecho  está  de  acuerdo  con  la  actividad  del  promotor  de  RSp31 

medida con la actividad del reportero GUS (fig. R8), y que presenta un cambio del patrón 

de splicing muy veloz (tan solo 3 horas) en el sentido de mayor “actividad transcripcional” 

al de menor; decidimos evaluar la posibilidad de que una de las isoformas (probablemente 

mRNA3)  estuviera  siendo  rápidamente  degradada  en  luz.  Esto  explicaría  por  qué 

detectamos una menor cantidad de mensajero total en esta condición, y sería una forma 

posible de generar un cambio veloz en la relación mRNA3/mRNA1 en condiciones de baja 

actividad transcripcional. 

 

Para  tal  fin  utilizamos  actinomicina  D,  un  conocido  inhibidor  de  la  transcripción 

[Goldberg et al., 1962; Goldberg et al., 1963]. La hipótesis de  trabajo es  la  siguiente:  la 

inhibición de la transcripción provoca un efecto similar al de la luz, dado que este estímulo 

parece inhibir la actividad del promotor de RSp31, permitiendo la rápida degradación del 

mRNA3 para generar un patrón de splicing similar al de luz. El esquema experimental fue 

el siguiente: se crecieron  las plántulas en  luz continua durante 7 días, se  las  transfirió a 

oscuridad  por  48  hs,  al  final  de  ese  período  se  agrego  actinomicina D  o  vehículo  a  las 

placas correspondientes en oscuridad, se incubo por un período más de 2 hs en oscuridad 

para permitir que la droga entre a las células de las plantas (se aplicó vacío en el comienzo 

0

1

2

3

4

5

0,2 1 2,2 14 80

RSp

31/Ef1C

Intensidad de Luz (umol de fotón/m2seg)

RSp31

P á g i n a  | 101  

 

Figura R26: efecto de la actinomicina D en la

abundancia relativa de isoformas de RSp31.

Luego de 48 hs de oscuridad las plantas

fueron tratadas por 3 o 6 hs con/sin la droga.

Las barras corresponden a la media de 3

réplicas ± DE correspondiente. Se muestra el

resultado de 1 experimento representativo.

de este período para facilitar el ingreso), y finalmente fueron tratadas en luz u oscuridad 

por 3 y 6 hs. Sorpresivamente, lo que observamos fue el patrón opuesto al esperado (fig. 

R26).  La  actinomicina  D  inhibe  significativamente  el  efecto  de  la  luz  sobre  el  splicing 

alternativo de RSp31 y mantiene una relación mRNA3/mRNA1 elevada, similar a la que se 

observa en oscuridad.  

 

La conclusión más directa de este experimento nos dice que para observar el efecto de 

la luz necesito la transcripción de algún gen (nuclear o del cloroplasto).  

Considero que estos resultados son sujeto de diferentes  interpretaciones. A pesar de 

esto, cuando desgloso cada una de ellas  llego a un mismo punto. Dado que uno de  los 

efectos  de  la  luz  sobre  RSp31  es  una  caída  abrupta  en  la  actividad  de  su  promotor, 

podríamos  pensar  que  el  cambio  en  el  cociente mRNA3/mRNA1  está  causado  por  la 

desestabilización de la isoforma mRNA3 bajo esta condición. Además, de ser estos efectos 

mediados  por  un mecanismo  de  degradación,  el mismo  debe  ser  “activo”,  ya  que  al 

parecer, algún factor debe transcribirse para que ocurra la desestabilización/degradación 

del ARN  específico.  Es  interesante destacar que  la  actinomicina D  aumenta  el  cociente 

mRN3/mRNA1 por encima de  los niveles “basales” de oscuridad. Esto se debe a que en 

presencia de  la droga el mRNA3 es “más estable” en  luz, y también en oscuridad,  lo que 

puede  deberse  a  que  no  se  eliminó  completamente  durante  el  período  de  48  hs  de 

oscuridad al  factor que “lleva el mRNA3 a degradación”. Quizás  la desaparición  lenta de 

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

sin ActD 3h con ActD 3h sin ActD 6h con ActD 6h

mRNA3/m

RNA1

RSp31Luz Osc

P á g i n a  | 102  

 

este factor en plántulas en oscuridad, y su aparición rápida en luz, explique la cinética de 

los cambios del splicing alternativo de RSp31.  

También  pudimos  evaluar  lo  que  sucede  con  RCA  en  ausencia  de  transcripción. 

Utilizando el mismo esquema experimental que el descripto para RSp31 observamos que, 

para ver los efectos inducidos por la luz sobre el splicing alternativo de RCA, es necesaria 

la  transcripción. Es decir que al agregar actinomicina D no hay efecto de  la  luz sobre el 

splicing de los transcriptos de este gen (datos no mostrados).  

 

   

P á g i n a  | 103  

 

Discusión (Capítulo I) 

La luz y su efecto sobre el splicing alternativo 

Las figuras R2 y R4 muestran que si se exponen plántulas crecidas de 1 a 2 semanas en 

luz  continua  a  un  tratamiento  de  oscuridad  por  diferentes  períodos  de  tiempo,  ese 

tratamiento causa  cambios en  los patrones de  splicing de  los  transcriptos de RSp31 y 

RCA, a partir de las 24 o 48 hs (comparado a un control en luz continua). Esto no sucede 

con otros eventos de splicing como  los de  los transcriptos de RSZ33 y AtPP5  (fig. R5),  lo 

que  implica una  cierta especificidad del efecto. Además, es  interesante destacar que el 

efecto  se  observa  tanto  en  plantas  juveniles  de Arabidopsis  thaliana,  como  en  plantas 

adultas,  florecidas,  y  en  diferentes  tejidos  de  las  mismas,  incluyendo  hojas  aisladas 

(resultados no mostrados). Es decir, el efecto no depende del desarrollo de  la planta, si 

bien puede presentar algunas variaciones en los distintos estadios y tejidos. 

Debido  a  que  el  tratamiento  en  oscuridad  va  en  detrimento  de  las  reservas 

acumuladas por  la planta y podría generar un estrés energético, era  importante probar 

que  después  del mismo  las  plantas  ‐o  plántulas‐  respondieran  a  luz  y  siguieran  siendo 

viables.  La  figura  R6  muestra  que  con  3  hs  de  exposición  a  luz  blanca  después  del 

tratamiento de oscuridad, es tiempo suficiente para que la relación de isoformas de RSp31 

sea  nuevamente  la  observada  en  una  planta  expuesta  a  luz  continua  durante  todo  su 

desarrollo. El fenómeno es reversible. Sin embargo, la cinética de la variación en el patrón 

de splicing  de RSp31 y RCA en la dirección luz‐oscuridad es más lenta (de 24 a 48 hs) que 

en la dirección oscuridad‐luz (~3 hs).  

Esto último es muy  interesante y vale  la pena discutirlo en mayor detalle. Para RCA, 

encontramos mayor  abundancia  de  transcriptos  en  luz  (fig.  R7  B).  Es  probable  que  la 

mayor  tasa de  transcripción establezca  rápidamente un cociente L/C pequeño que es el 

correspondiente al tratamiento de  luz. En oscuridad, caería  la transcripción y el cociente 

iría cambiando paulatinamente hasta ser significativamente distinto del de luz al cabo de 

P á g i n a  | 104  

 

~48 hs. Una  leve diferencia en  las estabilidades de  las distintas  isoformas  (L  y C), o un 

procesamiento diferencial en las condiciones de oscuridad (que genere en proporción más 

isoforma  L  que  en  luz)  para  los  pocos  transcriptos  que  se  generen  en  esta  condición, 

podrían explicar  las diferencias observadas. Sin embargo,  la cantidad de transcripto total 

de RSp31 es mayor en oscuridad que en luz (fig. R7 A) por lo que las deducciones hechas 

para  RCA  no  son  aplicables  en  este  caso.  Es  importante  destacar  que  la  actividad  del 

promotor de RSp31  (fig. R8) medida por su fusión a GUS, es coherente con  los datos de 

abundancia de mensajero total del gen medido por PCR en tiempo real (Real Time PCR). Es 

decir, habría una menor tasa de transcripción en oscuridad. Cómo se explica entonces  la 

diferencia  en  las  cinéticas  de  respuesta  a  la  luz/oscuridad  en  el  patrón  de  splicing  de 

RSp31. Una posibilidad es que haya algún compuesto que se sintetiza y acumula en luz, y 

deja  de  hacerlo  cuando  la  planta  está  en  oscuridad,  desapareciendo  lentamente.  Este 

compuesto  actuaría  como  una  señal  ‐o  un  intermediario  de  la  señal‐  que    gatilla  los 

cambios  en  el  splicing  alternativo  de  RSp31  en  respuesta  a  las  transiciones  de 

luz/oscuridad (discuto un poco esto en base a los resultados de las figuras R25 y R26 de la 

sección previa de resultados). 

 

No discutiré  en detalle  lo que  sucede  con  los  transcriptos de RCA, debido  a que el 

efecto de la luz sobre su evento de splicing alternativo ha sido marginal en la mayoría de 

los experimentos. Debido a que el panel de RT‐PCR (tabla R1, fig. R24 A‐D y tablas A‐B del 

apéndice)  indica que numerosos eventos de  splicing alternativo de Arabidopsis  thaliana 

son afectados por transiciones de  luz/oscuridad,  tomaré como modelo de  los mismos al 

evento del gen RSp31. Sólo mencionaré a RCA cuando  le confiera un valor agregado a  lo 

que sucede con la regulación del splicing alternativo o la transcripción de RSp31. 

 

 

 

 

El ca

tejid

E

en o

luz  s

debe

splici

esta 

R9 m

distin

cocie

expre

tiene

ambio en 

dos de la p

El reportero

scuridad qu

sólo  aparec

en  a  una  d

ing  alterna

hipótesis d

muestra que

ntos  tejido

ente mRNA3

esión y patr

en lugar en 

Figura

de spl

el patrón 

planta y e

o GUS fusion

ue en  luz (f

e  en  los  co

iferencia  d

tivo  especí

disectando  l

e el cambio 

s de  las pl

3/mRNA1  

rones de sp

plantas en 

a D1: Esquem

licing específi

de splicin

en diferen

nado al prom

fig. R8),  incl

otiledones 

e  expresió

íficos  (la  fig

la plántula,

en el patró

ántulas.   N

causadas p

plicing espec

diferente et

ma del efecto d

cos.

ng de RSp3

tes estadi

motor de RS

lusive,  la tin

(fig.  R8 A).

n  en  los  d

g.  D1  esqu

 es decir, s

ón de splicin

No es posib

or las trans

cíficos de te

tapa del de

de diferencias

31 se evid

ios de des

Sp31 revela

nción más t

  Esto  podr

istintos  tej

ematiza  la 

eparando  l

ng alternati

le entonces

siciones de 

ejido. Adem

sarrollo (no

s de expresió

dencia en 

sarrollo 

a que este ú

tenue en p

ría  implicar 

idos  que  p

situación). 

os diferent

ivo de RSp3

s, atribuir  l

luz/oscurid

más, sabemo

o mostrado)

n en tejidos c

P á g i

diferentes

último es m

lántulas cre

que  los  ef

poseen  patr

Decidimos

es tejidos. 

31 tiene lug

as diferenc

ad, a difere

os que esto

). 

con patrones

n a  | 105 

s 

ás activo 

ecidas en 

fectos  se 

rones  de 

s  evaluar 

La figura 

gar en los 

cias en el 

encias de 

s efectos 

P á g i n a  | 106  

 

Los fotorreceptores, criptocromos y fitocromos, no están involucrados en la 

vía de señalización lumínica que cambia la abundancia relativa de 

isoformas de RSp31 

Habiendo resuelto y confirmado que el cambio en los patrones de splicing alternativo 

de RCA y RSp31 ocurre en los diferentes tejidos de la plántula en respuesta a transiciones 

de  luz/oscuridad,  decidimos  tratar  de  identificar  la  vía  de  señalización  involucrada.  La 

primera vía que ensayamos  la de  los  fotorreceptores. Es decir, nuestra hipótesis es que 

algún  fotorreceptor  percibe  la  luz,  transduce  la  señal  al  núcleo,  y  altera  la 

transcripción/splicing  de  RSp31.  El  corolario  de  esta  hipótesis  sería  que mutantes  del 

fotorreceptor/fotorreceptores  deberían  comportarse  como  “ciegas”  a  la  luz,  o  sea,  el 

cociente mRNA3/mRNA1 no debería variar entre  luz y oscuridad. Además, el patrón de 

isoformas de la mutante debería ser similar al que presenta la planta salvaje en oscuridad. 

Como muestra  la figura R10,  la mutante doble de criptocromos (cry1 y cry2),  la mutante 

doble de fitocromos (phyA y phyB), como las mutantes simples, y una mutante doble para 

criptocromo 1 (hy4) y un factor de transcripción asociado a la vía de los fitocromos (hy5), 

todas ellas responden de manera similar a la planta salvaje cuando se enfrentan a nuestro 

protocolo de  luz/oscuridad. Esto  implicaría que  los  fotorreceptores ensayados, y en  las 

combinaciones  particulares  probadas,  no  estarían  involucrados  en  el  efecto  de  la  luz 

sobre  el  splicing  alternativo  de  RSp31.  Tampoco  estaría  involucrado  en  esta  vía  de 

señalización el factor de transcripción HY5. Si bien se lo asocia a la vía de los fitocromos, 

HY5 es un  regulador clave de  la  fotomorfogénesis cuya abundancia  se  regula a nivel de 

estabilidad de  la proteína. En oscuridad, HY5 es marcado para degradación proteolítica 

por COP1  (una E3  ligasa de ubicuitina). En  luz, este proceso es  inhibido, en parte, por  la 

acción de CRYs, posiblemente por el purgado de COP1 del núcleo [Gyula et al., 2003].  

Los  factores  de  transcripción  como HY5  funcionan  como  puntos  de  convergencia  e 

integración de señales de  las  ramas principales de  todos  los  fotorreceptores  [Jiao et al., 

2007],  el hecho de que la mutante hy5 se comporte como la plántula salvaje nos permite 

descartar con mayor nivel de confianza el rol de esta vía de señalización en la regulación 

P á g i n a  | 107  

 

del splicing alternativo de RSp31. Resulta  interesante destacar en este momento que, de 

manera similar a COP1, el complejo de señalización COP9 (CSN, COP9 signalosome) es otro 

regulador  clave  de  las  respuestas  a  luz  y  el  desarrollo.  Inclusive,  las mutaciones  que 

causan deficiencias en COP1 o en CSN generan el mismo  fenotipo de  fotomorfogénesis 

constitutiva típico de las mutantes cop/det/fus [Schwechheimer y Deng, 2000; Wang et al., 

2009]. Esto se debe a que la interacción de E3 ligasas de ubicuitina como COP9 con CSN es 

necesaria para  la actividad de  las mismas, de allí que  los sustratos de degradación de  las 

E3 ligasas se encuentren estabilizados en mutantes csn [Dohmann et al., 2008]. Si bien no 

muestro los resultados, las mutantes de csn que nos cedió Claus Schwechheimer, tampoco 

evidencian  diferencias  de  respuesta  (con  la  planta  salvaje)  a  las  transiciones  de 

luz/oscuridad a nivel de splicing de RSp31.  

En resumen,  los integradores de las vías de señalización de los fotorreceptores (ver 

fig.  I9),  COP/DET/FUS  y  HY5,  no  participan  de  la  señalización  lumínica  que  causa  los 

cambios en la abundancia relativa de isoformas de RSp31. 

¿Hay alguna diferencia en el efecto causado sobre el splicing alternativo de 

RSp31 cuando se utilizan calidades de luz incidente distintas?  

No conformes con esto, decidimos evaluar si alguna  longitud de onda captada por  la 

planta era más eficiente en producir el efecto que otra, es decir, si el cambio en el splicing 

alternativo de RSp31 era causado por  la calidad de  luz. Utilizamos módulos de LEDs para 

exponer las plántulas a una longitud de onda particular y acotada. La figura R11 muestra 

que el efecto de luz de 470 nm (azul) y de 660 nm (roja) de longitud de onda, es similar al 

causado por la luz blanca de un tubo fluorescente o de un módulo de LEDs que emite en 

blanco. Además,  la mutante doble para  fitocromos  (phyA y phyB) “ve”  luz  roja, como  la 

mutante cry1 “ve” luz azul en lo referido a la regulación del splicing de RSp31 (fig. R12). 

Como conclusión general, y a modo de resumen de lo dicho hasta aquí, el efecto de la 

luz  sobre  el  splicing  alternativo  de  RSp31  no  está  mediado  por  fotorreceptores  y  –

coherentemente  con  esto‐  no  está  modulado  por  la  calidad  de  la  luz  perceptible  y 

P á g i n a  | 108  

 

fotosintéticamente activa. Esto último quiere decir que si la luz tiene la capacidad de ser 

captada  y  aprovechada  por  la  planta,  en  lo  que  se  refiere  al  cambio  en  el  patrón  de 

splicing de RSp31, no se observan diferencias significativas entre una  longitud de onda y 

otra (ej.: rojo y azul). 

Los cambios inducidos por la luz en el patrón de splicing alternativo de 

RSp31 son modulados por la intensidad de la luz incidente 

Antes de usar  los módulos de LEDs utilizábamos tubos fluorescentes con acetatos de 

colores  como  filtros  para  tratar  las  plantas  con  luces  de  longitudes  de  onda  acotada. 

Algunas  veces,  cuando  la  luz  de  los  tubos  no  era  muy  intensa  y  el  filtro  (acetato) 

bloqueaba  el  paso  de  una  alícuota  importante  de  fotones  haciendo  aún  menor  la 

intensidad, no observábamos diferencias entre  luz y oscuridad. Esto nos dio  la pauta de 

que  la  intensidad  podía  tener  que  ver  con  los  efectos  que  estudiamos.  La  figura  R13 

muestra  que,  efectivamente,  la  intensidad  de  luz  blanca  afecta  el  patrón  de  splicing 

alternativo  de  RCA  y  de  RSp31  de  forma  “dosis‐dependiente”. De  la misma  forma,  la 

intensidad de la luz afecta la abundancia de mensajeros totales de RCA (no mostrado) y 

RSp31 (fig. R28).  

La  evidencia  reunida  hasta  este  momento  parece  indicar  que  el  mecanismo  que 

genera la molécula o factor que transmite la señal lumínica no diferencia entre luz roja y 

azul (fig. R11 y R12); pero sí tiene la capacidad de detectar diferencias en la intensidad (fig. 

R13). Además, ya descartamos a los fitocromos, criptocromos, y factores “río abajo” de los 

mismos como posibles candidatos para la transmisión de esta señal. Todo nos conduce a 

un nuevo sospechoso, el cloroplasto. 

El cloroplasto está involucrado en la respuesta del gen RSp31 a las 

transiciones de luz/oscuridad 

Un primer  indicio que apuntó en esa dirección provino de un experimento en el que 

las  plántulas  crecidas  en  luz  fueron  tratadas  con  kanamicina.  Este  antibiótico  inhibe  la 

traducción  llevada  a  cabo  por  ribosomas  70S  de  los  procariotas,  y  de mitocondrias  y 

P á g i n a  | 109  

 

cloroplastos  (según  la  teoría endosimbiótica, de origen procariótico). Plántulas  tratadas 

desde  la  germinación de  la  semilla  con  cantidades  crecientes de  la droga muestran un 

cociente mRNA3/mRNA1  de  transcriptos  de RSp31  similar  al de  plántulas  en  oscuridad 

(resultados no mostrados).  

La  primera  aproximación  utilizada  para  investigar  el  papel  del  cloroplasto  en  la 

regulación  del  splicing  alternativo  de  RSp31  fue  el  tratamiento  de  las  plántulas  con  el 

herbicida DCMU. Observamos que el efecto de la luz sobre el cociente mRNA3/mRNA1 de 

RSp31  disminuye  (causando  que  el  patrón  de  splicing  en  luz  sea más  parecido  al  de 

oscuridad) a medida que  aumenta  la  concentración de DCMU,  con un efecto notorio  a 

partir de 1 µM de droga  (fig. R14). Por  consiguiente, el  funcionamiento del  transporte 

electrónico fotosintético es necesario para que las transiciones de luz/oscuridad causen 

un  cambio  en  el  patrón  de  splicing  alternativo  de  RSp31.  Resultados  similares  se 

obtuvieron  con  atrazina,  otro  herbicida  que  al  igual  que  el  DCMU  inhibe  el  pasaje  de 

electrones desde el fotosistema II al pool de PQ (no mostrado). 

Como  conclusión  de  lo  dicho  anteriormente  se  puede  decir  que  es  necesario  un 

“cloroplasto  funcional”  para  observar  un  efecto  causado  por  las  transiciones  de 

luz/oscuridad. Esto sugiere un posible rol del cloroplasto y alguna señal retrógrada en el 

efecto  de  la  luz  sobre  el  splicing  de  RSp31,  por  lo  tanto,  comenzamos  a  indagar  esta 

hipótesis seriamente.  

Es interesante remarcar que como resultado del tratamiento con DCMU no se obtiene 

en  la práctica, en nuestras manos, una  inhibición completa del efecto de  la  luz. Esto  se 

puede deber a un transporte residual de electrones en ciertos cloroplastos a  los que no 

llega  la droga, o a que  se  requiera una mayor  concentración de  la misma  (pocas  veces 

probamos  más  de  10  µM  y  no  obtuvimos  resultados  satisfactorios),  entre  otras 

posibilidades. 

 

 

 

Cara

S

enco

cloro

raíz, 

resul

gen e

trans

de d

cloro

retra

cloro

de p

RSp3

plánt

resul

gene

plant

mRN

acterizació

Si  el  clorop

ontremos  d

oplastos. Ob

hecho no p

ltados cons

estudiado e

siciones de 

iferentes m

oplasto loca

aso  respect

oplastos en 

roducir  los 

31 en la raíz

tulas  previa

ltado de ta

erada en el 

ta y recibe 

NA3/mRNA1

ón de la s

plasto  es  el

iferencias  a

bviamente, 

probado ha

tituyen las 

en este tejid

luz/oscurid

maneras. La 

alizado en la

o  del  efect

las hojas e

cambios q

z. Se nos ocu

amente  al 

l esquema 

“tejido verd

el tratamie

1 de RSp31 (

eñal gene

l  sensor/re

a  nivel  del 

esto es sólo

asta el mom

figuras R15

do y ademá

dad a nivel 

primera y m

a raíz. Sin em

to  en  la  ho

estaban gen

ue observa

urrió que un

tratamient

experiment

de” que viaj

nto de luz/o

(fig. R16) co

erada en e

eceptor  de 

splicing  d

o posible d

mento en qu

5 y R16. La f

ás, que la ra

del procesa

más simple 

mbargo, la r

oja  (fig.  R15

nerando un

amos en el 

na manera 

to  (pre‐trat

tal (fig. R16

ja a la raíz. 

oscuridad, 

omo sí suce

el cloropla

la  señal  lu

e  RSp31  en

e analizar s

ue  llevamos

figura R15 m

aíz también

amiento de 

es que hab

respuesta a

5).  Esto  no

a señal cap

splicing alt

de probar e

tamiento) 

6) aportó ev

Cuando la 

no se visua

de cuando 

asto 

umínica,  es

n  la  raíz  d

si hay expre

s a cabo el 

muestra qu

n evidencia 

RSp31. Est

bría otro “se

a la luz en la

s  hizo  pens

paz de move

ernativo de

esto era efe

de  luz/osc

videncias a

raíz está ais

lizan difere

está integra

Figura D2

protocolos

tratamiento

P á g i

s  esperable

ado  que  ca

esión de RSp

experimen

ue hay expre

una respue

to se puede

ensor” difer

a raíz tiene 

sar  que,  qu

erse por  la 

e  los mensa

ectuar el cor

uridad  (fig.

 favor de u

slada del re

encias en el 

ada (fig. R1

2: Esquema

de corte pre

o de luz y oscu

n a  | 110 

e  que  no 

arece  de 

p31 en la 

nto cuyos 

esión del 

esta a las 

e explicar 

rente del 

un cierto 

uizás,  los 

planta y 

ajeros de 

rte de las 

.  D2).  El 

una señal 

esto de la 

cociente 

5). 

a de los

e- y post-

uridad.

P á g i n a  | 111  

 

Es necesario destacar que podrían superponerse a  los efectos de  las  transiciones de 

luz/oscuridad  los  causados  por  el  daño mecánico  sobre  la  plántula  (wounding)  al  que, 

RSp31 es  “sensible”  (comunicación personal de Maria Kalyna  y Andrea Barta, datos no 

publicados).  Esta  clase  de  estrés  genera  grandes  cantidades  de  especies  reactivas  de 

oxígeno  en  el  lugar  donde  ocurre  y  además,  luego  de  un  tiempo,  genera  ROS  a  nivel 

sistémico [Orozco‐Cardenas y Ryan, 1999; Orozco‐Cardenas et al., 2001; Neill et al., 2002]. 

Sin embargo, no observamos cambios en los controles de plántulas en oscuridad a lo largo 

del tiempo en las partes cortadas y aisladas de las plántulas.  

Me  permito  entonces,  habiendo  hecho  las  salvedades  pertinentes,  resumir  los 

resultados previos  sobre  la  regulación  del  splicing  alternativo de RSp31  de  la  siguiente 

forma: la luz es captada en las hojas de Arabidopsis por los cloroplastos, éstos generan 

una señal que se traduce en un cambio en la expresión y el procesamiento de RSp31. Esa 

misma señal sería capaz de viajar y de transmitir  la  información de  las transiciones de 

luz/oscuridad a las células de la raíz.  

Habiendo  arribado  a  esta  conclusión,  decidimos  tratar  de  identificar  la/s  señal/es 

generada/s  en  el  cloroplasto  que  puede/n  alterar  el  procesamiento  de  un  gen  nuclear 

como RSp31. Ya mencioné en la introducción de este capítulo, y también en la sección de 

resultados, que se ha acumulado evidencia a  favor de  la existencia de, al menos, 5 vías 

diferentes  (aunque  algo  relacionadas)  de  señalización  retrógrada  (fig.  I10).  Sólo  para 

tenerlas en mente las enumeraré otra vez: intermediarios de la biosíntesis de la clorofila, 

expresión  génica  del  plástido,  especies  reactivas  de  oxígeno  o  ROS,  señalización  por 

azúcares, y estado  redox de  la cadena de  transporte electrónico  fotosintético  [Zhang et 

al., 2010]. 

   

P á g i n a  | 112  

 

Intermediarios de la biosíntesis de clorofila y expresión génica del plástido 

Se  sabe  que  existe  una  señal  derivada  del  plástido  que  depende  de  su  actividad 

transcripcional/traduccional y que es esencial para su biogénesis. Sin embargo, los efectos 

de  los  inhibidores de  la expresión génica del cloroplasto a nivel nuclear  sólo  se pueden 

observar  si  el  tratamiento  se  realiza  dentro  de  una  ventana  temporal  de  3  días  post‐

germinación  [Sullivan y Gray, 1999; Pogson et al., 2008]. Es probable que el efecto que 

observamos al aplicar kanamicina sea consecuencia de un defecto general en el desarrollo 

o  la biogénesis del cloroplasto, y no a un efecto específico de  la  inhibición de una señal 

generada por  la expresión de genes de  la organela. Esto se condice con el hecho de que 

cuando  tratamos  las  plántulas  sólo  durante  el  período  de  incubación  en  luz/oscuridad, 

después  de  haberlas  crecido  en  luz  continua  por  1  semana  o más  sin  kanamicina,  no 

observamos  diferencias  entre  tratadas  y  control.  Lo  mismo  sucedió  cuando  usamos 

tagetina,  un  inhibidor  específico  de  la  transcripción  del  cloroplasto,  en  lugar  de 

kanamicina (no mostrado).  

Debido a que la kanamicina fue el puntapié inicial en la demostración de un rol para el 

cloroplasto en la vía de señalización lumínica que induce cambios en la transcripción y en 

el procesamiento de RSp31, debemos considerar  la hipótesis de que  la expresión génica 

del  plástido  sea,  en  sí  misma,  causante  de  la  señal  retrógrada.  Como  discutimos 

anteriormente,  GUN1  estaría  implicada  en  esa  vía  de  señalización.  Sin  embargo,  la 

mutante  gun1  se  comporta  como  la  planta  salvaje  respecto  del  splicing  alternativo  de 

RSp31 (fig. R17). Lo mismo sucede con las mutantes del factor de transcripción ABI4, que 

actúa “río abajo” de GUN1 (resultados no mostrados).  

ABI4 también actuaría “río abajo” de GUN5. Los resultados expuestos en la figura R17 

también muestran que  las plántulas mutantes gun5, presentan  cambios  similares en el 

patrón  de  splicing  de  RSp31  a  los  obsevados  en  las  plantas  salvajes.  Este  resultado  es 

consistente con lo observado para las mutantes abi4. GUN5 funciona junto a  GUN4 en la 

biosíntesis de clorofila [Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003] y es esencial en esa vía 

biosintética. 

P á g i n a  | 113  

 

Tomando estos resultados en conjunto podemos concluir que la vía de señalización de 

los tetrapirroles (GUN5, ABI4) y la relativa a una señal generada por la expresión génica 

del cloroplasto  (GUN1, ABI4), no están  relacionadas con  la que genera  la  respuesta de 

RSp31 a la luz. 

Especies reactivas de oxígeno (ROS) 

La evolución de procesos metabólicos aeróbicos, como la respiración y la fotosíntesis, 

conllevan  la generación de especies reactivas de oxígeno en mitocondrias y cloroplastos 

[Laloi  et  al.,  2007].  Concluimos  antes  que  es  necesario  un  cloroplasto  funcional, 

fotosintéticamente activo, para que se observe un efecto de la luz sobre el procesamiento 

de RSp31. Además, la diferencia entre los patrones de splicing de RSp31 en oscuridad y luz 

aumenta  con  la  intensidad  de  la  luz  incidente  (fig.  R13)  y  es  esperable  que  lo mismo 

suceda con la producción de ROS en el cloroplasto, es decir, que se generen más especies 

reactivas a mayor flujo de electrones por la cadena fotosintética. Este conjunto de hechos 

e  ideas  relacionadas  nos  llevó  a  plantear  la  hipótesis  de  que  una  especie  reactiva  de 

oxígeno fuera  la causante de  los efectos estudiados. Considero  importante agregar aquí, 

que cada vez que una réplica experimental (ej.: 30 plántulas en una placa de Petri) “luce 

estresada”, con una coloración rojiza por la generación de antocianinas fotoprotectoras, o 

con  un  aspecto  deteriorado,  no  detectamos  diferencias  en  los  patrones  de  splicing  de 

RSp31  en  luz  y  oscuridad  (el  cociente mRNA3/mRNA  es  similar  al  de  luz  en  cualquier 

condición).  Se ha  reportado que el estrés genera un aumento  remarcado de ROS en el 

cloroplasto  [Laloi  et  al.,  2007]  y  esta  sería  una  correlación más  a  favor  de  la  hipótesis 

planteada.  

Consistentemente,  cuando  tratamos  exógenamente  plántulas  con  peróxido  de 

hidrógeno  vemos  que  el mismo  simula  el  efecto  de  la  luz  en  plantas mantenidas  en 

oscuridad (fig. R17).  

A pesar de que hasta aquí todas las piezas parecen encajar, no debemos ignorar que el 

peróxido de hidrógeno a nivel sistémico puede estar causando efectos indirectos [Noctor 

P á g i n a  | 114  

 

et al., 2000] e inclusive, puede estar afectando otra vía de señalización. Por ejemplo, se ha 

reportado que el  tratamiento  con H2O2 promueve  la oxidación del aceptor primario de 

electrones  del  pool  de  PQ  (llamado  QA)  aumentando  el  flujo  de  electrones  desde  el 

fotosistema  II [Laloi et al., 2007]. Esta característica pleiotrópica del peróxido nos  llevó a 

analizar los posibles efectos de las especies reactivas de oxígeno con otras aproximaciones 

para tener un mayor nivel de certeza acerca de los comportamientos observados. 

Al  utilizar  plántulas  de  Arabidopsis  thaliana    que  sobre‐expresan  flavodoxinas  no 

observamos diferencias significativas entre su comportamiento y el de plantas salvaje con 

respecto  al  cambio  en  la  abundancia  relativa  de  las  isoformas  de  RSp31  (fig. R19).  Las 

plantas sobre‐expresantes tienen mayor resistencia a todo tipo de estrés [Tognetti et al., 

2006]  probablemente  por  una mayor  capacidad  de  eliminar  ROS.  Debido  a  que  estas 

plantas que presentarían niveles de ROS más bajos se comportan como la salvaje, es poco 

probable que las especies reactivas de oxígeno sean mediadores de la señal lumínica para 

los efectos sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. A esta línea de evidencia le 

podemos  sumar  los datos  informados personalmente por Maria Kalyna y Andrea Barta. 

Ellas observaron que en hojas dañadas mecánicamente  (estrés que aumenta  la cantidad 

de ROS en el  lugar del daño), hay un  incremento de  la actividad del promotor de RSp31 

(como sucede en oscuridad, no en luz), y el patrón de splicing de las primeras horas post‐

daño  es  el  de  un  cociente mRNA3/mRNA1  elevado  similar  al  de  oscuridad  (datos  no 

publicados, comunicación personal). El metil‐viológeno, una droga que debería aumentar 

la cantidad de ROS generados en el cloroplasto [Donahue et al., 1997], tampoco produjo 

cambios significativos en la respuesta de RSp31 a la luz (no mostrado). Por último, cuando 

tratamos  las  plántulas  con  ascorbato,  un  poderoso  anti‐oxidante  que  actuaría  en  el 

cloroplasto  principalmente  en  la  remoción  de  peróxido  de  hidrógeno  formado  en  el 

fotosistema I por la foto‐reducción del oxígeno [Smirnoff y Wheeler, 2000; Smirnoff et al., 

2001],  tampoco  observamos  diferencias  con  respecto  al  control  en  ninguna  de  las 

concentraciones probadas (datos no mostrados). 

P á g i n a  | 115  

 

En  conclusión  ‐y  a  modo  de  resumen‐  probamos  que  el  agregado  exógeno  de 

peróxido de hidrógeno, en ciertas condiciones, simula el efecto que produce la luz sobre 

el  procesamiento  de  RSp31,  pero  numerosos  controles  adicionales  indican  que  lo más 

probable es que  lo haga de manera  indirecta. Los resultados con  las plantas que sobre‐

expresan flavodoxina (fig. R19), y los tratamientos con MV y ascorbato (no mostrados), 

indican  que  es  poco  probable  que  una  especie  reactiva  de  oxígeno  esté  involucrada 

directamente en  la vía de señalización que  le permite a  la  luz modular  la expresión de 

RSp31.  

Señalización por azúcares 

Es evidente que tras 48 hs de tratamiento en oscuridad, los niveles de azúcares de la 

planta pueden caer. Existe una gran variedad de estudios que utilizan cultivos celulares, 

raíces y hojas aisladas, que muestran que cuando éstas son incubadas en oscuridad puede 

observarse la inducción de un grupo de genes llamados DIN (Dark Induced). Esta inducción 

puede ser  inhibida por el agregado de azúcar al medio [Fujiki et al., 2000; Rolland et al., 

2006; Baena‐Gonzalez et al., 2007]. Se ha reportado que los genes DIN son activados bajo 

diversas condiciones de estrés y reprimidos por azúcares y luz. Consistentemente, DIN1 y 

DIN6  son  activados  por  oscuridad,  DCMU  y  condiciones  de  inundación/inmersión,  que 

pueden  limitar  la  fotosíntesis  y  la  respiración,  y  por  consiguiente,  agotar  las  reservas 

energéticas en células aisladas y plantas enteras [Baena‐Gonzalez et al., 2007].  

Dado que RSp31  reúne  varias  características  como para  incluirlo  en  la  categoría de 

genes inducidos por oscuridad decidimos trabajar en base a la hipótesis, de que teníamos 

en  nuestras manos  un  gen  DIN.  La  figura  R20 muestra  que  al  tratar  las  plantas  con 

sacarosa, el efecto de  las  transiciones de  luz/oscuridad  sobre el splicing de RSp31 se ve 

disminuido. El agregado de sacarosa al 7 %   (p/v) genera que  la relación de  isoformas de 

RSp31 sea, en oscuridad, similar a  la de  la  luz  (fig. R20). Es decir, el agregado de azúcar 

simula el efecto de la luz sobre la transcripción y el procesamiento de RSp31. El agregado 

de glucosa al 3,6 %  (p/v) (200 mM, la misma osmolaridad que sacarosa al 7 %  (p/v)) causa 

un  efecto  similar  a  la  sacarosa  al  3,5  %   (p/v)  o  100 mM.  Este  no  es  un  efecto  claro  y 

P á g i n a  | 116  

 

reproducible, pero en algunos diseños experimentales esa cantidad de azúcar es capaz de 

inhibir parcialmente el aumento del cociente mRNA3/mRNA1 inducido por la oscuridad.  

Esto nos introdujo en el mundo de la señalización por azúcares con la hipótesis de que 

alguna vía de señalización mediada por azúcares podría estar involucrada en la respuesta 

de RSp31 a  la  luz.  Se  conocen, al menos parcialmente,  los  componentes de algunas de 

estas  vías  y  se  cuenta  con  mutantes  funcionales  o  nulos  de  diferentes  quinasas  que 

participan en ellas [Rolland et al., 2002; Moore, 2003; Rolland et al., 2006; Baena‐Gonzalez 

et al., 2007].  

De  las  mutantes  y  sobre‐expresantes  probadas  bajo  nuestro  protocolo  de 

luz/oscuridad  (fig.  R21‐22),  ninguna  mostró  un  comportamiento  significativamente 

distinto  al  de  las  plántulas  control.  En  conclusión,  el  efecto  de  la  luz  sobre  el  splicing 

alternativo de RSp31 no estaría mediado por  las vías de señalización por azúcares que 

involucran a la hexoquinasa HXK1 ni a la quinasa KIN10. 

Es  interesante  destacar  que  mutantes  del  gen  que  codifica  para  ABI4  poseen  

fenotipos de  insensibilidad en  la respuesta al azúcar  [Rolland et al., 2002; Rolland et al., 

2006]. Cuando analizábamos  lo que sucedía con GUN1 y GUN5, analizamos  la respuesta 

de las plantas mutantes abi4 (datos no mostrados). El resultado es que estos mutantes se 

comportan como las plantas salvajes en la respuesta de RSp31 a la luz.  

En resumen, no  fuimos capaces de  identificar/aislar el “sensor”  responsable de  los 

efectos de luz/oscuridad que estarían modulados por sacarosa. Esto no quiere decir que 

los azúcares no estén involucrados en la regulación de la transcripción y el procesamiento 

de RSp31. Sólo puedo concluir que  la respuesta de RSp31 a  la  luz es  independiente  (no 

necesita) de KIN10 y de HXK1. 

No  puedo  dejar  fuera  de  discusión  la  posibilidad  de  que  el  efecto  del  azúcar  sea 

indirecto.  Esta  posibilidad  explicaría  la  necesidad  de  una  elevada  cantidad  de  azúcar 

(sacarosa al 7 %  (p/v)) para observar un efecto. Por otra parte, se ha reportado que frente 

a daño mecánico se induce la expresión de transportadores de sacarosa en la zona dañada 

P á g i n a  | 117  

 

ya que esos  tejidos se comportan como un  lugar de destino o una bomba  (sink) para el 

transporte de azúcar  [Meyer et al., 2004]. Como discutimos previamente, el daño causa 

un efecto parecido al de la oscuridad sobre RSp31 (datos no mostrados) y el azúcar simula 

el efecto de la luz (fig. R20); lo que sería en cierta medida contradictorio para postular que 

el  azúcar  “señaliza”  la  luz.  Pero,  ¿qué  clase  de  efecto  indirecto  puede  explicar  la 

regulación que ejerce la sacarosa sobre RSp31?  

 

Estado redox de la cadena de transporte electrónico fotosintético: pool de 

plastoquinonas 

El mejor truco alguna vez realizado por el diablo fue convencer

al mundo de que él no existe

Kevin Spacey, Los Sospechosos de Siempre

Los  resultados  hasta  aquí  expuestos,  y  discutidos  con  cierto  detalle,  nos  fueron 

llevando por diferentes caminos que, muchas veces, confluían en una sospecha: el pool de 

PQ  sería  responsable  de  la  señalización  lumínica  que  provoca  los  cambios  en  el 

procesamiento  y  la  transcripción  de  RSp31.  Por  ejemplo,  se  ha  reportado  que  el 

tratamiento con H2O2 promueve  la oxidación del aceptor primario de electrones del pool 

de PQ (llamado QA) aumentando el flujo de electrones desde el fotosistema II [Laloi et al., 

2007],  lo  que  podría  explicar  el  carácter  indirecto  del  efecto  del  H2O2  sobre  RSp31 

propuesto más arriba. Por otra parte, también sabemos que los diferentes tipos de estrés 

biótico y abiótico disminuyen los niveles de NADP+, y que esto genera una sobre‐reducción 

de  los componentes de la cadena de transporte electrónico fotosintético [Tognetti et al., 

2006]. Quizás estos hechos explican por qué plántulas que lucen estresadas, no responden 

con  cambios  en  el  los  patrones  de  splicing  alternativo  de  RSp31  a  transiciones  de 

luz/oscuridad, mostrando un  cociente  similar al de  luz en  cualquier  condición. Además, 

existe también la posibilidad de que las señales de los azúcares y de la luz sean integradas 

a  nivel  del  pool  de  plastoquinonas.  Según  se  ha  planteado  en  trabajos  recientes  esto 

P á g i n a  | 118  

 

podría  ocurrir  para  los  casos  de  la  inducción  de  la  síntesis  de  antocianinas  y  para  el 

transporte de azúcares  [Jeong et al., 2010]. Por  lo  tanto,  los posibles efectos  indirectos 

que hemos discutido hasta aquí podrían, todos ellos, ser explicados de la misma forma.  

Con la intención de evaluar la hipótesis de que el pool de PQ esté involucrado en la vía 

de señalización utilizamos DCMU y DBMIB, drogas que inhiben el transporte de electrones 

antes  y después de  la PQ haciendo que el pool quede mayormente oxidado  (DCMU) o 

reducido  (DBMIB). La  figura R23 A muestra que el DBMIB no anula  los efectos de  la  luz 

sobre los transcriptos analizados. Dado que el mismo no tiene un efecto en oscuridad (no 

hay transporte electrónico sobre el cual actuar) se podría pensar que no está funcionando, 

sin embargo  la figura R23 B demuestra que sí afecta  la expresión de otros genes (PORc). 

Por otra parte, el hecho de que no aumente el efecto de la luz sobre el splicing alternativo 

de RSp31 puede deberse a que alcanzó un umbral, deberíamos probar  lo que sucede en 

respuesta a una curva de intensidad lumínica.  

Las  evidencias  hasta  aquí  presentadas,  indicarían  que  es  probable  que  el  pool  de 

plastoquinonas  sea el  responsable de  los efectos de  las  transiciones de  luz oscuridad 

sobre el  splicing alternativo de RSp31. Sin embargo, no podemos  “descartar de  cuajo” 

que  los  azúcares  y  las  especies  reactivas  de  oxígeno  participen  de  la  señalización  de 

manera independiente del pool de plastoquinonas.  

Haciendo alusión a la frase del comienzo de la sección, tenemos una señal retrógrada 

involucrada en  la  regulación del splicing alternativo de RSp31 y un sospechoso principal 

detrás: el pool de PQ. Los resultados  indican que el estado redox del pool de PQ modula 

los cambios en el splicing alternativo de RSp31 en respuesta a la luz. Inclusive, éste mismo 

podría integrar las señales relacionadas al estado energético o de reservas de la planta, y a 

la presencia/ausencia de estrés. Sin embargo, no podemos descartar que sea un conjunto 

de señales separadas (ROS, azúcares, y estado redox del pool de PQ) e integradas a nivel 

nuclear las que “manejen” la expresión de RSp31 y otros transcriptos con comportamiento 

similar.  

P á g i n a  | 119  

 

Globalidad del efecto de la luz sobre el splicing alternativo 

Mientras intentábamos identificar qué señales regulan la respuesta a la luz de RSp31, 

decidimos  evaluar  la  extensión  del  fenómeno  con  un  mayor  número  de  eventos  de 

splicing alternativo. Además  incluimos sacarosa como  tratamiento extra, para  identificar 

aquellos  eventos  que  podían  estar  respondiendo  a  una  caída  general  de  las  reservas 

producto del  tratamiento en oscuridad. El abordaje experimental  incluyó  considerar  las 

diferencias producidas sobre eventos de splicing diferentes analizados en el panel de RT‐

PCR [Simpson et al., 2008] por los tratamientos LUZ/SORBITOL – OSCURIDAD/SORBITOL – 

LUZ/SACAROSA – OSCURIDAD/SACAROSA.  

La  tabla  R1 muestra  que  41  eventos  de  splicing  alternativo  (de  un  total  de  100) 

evidencian cambios (mayores al 5 %  en valor absoluto y con un valor p < 0,1 en un test de 

student)  en  respuesta  al  protocolo  de  luz/oscuridad.  Cinco  de  ellos  cambian  sólo  en 

sorbitol y otros 3 sólo en sacarosa, esto nos deja 33 que están cambiando sin importar la 

presencia/ausencia de azúcares. Es decir que el 33%  de los eventos de splicing alternativo 

representados  en  el  panel  cambian  por  transiciones  de  luz/oscuridad,  de  manera 

independiente  a  la  abundancia  de  azúcares.  Esto  es  sumamente  importante  por  dos 

razones:  

1‐ El efecto de las transiciones de luz/oscuridad sobre el splicing alternativo no es 

pleiotrópico e  indiscriminado, sino que afecta a un número definido y limitado 

de eventos.  

2‐ Los  cambios  de  splicing  alternativo  observados  en  oscuridad  no  son 

consecuencia  del  hambreado  de  azúcares  porque  no  se  revierten  con  el 

agregado de los mismos en la mayoría de los casos. 

Aún más,  los  dos  controles  de  splicing  constitutivo  incluidos  en  el  panel  sufren  la 

eliminación de sus intrones con una eficiencia del 100 %  en cualquiera de las condiciones 

analizadas.  

P á g i n a  | 120  

 

La identificación de estos eventos y los estudios que vamos a realizar con ellos a partir 

de ahora, nos va a permitir saber si hay otros eventos con una regulación similar a la que 

sufre  (o disfruta no?) RSp31. También vamos a poder estudiar otras vías de señalización 

por  luz, ya sea por fitocromos o por vías retrógradas, y así evaluar  los efectos de  la  luz a 

nivel del splicing alternativo. Por ejemplo, uno de  los eventos representados en el panel 

corresponde al splicing alternativo que sufren los transcriptos del gen que codifica SRp30, 

otra  proteína  SR  (similar  a  RSp31).  A  través  de  un  sitio  de  splicing  3’  alternativo  se 

obtienen 2 isoformas capaces de codificar para proteínas de diferente tamaño y con un C‐

terminal distinto. La isoforma corta representa un poco más del 70 %  del total en luz y cae 

a un 40  %  en oscuridad. Quizás RSp31 y SRp30 regulen el splicing de varios transcriptos 

“río abajo” de ellas y así amplifiquen la señal lumínica. 

Otro  de  los  genes  afectados  revelado  por  el  panel  es  el  que  codifica  KIN11. 

Previamente, hablé de esta proteína por su rol en  la señalización de  los azúcares. La  luz 

afecta un sitio dador alternativo  (5’ss) en  la región no traducida 5’  (5’ UTR). La  isoforma 

más corta que presenta una abundancia cercana al 60%  en  luz, en plántulas crecidas en 

sorbitol, aumenta significativamente hasta un 80 %  en oscuridad; pero al agregar azúcar, 

la abundancia en luz es del 40 %  aproximadamente y parece aumentar en oscuridad a un 

50 %  pero el cambio no es significativo (figura R24 D). Este gen estaría siendo regulado de 

manera  similar  a RSp31 en  los  cambios que evidencia  a nivel de  splicing,  también  será 

interesante ver qué señales están involucradas en su regulación y si RSp31 es uno de sus 

moduladores. 

 

En perspectiva, queda mucho por hacer pero tenemos muchos caminos “verdes” para 

avanzar en nuestro conocimiento acerca de cómo es regulado el splicing alternativo en las 

plantas. 

 

   

P á g i n a  | 121  

 

Consideraciones finales 

Deseo regresar al punto de “la extensión del período de oscuridad”, y detenerme allí 

un momento. Me parece que vale la pena destacar algo evidente, es poco común que las 

plantas se enfrenten en la naturaleza a la clase de estímulos a los que las expuse (7 días de 

luz, 2 días de oscuridad); sin embargo, haber llevado las condiciones al extremo es lo que 

nos  permitió  identificar  los  posibles  modos  de  regulación  de  los  que  estuvimos 

discutiendo en esta sección y en  las previas. Seguramente podemos ahora encontrar un 

marco fisiológico en el que podrían operar tales mecanismos. El trabajo realizado en esta 

tesis demostró que el patrón de splicing de RSp31 es dependiente de  la  intensidad de  la 

luz que recibe la planta y los cambios en este parámetro, sí son comunes en la naturaleza.  

Hay un momento en el desarrollo de la plántula en que sí se enfrenta a una transición 

de oscuridad a luz similar a la de nuestro esquema experimental, luego de la germinación 

de la semilla a unos centímetros por debajo de la superficie del suelo, la plántula crece en 

un entorno de muy baja intensidad de luz estirándose para alcanzarla. Dependiendo de la 

profundidad  a  la  que  germinó  la  semilla  y  las  características  del  suelo  en  que  crece  la 

plántula, pueden pasar muchas horas hasta que reciba  la  luz del sol,  lo que  las expone a 

una situación parecida a la de nuestros experimentos. Realizamos la experiencia de crecer 

una planta en oscuridad luego de la germinación y la expusimos a la luz al cabo de algunos 

días. Como era de esperar observamos que el cociente mRNA3/mRNA1 en  las plántulas 

que no habían “visto la luz” es elevado y disminuye con el paso del tiempo en luz. 

   

 

 

Pró

(d

E

Quej

algun

una a

 

C

labor

comp

para 

sabía

Cerd

logo del de lo person

En  el  prólo

jándome un

nas veces  la

anécdota q

Cuando  co

ratorio de M

partía parte

mis comien

a  siquiera, 

án), no sab

Capítulo

nal y emocion

ogo  del  ca

n poco por 

a historia e

ue es la bas

omenzamos

Marcelo Yan

e important

nzos, ya que

cómo  cos

bía preparar

o II nal) 

pítulo  I  co

la  falta de 

es diferente

se de la exis

s  a  trabaja

novsky y de

te de mi tra

e yo venía d

sechar  sem

r macetas a

mencé  hab

ella, que e

e. Deseo em

stencia de e

ar  en  Ara

e Jorge Casa

bajo con lo

de un ambie

millas  de  Ar

apropiadas…

blando,  ent

es el escena

mpezar esta

este “Capítu

bidopsis  p

al, hacía tra

os becarios d

ente exclus

rabidopsis

… en fin, no

tre  otras  c

ario más co

a discusión 

ulo II”.  

asaba  muc

atamientos 

del lugar. F

sivo de célu

(cosa  que 

o sabía un 

Primera

de spliclos ge

observa

de la m

splicing

P á g i

osas,  de  la

omún. Sin e

con una a

cho  tiemp

de mis plan

ue muy est

las de mam

me  enseñ

montón de

as evidencias

icing alternati

eles origin

mos por prim

mutación sob

g alternativo d

n a  | 122 

a  suerte. 

embargo, 

nécdota, 

o  en  el 

ntas allí y 

imulante 

mífero, no 

ñó  Pablo 

 cosas. Y 

de una muta

ivo. Escaneos

ales en

mera vez el efe

bre prmt5 en

de RCA.

ante

s de

que

ecto

n el

P á g i n a  | 123  

 

en ese lugar podía aprender directamente de la gente que lo hacía todos los días. Siempre 

me trataron muy bien (cosa que les agradezco profundamente), a tal punto, que muchas 

veces  me  “regalaban”  sus  plantas  para  que  hiciera  algunos  experimentos.  Dado  que 

estábamos dando nuestros primeros pasos con el splicing alternativo de RCA, y sabíamos 

ya,  que  respondía  a  luz,  decidimos  hacer  una  especie  de  búsqueda  de mutantes  de  la 

regulación  de  ese  proceso  a  pequeña  escala.  La  mayoría  de  las  mutantes  con  que 

trabajaban  los  chicos  tenían  algún  fenotipo  de  respuesta  a  luz,  y  por  eso  habían  sido 

aisladas en primer momento. La figura de la página anterior muestra el resultado crudo de 

una corrida de los productos de RT‐PCR de RCA en geles de poliacrilamida. Las dos bandas 

de  abajo  son  las  que  corresponden  a  los  productos  específicos  de  cada  isoforma,  y  el 

número escrito a mano debajo de cada calle, es el cociente L/C correspondiente. Como 

pueden observar (sobre todo por la presencia de un círculo rojo a su alrededor), una de las 

mutantes  tiene una relación de  isoformas L/C muy diferente a  la del resto de  las calles. 

Tuvimos además la fortuna de que 179 (el nombre original de prmt5‐5) esté representada 

en  dos  situaciones  de  iluminación  distinta  en  las  dos  calles  del  gel,  lo  que  daba  cierta 

fortaleza al resultado. 

En ese entonces no se sabía de qué era mutante 179, faltaba más de un año para que 

lo  supiéramos. Mientras  tanto  pude  determinar  que  el  efecto  de  las  transiciones  de 

luz/oscuridad estaba presente en esta mutante y que por  lo tanto, no tenía que ver con 

esa  vía  de  señalización  en  particular,  abriendo  (literalmente)  un  nuevo  capítulo  en 

nuestros estudios del splicing en plantas. 

   

P á g i n a  | 124  

 

Capítulo II  

Regulación del splicing alternativo por la metil‐transferasa PRMT5 

 

 

Introducción 

Desde el comienzo de la vida los ciclos ambientales más importantes del día, el mes y 

el año se han enfrentado a la selección natural, con ventanas de oportunidad y riesgo que 

se repiten con precisión a frecuencia predecible, y el “Demonio de Darwin” ha explotado 

esa previsibilidad mediante  la elaboración de programas  temporales  innatos que ponen 

en  fase  muchas  de  las  tareas  en  la  vida  de  una  célula  u  organismo  (metabólicas  o 

comportamentales)  con el momento oportuno del día  [Pittendrigh, 1993].  Las  ideas de 

Pittendrigh que se exponen en el párrafo anterior ponen de manifiesto los avances que se 

dieron en el estudio de los ritmos biológicos a lo largo de los años. Es evidente que lo más 

adecuado  para  comenzar  esta  sección  es  hacerlo  de  manera  cronológica  así  que, 

comencemos con un poco de historia. 

 

 

Figura I14

1. L

L

sin e

tema

por A

plant

que 

E

realiz

4: copia del inf

Los ritmo

La idea de q

embargo, lo

a son de los

Alejandro M

tas (siglo IV

durante  su

El  experime

zado en el c

forme de de M

os biológ

que existen 

s primeros 

s griegos. An

Magno, hizo

V aC). Si bie

u  viaje  él  o

ento  llevad

campo de lo

Mairan en 172

gicos 

ritmos en 

escritos de

ndróstenes 

o  las primer

en sus repor

observó  ató

o  a  cabo  p

os ritmos b

29.

la naturalez

e los que te

de Tasos, m

ras observa

rtes se perd

ónito  los  rit

(ta

ár

20

Ja

de

os

no

ho

ho

no

co

ho

ce

pe

en

es

co

ho

pu

por  de Ma

iológicos y 

za es quizás

nemos con

miembro de

aciones siste

dieron, los f

tmos  de  la

amarindo), 

boles  dorm

010].  Más 

acques  d’O

e  sensitiva

scuro  cerra

ombre  por 

ojas  al  ser

ojas  al  inic

oche.  de M

ondiciones 

ojas de  la  s

errando  co

ermite  “ve

ntonces, qu

s  un  p

omportamie

ojas    a  lo 

udica [de M

airan  es  el 

revela un c

s tan antigu

ocimiento y

e una exped

emáticas de

fragmentos

s  hojas  de 

los que le s

mían  de  no

de  2000  a

rtous  de M

(Mimosa  p

ado.  Estas 

el  hecho 

r  tocadas;

io  del  día  y

Mairan  obs

constantes

sensitiva  se

omo  lo  hac

er”  el  sol  (

ue el sol (o u

punto  nec

ento  de  ap

largo  del 

Mairan, 1729

primero  co

concepto bá

P á g i

ua como el 

y que menc

dición encom

e ritmos di

s hallados d

Tamarindu

sugirieron q

oche  [Jolm

años  despu

Mairan  dejó

pudica)  en 

plantas  re

de  que  cie

además,  a

y  las  cierra

ervó  que  a

s  de  oscur

e  siguen ab

cen  cuando

(fig.  I14).  C

un viento fu

cesario  p

pertura  y  c

día  en  la 

9].  

onocido  qu

ásico de los 

n a  | 125 

hombre; 

cionan el 

mendada 

urnos en 

describen 

us  indica 

que estos 

a  et  al., 

ués,  Jean 

ó  plantas 

un  lugar 

ciben  su 

erran  sus 

bren  las 

an  por  la 

aún  bajo 

idad,  las 

briendo  y 

o  se  les 

Concluyó 

uerte) no 

para  el 

cierre  de 

Mimosa 

ue  se  ha 

mismos, 

P á g i n a  | 126  

 

su  persistencia  en  ausencia  de  una  referencia  externa.  Sin  embargo,  sólo  descarta  la 

necesidad de  luz  solar para explicar el movimiento de  las hojas de  la mimosa pero hay 

muchas otras variables que podrían estar causando los ciclos. Por esa época todos creían 

que alguna variable externa dirigía los ritmos por lo que mucha de la investigación sobre 

ritmos del comienzo del siglo XX fue una cacería de un “factor X” que modulara los ciclos 

diarios [Albrecht, 2009]. Wilhelm Pfeffer trataba de demostrar que los movimientos en las 

hojas de la planta de porotos (Phaseolus vitellinus) dependían de claves externas y llegó a 

la conclusión opuesta, yendo en contra de  su propia opinión. Una de  las observaciones 

cruciales fue que el ritmo no se pierde si sólo se tapan los órganos sensibles a la luz en la 

base de la hoja y se permite que continúe la fotosíntesis. Posteriormente, Erwin Bunning 

eliminó  completamente  la  necesidad  de  un  factor  externo.  Bunning  demostró  que  la 

periodicidad era heredable y desarrolló el concepto de fotoperíodo y el de reloj biológico 

[Albrecht, 2009].  

Durante esos años también se acumuló evidencia y se describieron hallazgos  similares 

a los descriptos para plantas, llevados a cabo en modelos animales, que confluyeron en un 

simposio internacional en 1960 celebrado en Cold Spring Harbor donde, donde se dice que 

nació  la Cronobiología.  

Además del anecdotario, considero útil que resumamos algunos conceptos que serán 

importantes más adelante.  

I. Los ritmos circadianos y el reloj biológico 

Por definición, un  ritmo circadiano  (del latín circa, que significa "alrededor" y dies, que

significa "día") es  aquel  que  persiste  con  un  período  aproximadamente  24  horas  en 

condiciones  constantes  (“corrida  libre”  o  free‐running),  en  ausencia  de  referencias 

temporales externas. Un atributo importante de estos ritmos es que, señales del entorno 

(luz‐oscuridad o ciclos de temperatura) pueden “resetear”* o “entrenar” la fase del ritmo 

para que coincida con el ciclo ambiental [Barak et al., 2000].  

* Tomado y adaptado del inglés, debe ser entendido como llevar un sistema a sus condiciones iniciales.

 

 

Figu

se p

L

perío

pued

insec

activ

flora

en  3

comú

de  sa

2005

ura I15: esque

puede dividir a

Los relojes c

odos  (distan

den ser enco

ctos,  hongo

vidades, des

ción en las 

3  partes  p

únmente lla

alida  que  r

5]. La figura 

ema de las 3 p

a un reloj bio

circadianos 

ncia  entre 

ontrados en

os,  mamífe

sde los ciclo

plantas [Gr

principales: 

amada “osc

regulan  las 

I15 esquem

partes funcion

lógico.

son comple

picos  de  e

n una gran v

eros  y  plan

os de sueño

reen y Tobin

la  maqui

cilador”; las

funciones 

matiza estas

nales en que

ejos sistema

expresión/a

variedad de

ntas.  Los  m

o/vigilia en 

n, 2002]. Se

naria  mole

s vías de en

periódicas 

s ideas.  

as que gene

ctividad)  ce

e organismo

mismos  con

animales a

e puede des

ecular  que

trada que l

dentro  de 

A niv

codificad

se  expre

en ausen

genes de

controla

mismos 

retro‐alim

De esta 

capaz  de

mismo, 

24 horas

a  los  ge

“salida”)

del  osc

2005].  

 

eran los ritm

ercanos  a 

os que inclu

ntrolan  una

 los movim

smembrar e

  permite 

o ajustan a

la  célula  [

vel molecula

do por  los g

esan  con  u

ncia de estí

el oscilador 

ndo  la  e

y de otros,

mentación 

manera, el 

e  generar 

ritmos  de 

s, entregand

nes  regulad

) que se enc

cilador  [Sc

P á g i

mos endóge

las  24  hora

uyen cianob

a  gran  vari

ientos de h

esta clase d

funcionar 

al entorno; y

[Schoning  y

ar un oscila

genes del  r

n  cierto  rit

mulos exte

central int

xpresión  d

 mediante 

positiva y n

oscilador c

y  sostener

aproximad

do esta info

dos por  el 

cuentran “rí

honing  y 

n a  | 127 

enos con 

as  y  que 

bacterias, 

edad  de 

hojas y la 

de relojes 

al  reloj, 

y las vías 

y  Staiger, 

ador está 

reloj que 

tmo,  aún 

rnos. Los 

eractúan 

de  ellos 

ciclos de 

negativa. 

entral es 

r,  por  sí 

damente 

ormación 

reloj  (de 

ío abajo” 

Staiger, 

 

 

Figura

expresi

factores

sus int

[Hardin

M

difer

2002

II. D

E

abun

oscila

se  a

retro

E

mod

I16: esquem

ión del gen pes desconocido

termediarios

n et al., 1990]

Mientras  qu

rentes  orga

2].  

Diferentes

El clonado d

ndancia  del

aciones a n

cumula,  el 

oalimentació

El  paradigm

ulan transc

ma de la os

per de Drosopos como la fu

bioquímicos

). 

ue  la  arquit

anismos,  las

s organism

del gen per 

 mensajero

ivel de prot

mensajero

ón negativa

ma  de  los 

cripción y tr

scilación en

phila. X e Y so

unción de PER

(adaptado

tectura  bás

s moléculas

mos, ¿dife

(period) de

o  presenta 

teína (con u

o  de  per  d

a muy  senc

diferentes 

raducción, s

la

on

R y

de

sica  de  los 

s  involucra

erentes rel

e Drosophila

oscilacione

una diferenc

disminuye  e

cillo: el gen

tradu

del  g

reinic

I16  e

sobre

ido ha

PER  s

TIM  (

los  p

heter

transc

Adem

facto

transc

 

 

circuitos 

subyace a lo

osciladore

das  no  son

lojes? 

a, y su post

es  circadian

cia de 4 hs)

en  abundan

 del  reloj s

ce,  y  la  pr

gen.  Al  cae

cia el ciclo 

esquematiza

evivido al p

aciendo má

se une a un

(TIMELESS),

promotores

rodímero co

cripción  dC

más, dCLK/C

res  positi

cripción de 

de  retroal

os mecanism

s  parece  e

n  las mism

terior anális

nas,  que  so

. A medida

ncia.  Esto 

se  transcrib

roteína  inhi

er  los  nive

[Hardin et 

a  este  simp

aso del  tie

ás y más co

na  segunda

,  para  inhib

s  de  per

onformado 

CLK  (CLOC

CYC activan

ivos  y 

clk [Hardin

imentación

mos molecu

P á g i

star  conser

as  [Green 

sis demostr

on  seguidas

que la prot

sugirió  un 

e, su  trans

ibe  la  tran

les  de  pro

al., 1990]. 

ple modelo

mpo, aunq

omplejo. La 

a proteína d

bir  la  activ

y  de  tim 

por  los  fac

K)  y  CYC 

la  transcri

negativos 

, 2005].  

n  entrelaza

ulares de lo

n a  | 128 

rvada  en 

y  Tobin, 

ró que  la 

s  por  las 

teína PER 

ciclo  de 

cripto se 

scripción 

oteína  se 

La  figura 

o  que  ha 

ue  se ha 

proteína 

del  reloj, 

ación  de 

por  el 

ctores de 

(CYCLE). 

pción de 

de  la 

dos  que 

os relojes 

P á g i n a  | 129  

 

circadianos  en  todos  los  eucariotas  estudiados  a  la  fecha,  aunque  los  componentes 

reclutados varían entre los diferentes organismos [McClung, 2006].  

III. El reloj biológico de Arabidopsis 

La  secuenciación  del  genoma  de  Arabidopsis  en  el  año  2000  no  identificó  ningún 

ortólogo de la planta para genes del reloj conocidos en otros sistemas. Esto implicaba que 

la composición de su reloj era novedosa.  

Fue  necesario  el  desarrollo  de  una  nueva  herramienta  para  abrir  una  ventana  al 

mecanismo del reloj de este organismo modelo y revelar sus componentes. Se generó una 

construcción  reportera  que  al  integrarse  al  genoma  de  la  planta  puede  emitir 

bioluminiscencia por la expresión de luciferasa. Si el promotor “río arriba” de la secuencia 

codificante de  luciferasa  es  el  de  un  gen  cuya  expresión  está  regulada  por  el  reloj  (ej: 

LHCB),  cualquier mutación  introducida  en  el  genoma de  la planta que  afecte el patrón 

circadiano de bioluminiscencia emitida estará ocurriendo en algún gen relacionado con el 

oscilador  [Millar  et  al.,  1992]. De  esta manera  se  identificaron  diferentes mutantes  de 

período más corto y de período más  largo (léase, con un ciclo de expresión de  luciferasa 

menor o mayor a las 24 hs respectivamente). Una de las mutantes con período corto es la 

de pérdida de función del gen toc1 (timing of cab expression) [Millar et al., 1995; McClung, 

2006].  Esta  clase  de  aproximaciones  permitió  construir  un  esquema  del  reloj  de 

Arabidopsis (fig. I17).  

 

 

Figu

inte

inte

E

confo

HYPO

RESP

perte

Amb

activ

del 

meca

inter

los P

ura I17: esqu

eracciones en

erconectados,

El  primer 

ormado  po

OCOTYL)  y 

PONSE  REG

enecen a la

os reprime

vación trans

oscilador, 

anismo  del

rconectados

RR (con cie

uema simplific

ntre los comp

compuesto p

circuito  de

or  CCA1  (CI

TOC1/PRR1

ULATOR  1)

 familia de 

n  la expres

scripcional d

el  núcleo 

l  reloj  de 

s. Otro de e

erta similitud

cado del reloj

ponentes del c

or los PRR. 

e  autoregu

RCADIAN  A

1  (TIMING 

.  CCA1  y  L

los factore

sión de TOC

de CCA1 y 

del  marca

Arabidopsi

estos circuit

d a TOC1), c

j de Arabidopcircuito centr

ulación  des

AND  CLOCK

OF  CHLORO

LHY  son  pa

s de transc

C1 y, a su v

LHY [Alabad

pasos  circa

is  está  com

tos involucr

conocidos c

psis thaliana.

ral; en verde

scripto  par

K  ASSOCIAT

OPHYLL  A/B

rcialmente 

ripción del 

ez,  la prote

di et al., 20

adiano  de 

mpuesto  co

a a CCA1, L

como PRR5,

Las flechas e

, se muestra

ra  Arabido

TED  1),  LHY 

/B  BINDING 

redundant

tipo Myb [Y

eína TOC1 e

001]. Este e

Arabidopsi

omo  mínim

HY y 3 facto

, PRR7 y PR

P á g i

en negro desta

otro de los c

opsis  thalia

(LATE  ELO

G  PROTEIN/P

tes  en  su  f

Yanhui et a

es requerid

es el circuito

is.  Se  cree

mo  por  3 

ores de la fa

RR9 (fig. I17

n a  | 130 

acan las

circuitos

ana  está 

ONGATED 

/PSEUDO‐

unción  y 

l., 2006]. 

a para  la 

o central 

e  que  el 

circuitos 

amilia de 

). CCA1 y 

P á g i n a  | 131  

 

LHY activan la expresión de PRR5, PRR7 y PRR9 cuyos productos proteicos inhiben a su vez 

la expresión de CCA1 y LHY [Farré et al., 2005; McClung, 2006]. 

 

 

 

 

Los componentes de los osciladores en las especies modelo, Drosophila melanogaster 

y Arabidopsis  thaliana, no muestran conservación a nivel de  secuencia. Sin embargo, el 

principio fundamental para generar oscilaciones auto‐sustentables de proteínas del reloj, 

que  a  su  vez  transmiten  los  ritmos  circadianos  a  los  procesos  “río  abajo”  dentro de  la 

célula, se repite de manera remarcable [Schoning y Staiger, 2005]. 

 

 

 

 

 

 

 

P á g i n a  | 132  

 

2. Metilación de proteínas 

Una  gran  variedad  de  modificaciones  químicas  puede  ocurrir  en  una  proteína  de 

manera dependiente del desarrollo y del ambiente. Estas modificaciones determinan  la 

estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas modificadas y regulan su actividad [Seo 

y Lee, 2004]. La metilación de proteínas es una de las modificaciones post‐traduccionales 

más abundante. Cerca del 2  %  de  todos  los  residuos de arginina, están di‐metilados en 

extractos  de proteína  nuclear de  hígado de  rata  [Boffa  et  al.,  1977]. Aunque,  desde  la 

década  de  1960  tenemos  noción  de  la  existencia  de  estas  modificaciones,  el 

descubrimiento de su función en la célula y de las enzimas involucradas ocurrió recién en 

los últimos años [Lee y Stallcup, 2009].  

Las metil‐transferasas de proteínas  son  las enzimas encargadas de  transferir grupos 

metilo  (CH3‐)  desde  el  dador  de metilos  (S‐adenosilmetionina)  a  aceptores  específicos 

como: arginina, lisina, histidina y grupos carboxilo [Lee y Stallcup, 2009]. Debido a que la 

idea de esta introducción es brindar herramientas para poner en marco los experimentos 

y los resultados que trataré en las secciones próximas, no deseo hacer una revisión acerca 

de  la metilación de diferentes sustratos, y  la  función de esa modificación en el contexto 

celular. Espero permitan y disculpen el sesgo de llevarlos por el camino de la metilación de 

argininas.  

 

I. Metilación de argininas y sus protagonistas 

El  residuo arginina de una proteína puede  ser mono‐ o di‐ metilado, es decir,  se  le 

pueden  agregar 1 o 2  grupos metilo. De  agregarse 2 CH3‐, esa di‐metilación puede  ser 

asimétrica (los 2 metilos en el mismo átomo de N al final de la cadena lateral de arginina) 

o simétrica (1 grupo metilo en cada uno de los 2 átomos terminales de N) [Lee y Stallcup, 

2009]. Las enzimas que catalizan esas reacciones se conocen como metil‐transferasas de 

arginina de proteínas  (PRMTs)  y pueden  ser encontradas en diversos organismos  como 

 

 

levad

PRM

princ

de m

(PRM

de  la

simé

 L

regu

en ra

expre

PRM

al na

duras, insec

Ts distintas

cipales, las 

mono‐metil 

MT1, PRMT3

a arginina (a

étrica (sDMA

Las PRMTs 

la su expre

atones dem

esan PRMT

T4 (CARM1

cer [Bedfor

ctos, planta

s  [Yang et a

de “tipo I” 

arginina (M

3, PRMT4 y

aDMA), y  la

A) [Bedford 

son  enzim

esión y esta

muestran  la 

T1 mueren 

1: COACTIVA

rd y Richard

s, gusanos,

al., 2009]. S

 y las de “t

MMA) como

y PRMT6 en

as de tipo  I

y Richard, 

as  expresa

bilidad [Sco

relevancia 

poco despu

ATOR‐ASSO

d, 2005; Bed

 peces y m

Según su  fu

tipo II” (fig. 

o  intermedi

n mamífero

I (PRMT5 y

2005]. 

das ubicua

orilas et al.,

funcional d

ués de  la  im

OCIATED ARG

dford, 2007

amíferos. E

unción, se  l

I18). Amba

ario. Poster

os) produce

y PRMT7 en

mente  y  se

, 2000]. Exp

de algunas 

mplantación

GININE  ME

]. 

Figura

modific

las dife

de arg

activida

las dife

del sust

las acti

tipo I y

[Bedfor

En estos últ

as puede d

as clases cat

riormente, 

n una di‐m

n mamíferos

e  conoce p

perimentos

PRMTs. Los

n, y aquello

ETHYLTRAN

P á g i

I18: esque

caciones cata

erentes metil

ginina de pr

ad conocida.

erencias entre

trato al ser m

ividades de la

y de tipo II

rd y Richard, 2

imos se con

dividir en do

talizan la fo

las PRMTs 

etilación as

s) una di‐m

oco  sobre 

s de ablació

s embrione

os que no e

NSFERASE 1)

n a  | 133 

ema de las

alizadas por

l-transferasas

roteínas con

Se muestran

e los caminos

odificado por

as PRMTs de

(adaptado de

2005]).  

nocen 11 

os clases 

ormación 

de tipo  I 

simétrica 

metilación 

cómo  se 

ón génica 

s que no 

expresan 

) mueren 

s

r

s

n

n

s

r

e

e

 

 

Figura I1

distintas P

Richard, 2

CARM

proce

PRM

poste

trans

1.III)

(aDM

catal

A

2007

acerc

9: algunos s

PRMTs (extraíd

2005]). 

M1/PRMT4 

esamiento 

Ts  involucr

erior  metil

scripcionale

. Es  interes

MA) ha sido 

lizada por P

A  pesar  de 

7 (cuando la

ca de los ro

sustratos de

do de [Bedfor

y  PRMT5 

del ARN. N

e el recluta

lación  de 

es [Bedford 

sante agreg

ligada a la 

PRMT5 (sDM

toda  la  inf

a realización

les de las P

las

rd y

E

PRMT

activ

muy  c

A  pes

transf

las di

estab

de arg

señale

repar

mamí

Es  int

sido i

ARN, 

tradu

Se

son  capace

No es casua

amiento de 

histonas,  d

y Richard, 

ar que  la m

activación t

MA) ha sido 

formación 

n de la pres

RMTs en las

l  tamaño m

T  posee  u

idad metil‐

conservada

sar  de  esta

ferasa, exist

ferentes PR

lecido  dive

gininas en

es,  splicin

ación  del 

íferos [Wyso

teresante d

mplicada e

incluyend

cción y deg

e  puede  o

es  de meti

l entonces,

las mismas

de  co‐activ

2005; Yang

metilación d

transcripcio

asociada a 

acumulada 

sente tesis e

s plantas [W

molecular d

un  dominio

transferasa

a  de  aproxi

a  alta  conse

te poca sup

RMTs  (fig.  I

rsos  roles 

distintos pr

ng  del  A

ADN  y  tr

ocka et al., 

estacar que

n todos los

do,  transcr

radación [B

observar  en

ilar  histona

que  la reg

s a  los prom

vadores  y/o

 et al., 2009

de histonas

onal de los g

represión [

en  diferen

estaba por 

Wang et al., 

de  las PRMT

o  N‐termin

a  reside  en 

madamente

ervación  en

perposición

I19)  [Lee  et

fisiológicos

rocesos com

RN,  contr

anslocación

2006; Bedf

e  la metilac

 aspectos d

ripción,  sp

Bedford y Cl

n  la  figura

as  y  proteín

ulación de 

motores cor

o  de  facto

9] (véase, In

causada po

genes; en ca

[Wysocka et

ntes  organi

la mitad) se

2007].  

P á g i

Ts es variab

nal  único 

una  región

e  310  amin

n  el  domin

n de sustrat

t  al., 2005]

s  para  la m

mo  transdu

rol  transcr

n  de  prote

ford y Clark

ción de argi

del metabol

plicing,  tra

arke, 2009]

a  I19  que 

nas  relacio

la transcrip

rrespondien

ores  de  elo

ntroducción

or CARM1 y

ambio, la m

t al., 2006].

smos,  hast

e conocía m

n a  | 134 

ble,  cada 

pero  su 

n  central 

noácidos. 

io metil‐

tos entre 

].  Se han 

metilación 

ucción de 

ripcional, 

eínas  en 

e, 2009]. 

ininas ha 

lismo del 

ansporte, 

].  

PRMT1, 

nadas  al 

pción por 

ntes, y  la 

ongación 

n General 

y PRMT1 

metilación 

 

a  el  año 

muy poco 

P á g i n a  | 135  

 

II. Las PRMTs en las plantas y el rol de PRMT5 

Una búsqueda rápida en la base de datos genómica tair de Arabidopsis thaliana revela 

que existen al menos 9  loci que codifican para distintas PRMTs. Las PRMTs de  tipo  II  ‐o 

simétricas‐ están representadas en Arabidopsis por PRMT5 (o AtPRMT5), y las asimétricas 

o  tipo  I,  están    representadas  por  varias  proteínas  entre  las que  se  destacan  PRMT1a, 

PRMT1b, PRMT4a, PRMT4b, PRMT10. Todas ellas están  involucradas en el control de  la 

floración en Arabidopsis [Niu et al., 2007; Pei et al., 2007; Scebba et al., 2007; Wang et al., 

2007; Niu et al., 2008].  

PRMT5 fue clonado inicialmente en mamíferos como “Janus kinase binding protein 1” 

y al mismo tiempo se demostró que podía metilar las histonas H2A, H3 y H4 [Branscombe 

et al., 2001]. Se  localiza tanto en el citoplasma como en el núcleo. En el citoplasma se  la 

encuentra formando parte de un complejo llamado “metilosoma”, donde está involucrada 

en la metilación de las proteínas Sm (componentes del spliceosoma) [Friesen et al., 2001]. 

Esta función dual le confiere la capacidad de controlar diferentes etapas del metabolismo 

del ARN.  

Durante la fase citoplasmática de la biogénesis de las “pequeñas ribo‐nucleopartículas 

nucleares”  (snRNP),  el  complejo  SMN  (Survival Motor  Neuron)  carga  las  proteínas  Sm 

sobre  los  sitios  Sm  de  los  pequeños ARN  nucleares  (snRNAs).  La  afinidad  del  complejo 

SMN  es mayor  por  las  Sm metiladas  (sDMA) que  por  las  Sm  no metiladas  o metiladas 

asimétricamente  [Brahms  et  al.,  2001; Meister  et  al.,  2001].  La disrupción  genética del 

ortólogo  de  PRMT5  en moscas  (Dart5),  genera  la  pérdida  completa  de  los  residuos  de 

sDMA en las proteínas Sm [Gonsalvez et al., 2006] lo que, al parecer, no interfiere con el 

ensamblado  de  los  complejos  de  snRNP  [Gonsalvez  et  al.,  2008].  En  células  humanas, 

PRMT5 y PRMT7 funcionan de manera no‐redundante en la metilación de proteínas Sm y 

ha  sido  demostrado  que  su  actividad  es  requerida  para  la  biogénesis  de  las  snRNP  

[Gonsalvez et al., 2007].  

Estas  líneas de evidencia que parecen contradecirse en  los diferentes sistemas, poco 

revelan de lo que está sucediendo a nivel de splicing y de otros eventos del procesamiento 

P á g i n a  | 136  

 

de  los  mensajeros.  Como  no  deseo  continuar  relatando  hallazgos  en  diferentes 

organismos para no alejarnos del panorama y el marco en que se realizó el trabajo, elijo 

entonces  (conciente del nuevo  sesgo que  le  impongo  al  lector), dejar de  lado  aquellos 

trabajos  que  no  sientan  un  claro  precedente  para  los  experimentos  y  resultados  que 

describiré a continuación.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

P á g i n a  | 137  

 

Objetivo general (Capítulo II) 

Identificar el mecanismo por el cual PRMT5, una metil‐transferasa de proteínas, 

regula el splicing alternativo de diferentes eventos. 

Objetivos particulares (Capítulo II) 

Evaluar el alcance de PRMT5 como  regulador de splicing alternativo, cuántos 

eventos afecta. 

Evaluar qué clase de eventos son modulados por PRMT5. 

Evaluar una posible interacción entre el reloj circadiano y el proceso de splicing 

alternativo. Identificar el rol de PRMT5 en cada proceso. 

Determinar qué  sustratos de  la  actividad de PRMT5  son  responsables de  los 

cambios a nivel de procesamiento. 

Evaluar un posible rol conservado en organismos animales.  

P á g i n a  | 138  

 

Metodología (Capítulo II) 

Material vegetal y condiciones de crecimiento  

Las  líneas de Arabidopsis usadas en este capítulo son del ecotipo Columbia. A menos 

que se indique lo contrario, las semillas se sembraron en cajas plásticas transparentes (40 

x 33 mm, 15 mm altura) conteniendo 4 ml de agar‐agua al 0,8%  (p/v), y se incubaron por 

3‐4 días a 4 ºC.  

Las plantas se crecieron en macetas plásticas de 110 cm3 conteniendo una mezcla de 

perlita, vermiculita y turba (1:1:0,5), y el riego se realizó con solución nutritiva (Hakaphos 

Rojo,  Compo)  durante  el  período  de  crecimiento.  La  temperatura  en  las  cámaras  fue 

mantenida  en  22‐24  ºC.  Las  condiciones  lumínicas  en  término  de  fotoperíodo  e 

irradiancia, varía para cada experimento, por lo cual se detallará según corresponda. 

Las  mutantes  empleadas  fueron:  phyA,  phyB  (SALK_069700),  cry1  (SALK_069292), 

cry2, atprmt5‐1 (SALK_065814), atprmt5‐2 (SALK_095085), flc (SALK_092716), prr7 , prr9‐

1, atprmt10, atprmt11.  

Fuentes de luz y tratamientos lumínicos 

La luz blanca fue provista por tubos fluorescentes Philips. El azul continuo fue provisto 

por  tubos  fluorescentes  de  luz  blanca  filtrada  por  un  filtro  acrílico  azul  de  2 mm  de 

espesor  (Paolini  2031,  La  Casa  del  Acetato,  Buenos  Aires,  Argentina).  El  rojo  lejano 

continuo  fue  provisto  por  cuatro  lámparas  incandescentes  de  150 W  (Philips  R95),  en 

combinación  con  un  filtro  de  agua  (aislante  térmico),  un  acetato  rojo  y  seis  filtros  de 

acrílico azul (Paolini 2031). El rojo continuo fue provisto por diodos que emiten  luz en el 

rango de 635‐650 nm. Para lograr las distintas intensidades de azul, rojo lejano y rojo, se 

utilizaron hojas de papel blanco y liso sobre las cajas plásticas. 

 

P á g i n a  | 139  

 

Análisis de la expresión génica 

Medición por PCR en Tiempo Real (qPCR) 

Los experimentos de qPCR fueron realizados sobre plántulas de aproximadamente 20 

días, crecidas en macetas y según el tratamiento lumínico que se indica en cada caso. Los 

pasos a seguir para la purificación del ARN, síntesis del ADNc y para llevar a cabo la qPCR 

están  explicados  en  Metodología  del  Capítulo  I.  Los  genes  Act8  y  PP2A  (Protein 

Phosphatase 2A Subunit A) fueron empleados para relativizar la expresión. 

Análisis global I: microarreglos de expresión en A. thaliana 

Se utilizaron plantas crecidas como se  indica anteriormente, pero en condiciones de 

luz y temperatura constante, sin la posibilidad de que el reloj circadiano se sincronice. Una 

vez que la roseta alcanzó las 8‐9 hojas, antes de que florezcan, se cosechó la parte aérea. 

Cada  réplica  estuvo  compuesta  por  3‐4  plantas  crecidas  en  macetas  distintas,  y  se 

obtuvieron  3  réplicas.  Para  obtener  el ARN  se  procedió  de  la misma manera  que  para 

realizar  qPCR.  5  µg  de  ARN  correspondiente  a  cada  muestra  de  genotipo  salvaje  o 

mutante,  fue procesado e hibridado  contra  los microarreglos de  expresión  (Affymetrix: 

GeneChip  Arabidopsis  ATH1  Genome  Arrays),  según  las  instrucciones  provistas  por  el 

fabricante. 

Fue  posible  comparar  la  señal  de  los  microarreglos,  después  de  normalizarla  al 

promedio de la intensidad de la señal general de todas las sondas. Los datos se analizaron 

utilizando el algoritmo MAS5. Fueron sujeto de análisis, aquellos genes cuya señal resultó 

detectable en las 3 réplicas de al menos uno de los genotipos. La significancia estadística 

atribuible a la diferencia de señales, fue calculada empleando el software SAM [Tusher et 

al., 2001]. Se realizaron dos clases de t‐test no pareados sobre los valores de las señales, y 

para estimar la tasa de falsos descubrimientos, se utilizaron 100 permutaciones.  

La distribución de fases de genes asociados al reloj fue evaluada utilizando el software 

Phaser, disponible en la web (http://phaser.cgrb.oregonstate.edu)[Michael et al., 2008]. 

P á g i n a  | 140  

 

La categorización funcional de genes se realizó mediante la herramienta disponible en 

la  página  de  internet  de  la  universidad  de  Toronto,  “The  Bio‐Array  Resource  for 

Arabidopsis Functional Genomics”. Esta provee el valor absoluto de genes pertenecientes 

a cada categoría funcional, así como también la relación existente entre ese valor y el total 

de genes pertenecientes a esa categoría, presentes en el genoma.  

Análisis global II: panel de RT‐PCR de Arabidopsis 

Se utilizaron plántulas crecidas como se indica anteriormente, pero en condiciones de 

luz y temperatura constante, sin  la posibilidad de que el reloj circadiano se sincronice. A 

partir de 100 mg de material se aisló el ARN que fue utilizado en sucesivas reacciones de 

RT‐PCR según lo indica [Simpson et al., 2008]. 

Análisis global III: tiling‐arrays 

Para  realizar  los  tiling‐arrays  5  µg  de  ARN  correspondientes  a  cada  muestra  de 

genotipo  salvaje  o  mutante,  fueron  procesados  e  hibridados  contra  los  tiling‐arrays 

(Affymetrix: GeneChip® Arabidopsis Tiling 1.0R Array y Affymetrix: GeneChip® Drosophila 

Tiling 1.0R Array), según las instrucciones provistas por el fabricante. 

El  análisis  de  los  datos  obtenidos  para  ambos  organismos,  fue  realizado  por  el Dr. 

Justin Borevitz  y  la Dra.  Xu  Zhang. Detallo  a  continuación  la  información que  ellos nos 

proveyeron acerca de su proceder.  

El primer paso,  fue  transformar  logarítmicamente  la  intensidad de  la  señal de  cada 

sonda. Luego se ajustó a un modelo lineal: intensidad= genotipo + error, donde el término 

genotipo  contrasta  salvaje  y mutante.  El  arreglo    contra  el  cual  fueron  hibridadas  las 

muestras de A. thaliana, ya había sido anotado previamente [Zhang et al., 2008]. Por otro 

lado,  la  anotación  para  el  arreglo  de  D.  melanogaster  fue  “megablasteada”  contra  la 

versión 5 del genoma de Drosophila. Así, y  restringiendo el número de oligonucleótidos 

según  su nivel de  apareamiento,  se  trabajó  con un  total de 2.930.433  sondas. Estas  se 

mapearon  sobre  los  ARNm  anotados  para  marcar  los  exones,  intrones,  regiones 

intergénicas, o comprobar si exceden los límites de anotación de esa versión del genoma. 

P á g i n a  | 141  

 

Este  último  tipo  de  sondas,  así  como  las  que  corresponden  a  regiones  intergénicas,  o 

aquellas  que  hibridan  con  múltiples  transcriptos,  fueron  eliminadas  del  análisis  del 

transcriptoma de D. melanogaster. 

Para el análisis del splicing, se empleó la  intensidad de señal de las sondas, corregida 

por  la media de  la expresión génica. La  tasa de  falsos descubrimientos  fue determinada 

mediante 20 permutaciones [Zhang et al., 2008]. 

Análisis bioinformático de las secuencias dadoras de splicing 

La frecuencia genómica de cada nucleótido para cada posición en la secuencia dadora 

de splicing, 5’ss, fue obtenida del sitio web SpliceRack [Sheth et al., 2006]. La sub‐ o sobre‐ 

representación de un nucleótido particular,  con  respecto a  la  frecuencia genómica y  su 

valor  P,  fueron  calculados  utilizando  el  test  hipergeométrico.  La  frecuencia  de  los 

nucleótidos  fue  representada  en  forma  de  pictogramas,  los  cuales  se  construyeron 

mediante el uso del software WebLogo [Crooks et al., 2004]. 

Detección de splicing por PCR radiactiva y qPCR 

Ver Materiales y Métodos del Capítulo I para más información. 

Para detectar las distintas isoformas del mensajero de PRR9 mediante PCR radiactiva, 

se realiza una amplificación de PCR (Metodología, Capítulo I) con 2 mM MgCl2. Los primers 

empleados  para  amplificar  los  mensajeros  del  gen  per,  son  los  descriptos  por  John 

Majercak  [Majercak  et  al.,  2004].  Ver  el  apéndice  con  la  lista  de  primers  para  más 

información. Los productos de amplificación obtenidos para PRR9 se sembraron en geles 

de  acrilamida  8% ,  tras  la  corrida  electroforética  se  detectaron  por  autoradiografía  las 

bandas correspondientes a  las diferentes  isoformas. Las cuentas radiactivas emitidas por 

cada banda se miden en un contador de centelleo (método de Cerenkov). 

 

 

P á g i n a  | 142  

 

 Extracción de proteínas y Western blot 

Para  la extracción de proteínas a partir de plántulas de Arabidopsis thaliana, al  igual 

que para la extracción de ARN, el primer paso es llevar el tejido a un fino polvo por medio 

de  un mortero  al  que  se  le  agrega  nitrógeno  líquido  para  facilitar  la  destrucción  del 

material. Habiendo obtenido el fino polvo se agrega un buffer de extracción que disuelve 

las membranas celulares y libera los contenidos. Utilizamos diferentes recetas y buffers de 

extracción pero el más usado fue: 

PEB400 (Protein Extraction Buffer 400 mM KCl) 

50 mM Hepes KOH pH 7.9 

400 mM KCl 

2,5 mM MgCl2 

1 mM EDTA 

1 mM DTT 

0,1%  Triton X‐100 

+inhibidor/es de proteasas (usamos el de Roche, libre de EDTA en pastillas) 

 

Para  sembrar  la muestra en un SDS‐PAGE 15‐18  % ,  se diluye en buffer PEB  (sin KCl) 

para  bajar  la  concentración  de  potasio  a menos  de  200 mM  y  evitar  que  se  gelifique 

cuando se calientan (crackeado) en Laemmli buffer (por el SDS). 

2X Laemmli 

12,5 ml 0,5M Tris HCl pH 6,8 

10 mL Glicerol 

2 g SDS 

1 ml β‐Mercaptoetanol 

Para crackear  las muestras calenté a 65 °C por 5 minutos para evitar el agregado de 

proteínas por las posibles interacciones hidrofóbicas. 

Después  de  la  electro‐transferencia  a  una  membrana  de  PVDF  se  reveló  con  el 

anticuerpo SYM10 siguiendo las instrucciones del proveedor (Millipore).    

P á g i n a  | 143  

 

Resultados  

1. Introducción al conocimiento de PRMT5 y su función:  

Aislamiento y caracterización inicial de la mutante prmt5‐5 

El aislamiento y  la caracterización  inicial de  la mutante comenzaron en el  laboratorio 

del  Dr. Marcelo  Yanovsky  a  cargo  de  la  lic.  Sabrina  Sanchez.  Con  el  fin  de  identificar 

nuevos componentes que participen o modulen el funcionamiento del reloj circadiano, se 

realizó  una  búsqueda  a  gran  escala  de  mutantes  en  la  especie  modelo  Arabidopsis 

thaliana.  

Al momento de realizar la búsqueda de mutantes no se contaba con las herramientas 

que  permitieran  realizar  un  análisis  rápido  y  eficiente  del  funcionamiento  del  reloj 

circadiano, para lo cual se empleó una estrategia alternativa. Como se sabe,  la inhibición 

del  alargamiento  del  hipocotilo  durante  la  des‐etiolación  es  una  respuesta  controlada 

tanto  por  el  reloj  circadiano  como por  la  percepción  de  las  señales  lumínicas,  y  por  la 

interacción  entre  esos  dos  mecanismos.  De  esta  forma,  identificar  mutantes  cuyo 

hipocotilo sea particularmente largo o corto, sugiere que el gen alterado participa directa 

o  indirectamente en  los procesos citados anteriormente. Por otro  lado,  la elongación del 

hipocotilo  es  una  respuesta  de  simple  y  de  rápida  detección.  Así,  se  decidió  que  la 

búsqueda consistiría en encontrar plántulas cuyos hipocotilos  fueran  largos  (más que el 

promedio),  en  condiciones  de  crecimiento  donde  normalmente  se  maximizan  las 

diferencias, o sea, ciclos de  luz y oscuridad, y en particular en  fotoperíodos de día corto 

(DC:  luz  blanca,  8  horas  y  oscuridad,  16  horas).  Alrededor  de  100  plántulas  fueron 

seleccionadas por presentar hipocotilo alargado. La siguiente generación fue sometida al 

mismo análisis para corroborar su fenotipo. Así se aisló la mutante prmt5‐5 (denominada 

179 en ese entonces).  

P á g i n a  | 144  

 

El tiempo que tardan las plantas en florecer está regulado por distintas señales y por el 

reloj.  Por  eso  resultaba  importante  determinar  si  la  mutante  prmt5‐5  presentaba 

alteraciones en el  tiempo de  floración. Para medirlo  se usó  como estimador de éste  la 

cantidad de hojas presentes en la roseta al momento de aparecer el botón floral, ya que 

de  esa  forma  se  puede  conocer  el  tiempo  biológico  que  tarda  en  florecer 

independizándose  de  los  defectos  en  el  desarrollo  (en  particular  las  plantas mutantes 

prmt5‐5 crecen lento). Para ello se crecieron plantas del genotipo salvaje (WT) y prmt5‐5, 

en  tres  fotoperíodos:  día  corto,  día  largo  (DL:  16  hs  de  luz  ‐  8  hs  de  oscuridad),  y  luz 

continua. Tal como se ve en la figura R27 A la mutante prmt5‐5, presenta floración tardía 

respecto de la planta salvaje en cualquiera de los tres fotoperíodos puestos a prueba. 

Con  el  fin  de  evaluar  el  fenotipo  circadiano  de  la  mutante  aislada,  se  realizó  un 

experimento  en  el  cual  se mide  el  ángulo  formado  por  el  primer  par  de  hojas  de  las 

plántulas, y cómo éste va cambiando a lo largo del día. Tal como se ve en la figura R27 B, 

la mutante  prmt5‐5  presenta  un  período  circadiano  aproximadamente  tres  horas más 

largo que el de la planta salvaje.  

 

Fig. R27: El tiempo a floración y el ritmo del movimiento de hojas, se encuentran alterados en

la mutante. A: hojas en la roseta presentes en el momento de aparición del primer botón floral en

tres fotoperíodos distintos. B: medición del ángulo formado por el primer par de hojas (en grados)

cuando las plántulas son entrenadas en día largo y sometidas luego, a condiciones de luz continua

(H: horas). Los valores representan la media y la barra de error, + el error estándar.

24 48 72 96 120 144

50

70

90

110

130

150

170 WTprmt5-5

Tiempo en Luz Cont. (H)

Ang

ulo

entr

e H

ojas

Día Corto Día Largo Luz Continua0

10

20

30

40

50

60

70

80WTprmt5-5

Hoj

as a

l Flo

rece

r

A B

P á g i n a  | 145  

 

Dado  que  la  búsqueda  de  plantas  con  fenotipo  aberrante  se  realizó  sobre  una 

colección del ABRC  (generadas por  inserción aleatoria de T‐DNA), para  identificar el gen 

alterado  se  probaron  las  técnicas  clásicas  tales  como  TAIL‐PCR  y  PCR  invertida.  Sin 

embargo  se determinó que el T‐DNA no era  responsable per  se del  fenotipo observado 

debido  a  la  falta  de  co‐segregación  inserto‐fenotipo.  A  continuación,  se  realizó  el 

cruzamiento  con  la planta  salvaje del mismo ecotipo  (Columbia),  se obtuvieron plantas 

con  el  fenotipo  caracterizado  y  sin  la  inserción  de  T‐DNA  identificada  anteriormente. 

Sobre  esos  individuos,  se  determinó  la  presencia  de  otras  inserciones  de  T‐DNA  que 

pudieran ser  responsables del  fenotipo. Debido al  interés por  la mutante prmt5‐5, cuyo 

fenotipo estaría dado por un único gen  según  los datos obtenidos en experimentos de 

genética  clásica  (que  coinciden  con  una  segregación  de  tipo  mendeliana),  se  decidió 

realizar  la  técnica  de  clonado  posicional  para  determinar  la  localización  y  el  tipo  de 

mutación  asociada  al  fenotipo  observado.  Para  eso  se  realizó  la  cruza  de  la mutante 

prmt5‐5  (ecotipo  Col)  con  una  planta  salvaje  del  ecotipo  Landsberg  erecta  (Ler)  ‐que 

presenta  diferencias  a  nivel  genómico  con  el  ecotipo  Columbia‐.  Se  realizó  un  “mapeo 

grueso” y se determinó que la mutación se localizaba en el brazo derecho del cromosoma 

4. El paso siguiente se basó en un mapeo más “fino”, para lo cual se diseñaron marcadores 

aprovechando  ciertas  regiones  ausentes  en  Ler  y  presentes  en  Col.  Cuando  se  tenía 

acotado  el  intervalo  en  el  cual  podía  ubicarse  la  mutación  (aproximadamente  430 

kilobases,  que  comprenden  alrededor  de  160  loci),  se  identificó  un  gen  candidato,  el 

At4g31120, gracias a que la descripción bibliográfica del fenotipo de un mutante nulo para 

este gen, era similar al fenotipo de la mutante prmt5‐5 [Wang et al., 2007]. A continuación 

se secuenció el gen candidato completo: desde 1700 pares de bases río arriba de su sitio 

de iniciación de la traducción hasta 650 pares de bases río abajo del codón de terminación 

de la traducción. De este modo, se determinó que prmt5‐5 posee una mutación puntual, 

la cual da origen a un codón de terminación prematuro de la traducción en el transcripto 

del  gen  At4g31120.  El  locus  mutado  codifica  para  la  proteína  AtPRMT5  (Arabidopsis 

thaliana  protein  arginine  methyltransferase)  una metiltransferasa  de  tipo  II  [Liu  et  al., 

P á g i n a  | 146  

 

prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2 phyB0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

WT

Rojo

Larg

o de

l Hip

ocot

ilo(U

nid.

Rel

ativ

as)

prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2 phyA0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.80.91.0

WT

Rojo Lejano

Larg

o de

l Hip

ocot

ilo(U

nid.

Rel

ativ

as)

prmt5-5prmt5-1prmt5-2 cry1 cry20.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

WT

Azul

Larg

o de

l Hip

ocot

ilo(U

nid.

Rel

ativ

as)

A B C

24 48 72 96 120 14440

60

80

100

120

140

160

180

prmt5-2prmt5-1WT

Tiempo en Luz Cont. (H)

Ang

ulo

entr

e H

ojas

24

26

28

30

WT prmt5-5 prmt5-1 prmt5-2

*****

**

Per

íodo

(h)

D E

Fig. R28: PRMT5 es el locus responsable de los fenotipos aberrantes de inhibición de la elongación del

hipocotilo y el período circadiano. Medición del hipocotilo relativizado al valor obtenido en oscuridad, en

luz roja (10 µmoles de fotón/m2seg) (A), roja lejana (15 µmoles de fotón/m2seg) (B) y azul (10 µmoles de fotón/m2seg) (C). D: Medición del ángulo formado por el primer par de hojas cuando éstas son entrenadas

en día largo y sometidas luego, a condiciones de luz continua (H: horas). E: Período del reloj circadiano

calculado a partir del ritmo del movimiento de hojas (*** P<0,001; ** P<0,01). Los valores representan la

media + el error estándar.

2010]. AtPRMT5  es  la única metil‐transferasa  simétrica descripta hasta el momento  en 

Arabidopsis thaliana.  

Debido a que para  realizar el  clonado posicional  se empleó el  fenotipo de  floración 

tardía,  fue  necesario  evaluar  si  los  fenotipos  de  fotomorfogénesis  y  reloj  circadiano  se 

debían también a la alteración en el gen determinado. Para eso, se trabajó con otros dos 

alelos mutantes del gen At4g31120 disponibles en el ABRC: SALK_065814  (prtm5‐1) y el 

SALK_095085 (prtm5‐2), ambos descriptos anteriormente como alelos nulos. Se realizaron 

experimentos con el fin de evaluar la inhibición del alargamiento del hipocotilo durante la 

des‐etiolación y el período de movimiento de las hojas. En la figura R28 (A‐C) se muestra 

el resultado del alargamiento del hipocotilo, relativizado a  la oscuridad. Tal como puede 

P á g i n a  | 147  

 

observarse, el fenotipo hiposensible de prmt5‐5 a las tres calidades de luz empleadas, es 

similar  al  que muestran  los  otros  alelos mutantes  de  PRMT5.  En  la  Fig.  R28  (D‐E)  se 

muestra  el  ángulo  formado  por  el  primer  par  de  hojas  en  condiciones  de  luz  continua 

(plántulas  entrenadas  en  días  largos)  y  la  estimación  del  período,  tanto  para  plantas 

salvajes,  como  para  los  dos  alelos  en  estudio.  Tal  como  puede  observarse,  no  hay 

diferencias significativas entre prmt5‐5 y los mutantes prmt5‐1 y prmt5‐2. 

Estos  resultados,  en  conjunto,  sugieren  que  el  producto  del  gen  PRMT5  estaría 

involucrado no  sólo en  la  floración,  sino  también en el  control del  reloj  circadiano  y  la 

respuesta fotomorfogénica.  

2. Caracterización de la mutante prmt5‐5, su efecto sobre la 

transcripción y el splicing alternativo 

a. Análisis inicial, los primeros blancos del efecto de prmt5‐5. 

En paralelo a los resultados que se mostraron previamente (Fig. R27 y R28), en nuestro 

laboratorio determinamos que  la mutante prmt5‐5 presentaba alteraciones  importantes 

en los patrones de splicing alternativo (fig. R29) de los genes RCA y RSp31 (ver capítulo 1, 

fig. R1 y R3). La figura R29 muestra, además, que dicho efecto es específico ya que RSZ33 y 

AtPP5 (una fosfatasa de proteínas de Arabidopsis thaliana) no tienen alteraciones en  las 

relaciones  de  sus  isoformas  detectables  a  través  de  la  técnica  de  RT‐PCR  radiactiva  y 

posterior electroforesis en geles de poliacrilamida. 

 

 

 

 

 

Figura R29: Efectos de la mutante

prmt5-5 sobre el patrón de splicing alternativo de varios transcriptos. Se

grafica el cociente entre la isoforma

que da el producto de PCR largo y la

del producto corto (mRNA3 y mRNA1

en el caso de RSp31) en función del

transcripto analizado. Barras: media ±

DE (n=3). Se grafican los resultados de

un experimento representativo 0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

RCA RSp31 RSZ33 PP5

Isof

orm

a La

rga/

Cor

ta

Col prmt5-5

P á g i n a  | 148  

 

A sabiendas de que el patrón de splicing alternativo de RCA y RSp31 es modulado por 

luz, decidimos verificar si la respuesta al estímulo lumínico estaba alterada. La figura R30 

muestra lo que sucede con RSp31 en respuesta a transiciones de luz/oscuridad en plantas 

control y en la mutante. Como se puede observar la magnitud del efecto de oscuridad es 

el mismo en  las plantas control y en  la mutante prmt5‐5  (fig. R31). Para RCA se observa 

algo similar  (datos no mostrados). Analizados en conjunto,  los  resultados  indican que  la 

vía  de  señalización  responsable  del  efecto  de  las  transiciones  de  luz/oscuridad  no  es 

interferida  por  PRMT5. Dicho  de  otra manera,  el  efecto  de  la  luz  es  independiente  de 

PRMT5.  

 

 

 

 

 

 

 

Figura R30: Efectos de la mutación

prmt5-5 sobre el cambio en splicing

causado por la transición luz/oscuridad.

Se grafica el mRNA3 y mRNA1 de RSp31

para la planta salvaje (wt) y la mutante

(prmt5-5) en luz y oscuridad (osc). Las

barras representan la media ± DE (n=3).

Se grafican los resultados de un

experimento representativo.

Figura R31: Efectos de la mutación

prmt5-5 sobre el cambio en splicing

causado por la transición luz/oscuridad.

Se graficaron las “veces de cambio” del

cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 para

la planta salvaje (wt) y la mutante

(prmt5-5) en luz y oscuridad (osc). Las

barras representan la media del cociente

mRNA3/mRNA1 que se normalizó a 1

para el tratamiento de luz en cada

genotipo. 0

1

2

3

4

5

6

7

wt prmt5-5

vece

s de

efe

cto

(mR

NA

3/m

RN

A1)

Genotipo

RSp31luz osc

0

1

2

3

4

5

6

7

wt prmt5-5

mR

NA

3/m

RN

A1

Genotipo

RSp31luz osc

P á g i n a  | 149  

 

Posteriormente  nos  interesó  evaluar  si  otras  metil‐transferasas  de  argininas  de 

proteínas caracterizadas en Arabidopsis son capaces de modular el splicing alternativo de 

los eventos que estamos analizando. Con tal fin, estudiamos lo que sucede con el patrón 

de splicing alternativo de RCA y RSp31 en diferentes mutantes de genes que codifican para 

distintas PRMT’s (fig. R32). De las mutantes testeadas, sólo los diferentes alelos mutantes 

de  PRMT5  alteran  el  cociente  de  isoformas  de  RCA  de  forma  significativa  (resultados 

similares  se  obtuvieron  para  RSp31  pero  no  se muestran).  En  conclusión,  el  efecto  de 

PRMT5 sobre el splicing alternativo de RCA y RSp31 es específico de esta metil‐transferasa 

y no  lo  causa  cualquier enzima  con esa  función. En otras palabras,  los efectos  sobre el 

procesamiento  de  estos  genes  no  se  deben  a  una  caída  en  la metilación  general  de 

histonas  y  otras  proteínas,  sino  a  la  pérdida particular  del  tipo  de metilación  (sobre  el 

blanco particular) que causa PRMT5. 

 

 

b. Regulación de la transcripción y del splicing. 

La  función  bioquímica  de  PRMT5,  su  capacidad  de  transferir  grupos metilos  a  las 

argininas presentes –potencialmente‐ en cualquier proteína celular (tanto en núcleo como 

en citoplasma), convierte a esta enzima en un poderoso  factor de  regulación. Se probó 

que es capaz de metilar histonas, y que esto controla epigenéticamente  la expresión del 

gen  FLC  (Flowering  Locus C)  [Wang et  al., 2007;  Schmitz et  al., 2008].  La diversidad de 

fenotipos observados en  la mutante podría deberse, a que existe una gran cantidad de 

genes  regulados  por  PRMT5,  ya  sea  de  forma  directa  (a  través  de  la metilación  de  las 

Figura R32: Cambios en el splicing

alternativo de RCA en mutantes de

diferentes PRMTs. Se grafica el cociente

de isoformas larga (L) y corta (C) de RCA

para la planta salvaje (wt) y las

diferentes mutantes mantenidas en luz

continua. Barras, representan la media ±

DE (n=3). Se grafican los resultados de

un experimento típico.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Col prmt5‐5 prmt5‐1 prmt10 prmt10 prmt11

L/C

Genotipo

RCA 

P á g i n a  | 150  

 

histonas asociadas a  sus promotores) o  indirecta  (regulando  factores de  transcripción y 

otras proteínas). Con  la  intención de  identificar cuáles son  los genes cuya expresión está 

controlada por PRMT5 y mejorar nuestro entendimiento sobre el rol de  la misma a nivel 

celular,  decidimos  analizar  los  cambios  globales  en  la  expresión  génica  en  la mutante 

prmt5‐5 comparándola con la planta salvaje. Para ello, en el laboratorio del Dr. Yanovsky 

se  llevó a cabo un experimento de microarreglos de expresión. El mismo reveló que 355 

genes aumentan su expresión en la mutante prmt5‐5 mientras que 190 genes evidencian 

niveles de expresión más bajos (tablas D‐E en el Apéndice). Las tablas R2 y R3 muestran 

aquellos que cambian más de 3 veces, ya sea, hacia mayor (R2) o menor expresión (R3). 

 

 

 

 

 

 

 

Tabla R2.  Affymetrix ID  Locus  Aumento en expresión

 (prmt5‐5 vs. wt) 

266720_s_at  AT2G46670;AT2G46790  6.45 

255939_at  AT1G12730  5.62 

256096_at  AT1G13650  4.68 

256459_at  AT1G36180  4.32 

256851_at  AT3G27930  4.16 

266651_at  AT2G25760  4.11 

244966_at  ATCG00600  3.98 

245008_at  ATCG00360  3.91 

254286_at  AT4G22950  3.69 

244933_at  ATCG01070  3.65 

244995_at  ATCG00150  3.60 

245449_at  AT4G16870  3.54 

262244_at  AT1G48260  3.48 

261431_at  AT1G18710  3.42 

252415_at  AT3G47340  3.42 

257075_at  AT3G19670  3.41 

252508_at  AT3G46210  3.40 

259329_at  AT3G16360  3.37 

258137_at  AT3G24515  3.32 

258627_at  AT3G04460  3.26 

266652_at  AT2G25760  3.26 

246700_at  AT5G28030  3.15 

250476_at  AT5G10140  3.11 

251095_at  AT5G01510  3.07 

260500_at  AT2G41705  3.07 

253563_at  AT4G31150  3.05 

Tabla R3.  Affymetrix ID  Locus 

Disminución en expresión  

(prmt5‐5 vs. wt) 

245928_s_at  AT5G24770;AT5G24780  0.18 

266142_at  AT2G39030  0.21 

259802_at  AT1G72260  0.23 

249917_at  AT5G22460  0.25 

250942_at  AT5G03350  0.26 

250445_at  AT5G10760  0.26 

252170_at  AT3G50480  0.27 

248062_at  AT5G55450  0.27 

254255_at  AT4G23220  0.27 

247684_at  AT5G59670  0.28 

265837_at  AT2G14560  0.29 

257793_at  AT3G26960  0.32 

255595_at  AT4G01700  0.33 

262408_at  AT1G34750  0.33 

Tablas R2 y R3: Cambios en los niveles de

expresión génica entre plantas mutantes prmt5-5 y plantas salvajes. Muestran los genes cuya

expresión cambia más de 3 veces (en valor

absoluto) entre la mutante y la salvaje.

P á g i n a  | 151  

 

 También se analizó si alguno de  los genes asociados al reloj circadiano, que pudiera 

explicar  los  fenotipos  circadianos  asociados  a  la  mutante,  presenta  diferencias 

significativas en su expresión entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje (Apéndice, tabla 

F). Los únicos 2 genes de esta categoría afectados resultaron ser PRR7 y PRR9, ambos con 

un aumento de expresión en  la mutante prmt5‐5  (Introducción,  fig.  I17).  La bibliografía 

disponible a  la  fecha  indicaba que sobre‐expresar PRR9 [Matsushika et al., 2002] genera 

plantas de período corto, tanto en caracteres moleculares como fisiológicos. Esto aparecía 

como  contradictorio  con  lo  que  observamos  en  la mutante  prmt5‐5,  la  cual  posee  un 

período largo a pesar de que sobre‐expresa PRR9 y PRR7.  

 Por otro  lado, utilizando microarreglos del tipo tiling array que cuentan con sondas 

prácticamente solapadas en toda la extensión de los genes, fuimos capaces de determinar 

que 471  intrones muestran mayor  señal de hibridación en  la mutante que en  la planta 

salvaje (Apéndice, tabla G). Tal señal está normalizada a  la de  los exones vecinos, por  lo 

tanto,  esos  intrones  se  están  reteniendo  más  (o  no  están  siendo  eficientemente 

eliminados de los mensajeros) en la mutante prmt5‐5. En conclusión, el splicing de varios 

intrones  está  afectado  en  la  mutante.  Dado  que  diferentes  bases  de  datos  sobre  el 

transcriptoma  de  Arabidopsis  thaliana  muestran    que  PRR9  posee  más  de  un  ARN 

mensajero maduro, decidimos evaluar la posibilidad de que el patrón de isoformas de este 

gen  estuviera  alterado  en  la  mutante  prmt5‐5  y  eso  explicara  por  qué  una  mayor 

expresión de PRR9 no causa un fenotipo de período más corto.  

Existen dos eventos distintos de splicing alternativo que al combinarse dan origen a 

las  cuatro  isoformas  reportadas para PRR9: un  sitio dador 5’  alternativo en el  segundo 

exón  y  la  posible  retención  del  tercer  intrón  (fig.  R33  A).  Diseñamos  primers  que  nos 

permitieran amplificar todas las isoformas codificadas por el gen PRR9. Los resultados de 

las RT‐PCR correspondientes se muestran en la figura R30 B. Es evidente que, a pesar de 

un  gran  aumento  en  la  expresión  de  PRR9,  la  cantidad  de  isoforma  activa  (capaz  de 

generar la proteína completa) es menor en mutantes de prmt5. Dato que fue confirmado 

por PCR en tiempo real (Real Time PCR) o qPCR para prmt5‐5 (fig. 33 C). 

P á g i n a  | 152  

 

En  conclusión,  hemos  demostrado  que  PRMT5  regula  la  expresión  de  numerosos 

genes (directa o indirectamente) y su procesamiento (altera el splicing). Además, la suma 

de estos efectos podría mediar el fenotipo circadiano de la mutante prmt5‐5 por su acción 

sobre PRR9. Decidimos indagar sobre estas cuestiones.  

c. Regulación circadiana del splicing alternativo por PRMT5. 

A partir de  los datos publicados [Edwards et al., 2006] teníamos evidencias de que  la 

cantidad  de  mensajero  de  PRMT5  oscila  de  forma  circadiana  (fig.  R34),  y  decidimos 

evaluar el splicing alternativo de alguno de los mensajeros de los genes bajo estudio para 

ver  si  se  pueden  observar  oscilaciones  asociadas  durante  el  transcurso  del  día  en  tal 

proceso, y si las posibles oscilaciones se ven anuladas en la mutante prmt5‐5. 

Como  se  puede  observar  en  la  figura  R35,  el  patrón  de  splicing  alternativo  del 

mensajero de RCA varía a lo largo del día (en un día con 8 hs de luz y 16 hs de oscuridad, 

día  corto)  en  plantas  salvajes  o  control.  Como  esperábamos,  las  oscilaciones  se  ven 

Figura R33: A) Esquema de las isoformas que presenta el gen PRR9. B) Foto de un gel representativo con 3

réplicas biológicas de plantas salvajes (WT) y mutantes (prmt5-5). La isoforma A (subrayada en rojo) es la

única que da la proteína activa. C) Análisis por PCR en tiempo real de la abundancia de isoforma activa

con respecto al total. *** p < 0,05

 

P á g i n a  | 153  

 

Figura R35: Cambios en el patrón de

splicing de RCA en función de la hora

del día. Las plántulas fueron mantenidas

en condiciones de día corto (8:16) desde

su germinación. Se muestran los

resultados de un experimento tipo con

n=3. Puntos, media ± ES.

Figura R34: Expresión relativa de

PRMT5 según los datos de Edwards et al,

2006. Las plántulas fueron crecidas bajo

un fotoperíodo de 12:12 (horas de

luz:oscuridad) y al octavo día fueron

transferidas a luz continua. Se

recolectaron muestras cada 6 hs.

disminuidas  en  la mutante  de  prmt5‐5  y  el  patrón  de  splicing  es muy  distinto  al  de  la 

planta salvaje (WT). 

Posteriormente decidimos ver si el evento de splicing alternativo de RCA es regulado 

por el reloj circadiano. Para tal fin evaluamos lo que sucede con el patrón de isoformas de 

RCA en condiciones de “corrida libre” (free running) en luz continua (LL). Como se observa 

en  la  figura  R36,  si  bien  las  oscilaciones  son  menores  bajo  las  condiciones  de  este 

experimento, el patrón de splicing alternativo de RCA en la mutante prmt5‐5 es diferente 

al de la planta salvaje (WT) en cada punto, y las oscilaciones en la abundancia relativa de 

las isoformas de este gen se ven disminuidas. Algo similar se observa para RSp31 y otros 

genes regulados por PRMT5 y el reloj circadiano  (Apéndice,  fig. A para RSp31). También 

encontramos ejemplos de genes regulados por PRMT5 a nivel de su procesamiento que no 

0 4 8 12 16 20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2 WTprmt5-5

Tiempo en Día Corto (hs)

RC

A (

L/C

)

26 34 42 50 58 66 74

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4WT: Col

Tiempo en LL (hs)

PR

MT

5(N

ivel

de

Exp

resi

ón)

P á g i n a  | 154  

 

presentan  oscilaciones  en  su  patrón  de  splicing  alternativo  a  lo  largo  del  día  (ej.: 

At5g57630, Apéndice fig. B). 

Hasta aquí comprobamos que PRMT5  regula  la  transcripción y el splicing alternativo 

de PRR9, la transcripción de PRR7, y también regula el splicing alternativo de RCA siendo 

necesaria para las oscilaciones de éste a lo largo del día y en respuesta al reloj (fig. R35 y 

R36).  Sin  embargo,  no  sabemos  si  la  regulación  del  splicing  de  RCA  por  PRMT5  en 

respuesta al reloj circadiano es directa, o si involucra a PRR7 y a PRR9. 

La figura R37 muestra que las oscilaciones en el patrón de splicing alternativo de RCA a 

lo  largo  del  día  se  ven  reducidas  en  una mutante  sin  PRR7  ni  PRR9.  Sin  embargo,  el 

cociente  L/C de  transcriptos de RCA de  esta mutante doble, no  se  ve  tan  fuertemente 

afectado  como  el  de  la mutante  prmt5‐5  al  compararlo  con  el  de  la  planta  salvaje.  La 

ausencia de PRMT5 anula las oscilaciones y cambia drásticamente el patrón de splicing de 

RCA, ya  sea en el  contexto genético de  la planta  salvaje  (prmt5‐5 vs. Col) o en el de  la 

mutante doble prr7;prr9 (prr7;prr9;prmt5‐5 vs. prr7;prr9). En conclusión, PRMT5 regula el 

splicing  alternativo  de manera  independiente  de  PRR7  y  PRR9,  y  de modo  directo.  La 

regulación de las oscilaciones en la abundancia relativa de isoformas de RCA en respuesta 

al reloj podría, en parte, estar mediada por el circuito al que pertenecen PRR7 y PRR9.  

24 28 32 36 40 44 48

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5WT

prmt5-5

Tiempo en LL (hs)

RC

A (

L/C

)

Figura R36: Cambios en el patrón de

splicing de RCA en función de la hora del

día subjetivo. Las plántulas fueron

mantenidas en un régimen de 12:12

(luz:oscuridad) desde su germinación y

fueron transferidas luego a luz continua. Se

muestran los resultados de un experimento

típico con n=3. Puntos, media ± ES.

P á g i n a  | 155  

 

Figura R37: relación de isoformas de RCA en condiciones de free-running (luz constante) luego de haber

entrenado las plantas con un fotoperiodo de 8:16 (Luz/Oscuridad). En el eje horizontal se representa el

horario aparente, barra gris: noche subjetiva, barra blanca: día subjetivo. Se compara el cociente L/C de

transcriptos de RCA en la planta salvaje (Col) y en las mutantes prmt5-5, en la doble mutante prr7;prr9, y

en la mutante triple (prmt5-5;prr7;prr9). Cada punto representa la media ± ES (n=3). 

Es interesante remarcar en este punto, que también fuimos capaces de demostrar que 

el efecto de PRMT5 sobre el período (ej,: movimiento de hojas) ocurre a través de PRR7 y 

PRR9. El fenotipo observado en las plantas mutantes prmt5 de un período más largo no se 

evidencia  al  comparar  la  doble  mutante  prr7;prr9  con  la  triple  prr7;prr9;prmt5‐5 

(Apéndice, fig. C). 

d. Alcances de la regulación del splicing alternativo por PRMT5. 

De  lo  expuesto  anteriormente  se  puede  concluir  que  PRMT5  es  un  regulador  del 

splicing  alternativo  en  Arabidopsis  thaliana  y  está  íntimamente  conectado  al  reloj 

circadiano, siendo su expresión y su  función,  reguladas a  lo  largo del día. Entonces, nos 

cuestionamos  acerca  del  alcance  de  PRMT5  como modulador  del  splicing  alternativo. 

Abordamos  el  problema mediante  dos  enfoques  diferentes.  Por  un  lado,  utilizamos  la 

tecnología de microarreglos, en particular el sub‐tipo de tiling arrays. Los mismos, como 

expliqué más arriba, permiten observar  la expresión de un gen con mayor  resolución y, 

por ejemplo, evaluar si un intrón y/o exón “se expresa” en una dada condición (es decir, si 

24 28 32 36 40 440.0

0.5

1.0

Colprmt5-5prr7;prr9;prmt5-5prr7; prr9

Tiempo en luz continua (LL)

L/C

RCA

P á g i n a  | 156  

 

está  incluido/retenido en el mensajero maduro).  La  figura R38 muestra un ejemplo del 

análisis utilizado, el  locus At2g43430, que  según  lo predicho codifica para una glioxilasa 

mitocondrial GLX2‐1, muestra una mayor retención (mayor señal) de su primer intrón. 

 

Si bien esta aproximación es muy útil para el fenómeno de retención de  intrones, no 

es  sencillo  definir  otros  tipos  de  eventos  de  splicing  alternativo.  Sin  embargo,  como 

expresé  antes  fuimos  capaces  de  determinar  que  471  intrones,  de  un  total  de  67791, 

tenían significativamente más señal en  la mutante prmt5‐5 que en  las plantas salvajes o 

WT. De  lo anterior se deduce que el efecto de PRMT5 no es sobre el splicing en general 

sino que es específico de algunos eventos particulares. 

Debido a  los  límites que posee esta técnica, es que decidimos realizar un análisis de 

alta  resolución  con  un  panel  de  RT‐PCR  similar  al  descripto  previamente  (Capítulo  I, 

Extensión  del  Análisis  [Simpson  et  al.,  2008]).  En  este  caso  analizamos  cerca  de  300 

eventos  de  splicing  alternativo  comparando  la mutante  prmt5‐5  con  el  control WT.  La 

tabla  R4  muestra  los  genes/loci  con  eventos  de  splicing  alternativo  que  presentan 

diferencias mayores al 5 %  (valor absoluto) en  la abundancia relativa de  la  isoforma más 

pequeña,  a  la  que  llamamos  X,  con  respecto  al  total  de  isoformas  analizadas  para  tal 

evento. Observamos que, 44 de los 288 eventos analizados presentan diferencias entre la 

mutante prmt5‐5 y el control, y PRR9 (At2g46790) es uno de  los eventos analizados que 

muestra una de las diferencias más grandes. 

Intensidad de la se

ñal (log)

 

Figura R38: Análisis de retención de

intrones por tiling arrays del locus

At2g43430. Las plántulas fueron crecidas

en luz continua. El análisis lo llevó a cabo

Xu Zhang en el laboratorio de Justin

Borevitz de la Universidad de Chicago.

P á g i n a  | 157  

 

Tabla R4: eventos de splicing alternativo alterados en la mutante prmt5-5. Se muestra la

diferencia entre el cociente de la abundancia de la isoforma X sobre el total de isoformas del

evento analizado para prmt5-5 y el control. Mediante un test de Student se determinó la

significancia de tales diferencias como valor p de la prueba

Locus Evento de splicing

Tamaño de isoforma X (pb)

Tamaño de otras isoformas detectadas (nucleótidos)

Diferencia entre “isoforma X/Todas” de prmt5-5 vs. WT (%)

Valor- p de la prueba

At1g01060 Ret. Int. 160 330 -5.691 0.001

At2g43410 Ret. Int. 406 540 -7.092 0.009

At1g49730 Ret. Int. 238 342 -8.918 0.000

At5g37055 Ret. Int. 355 524 -9.750 0.009

At4g23260 Ret. Int. 285 401 -28.459 0.000

At5g25610 Ret. Int. 231 607 -71.686 0.006

At2g46790 Ret. Int./5' SS 244 252, 332 & 339 -56.828 0.001

At5g24270 Ret. Int./5' SS 308 337, 416 & 445 -24.585 0.000

At3g16800 Ret. Int./3' SS 367 385, 572 & 590 -31.590 0.000

At5g05550 Exon Skipping 210 308 32.721 0.000

At5g48150 Exon Skipping 204 284 18.657 0.000

At3g23280 Exon Skipping 128 201 18.213 0.000

At4g24740 Exon Skipping 143 309 16.068 0.003

At3g20270 Exon Skipping 195 217 8.514 0.005

At3g25840 Exon Skipping 283 341 6.506 0.000

At3g01150 Exon Skipping 166 268 -13.698 0.000

At1g54360 5´SS 129 152 39.213 0.001

At5g57630 5´SS 210 254 31.070 0.006

At4g32730 5´SS 184 199 30.926 0.001

At2g27230 5´SS 208 246 27.230 0.000

At2g15530 5´SS 222 241 21.124 0.000

At1g53650 5´SS 177 195 18.934 0.000

At5g13220 5´SS 173 226 16.355 0.001

At4g38510 5´SS 216 232 & 289 15.530 0.003

At2g04790 5´SS 167 190 11.140 0.002

At5g18620 5´SS 213 222 9.278 0.000

At1g49950 5´SS 238 193 & 400 7.699 0.004

At2g39730 5´SS 247 258 5.571 0.000

At1g72650 5´SS 183 201 -7.475 0.003

At2g38880 5´SS 310 372 -10.439 0.001

At3g12250 5´SS 220 329 -16.288 0.000

At3g23900 5´SS 118 125 -16.766 0.002

At3g29160 5´SS 159 307 -18.240 0.008

At3g19840 5´SS 171 207 -26.201 0.001

At2g33480 5´SS 400 487 -27.161 0.002

At1g76510 5´SS 189 212 -28.000 0.000

At4g02430 3´SS 153 163 27.455 0.010

At3g62190 3´SS 144 334 15.035 0.000

At4g31720 3´SS 189 206 12.374 0.000

At1g60850 3´SS 108 119 12.348 0.001

At3g53270 3´SS 264 360 11.739 0.002

At3g12570 3´SS 159 188 10.177 0.009

At2g37340 3´SS 123 341 -6.472 0.007

At4g12790 3´SS 212 341 -9.041 0.009

 

P á g i n a  | 158  

 

El hecho de contar en el panel con diferentes tipos de splicing alternativo nos permitió 

evaluar  la pregunta de si algún tipo particular de evento se encuentra en frecuencia más 

afectado en la mutante prmt5 que otro. La respuesta a tal pregunta podría acercarnos al 

mecanismo molecular por el cual PRMT5 regula al proceso de splicing. Con este objetivo 

evaluamos  las  diferencias  entre  representación  en  el  panel  de  cada  tipo  de  splicing,  y 

respuesta (leída como cambio en el patrón de  isoformas) a  la mutación prmt5‐5 de cada 

evento.  La  figura  R39  muestra  los  resultados  de  tal  análisis.  Se  observa  una  sobre‐

representación  de  los  5´ss  o  sitios  dadores  y  una  sub‐representación  de  los  3’ss  o 

aceptores. Esto  indicaría que  la modulación de PRMT5 sobre el splicing alternativo tiene 

que ver con la elección de los sitios dadores (5´ss), más que con los aceptores o el proceso 

global de splicing.  

Tomando  los  resultados de  esta  sección  en  conjunto podemos  concluir que PRMT5 

colabora  en  el  reconocimiento  de  5’ss  débiles.  Esta  hipótesis  se  basa  en  la  mayor 

representación de 5´ss  afectados  en  la mutante  prmt5‐5  y  la menor  representación de 

3´ss, y en el hecho de que de todos los intrones analizados a nivel genómico (67791) con 

los tiling arrays de Affymetrix, es decir los 471 intrones “alterados”, muestran mayor señal 

en las plantas mutantes prmt5‐5 que en la planta salvaje. 

5'SS 3'SS Ret. Int. Exon skipping0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6Totalprmt5-5

RF=1,85p=5,0.10-4

RF=0,44p=4,0.10-5

RF=1,64p=0,072 RF=0,92

p=0,49

Fre

cuen

cia

del e

vent

o

Figura R39: Representación de los eventos

de splicing alternativo en el panel versus

frecuencia de cambio. Se grafica la

frecuencia de cada evento, o tipo de

splicing alternativo, representado en el

panel (Total), y la frecuencia de los mismos

que presentan diferencias entre la mutante

(prmt5-5) y la planta salvaje. RF: factor de

representación, o frecuencia de eventos

con cambio en prmt5-5 sobre su

frecuencia en el panel; y el valor p

correspondiente. Exon skipping, salteado

exónico.

P á g i n a  | 159  

 

3. Descifrando el mecanismo de acción de PRMT5 sobre el splicing 

alternativo (parte I). 

A  partir  de  los  resultados  previos  decidimos  que  el  paso  siguiente  debía  ser  la 

búsqueda  de  una  característica  común  entre  los  eventos  de  splicing  alterados  en  la 

mutante prmt5‐5. Ya contábamos con  la  información de que  los sitios dadores (5’ss) son 

los más afectados por la mutación en PRMT5, entonces pensamos que era lógico iniciar la 

búsqueda allí. 

La comparación entre los 5’ss de los eventos de splicing más afectados (a partir de los 

datos de  los tiling arrays) en  la mutante prmt5‐5 y  la secuencia consenso para el 5’ss de 

Arabidopsis thaliana (obtenida del SpliceRack [Sheth et al., 2006]), revela una disminución 

importante  y  significativa  en  la  frecuencia  de  la  G  dominante  en  la  posición  ‐1  y  una 

tendencia a la aleatoriedad en los nucleótidos presentes en las posiciones ‐2, ‐1 y +5 en los 

eventos afectados (fig. R40). 

Concluimos entonces que PRMT5 colabora de alguna manera con el  reconocimiento 

de estos sitios 5’ss débiles (alejados del consenso). Dado que estos 5’ss que se alejan del 

consenso  abundan  en  la  juntura  exón‐intrón  de  eventos  de  splicing  alternativo,  esta 

característica convierte a PRMT5 en un poderoso regulador de este proceso. 

 

Figura R40: Diferencias en los sitios

dadores (5’ss) de los eventos de splicing

alterados en la mutante prmt5-5. Los

pictogramas muestran la distribución de

nucleótidos en un 5’ss usando WebLogo

[Crooks et al., 2004]. RF: factor de

representación, o frecuencia de un

nucleótido particular; y el valor p

correspondiente a un test

hipergeométrico.

 

P á g i n a  | 160  

 

Figura R41: Análisis de los patrones de metilación de

proteínas celulares en plantas salvaje y mutantes

prmt5-5. Western blot revelado con el anticuerpo

SYM10 que reconoce argininas simétricamente

dimetiladas. Comparación de un extracto proteico

total de una planta salvaje (WT) y una mutante

prmt5-5. Las flechas indican bandas

correspondientes a proteínas que pierden su

metilación en la mutante.  

Dado que PRMT5 tiene la capacidad reportada en células de mamífero y en Drosophila 

[Gonsalvez  et  al.,  2006;  Gonsalvez  et  al.,  2007]  de  metilar,  entre  otras,  histonas  y 

proteínas  Sm,  que  en  conjunto  podrían  afectar  la  transcripción  y  el  procesamiento  de 

diferentes  genes,  decidimos  evaluar  qué  sucedía  en  Arabidopsis  thaliana.  Los  reportes 

indican que  la metilación de histonas en este organismo, mediada por PRMT5  causa  la 

inhibición  de  la  expresión  de  FLC  [Wang  et  al.,  2007;  Schmitz  et  al.,  2008],  pero  ¿qué 

sucede con la metilación de las Sm? 

Como  muestra  la  figura  R41,  el  patrón  de  proteínas  con  argininas  di‐metiladas 

analizado por Western blot  con  el  anticuerpo  SYM10, es muy diferente  entre  la planta 

salvaje y  la mutante prmt5‐5. La diferencia es muy evidente a pesos moleculares bajos, 

donde  se encuentran o “corren”  las proteínas Sm y  simil‐Sm  (Sm‐like proteins, Lsm). En 

conclusión,  estos  resultados  indican  que  la  dimetilación  simétrica  de  las  argininas  de 

proteínas Sm y relativas, entre otras proteínas celulares, se ve  fuertemente reducida en 

las mutantes que carecen de la enzima PRMT5 funcional.  

 

 

P á g i n a  | 161  

 

4. Evidencias de un rol conservado: Drosophila melanogaster. 

Debido a que hay una abundante bibliografía  sobre  los efectos de PRMT5/Dart5 en 

moscas, a  la posibilidad concreta de una colaboración con el grupo de Fernanda Ceriani 

(experta  en  cronobiología  de moscas),  y  a  que  podíamos  contar  con moscas mutantes 

para PRMT5 (dart5 y csul); nos pareció interesante aprovechar estas ventajas y evaluar si 

los hallazgos realizados en el sistema de plantas están conservados en un sistema animal.  

Un primer paso fue la determinación de un fenotipo circadiano en las mutantes dart5 

de  Drosophila  melanogaster.  El  grupo  de  Fernanda  Ceriani  llevó  a  cabo  una  serie  de 

experimentos,  tras  los  cuales  demostraron  que  las  mutantes  dart5  son  arrítmicas 

(Apéndice,  fig. D). El segundo paso consistió en evaluar si existen cambios en diferentes 

eventos de splicing alternativo de genes relacionados, y no relacionados, al reloj biológico 

de Drosophila. Un experimento de microarreglos similar al llevado a cabo para Arabidopsis 

(tiling  array)  evidenció  que  418  intrones  son  retenidos  en mayor  proporción,  y  30  en 

menor,  en  las  mutantes  dart5  de  Drosophila.  Entre  ellos  están  representados  los 

transcriptos de diferentes genes relacionados al reloj (Apéndice, tablas H‐I).  

Con  los primeros pasos dados,  lo siguiente fue validar estos resultados a través de  la 

técnica de RT‐PCR radiactiva, para algunos de los candidatos seleccionados a partir de los 

microarreglos, y para otros de interés que no habían aparecido en el análisis. La figura R42 

muestra que algunos de  los eventos analizados presentan oscilaciones  (ej.: takeout) que 

son anuladas por la ausencia de PRMT5/Dart5. Otros no presentan cambios evidentes en 

los dos momentos seleccionados, pero de todas formas, el patrón de splicing alternativo 

de  la  mutante  dart5  es  diferente  al  de  la  mosca  salvaje  (wt).  El  caso  de  per  es 

paradigmático  (fig. 42E), se puede observar que  la marcada oscilación en  la abundancia 

relativa de sus isoformas durante el día subjetivo se anula completamente en ausencia de 

PRMT5/Dart5. 

P á g i n a  | 162  

 

Figura R42: A-D) Relación de isoformas de los transcriptos de diversos genes en dos momentos del día subjetivo

(CT, circadian time) en condiciones de free-running. TO o takeout, CG8266, CG14180, CG7199 son genes que

fueron identificados por el microarreglo y validados por RT-PCR. takeout es un gen relacionado al reloj

circadiano. CT2, comienzo del día subjetivo y CT14, comienzo de la noche subjetiva. Barras, media ± ES (n=4)

E) Relación de isoformas de period (per), otro gen del reloj, en condiciones constantes (free-running). Se graficó

el cociente entre la isoforma de retención de un intrón en el 3’UTR y la que lo procesa totalmente (llamadas

también A/B’, [Cheng et al., 1998]). Puntos, media ± ES (n=4). 

TO

CT2 CT140.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06wtdart5

Hora del día

L/(L

+C)

CG8266

CT2 CT140.0

0.1

0.2

0.3

0.4wtdart5

Hora del día

L/(L

+C

)

CG14180

CT2 CT140.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6wtdart5

Hora del día

L/(L

+C)

CG7199

CT2 CT140.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6wtdart5

Hora del día

L/(L

+C)

A B

C D

 

 

 

 

 2 5 8 11 14 17 20 23

0

2

4

6

8

10 WTdart5

E

Tiempo en free-running

per

(ret

en

ido

/pro

cesa

do

)

 

 

E

mela

mens

Tene

tamb

amp

simil

fig. F

oscila

V

PRM

esta 

splici

mues

una r

azaro

 

E

reco

En  conclusió

anogaster. 

sajeros  (reg

emos eviden

bién sabem

litudes)  en 

ares al com

F Drosophila

ador centra

Volviendo  a

T5/Dart5, ¿

pregunta 

ing  5’  (la  j

stra el  resu

reducción e

osa de los n

En conclusió

nocimiento

ón,  PRMT5

En  ambos

gulados por

ncias de qu

os que a dif

los  niveles

mparar  la m

a). Esto sug

al de Drosop

a  la  regula

¿es el meca

volvimos  a

untura  exó

ultado del  a

en la frecue

nucleótidos 

ón, también

o de sitios 5’

  cumple  ro

s  organism

r el reloj ci

e su mensa

ferencia de

s  de  expre

mutante dar

giere que P

phila, en rel

ción  del  sp

anismo en D

a  los  result

ón‐intrón)  d

análisis. En 

encia de la G

en las otras

n en Drosop

’ de splicing

oles  similar

mos  afecta 

rcadiano o 

ajero no osc

e lo que suc

sión  de  ge

rt5 y  la mos

RMT5 tend

lación a lo o

plicing  alte

Drosophila,

tados  del  m

de  los  dife

resumen, 

G dominant

s posiciones

phila es prob

g débiles o a

res  en  Arab

el  splicin

no) y regu

cila en Dros

ede en Ara

nes  centra

sca salvaje 

ría un rol d

observado e

ernativo  (qu

similar al d

micro‐arreg

rentes  eve

al  igual qu

te de la pos

s. 

bable que P

alejados de

Figu

dad

alter

pict

nuc

[Cro

repr

nuc

corr

hipe

 

bidopsis  tha

ng  alternat

la el  funcio

sophila (dat

bidopsis, la

les  del  relo

(Apéndice, 

de menor  im

en A. thalian

ue  es  el  e

e Arabidop

glo  y  analiz

ntos  afecta

e en Arabi

sición ‐1 y u

PRMT5 esté

l consenso.

ura R43: Dif

ores (5’ss) de

rados en la

ogramas mue

leótidos en u

ooks et al.,

resentación,

leótido part

respondiente

ergeométrico.

P á g i

aliana  y  Dr

tivo  de  d

onamiento d

tos no most

s oscilacion

oj  de  la mo

fig. E Arab

mportancia 

na. 

je  de  la  te

psis? Para re

zamos  los 

ados.  La  fig

dopsis, obs

na distribu

 colaborand

ferencias en

e los eventos

a mutante

estran la distr

un 5’ss usand

2004]. RF:

o frecuenc

ticular; y e

a u

n a  | 163 

rosophila 

iferentes 

del reloj. 

trados) y 

nes (y sus 

osca  son 

bidopsis y 

sobre el 

esis)  por 

esponder 

sitios  de 

gura  R43 

servamos 

ción más 

do con el 

los sitios

de splicing

dart5. Los

ribución de

do WebLogo

factor de

ia de un

el valor p

un test

P á g i n a  | 164  

 

5. Descifrando el mecanismo de acción de PRMT5 sobre el splicing 

alternativo (parte II). 

-Ha!

Lana Turner, El Cartero Siempre Llama Dos Veces

 

La “frase célebre” de arriba hace alusión a que  la suerte de haber encontrado que  la 

mutante  “179”  presenta  un  fenotipo  a  nivel  de  splicing  alternativo  volvió  a  golpear  la 

puerta. Expliqué más arriba que la mutante prmt5‐5 se debe a una mutación puntual en el 

gen que codifica para la enzima PRMT5. La mutación es un cambio de base donde la G que 

ocupa  el  extremo  3’  del  exón  20  es  reemplazada  por  una U,  generando  un  codón  de 

terminación o stop prematuro (GGA—UGA). Esto hace que no haya proteína funcional. Lo 

interesante (y afortunado a la vez) es que por esa misma mutación, ese 5’ss se hace débil 

al cambiar  la G en  la posición  ‐1 del consenso (pasa de ATGgtacctg a ATTgtacctg). Como 

consecuencia de todo esto, el  intrón “río abajo” de  la mutación comienza a ser retenido 

en la mutante (fig. R44). Es interesante ver cómo la banda correspondiente al producto de 

RT‐PCR (señalado por la flecha) de retención del intrón 20, que está “río abajo” del cambio 

de base aparece en la mutante prmt5‐5 pero es eliminado en la planta heterocigota. 

 

 

Col       Col        H          H     prmt5         H       Col    prmt5   prmt5   Col 

Figura R44: RT-PCR (ID 315 –apéndice, primers del panel) que amplifica una región que contiene la

mutación en los transcriptos del gen que codifica para PRMT5. Col, es la planta salvaje; H, heterocigota;

y prmt5, la mutante homocigota prmt5-5. La flecha roja señala la banda correspondiente al producto de

RT-PCR de retención del intrón 20.

P á g i n a  | 165  

 

Este  resultado  refuerza  la  evidencia  (fig.  R39,  R40  y  R43)  de  que  PRMT5  funciona 

colaborando  con  el  reconocimiento  de  sitios  débiles  5’ss  o  dadores  de  splicing. 

Discutiremos esto en  la próxima sección  junto con otras evidencias que podrían apuntar 

en el mismo sentido. 

 

   

P á g i n a  | 166  

 

Discusión (Capítulo II) 

PRMT5 y la regulación del splicing 

En esta  sección discutiré  las distintas evidencias que convergen hacia  la elucidación 

del mecanismo  de  regulación  de  PRMT5  sobre  el  proceso  de  splicing  alternativo.  Los 

primeros ítems serán útiles para regresar sobre los resultados, y tener un panorama más 

completo  a  la  hora  de  profundizar  sobre  el mecanismo  que  subyace  a  la  actividad  de 

PRMT5 como un regulador del proceso de splicing alternativo. 

1. Especificidad La figura R29 constituye  la primera pista sobre  la especificidad del efecto de PRMT5 

sobre  el  procesamiento  de  los mensajeros.  En  esta  figura  podemos  ver  que,  si  bien  el 

splicing alternativo de los transcriptos de RCA y RSp31 se encuentra alterado, los eventos 

de splicing alternativo que sufren RSZ33 y AtPP5 no evidencian ningún cambio. 

 Posteriormente investigamos si otras metil‐transferasas de proteínas eran capaces de 

provocar  cambios  semejantes  a  los  gatillados  por  PRMT5.  Probamos  a  PRMT10  y  a 

PRMT11,  dos metil‐transferasas  del  tipo  I  o  asimétricas.  PRMT11  es  capaz  de metilar 

histonas y otras proteínas de extractos celulares. Además, puede  interactuar con MBD7 

(Methyl‐DNA‐Binding)  que  sería  uno  de  sus  sustratos  asociando,  posiblemente,  la 

metilación de argininas a  la metilación del ADN [Scebba et al., 2007]. PRMT10 es todavía 

más  interesante ya que metila a  la histona 4 en su arginina 3 (H4R3), el mismo sitio que 

utiliza PRMT5, y se sabe que mutantes nulos de PRMT10 en Arabidopsis thaliana generan 

un  fenotipo  de  floración  tardía,  de  la  misma  forma  que  los  mutantes  para  PRMT5 

(actuando sobre FLC) [Niu et al., 2007]. La figura R32 muestra que las mutantes prmt10 y 

prmt11 de estas metil‐transferasas asimétricas no presentan diferencias significativas con 

en los patrones de splicing alternativo de RCA con respecto a la planta salvaje (resultados 

similares se obtuvieron para RSp31).  

En resumen, podemos concluir que la metil‐transferasa simétrica PRMT5 modula los 

patrones  de  splicing  alternativo  de  RCA  y  RSp31.  Tal  efecto  es  específico  ya  que  no 

P á g i n a  | 167  

 

modifica a otros eventos de splicing como los presentes en los genes AtPP5 y RSZ33. Otras 

metil‐transferasas,  PRMT10  y  PRMT11,  no  generan  esta  clase  de  respuesta  a  nivel  del 

splicing  de  los  eventos  ensayados.  Por  lo  tanto,  el  efecto  de  PRMT5  sobre  el  splicing 

alternativo es específico de esta metil‐transferasa y no es un mecanismo común a esta 

familia de enzimas. 

2. PRMT5 no afecta los cambios sobre el splicing alternativo gatillados por transiciones de luz/oscuridad 

Las  plantas  mutantes  prmt5  muestran  alteraciones  en  las  respuestas  a  la  luz, 

presentan  floración  tardía,  crecen más  lento  y  alargan más  su  hipocotilo  en  diferentes 

condiciones de  iluminación. Todo esto hizo que nos planteáramos  la hipótesis  inicial de 

que  la  misma  es  una  mutante  de  la  señalización  lumínica.  Esta  condición  la  hace 

interesante  para  nosotros,  dado  que  además modifica  la  abundancia  de  isoformas  de 

RSp31  y  RCA,  eventos  que  responden  a  los  cambios  en  la  iluminación  (Capítulo  I). 

Decidimos entonces, evaluar  si  los  cambios  gatillados por  transiciones de  luz/oscuridad 

sobre los patrones de splicing alternativo de los eventos mencionados están alterados en 

la mutante. La  figura R30 muestra que,  si bien el cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 es 

diferente entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje, la magnitud del cambio del splicing 

alternativo entre luz y oscuridad es similar para los dos genotipos. La figura R31 muestra 

que al relativizar a 1 los valores del cociente mRNA3/mRNA1 de RSp31 correspondientes 

al tratamiento con luz en cada genotipo, el efecto de la oscuridad (o las “veces de efecto”) 

es prácticamente idéntico entre la planta salvaje (wt) y la mutante prmt5‐5. 

En conclusión, PRMT5 altera la abundancia relativa de isoformas de RSp31 y de RCA 

sin modificar la respuesta a transiciones de luz/oscuridad de los mismos. Esta conclusión 

es  importante  también en  el marco del  capítulo  I,  ya que  al  ensayar una mutante  con 

fenotipo circadiano como es el caso de la mutante prmt5‐5 se sigue observando el efecto 

de luz/oscuridad. En este nuevo marco que proporciona el capítulo II podemos establecer 

que más allá de la regulación circadiana sobre la transcripción y el procesamiento de RCA 

y RSp31,  la  luz ejerce otro efecto  independiente del reloj biológico que se hace evidente 

con nuestro protocolo de transiciones de luz/oscuridad. 

P á g i n a  | 168  

 

3. Efectos de PRMT5 sobre el transcriptoma de Arabidopsis thaliana Los  diferentes  y  variados  fenotipos  de  la mutante  [Pei  et  al.,  2007] nos  llevaron  a 

pensar que PRMT5 debía alterar  la expresión y el splicing alternativo de muchos genes. 

Para  analizar  la  extensión  de  estos  efectos  realizamos  un  análisis  de  expresión  por 

microarreglos.  El mismo  reveló  que  355  genes  aumentan  su  expresión  en  la mutante 

prmt5‐5 mientras que aproximadamente 190 genes evidencian niveles de expresión más 

bajos. Las tablas R2 y R3 muestran aquellos loci para los que se detectó un cambio de más 

de 3 veces, ya sea, hacia mayor (R2) o menor expresión (R3). En el apéndice (tablas D‐E) se 

encuentran  todos  los que presentan un cambio significativo. Dado que no es el  foco de 

interés  de  la  presente  tesis  estudiar  cómo  se  regula  la  transcripción  de  los  diferentes 

genes en respuesta a PRMT5, sino que estamos  interesados en  la regulación del splicing 

alternativo por PRMT5, no discutiré en detalle estos resultados. Sí me parece importante 

destacar que la mayoría de los genes que pertenecen al grupo de los que más cambian en 

su nivel de expresión entre la mutante prmt5‐5 y la planta salvaje, poseen 1 o más eventos 

de  splicing  alternativo  (por  ejemplo,  los  primeros  6  loci  de  la  tabla  R2  sufren  splicing 

alternativo según la base de datos tair –www.arabidopsis.org‐), abriendo las puertas a una 

posible  interacción  entre  estos  procesos  que  podría  subyacer  al mecanismo  íntimo  de 

acción de PRMT5.  

El análisis llevado a cabo sobre tiling‐arrays nos permitió observar que 471 intrones se 

retienen más en  la mutante que en  la planta  salvaje  (Apéndice,  tabla G). Este hecho es 

muy importante, dado que nos arroja las primeras pistas sobre un posible mecanismo de 

acción general detrás de  la  función de PRMT5. El hecho de que  todos  los  intrones que 

presentan diferencias de retención entre  la planta mutante y  la salvaje, se retengan más 

en  la  primera,  nos  dice  que  la  ausencia  de  PRMT5  disminuye  la  eficiencia  en  el 

reconocimiento  y/o  eliminación  de  ciertos  intrones  (son  sólo  471  en  más  de  60000 

analizados). Volveré sobre esto más adelante en la discusión. 

4. Efectos circadianos de PRMT5 El  análisis  de  microarreglos  nos  permitió  identificar  qué  genes  del  reloj  están 

alterados  en  la mutante  prmt5‐5  que  nos  acerquen  al  entendimiento  de  sus  fenotipos 

P á g i n a  | 169  

 

circadianos  (Apéndice,  tabla F). Sorpresivamente,  sólo PRR9  (APRR9) y PRR7  (APRR7)  se 

sobre‐expresan más de 2 veces en  la mutante que en  la  salvaje o wt  (además de FLC). 

Cuando PRR9 y PRR7 son sobre‐expresados en Arabidopsis  thaliana  se obtienen plantas 

con período más corto. Mientras que cuando estos genes sufren mutaciones que anulan la 

función de  la proteína,  las plantas  tienen períodos más  largos  [Matsushika et al., 2002; 

Farré  et  al.,  2005;  Nakamichi  et  al.,  2010].  La  mutante  prmt5‐5  tiene  una  elevada 

expresión de PRR9 y PRR7 comparada con la planta salvaje, pero conlleva un fenotipo de 

período más largo. Esta paradoja se resuelve con los resultados que muestra la figura R33. 

A pesar del aumento en  la expresión de PRR9, prácticamente no se sintetiza  la  isoforma 

que  genera  la  proteína  activa,  debido  al  dramático  cambio  en  el  patrón  de  splicing 

alternativo. Posiblemente, la suma de los efectos sobre el splicing alternativo de PRR9 y la 

transcripción de PRR7 justifiquen parcialmente el fenotipo de período más largo.  

Además de modular la expresión y el procesamiento de estos componentes del reloj, 

sabemos que PRMT5 regula el splicing alternativo de otros genes. Nos pareció importante 

determinar  si  el  patrón  de  splicing  alternativo  de  algún  evento  regulado  por  PRMT5 

presenta  oscilaciones  circadianas.  Este  interrogante  surge  a  partir  de  los  resultados 

anteriores,  y  del  hecho  de  que  el  mensajero  de  PRMT5  oscila  a  lo  largo  del  día  en 

respuesta  al  reloj  (fig.  R34).  Es  decir  que  PRMT5  modula  la  expresión  de  algunos 

componentes  del  reloj  circadiano,  y  este  último  regula  la  expresión  de  PRMT5. 

Comenzamos nuestra búsqueda estudiando el comportamiento a  lo  largo de un día del 

patrón de splicing alternativo de RCA. La figura R35 muestra que el patrón de isoformas de 

dicho  gen  oscila  a  lo  largo  del  día  en  la  planta  salvaje  o WT  (se muestra  un  día  corto 

porque  las oscilaciones son más pronunciadas). Más  interesante aún es el hecho de que 

dichas  oscilaciones  se  ven  muy  atenuadas  o  (prácticamente)  anuladas  en  la  mutante 

prmt5‐5.  Estos  resultados  se  repiten  en  condiciones  de  corrida  libre  (free  running)  o 

condiciones  constantes  (fig.  R36).  Por  consiguiente,  las  oscilaciones  en  el  patrón  de 

splicing alternativo de RCA a  lo  largo del día están reguladas por el  reloj circadiano. A 

esto  último  se  le  debe  agregar  que  PRMT5  es  necesaria  para  que  se  observen  esas 

oscilaciones circadianas, ya que en  la mutante prmt5‐5 no están presentes. Con RSp31, 

P á g i n a  | 170  

 

entre otros, se obtienen resultados similares (Apéndice, fig. A) y también hay ejemplos de 

genes que no presentan oscilaciones circadianas en la abundancia de sus isoformas que de 

todas  formas  son  regulados por PRMT5  (Apéndice,  fig. B). Es decir que  la  actividad de 

PRMT5 no está limitada a la regulación del splicing alternativo de genes modulados por 

el  reloj.  Sin  embargo,  debemos  responder  un  interrogante  relacionado  con  estas 

evidencias:  ¿PRMT5  regula  el  splicing  de  RCA  de manera  indirecta  a  través  de  PRR9  y 

PRR7? 

Para esto fue necesario trabajar con las plantas mutantes simples prr7, prr9 y prmt5‐

5, para obtener la mutante doble prr7;prr9 y la mutante triple prr7;prr9;prmt5‐5. Con las 

mismas  somos  capaces  de  evaluar  si  PRR7  y  PRR9  son  necesarios  para  los  efectos  de 

PRMT5  sobre  el  patrón  de  splicing  alternativo  de  RCA.  La  figura  R37 muestra  que  los 

efectos de PRMT5 sobre el splicing alternativo de RCA no requieren de PRR7 y PRR9. La 

mutante  doble  (prr7;prr9)  altera  el  patrón  de  splicing  de  RCA  con  respecto  al  día,  al 

compararlo con el de la planta salvaje (Col). Pero, si comparamos su efecto sobre el patrón 

de splicing de RCA con el de  la mutante prmt5‐5, podemos observar que  los cambios en 

esta última son más fuertes. Además, en la mutante triple (prr7;prr9;prmt5‐5) el efecto es 

el mismo que en la mutante simple prmt5‐5, lo que demuestra que PRMT5 no requiere de 

PRR7 y PRR9 funcionales para ejercer una regulación sobre el splicing alternativo de RCA. 

En conclusión, PRMT5 regula el splicing alternativo de RCA de manera independiente de 

PRR7  y  PRR9,  tiene  un  efecto  directo  sobre  la  abundancia  de  isoformas  de  RCA. 

Resultados similares se obtuvieron con RSp31 (Apéndice, fig. A). Además, el hecho de que 

las oscilaciones en el patrón de splicing de RCA se vean disminuidas en  la mutante doble 

(prr7;prr9) sugiere que los efectos circadianos podrían estar mediados ‐o asociados‐ a las 

funciones de PRR7 y PRR9. En este camino de razonamiento, fuimos capaces de demostrar 

que los efectos de la mutante prmt5‐5 sobre el período se producen a través de PRR7 y 

PRR9 (Apéndice, fig. C). Si estos factores están mutados (prr7;prr9) adicionar la mutación 

prmt5‐5 (prr7;prr9;prmt5‐5) no genera mayor alargamiento del período. Este dato es muy 

relevante para poner en marco todos  los resultados y sugiere, en conjunto con  los datos 

previos,  que  PRMT5  podría  ser  una  parte  integral  del  “circuito  de  los  PRRs”  del  reloj 

P á g i n a  | 171  

 

circadiano  de  Arabidopsis  thaliana  (Introducción,  fig.  I17;  [Farré  et  al.,  2005; McClung, 

2006; Nakamichi et al., 2010]). 

5. PRMT5 y su relación con los sitios 5’ dadores de splicing Hasta aquí he venido haciendo un racconto de los resultados y las conclusiones de la 

sección pasada sin detenerme demasiado en ninguno. En este  ítem en particular trataré 

de desarrollar con mayor profundidad nuestros hallazgos y sus posibles  interpretaciones 

dado que son el fundamento del presente capítulo. 

Al  encontrarnos  estudiando  los  efectos  de  una  metil‐transferasa  (que  afecta  las 

histonas) en el splicing alternativo, no podemos eludir considerar el modelo cinético. En 

nuestro  laboratorio, como así también en otros, se ha  ido acumulando evidencia a favor 

de la regulación del splicing alternativo por la cinética de la ARN polimerasa II (pol II) sobre 

el molde que está siendo transcripto [de la Mata et al., 2003; Alló et al., 2009; Schor et al., 

2009; Schor et al., 2010]. El modelo cinético plantea que la velocidad de elongación de la 

polimerasa  afecta  el momento  en  que  diferentes  sitios  de  splicing  se  presentan  como 

posibles sustratos competidores frente a  la maquinaria de splicing  (Introducción, fig.  I6). 

Brevemente, un avance veloz y sin pausas de  la polimerasa provocará que sitios débiles 

(alejados  de  la  secuencia  consenso)  puedan  competir  con  otros  más  fuertes, 

disminuyendo  así  su  reconocimiento  por  la  maquinaria  de  procesamiento  [Fededa  y 

Kornblihtt,  2008;  Kornblihtt  et  al.,  2009].  Además  de  los  factores  que  modifican 

directamente  la  actividad  de  la  polimerasa,  aquellos  que  modifican  la  estructura 

cromatínica, también pueden afectar el avance de  la ARN polimerasa a través del molde 

[Orphanides y Reinberg, 2000; Schneider et al., 2004; Ingvarsdottir et al., 2007]. Sabemos 

que  PRMT5  regula  la  actividad  transcripcional  de  más  de  500  genes  de  Arabidopsis 

thaliana (Apéndice, tablas D‐E) y, se ha reportado que  la marca de dimetilación sobre  la 

arginina 3 de  la histona 4  (H4R3) que causa esta enzima, es responsable de  la represión 

transcripcional  de  FLC  [Wang  et  al.,  2007;  Schmitz  et  al.,  2008].  En  base  a  todo  esto, 

podríamos explicar los efectos de PRMT5 sobre el splicing alternativo a través del modelo 

cinético. Discutamos en detalle nuestros hallazgos, prestando especial atención al ajuste 

de nuestras conclusiones e interpretaciones con este modelo. 

P á g i n a  | 172  

 

Como  expresé más  arriba,  471  intrones  se  retienen más  en  la mutante  que  en  la 

planta salvaje  (Apéndice,  tabla G) según  reveló el análisis de microarreglos. El hecho de 

que todos los intrones que presentan diferencias de retención entre la planta mutante y la 

salvaje, se retengan más en  la primera, nos dice que  la ausencia de PRMT5 disminuye  la 

eficiencia  en  el  reconocimiento  y/o  eliminación  de  ciertos  intrones.  Es  interesante 

destacar que  la retención  intrónica se diferencia mecanísticamente del resto de  los tipos 

de splicing alternativo en que no involucra una competencia entre distintos sitios dadores 

y  aceptores  de  splicing  (Introducción,  fig.  I5).  Esta  falta  de  competencia  junto  a  lo 

expresado más  arriba,  debilita  la  hipótesis  de  que  el  efecto  global  de  PRMT5  ocurra  a 

través de la cromatina (por la modificación en H4R3) y de acuerdo al modelo cinético.  

Dado que el análisis de estos tiling arrays no nos permitió ver qué sucede con otras 

clases  de  eventos  de  splicing  alternativo  diferentes  de  la  retención  intrónica,  decimos 

utilizar el panel de RT‐PCR ya descripto (Capítulo I, Extensión del análisis) para evaluar los 

efectos de PRMT5 sobre los diferentes eventos. La tabla R4 muestra que todas las clases 

de splicing alternativo (retención de intrones, salteado exónico ‐exon skipping‐, 5’ss y 3’ss 

alternativos) presentan alteraciones en la mutante prmt5‐5 respecto de la planta salvaje. 

Sin embargo, un análisis más profundo muestra una sobre‐representación de eventos 5’ss 

alterados (fig. R39). Al comparar la distribución de frecuencias de representación de cada 

clase  de  evento  en  el  panel  con  la  frecuencia  de  eventos  que  presentan  cambios,  se 

observa  un  enriquecimiento  en  sitios  dadores  (5’ss)  alterados. Además,  hay  una  sub‐

representación  de  aceptores  (3’ss),  y  una  distribución  pareja  con  respecto  a  las 

retenciones  intrónicas y a  los eventos de salteado exónico (Exon skipping). Nuevamente, 

estos resultados descartarían al modelo cinético como marco de la regulación que efectúa 

PRMT5 sobre el splicing alternativo. De ser éste el mecanismo involucrado, no habría por 

qué esperar esta distribución particular que le otorga cierta preferencia a los eventos 5’ss 

en la regulación del splicing alternativo llevada a cabo por la acción de PRMT5.  

Este  último  resultado  acerca  de  una mayor  cantidad  de  eventos  5’ss  alternativos 

afectados  por  PRMT5  derivó  en  la  búsqueda  de  una  característica  común  a  los  sitios 

P á g i n a  | 173  

 

dadores  de  splicing  alternativo  afectados.  Volviendo  a  los  resultados  obtenidos  de  los 

microarreglos, tomamos los eventos más afectados en la mutante prmt5‐5, y comparamos 

sus secuencias en el 5’ss con la secuencia consenso para este sitio en Arabidopsis thaliana 

[Sheth et al., 2006]. La figura R40 muestra que los sitios afectados en la mutante prmt5‐5 

son  débiles,  están  alejados  en  su  secuencia  del  consenso.  Esto  nos  lleva  a  plantear  la 

posibilidad de que PRMT5 colabore con el reconocimiento de sitios dadores de splicing o 

5’ss  débiles.  Este  resultado  genera  una  nueva  hipótesis,  PRMT5  favorece  el 

reconocimiento de los sitios 5’ss débiles. Evaluemos si esta hipótesis se ajusta a nuestros 

resultados, volviendo a analizar los datos del panel de RT‐PCR.  

Hay un enriquecimiento de sitios 5’ss alternativos alterados en la mutante prmt5‐

5 con respecto a  la planta salvaje. Al mismo tiempo, hay una sub‐representación 

de eventos 3’ss alternativos. 

La distribución de  intrones  retenidos y exones  cassette alternativos no muestra 

diferencias  respecto  de  su  frecuencia de  representación  en  el  panel. Dado  que 

estos  eventos  pueden  combinar  5’ss  y  3’ss  débiles  es  de  esperar  que  algunos 

estén afectados y otros no. 

Aquellos  sitios 5’ss que presentan una base distinta a  la G en  la posición  ‐1  (la 

última base del exón en  la  juntura  con el  intrón)  son menos  reconocidos en  la 

mutante prmt5‐5. 

Es de esperar que los intrones que tienen sitios 5’ss débiles sean retenidos. Todos 

los  eventos  de  retención  de  intrón  del  panel  muestran  mayores  niveles  de 

retención en la mutante que en la planta salvaje. Aún más, todos los intrones que 

presentan cambios en el análisis de microarreglos se retienen más en la mutante 

prmt5‐5. 

Dado que los exones cassette alternativos pueden presentar sitios 5’ss débiles, es 

también un hecho  relevante a esta discusión, que  la mayoría de  los eventos de 

saltado exónico (exon skipping) que cambian en el panel se incluyen menos en la 

mutante prmt5‐5. 

P á g i n a  | 174  

 

El cambio T por G en la última base del exón 20 del gen que codifica para PRMT5, 

mutación puntual que dio origen a  la mutante prmt5‐5, provoca un alejamiento 

de  ese  5’ss  del  consenso  (debilitamiento)  y  concomitantemente,  una  mayor 

retención del  intrón 20  (la G que cambia es de  la posición  ‐1). Como muestra  la 

figura  R44,  la  retención  de  ese  intrón  desaparece  en  presencia  de  PRMT5  (el 

heterocigota tendría 1 alelo sano del gen que codifica para PRMT5). 

Si bien nada de  lo antedicho descarta  la posibilidad de que  la regulación del splicing 

alternativo que lleva a cabo PRMT5 ocurra por su rol de metil‐transferasa de histonas que 

afectaría  la estructura cromatínica, y provocaría cambios en  la elongación de  la pol  II, es 

difícil entender cómo el modelo cinético podría explicar todos los resultados que apuntan 

a un  sesgo especial en  la modulación de PRMT5  sobre eventos 5’ss alternativos. Repito 

(como dice Residente de Calle 13), si bien no podemos descartar al modelo cinético en el 

rol de PRMT5  sobre  la modulación del  splicing alternativo, decidimos generar un nuevo 

paradigma en el que los distintos resultados puedan ser entendidos. 

6. PRMT5, los 5’ss y las proteínas Sm PRMT5 fue clonado inicialmente en mamíferos como “Janus kinase binding protein 1” 

y al mismo tiempo se demostró que podía metilar las histonas H2A, H3 y H4 [Branscombe 

et  al.,  2001].  Se  la  puede  encontrar  tanto  en  el  citoplasma  como  en  el  núcleo.  En  el 

citoplasma forma parte de un complejo llamado “metilosoma”, donde está involucrada en 

la metilación de las proteínas Sm [Friesen et al., 2001]. Durante la fase citoplasmática de la 

biogénesis  snRNP,  el  complejo  SMN  carga  las  proteínas  Sm  sobre  los  sitios  Sm  de  los 

snRNAs. La afinidad del complejo SMN es mayor por las Sm metiladas (sDMA) que por las 

Sm no metiladas, o metiladas asimétricamente [Brahms et al., 2001; Meister et al., 2001]. 

Mutaciones en el ortólogo de PRMT5 en moscas (Dart5) generan  la pérdida completa de 

los residuos de sDMA en  las proteínas Sm [Gonsalvez et al., 2006]  lo que, al parecer, no 

interfiere  con  el  ensamblado  de  los  complejos  de  snRNP  [Gonsalvez  et  al.,  2008].  En 

células humanas, PRMT5 y PRMT7 (otra metil‐transferasa simétrica, tipo  II) funcionan de 

manera no‐redundante en  la metilación de proteínas  Sm  y ha  sido demostrado que  su 

actividad es requerida para la biogénesis de las snRNP  [Gonsalvez et al., 2007]. Nosotros 

 

 

demo

prov

bajo 

estab

b, Sm

auto

 

E

gene

E

crista

D4 b

con l

2009

ostramos q

voca una im

peso mole

blecido que

m D3a y b, 

res propon

En  lugar de

erar uno nue

El anillo de 

alina del U1

) que intera

los transcri

9]. 

ue en Arab

mportante c

ecular como

e la enzima 

y LSm4 de

en un mode

e discutir e

evo y más c

proteínas S

1 snRNP (fig

actúan con 

ptos en pro

bidopsis tha

caída en los

o las Sm y s

PRMT5 de 

e  la misma 

elo para la a

ste modelo

completo. 

Sm, y en pa

g. D4 a) hu

U1 snRNA (

ocesamiento

aliana, la m

s niveles de

sus relativa

Arabidops

planta en e

acción de P

o deseo agr

articular la 

mano estab

(fig. 4D c) ce

o o pre‐ARN

utación del

e di‐metilac

s, Sm‐like (

is thaliana

ensayos  in v

RMT5 que m

regar algun

proteína Sm

bilizando  la

erca de la z

Nm (fig. 4D

l gen que co

ción simétr

(fig. R41). R

es capaz d

vitro [Deng

muestro en

nas  cosas m

m D3, apare

s dos alfa‐h

zona en que

D d) [Pomer

Figura

la acció

thalianasplicingorigina

[Deng e

P á g i

odifica para

ica de prot

ecientemen

e metilar S

g et al., 201

n la figura D

más que ayu

ece en la es

hélices de U

e este últim

ranz Krumm

D3: Modelo

ón de PRMT5

na en la r

g. Conservo

l de la cita

et al., 2010].

n a  | 175 

a PRMT5 

teínas de 

nte se ha 

Sm D1a y 

10]. Estos 

3. 

udarán a 

structura 

U1‐C (fig. 

o aparea 

mel et al., 

propuesto pa

en Arabidopregulación d

o el idiom

a. Extraído

ara

psis del

ma

de

P á g i n a  | 176  

 

Es posible pensar que la metilación de las proteínas Sm genere algún cambio de toda 

esta estructura cuaternaria que afecte el reconocimiento de  los sitios 5’ss. En el 2001, el 

grupo  de Michael  Rosbash  demostró  que  en  levaduras  Sm  B,  Sm  D1,  y  Sm  D3  hacen 

contacto  directo  con  el  pre‐ARNm  cerca  de  5’ss.  Ensayos  bioquímicos  los  llevaron  a 

proponer  que  esto  funcionaría,  al  menos  en  parte,  para  estabilizar  la  interacción  U1 

snRNP‐pre‐ARNm [Zhang et al., 2001].  

Reuniendo  toda  esta  evidencia  me  permito  plantear  un  nuevo  modelo  para  la 

regulación del splicing por PRMT5, el cual contempla la posibilidad de que la metilación de 

las proteínas Sm afecte el reconocimiento de los 5’ss en Arabidopsis thaliana. La figura D5 

esquematiza el modelo planteado en el cual el efecto principal de PRMT5 sobre el splicing 

alternativo  ocurre  a  través  de  la  metilación  de  las  proteínas  Sm  y  su  acción  en  el 

reconocimiento de sitios dadores (5’ss) débiles. 

Figura D4: figuras de los resultados de la cristalografía del snRNP U1 humano. En el texto desarrollo el

contenido de a-d. Se remarcó la presencia de Sm D3 con el círculo rojo aunque estaría allí formando

parte del anillo de proteínas Sm. Se conserva el idioma original de la publicación. Extraído de [Pomeranz

Krummel et al., 2009].

 

 

 

7

R

entre

proce

por e

splici

ajust

E

mela

son 

micro

Fi

7. Por si laReuniendo 

e la regulac

esos circad

el  reloj, y  s

ing  débiles

tando la exp

En  colabor

anogaster q

arrítmicas 

oarreglos  s

igura D5: Mo

as moscas…

todas estas

ión del relo

ianos por s

su presenci

s,  alterand

presión de l

ación  con 

que  las mu

(Apéndice,

similar  al  q

odelo propuest

… evidencias evidencia

oj circadiano

u efecto so

a afecta di

o  los  patr

os mismos 

el  grupo  d

utantes dar

,  fig.  D).  A

ue  hicimos

to para la acc

as de un ros podríamo

o y el proce

obre PRR7 y

rectamente

rones  de 

al moment

de  Fernand

rt5  (Dart5 e

demás  de 

s  para  Arab

ción de PRMT5

ol conservaos establece

so de splicin

y PRR9. Por 

e el  recono

splicing  alt

o del día, co

da  Ceriani 

es el ortólo

este  fenot

bidopsis  no

5 sobre el pro

ado. er que PRM

ng. Por un l

otro, su ex

ocimiento d

ternativo  d

omo sucede

determinam

ogo de PRM

ipo  circadia

os  permitió

oceso de splici

P á g i

MT5 es una 

ado regular

xpresión es 

e  sitios dad

de  diversos

e con RCA. 

mos  en  Dr

MT5 en Dro

ano,  un  an

  observar 

ing.

n a  | 177 

interfase 

ría varios 

regulada 

dores de 

s  genes, 

rosophila 

osophila) 

nálisis  de 

que  418 

P á g i n a  | 178  

 

intrones se retienen en mayor proporción en la mutante que en la mosca salvaje (30 se 

retienen menos, ver Apéndice, tablas H‐I).  

Es  interesante resaltar el caso de per. Como muestra la figura R42, la abundancia de 

sus isoformas (retenido/procesado, más conocidas como A’ y B) oscila en moscas salvajes 

(WT)  en  condiciones  de  libre  corrida  (a  lo  largo  del  día  subjetivo).  Esto  implica  que  el 

splicing alternativo de dicho evento está controlado por el reloj circadiano. Sin embargo, 

las  oscilaciones  se  ven  completamente  anuladas  en  la mutante  dart5.  En  conclusión, 

PRMT5 regula el splicing alternativo de diferentes genes en Drosophila y en Arabidopsis, 

y ajusta al día las oscilaciones en la abundancia relativa de las isoformas de los mismos 

(ej.: RCA y per).  

Decidimos  entonces  evaluar  si  el  efecto  también  está  relacionado  con  el 

reconocimiento de los 5’ss. Haciendo un análisis similar al llevado a cabo para Arabidopsis 

demostramos que  la situación en Drosophila melanogaster es muy parecida  (fig. R43) y 

que en este sistema también hay una mayor  representación de sitios 5’ss alejados del 

consenso entre los eventos alterados en la mutante dart5. En conclusión, el modelo de 

la figura D5 es aplicable a lo que sucede en Drosophila melanogaster.  

A  pesar  de  estas  similitudes  en  el mecanismo  íntimo  por  el  cual  PRMT5  regula  el 

proceso de splicing,  tenemos evidencias de diferencias en cuanto a su  influencia a nivel 

del reloj circadiano. Por un lado, el mensajero de Dart5/PRMT5 en Drosophila no oscila a 

lo  largo  del  día.  Además  los  efectos  de  la mutante  dart5  sobre  la  expresión  de  genes 

centrales del reloj son leves en Drosophila, mientras que son más marcados para algunos 

genes del reloj de Arabidopsis (Apéndice, fig. E‐F).  

Reuniendo  todas  estas  evidencias  podemos  concluir  que  el  proceso  de  splicing 

alternativo está implicado en el ajuste fino de los relojes biológicos de plantas y animales 

(Arabidopsis  y  Drosophila)  y  que  la  capacidad  de  PRMT5  de  poder  controlar  la 

transcripción  de  los  genes  (modificando  histonas)  y  el  procesamiento  (modificando 

P á g i n a  | 179  

 

Figura D6: esquema simplificado del reloj de Arabidopsis thaliana (A) y Drosophila melanogaster (B).

Las flechas en negro destacan las interacciones entre los componentes del circuito central (ver la figura

I17 en la introducción del capítulo II para entender el contexto). 

proteínas Sm)  la hace una herramienta muy útil para modular estas  respuestas  finas de 

ajuste de los organismos a su entorno. 

La figura D6 esquematiza un modelo propuesto de las funciones de PRMT5 en el reloj 

circadiano de los diferentes organismos y resume un poco las ideas que hemos discutido. 

P á g i n a  | 180  

 

Conclusión general  

Existen  eventos  de  splicing  alternativo  en  Arabidopsis  thaliana  que 

responden  con  cambios  en  la  abundancia  relativa  de  isoformas  a  las 

variaciones en la luz incidente y a la metilación de proteínas. 

Conclusiones (Capítulo I) 

Los eventos de  splicing alternativo presentes en RSp31 y RCA  son  regulados por 

transiciones de luz/oscuridad. 

El efecto es específico, ya que no afecta a otros transcriptos, como los de RSZ33 y 

AtPP5, y es reversible. 

La  reversión del efecto de oscuridad  tiene una  cinética más  veloz en  relación al 

cambio en la abundancia relativa de los mensajeros estudiados. 

El análisis de aproximadamente 100 eventos de splicing alternativo de Arabidopsis 

thaliana  demuestra  que  aproximadamente  el  40  %   de  estos  responde  a  las 

transiciones de luz/oscuridad. También demuestra que el efecto no es pleiotrópico 

e  indiscriminado,  y  que  no  es  consecuencia  del  hambreado  de  azúcares  en  la 

mayoría de los casos. 

El  efecto  de  la  luz  en  el  splicing  alternativo  de  RSp31  es  independiente  de 

fitocromos  y  criptocromos,  y  de  los  integradores  de  las  señales  de  estos 

fotorreceptores,  como  el  factor  de  transcripción  HY5  y  las  proteínas  de  la  vía 

COP/DET/FUS. 

Longitudes de onda distintas como  luz  roja y  luz azul, ambas  fotosintéticamente 

activas,  causan  el mismo  efecto  a  nivel  del  splicing  de  RSp31  y  RCA  que  la  luz 

blanca. 

P á g i n a  | 181  

 

La intensidad de la luz incidente altera los patrones de splicing alternativo de RCA y 

RSp31 de  forma  “dosis‐dependiente”. De manera  similar, a mayor  intensidad de 

luz, mayor abundancia de mensajero total para RCA y menor para RSp31. 

Para que la luz cause un efecto sobre el splicing alternativo de RSp31 es necesario 

el transporte electrónico fotosintético, es decir, un cloroplasto funcional. 

La  señal  generada  en  el  cloroplasto  en  respuesta  a  la  luz  modula  el  splicing 

alternativo de RSp31. Esta  señal es  capaz de  viajar  y  transmitir  la  información a 

tejidos que no poseen cloroplastos activos. 

El agregado exógeno de H2O2 simula el efecto de la luz sobre el procesamiento de 

RSp31.  Sin  embargo,  diferentes  controles  realizados  indicarían  que  éste  es  un 

efecto indirecto. Varios resultados sugieren que es poco probable que una especie 

reactiva  de  oxígeno  (ROS)  esté  involucrada  directamente  en  la  señalización 

retrógrada que modula el splicing de RSp31. 

El  agregado  exógeno  de  sacarosa  simula  el  efecto  de  la  luz  sobre  el  splicing 

alternativo de RSp31. 

La respuesta de RSp31 a las transiciones de luz/oscuridad es independiente de las 

vías de señalización por azúcares que involucran a la hexoquinasa 1 y a KIN10. 

Tratamientos  con  inhibidores  que  actúan  en  distintos  puntos  de  la  cadena  de 

transporte  electrónico  fotosintético  sugieren  que  el  pool  de  plastoquinonas  es 

responsable de la modulación del procesamiento de RSp31 por la  luz. Esto podría 

explicar  otros  tipos  de  señales  como  las  de  estrés  mediadas  por  ROS,  y  las 

energéticas mediadas por azúcares. 

Conclusiones (Capítulo II) 

La  metil‐transferasa  de  proteínas  PRMT5  de  Arabidopsis  thaliana  modula  el 

splicing alternativo de muchos eventos, entre los cuales están los de RSp31 y RCA. 

Si  bien  la mutante  de  Arabidopsis  que  no  tiene  enzima  funcional  (prmt5)  tiene 

respuestas  alteradas  a  la  luz,  no  afecta  la  respuesta  de  RSp31  y  RCA  a  las 

transiciones de luz/oscuridad. 

P á g i n a  | 182  

 

 El efecto de PRMT5 sobre el splicing alternativo es específico de algunos eventos 

de  splicing  como  RSp31  y  RCA,  y  no  de  otros.  Y  también  es  específico  de  esta 

enzima  ya  que  otras metil‐transferasas  (PRMT10  y  PRMT11)  no  provocan  tales 

alteraciones. 

PRMT5 regula la expresión de más de 500 genes en Arabidopsis thaliana. Su efecto 

sería  reprimir  a  la mayoría  (355  genes  aumentan  su  expresión  en  la mutante 

prmt5‐5). 

De más de 60000 intrones analizados, 471 se retienen más en la mutante prmt5‐5. 

PRMT5 modula la expresión de algunos componentes del reloj circadiano. 

El reloj circadiano regula la expresión del mensajero de PRMT5. 

El patrón de splicing alternativo de RCA presenta oscilaciones circadianas. PRMT5 

es necesaria para que se observen estas oscilaciones moduladas por el reloj. 

PRMT5 regula también el splicing alternativo de genes no relacionados con el reloj 

circadiano.  

El mecanismo por el cual PRMT5 regula el splicing alternativo es independiente de 

PRR7 y PRR9.  

Existe  un  enriquecimiento  de  eventos  dadores  de  splicing  alternativo  regulados 

por  PRMT5.  Es  probable  que  su  función  sea  colaborar  en  el  reconocimiento  de 

sitios 5’ dadores de splicing débiles o alejados del consenso. Podría llevar a cabo tal 

función a través de su efecto en  la metilación de  las proteínas Sm, componentes 

del spliceosoma. 

El  rol  de  regulador  del  splicing  alternativo  de  PRMT5  está  conservado  en 

Drosophila melanogaster. También afecta el reloj biológico de la mosca a través de 

este proceso, sin embargo, los efectos no parecen ser a nivel del oscilador central 

en este sistema. 

 

 

 

P á g i n a  | 183  

 

Bibliografía Abdallah, F., F. Salamini y D. Leister (2000). "A prediction of the size and evolutionary origin of the 

proteome of chloroplasts of Arabidopsis." Trends Plant Sci 5(4): 141‐142. Alabadi,  D.,  T.  Oyama, M.  J.  Yanovsky,  F.  G.  Harmon,  P. Mas  y  S.  A.  Kay  (2001).  "Reciprocal 

Regulation Between TOC1 and LHY/CCA1 Within the Arabidopsis Circadian Clock." Science 293(5531): 880‐883. 

Albrecht, U. (2009). The circadian clock. New York, NY, Springer Science+Business Media, LLC. Alló, M., V. Buggiano, J. P. Fededa, E. Petrillo, I. Schor, M. de la Mata, E. Agirre, M. Plass, E. Eyras, 

S. A. Elela, R. Klinck, B. Chabot y A. R. Kornblihtt  (2009).  "Control of alternative  splicing through siRNA‐mediated  transcriptional gene silencing." Nat Struct Mol Biol 16(7): 717‐724. 

Archambault,  J.  y  J.  D.  Friesen  (1993).  "Genetics  of  eukaryotic  RNA  polymerases  I,  II,  and  III." Microbiol Rev 57(3): 703‐724. 

Baena‐Gonzalez,  E.,  F.  Rolland,  J.  M.  Thevelein  y  J.  Sheen  (2007).  "A  central  integrator  of transcription networks in plant stress and energy signalling." Nature 448(7156): 938‐942. 

Balmer, Y., A. Koller, G. del Val, W. Manieri, P. Schurmann y B. B. Buchanan  (2003). "Proteomics gives insight into the regulatory function of chloroplast thioredoxins." Proc Natl Acad Sci U S A 100(1): 370‐375. 

Barak,  S.,  E. M.  Tobin,  C.  Andronis,  S.  Sugano  y  R. M.  Green  (2000).  "All  in  good  time:  the Arabidopsis circadian clock." Trends Plant Sci 5(12): 517‐522. 

Bartsch, S., J. Monnet, K. Selbach, F. Quigley, J. Gray, D. von Wettstein, S. Reinbothe y C. Reinbothe (2008).  "Three  thioredoxin  targets  in  the  inner  envelope  membrane  of  chloroplasts function in protein import and chlorophyll metabolism." Proc Natl Acad Sci U S A 105(12): 4933‐4938. 

Bassham,  J. A., A. A. Benson y M. Calvin  (1950).  "The path of  carbon  in photosynthesis."  J Biol Chem 185(2): 781‐787. 

Batschauer, A. (1999). "Light perception in higher plants." Cell Mol Life Sci 55(2): 153‐166. Bauren,  G.  y  L.  Wieslander  (1994).  "Splicing  of  Balbiani  ring  1  gene  pre‐mRNA  occurs 

simultaneously with transcription." Cell 76(1): 183‐192. Beck, C. F.  (2005). "Signaling pathways from the chloroplast to the nucleus." Planta 222(5): 743‐

756. Bedford,  M.  y  S.  Richard  (2005).  "Arginine  methylation:  An  emerging  regulator  of  protein 

function." Mol. Cell 18: 263‐272. Bedford, M. T. (2007). "Arginine methylation at a glance." J Cell Sci 120(Pt 24): 4243‐4246. Bedford, M. T. y S. G. Clarke  (2009). "Protein arginine methylation  in mammals: who, what, and 

why." Mol Cell 33(1): 1‐13. Berger, S. L. (2007). "The complex language of chromatin regulation during transcription." Nature 

447(7143): 407‐412. Berget, S. M. (1995). "Exon recognition in vertebrate splicing." J Biol Chem 270(6): 2411‐2414. Beyer, A. L. y Y. N. Osheim (1988). "Splice site selection, rate of splicing, and alternative splicing on 

nascent transcripts." Genes Dev 2(6): 754‐765. Black, D. L. (2000). "Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and 

post‐genome biology." Cell 103(3): 367‐370. Black, D. L. (2003). "Mechanisms of alternative pre‐messenger RNA splicing." Annu Rev Biochem 

72: 291‐336. 

P á g i n a  | 184  

 

Boffa, L. C.,  J. Karn, G. Vidali y V. G. Allfrey  (1977). "Distribution of NG, NG,‐dimethylarginine  in nuclear protein fractions." Biochem Biophys Res Commun 74(3): 969‐976. 

Brahms,  H.,  L.  Meheus,  V.  de  Brabandere,  U.  Fischer  y  R.  Luhrmann  (2001).  "Symmetrical dimethylation of arginine residues in spliceosomal Sm protein B/B' and the Sm‐like protein LSm4, and their interaction with the SMN protein." RNA 7(11): 1531‐1542. 

Branscombe, T. L., A. Frankel, J. H. Lee,  J. R. Cook, Z. Yang, S. Pestka y S. Clarke  (2001). "PRMT5 (Janus  kinase‐binding  protein  1)  catalyzes  the  formation  of  symmetric  dimethylarginine residues in proteins." J Biol Chem 276(35): 32971‐32976. 

Brennan, C. M. y J. A. Steitz (2001). "HuR and mRNA stability." Cell Mol Life Sci 58(2): 266‐277. Brett,  D.,  H.  Pospisil,  J.  Valcarcel,  J.  Reich  y  P.  Bork  (2002).  "Alternative  splicing  and  genome 

complexity." Nat Genet 30(1): 29‐30. Cashmore, A. R.,  J. A.  Jarillo, Y.‐J. Wu y D. Liu  (1999). "Cryptochromes: Blue Light Receptors  for 

Plants and Animals." Science 284(5415): 760‐765. Conaway,  J. W.,  A.  Shilatifard,  A. Dvir  y  R.  C.  Conaway  (2000).  "Control  of  elongation  by  RNA 

polymerase II." Trends Biochem Sci 25(8): 375‐380. Consortium,  C.  e.  S.  (1998).  "Genome  sequence  of  the  nematode  C.  elegans:  a  platform  for 

investigating biology." Science 282(5396): 2012‐2018. Cottingham, K. (2008). "Revealing the secrets of histone H3 modification." J Proteome Res 7(10): 

4211. Crick, F. (1970). "Central dogma of molecular biology." Nature 227(5258): 561‐563. Crooks,  G.  E.,  G.  Hon,  J.‐M.  Chandonia  y  S.  E.  Brenner  (2004).  "WebLogo:  A  Sequence  Logo 

Generator." Genome Research 14(6): 1188‐1190. Chain,  R.  K.  (1985).  "Involvement  of  plastoquinone  and  lipids  in  electron  transport  reactions 

mediated by the cytochrome b6‐f complex isolated from spinach." FEBS Lett 180(2): 321‐325. 

Cheng,  Y.,  B.  Gvakharia  y  P.  E.  Hardin  (1998).  "Two  Alternatively  Spliced  Transcripts  from  the Drosophila  period  Gene  Rescue  Rhythms  Having  Different  Molecular  and  Behavioral Characteristics." Molecular and Cellular Biology 18(11): 6505‐6514. 

Das, R., J. Yu, Z. Zhang, M. P. Gygi, A. R. Krainer, S. P. Gygi y R. Reed (2007). "SR proteins function in coupling RNAP II transcription to pre‐mRNA splicing." Mol Cell 26(6): 867‐881. 

de  la Mata, M., C. R. Alonso, S. Kadener,  J. P. Fededa, M. a. Blaustein, F. Pelisch, P. Cramer, D. Bentley y A. R. Kornblihtt (2003). "A Slow RNA Polymerase II Affects Alternative Splicing In Vivo." Molecular Cell 12(2): 525‐532. 

de  la Mata, M.,  C.  Lafaille  y A.  R.  Kornblihtt  (2010).  "First  come,  first  served  revisited:  factors affecting the same alternative splicing event have different effects on the relative rates of intron removal." RNA 16(5): 904‐912. 

de Mairan, J. J. d. O. (1729). "Observation botanique." Histoire de lAcademie Royale des Sciences: 35‐36. 

Deng, X., L. Gu, C. Liu, T. Lu, F. Lu, Z. Lu, P. Cui, Y. Pei, B. Wang, S. Hu y X. Cao (2010). "Arginine methylation mediated by the Arabidopsis homolog of PRMT5  is essential for proper pre‐mRNA splicing." Proc Natl Acad Sci U S A 107(44): 19114‐19119. 

Dohmann,  E.  M.,  M.  P.  Levesque,  E.  Isono,  M.  Schmid  y  C.  Schwechheimer  (2008).  "Auxin responses  in  mutants  of  the  Arabidopsis  CONSTITUTIVE  PHOTOMORPHOGENIC9 signalosome." Plant Physiol 147(3): 1369‐1379. 

Donahue,  J.  L., C. M. Okpodu, C.  L. Cramer, E. A. Grabau y R. G. Alscher  (1997).  "Responses of Antioxidants  to  Paraquat  in  Pea  Leaves  (Relationships  to  Resistance)."  Plant  Physiol 113(1): 249‐257. 

P á g i n a  | 185  

 

Edwards, K. D., P. E. Anderson, A. Hall, N. S. Salathia, J. C. Locke, J. R. Lynn, M. Straume, J. Q. Smith y  A.  J.  Millar  (2006).  "FLOWERING  LOCUS  C  mediates  natural  variation  in  the  high‐temperature response of the Arabidopsis circadian clock." Plant Cell 18(3): 639‐650. 

Ermakova, E. O., R. N. Nurtdinov y M. S. Gelfand  (2006).  "Fast  rate of evolution  in alternatively spliced coding regions of mammalian genes." BMC Genomics 7: 84. 

Farré,  E. M.,  S.  L. Harmer,  F. G. Harmon, M.  J.  Yanovsky  y  S. A.  Kay  (2005).  "Overlapping  and Distinct Roles of PRR7 and PRR9 in the Arabidopsis Circadian Clock." Current Biology 15(1): 47‐54. 

Fededa, J. P. y A. R. Kornblihtt (2008). "A splicing regulator promotes transcriptional elongation." Nat Struct Mol Biol 15(8): 779‐781. 

Fededa,  J.  P.,  E.  Petrillo, M.  S. Gelfand, A. D. Neverov,  S.  Kadener, G. Nogues,  F.  Pelisch,  F.  E. Baralle, A.  F. Muro  y A. R. Kornblihtt  (2005).  "A polar mechanism  coordinates different regions of alternative splicing within a single gene." Mol Cell 19(3): 393‐404. 

Fey, V., R. Wagner, K. Brautigam, M. Wirtz, R. Hell, A. Dietzmann, D.  Leister, R. Oelmuller  y  T. Pfannschmidt (2005). "Retrograde plastid redox signals in the expression of nuclear genes for chloroplast proteins of Arabidopsis thaliana." J Biol Chem 280(7): 5318‐5328. 

Filichkin, S. A., H. D. Priest, S. A. Givan, R. Shen, D. W. Bryant, S. E. Fox, W. K. Wong y T. C. Mockler (2010). "Genome‐wide mapping of alternative splicing  in Arabidopsis  thaliana." Genome Res 20(1): 45‐58. 

Flaus, A. y T. Owen‐Hughes (2001). "Mechanisms for ATP‐dependent chromatin remodelling." Curr Opin Genet Dev 11(2): 148‐154. 

Friesen, W., S. Paushkin, A. Wyce, S. Massenet, G. Pesiridis, G. Van Duyne, J. Rappsilber, M. Mann y  G.  Dreyfuss  (2001).  "The Methylosome,  a  20S  Complex  Containing  JBP1  and  pICln, Produces  Dimethylarginine‐Modified  Sm  Proteins." Molecular  and  Cellular  Biology  21: 8289–8300. 

Fujiki, Y., M. Ito, I. Nishida y A. Watanabe (2000). "Multiple signaling pathways in gene expression during  sugar  starvation. Pharmacological  analysis of din  gene  expression  in  suspension‐cultured cells of Arabidopsis." Plant Physiol 124(3): 1139‐1148. 

Gautheret, D., O. Poirot, F. Lopez, S. Audic y J. M. Claverie  (1998). "Alternate polyadenylation  in human mRNAs: a large‐scale analysis by EST clustering." Genome Res 8(5): 524‐530. 

Goff, S. A., et al.  (2002).  "A draft  sequence of  the  rice genome  (Oryza  sativa  L.  ssp.  japonica)." Science 296(5565): 92‐100. 

Goldberg, I. H., M. Rabinowitz y E. Reich (1962). "Basis of actinomycin action. I. DNA binding and inhibition of RNA‐polymerase synthetic reactions by actinomycin." Proc Natl Acad Sci U S A 48: 2094‐2101. 

Goldberg,  I.  H.,  M.  Rabinowitz  y  E.  Reich  (1963).  "Basis  of  actinomycin  action.  II.  Effect  of actinomycin  on  the  nucleoside  triphosphate‐inorganic  pyrophosphate  exchange."  Proc Natl Acad Sci U S A 49: 226‐229. 

Gonsalvez, G., T. Rajendra, L. Tian y A. Matera (2006). "The Sm‐Protein methyltransferase, Dart5, is essential for germ‐cell specification and maintenance." Current Biology 16: 1077‐1089. 

Gonsalvez, G. B., K. Praveen, A. J. Hicks, L. Tian y A. G. Matera (2008). "Sm protein methylation is dispensable for snRNP assembly in Drosophila melanogaster." RNA 14(5): 878‐887. 

Gonsalvez, G. B., L. Tian,  J. K. Ospina, F.‐M. Boisvert, A.  I. Lamond y A. G. Matera  (2007).  "Two distinct  arginine  methyltransferases  are  required  for  biogenesis  of  Sm‐class ribonucleoproteins." Journal of Cell Biology 178(5): 733‐740. 

Gornemann, J., K. M. Kotovic, K. Hujer y K. M. Neugebauer (2005). "Cotranscriptional spliceosome assembly occurs  in a  stepwise  fashion and  requires  the  cap binding  complex." Mol Cell 19(1): 53‐63. 

P á g i n a  | 186  

 

Graveley, B. R.  (2001). "Alternative splicing:  increasing diversity  in the proteomic world." Trends Genet 17(2): 100‐107. 

Green, R. M. y E. M. Tobin (2002). "The role of CCA1 and LHY in the plant circadian clock." Dev Cell 2(5): 516‐518. 

Guhaniyogi, J. y G. Brewer (2001). "Regulation of mRNA stability in mammalian cells." Gene 265(1‐2): 11‐23. 

Gyula, P., E. Schafer y F. Nagy (2003). "Light perception and signalling in higher plants." Curr Opin Plant Biol 6(5): 446‐452. 

Hardin, P. E. (2005). "The circadian timekeeping system of Drosophila." Curr Biol 15(17): R714‐722. Hardin, P. E., J. C. Hall y M. Rosbash (1990). "Feedback of the Drosophila period gene product on 

circadian cycling of its messenger RNA levels." Nature 343(6258): 536‐540. Hou,  J.,  L.  Liu,  J.  Zhang, X. H. Cui,  F. X. Yan, H. Guan, Y.  F. Chen  y X. R. An  (2008).  "Epigenetic 

modification  of  histone  3  at  lysine  9  in  sheep  zygotes  and  its  relationship  with  DNA methylation." BMC Dev Biol 8: 60. 

House, A. E. y K. W. Lynch (2008). "Regulation of alternative splicing: more than just the ABCs." J Biol Chem 283(3): 1217‐1221. 

Houtz, R. L. y A. R. Portis, Jr. (2003). "The life of ribulose 1,5‐bisphosphate carboxylase/oxygenase‐‐posttranslational facts and mysteries." Arch Biochem Biophys 414(2): 150‐158. 

Huang, Y., C. Y. Li, D. L. Pattison, W. M. Gray, S. Park y S. I. Gibson (2010). "SUGAR‐INSENSITIVE3, a RING E3 ligase, is a new player in plant sugar response." Plant Physiol 152(4): 1889‐1900. 

Illerhaus,  J.,  L. Altschmied,  J.  Reichert,  E.  Zak,  R. G. Herrmann  y W. Haehnel  (2000).  "Dynamic interaction of plastocyanin with the cytochrome bf complex." J Biol Chem 275(23): 17590‐17595. 

Ingvarsdottir, K., C. Edwards, M. G. Lee, J. S. Lee, D. C. Schultz, A. Shilatifard, R. Shiekhattar y S. L. Berger  (2007). "Histone H3 K4 demethylation during activation and attenuation of GAL1 transcription in Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 27(22): 7856‐7864. 

Jarvis, P. (2007). "Intracellular signalling: chloroplast backchat." Curr Biol 17(14): R552‐555. Jeong, S. W., P. K. Das, S. C. Jeoung, J. Y. Song, H. K. Lee, Y. K. Kim, W. J. Kim, Y. I. Park, S. D. Yoo, S. 

B.  Choi  y  G.  Choi  (2010).  "Ethylene  suppression  of  sugar‐induced  anthocyanin pigmentation in Arabidopsis." Plant Physiol 154(3): 1514‐1531. 

Jiao, Y., O. S. Lau y X. W. Deng (2007). "Light‐regulated transcriptional networks in higher plants." Nat Rev Genet 8(3): 217‐230. 

Johnson,  C.  N.,  N.  L.  Adkins  y  P.  Georgel  (2005).  "Chromatin  remodeling  complexes:  ATP‐dependent machines in action." Biochem Cell Biol 83(4): 405‐417. 

Jolma,  I. W., O. D. Laerum, C. Lillo y P. Ruoff  (2010). "Circadian oscillators  in eukaryotes." Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med 2(5): 533‐549. 

Karpinski, S., H. Reynolds, B. Karpinska, G. Wingsle, G. Creissen y P. Mullineaux (1999). "Systemic signaling and acclimation in response to excess excitation energy in Arabidopsis." Science 284(5414): 654‐657. 

Kim,  E., A. Magen  y G.  Ast  (2007).  "Different  levels  of  alternative  splicing  among  eukaryotes." Nucleic Acids Res 35(1): 125‐131. 

Kim, S. H., O. A. Koroleva, D. Lewandowska, A. F. Pendle, G. P. Clark, C. G. Simpson, P. J. Shaw y J. W. Brown (2009). "Aberrant mRNA transcripts and the nonsense‐mediated decay proteins UPF2 and UPF3 are enriched in the Arabidopsis nucleolus." Plant Cell 21(7): 2045‐2057. 

Kircher, S., P. Gil, L. Kozma‐Bognar, E. Fejes, V. Speth, T. Husselstein‐Muller, D. Bauer, E. Adam, E. Schafer  y  F.  Nagy  (2002).  "Nucleocytoplasmic  Partitioning  of  the  Plant  Photoreceptors Phytochrome A, B, C, D, and E  Is Regulated Differentially by Light and Exhibits a Diurnal Rhythm." Plant Cell 14(7): 1541‐1555. 

P á g i n a  | 187  

 

Kiss, T. (2004). "Biogenesis of small nuclear RNPs." J Cell Sci 117(Pt 25): 5949‐5951. Koren, E., G. Lev‐Maor y G. Ast (2007). "The emergence of alternative 3' and 5' splice site exons 

from constitutive exons." PLoS Comput Biol 3(5): e95. Kornblihtt, A. R. (2007). "Coupling transcription and alternative splicing." Adv Exp Med Biol 623: 

175‐189. Kornblihtt, A. R., I. E. Schor, M. Allo y B. J. Blencowe (2009). "When chromatin meets splicing." Nat 

Struct Mol Biol 16(9): 902‐903. Koussevitzky, S., A. Nott, T. C. Mockler, F. Hong, G. Sachetto‐Martins, M. Surpin, J. Lim, R. Mittler y 

J. Chory (2007). "Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression." Science 316(5825): 715‐719. 

Laloi,  C., M.  Stachowiak,  E.  Pers‐Kamczyc,  E. Warzych,  I. Murgia  y  K.  Apel  (2007).  "Cross‐talk between singlet oxygen‐ and hydrogen peroxide‐dependent signaling of stress responses in Arabidopsis thaliana." Proc Natl Acad Sci U S A 104(2): 672‐677. 

Lamond, A.  I. y D. L. Spector (2003). "Nuclear speckles: a model for nuclear organelles." Nat Rev Mol Cell Biol 4(8): 605‐612. 

Lander,  E.  S.,  et  al.  (2001).  "Initial  sequencing  and  analysis  of  the  human  genome."  Nature 409(6822): 860‐921. 

Larkin, R. M., J. M. Alonso, J. R. Ecker y J. Chory (2003). "GUN4, a regulator of chlorophyll synthesis and intracellular signaling." Science 299(5608): 902‐906. 

Lazarev,  D.  y  J.  L. Manley  (2007).  "Concurrent  splicing  and  transcription  are  not  sufficient  to enhance splicing efficiency." RNA 13(9): 1546‐1557. 

Lee,  D.  Y.,  C.  Teyssier,  B.  D.  Strahl  y M.  R.  Stallcup  (2005).  "Role  of  protein  methylation  in regulation of transcription." Endocr Rev 26(2): 147‐170. 

Lee,  Y.  H.  y  M.  R.  Stallcup  (2009).  "Minireview:  protein  arginine  methylation  of  nonhistone proteins in transcriptional regulation." Mol Endocrinol 23(4): 425‐433. 

Lemaire, S. D., L. Michelet, M. Zaffagnini, V. Massot y E. Issakidis‐Bourguet (2007). "Thioredoxins in chloroplasts." Curr Genet 51(6): 343‐365. 

Lin, C. y D. Shalitin (2003). "Cryptochrome structure and signal transduction." Annu Rev Plant Biol 54: 469‐496. 

Listerman, I., A. K. Sapra y K. M. Neugebauer (2006). "Cotranscriptional coupling of splicing factor recruitment and precursor messenger RNA splicing  in mammalian cells." Nat Struct Mol Biol 13(9): 815‐822. 

Liu, C., F. Lu, X. Cui y X. Cao (2010). "Histone methylation in higher plants." Annu Rev Plant Biol 61: 395‐420. 

Majercak, J., W. Chen y I. Edery (2004). "Splicing of the period gene 3' ‐terminal intron is regulated by light, circadian clock factors, and Phospholipase C." Molecular and Cellular Biology 24: 3359–3372. 

Maniatis,  T.  y  B.  Tasic  (2002).  "Alternative  pre‐mRNA  splicing  and  proteome  expansion  in metazoans." Nature 418(6894): 236‐243. 

Maquat,  L.  E.  (2004).  "Nonsense‐mediated  mRNA  decay:  splicing,  translation  and  mRNP dynamics." Nat Rev Mol Cell Biol 5(2): 89‐99. 

Margulis,  L.  (1975).  "Symbiotic  theory of  the origin of eukaryotic organelles;  criteria  for proof." Symp Soc Exp Biol(29): 21‐38. 

Margulis, L. y D. Bermudes (1985). "Symbiosis as a mechanism of evolution: status of cell symbiosis theory." Symbiosis 1: 101‐124. 

Matsushika, A., A.  Imamura, T. Yamashino y T. Mizuno (2002). "Aberrant expression of the  light‐inducible  and  circadian‐regulated  APRR9  gene  belonging  to  the  circadian‐associated 

P á g i n a  | 188  

 

APRR1/TOC1 quintet results  in the phenotype of early flowering in Arabidopsis thaliana." Plant Cell Physiol 43(8): 833‐843. 

Mazzella,  M.  A.,  P.  D.  Cerdan,  R.  J.  Staneloni  y  J.  J.  Casal  (2001).  "Hierarchical  coupling  of phytochromes and cryptochromes reconciles stability and light modulation of Arabidopsis development." Development 128(12): 2291‐2299. 

McClung, C. R. (2006). "Plant circadian rhythms." Plant Cell 18(4): 792‐803. McGlincy, N.  J. y C. W. Smith (2008). "Alternative splicing resulting  in nonsense‐mediated mRNA 

decay: what is the meaning of nonsense?" Trends Biochem Sci 33(8): 385‐393. McGlincy,  N.  J.,  L.  Y.  Tan,  N.  Paul, M.  Zavolan,  K.  S.  Lilley  y  C. W.  Smith  (2010).  "Expression 

proteomics  of  UPF1  knockdown  in  HeLa  cells  reveals  autoregulation  of  hnRNP  A2/B1 mediated  by  alternative  splicing  resulting  in  nonsense‐mediated  mRNA  decay."  BMC Genomics 11: 565. 

Meister, G., C. Eggert, D. Buhler, H. Brahms, C. Kambach y U. Fischer (2001). "Methylation of Sm proteins by a complex containing PRMT5 and the putative U snRNP assembly factor pICln." Curr Biol 11(24): 1990‐1994. 

Meyer,  S., C.  Lauterbach, M. Niedermeier,  I. Barth, R. D. Sjolund y N.  Sauer  (2004).  "Wounding enhances expression of AtSUC3,  a  sucrose  transporter  from Arabidopsis  sieve elements and sink tissues." Plant Physiol 134(2): 684‐693. 

Meyer, Y., B. B. Buchanan,  F. Vignols  y  J. P. Reichheld  (2009).  "Thioredoxins and glutaredoxins: unifying elements in redox biology." Annu Rev Genet 43: 335‐367. 

Michael,  T.  P., G.  Breton,  S.  P. Hazen, H.  Priest,  T.  C. Mockler,  S. A.  Kay  y  J.  Chory  (2008).  "A Morning‐Specific  Phytohormone  Gene  Expression  Program  underlying  Rhythmic  Plant Growth." PLoS Biol 6(9): e225. 

Millar, A.  J.,  I. A. Carre, C. A. Strayer, N. H. Chua y S. A. Kay  (1995). "Circadian clock mutants  in Arabidopsis identified by luciferase imaging." Science 267(5201): 1161‐1163. 

Millar, A. J., S. R. Short, N.‐H. Chua y S. A. Kay (1992). "A novel circadian phenotype based on firefly luciferase expression in transgenic plants." Plant Cell 4: 1075‐1087. 

Misteli,  T.  y  D.  L.  Spector  (1999).  "RNA  polymerase  II  targets  pre‐mRNA  splicing  factors  to transcription sites in vivo." Mol Cell 3(6): 697‐705. 

Mochizuki,  N.,  J.  A.  Brusslan,  R.  Larkin,  A.  Nagatani  y  J.  Chory  (2001).  "Arabidopsis  genomes uncoupled 5 (GUN5) mutant reveals the involvement of Mg‐chelatase H subunit in plastid‐to‐nucleus signal transduction." Proc Natl Acad Sci U S A 98(4): 2053‐2058. 

Moore, B., L. Zhou, F. Rolland, Q. Hall, W. H. Cheng, Y. X. Liu, I. Hwang, T. Jones y J. Sheen (2003). "Role of the Arabidopsis glucose sensor HXK1  in nutrient,  light, and hormonal signaling." Science 300(5617): 332‐336. 

Nakamichi, N.,  T.  Kiba,  R. Henriques,  T. Mizuno, N. H.  Chua  y H.  Sakakibara  (2010).  "PSEUDO‐RESPONSE  REGULATORS  9,  7,  and  5  are  transcriptional  repressors  in  the  Arabidopsis circadian clock." Plant Cell 22(3): 594‐605. 

Nakamoto, R. K., J. A. Baylis Scanlon y M. K. Al‐Shawi (2008). "The rotary mechanism of the ATP synthase." Arch Biochem Biophys 476(1): 43‐50. 

Narlikar, G.  J., H. Y. Fan y R. E. Kingston  (2002). "Cooperation between complexes  that  regulate chromatin structure and transcription." Cell 108(4): 475‐487. 

Neill, S., R. Desikan y J. Hancock (2002). "Hydrogen peroxide signalling." Curr Opin Plant Biol 5(5): 388‐395. 

Neill, S. J., R. Desikan, A. Clarke, R. D. Hurst y J. T. Hancock (2002). "Hydrogen peroxide and nitric oxide as signalling molecules in plants." J Exp Bot 53(372): 1237‐1247. 

Ner‐Gaon,  H.  y  R.  Fluhr  (2006).  "Whole‐genome  microarray  in  Arabidopsis  facilitates  global analysis of retained introns." DNA Research 13: 111‐121. 

P á g i n a  | 189  

 

Niu, L., F. Lu, Y. Pei, C. Liu y X. Cao (2007). "Regulation of flowering time by the protein arginine methyltransferase AtPRMT10." EMBO Rep 8(12): 1190‐1195. 

Niu,  L., Y. Zhang, Y. Pei, C.  Liu y X. Cao  (2008).  "Redundant Requirement  for a Pair of PROTEIN ARGININE  METHYLTRANSFERASE4  Homologs  for  the  Proper  Regulation  of  Arabidopsis Flowering Time." Plant Physiol. 148(1): 490‐503. 

Noctor,  G.,  S.  Veljovic‐Jovanovic  y  C.  H.  Foyer  (2000).  "Peroxide  processing  in  photosynthesis: antioxidant coupling and redox signalling." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 355(1402): 1465‐1475. 

Nott, A., H.  S.  Jung,  S. Koussevitzky  y  J. Chory  (2006).  "Plastid‐to‐nucleus  retrograde  signaling." Annu Rev Plant Biol 57: 739‐759. 

Onodera, Y., J. R. Haag, T. Ream, P. C. Nunes, O. Pontes y C. S. Pikaard (2005). "Plant nuclear RNA polymerase  IV  mediates  siRNA  and  DNA  methylation‐dependent  heterochromatin formation." Cell 120(5): 613‐622. 

Oosawa,  N.,  T.  Masuda,  K.  Awai,  N.  Fusada,  H.  Shimada,  H.  Ohta  y  K.  Takamiya  (2000). "Identification and light‐induced expression of a novel gene of NADPH‐protochlorophyllide oxidoreductase isoform in Arabidopsis thaliana." FEBS Lett 474(2‐3): 133‐136. 

Orozco‐Cardenas, M. y C. A. Ryan  (1999). "Hydrogen peroxide  is generated systemically  in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway." Proc Natl Acad Sci U S A 96(11): 6553‐6557. 

Orozco‐Cardenas, M.  L.,  J. Narvaez‐Vasquez  y  C. A.  Ryan  (2001).  "Hydrogen  peroxide  acts  as  a second messenger  for  the  induction  of  defense  genes  in  tomato  plants  in  response  to wounding, systemin, and methyl jasmonate." Plant Cell 13(1): 179‐191. 

Orphanides, G. y D. Reinberg (2000). "RNA polymerase  II elongation through chromatin." Nature 407(6803): 471‐475. 

Palusa,  S. G., G.  S. Ali  y  A.  S.  Reddy  (2007).  "Alternative  splicing  of  pre‐mRNAs  of Arabidopsis serine/arginine‐rich proteins: regulation by hormones and stresses." Plant  J 49(6): 1091‐1107. 

Pei,  Y.,  L. Niu,  F.  Lu,  C.  Liu,  J.  Zhai,  X.  Kong  y  X.  Cao  (2007).  "Mutations  in  the  type  II  protein arginine  methyltransferase  AtPRMT5  result  in  pleiotropic  developmental  defects  in Arabidopsis." Plant Physiology 44: 1913‐1923. 

Pellizzoni, L., J. Yong y G. Dreyfuss (2002). "Essential role for the SMN complex in the specificity of snRNP assembly." Science 298(5599): 1775‐1779. 

Pesaresi, P., A. Schneider, T. Kleine y D. Leister (2007). "Interorganellar communication." Curr Opin Plant Biol 10(6): 600‐606. 

Phatnani, H. P. y A. L. Greenleaf (2006). "Phosphorylation and functions of the RNA polymerase II CTD." Genes Dev 20(21): 2922‐2936. 

Piippo, M., Y. Allahverdiyeva, V. Paakkarinen, U. M. Suoranta, N. Battchikova y E. M. Aro (2006). "Chloroplast‐mediated regulation of nuclear genes  in Arabidopsis thaliana  in the absence of light stress." Physiol Genomics 25(1): 142‐152. 

Pittendrigh, C. S. (1993). "Temporal organization: reflections of a Darwinian clock‐watcher." Annu Rev Physiol 55: 16‐54. 

Pogson,  B.  J., N.  S. Woo,  B.  Forster  y  I. D.  Small  (2008).  "Plastid  signalling  to  the  nucleus  and beyond." Trends Plant Sci 13(11): 602‐609. 

Pomeranz Krummel, D. A., C. Oubridge, A. K. Leung,  J. Li y K. Nagai  (2009). "Crystal structure of human spliceosomal U1 snRNP at 5.5 A resolution." Nature 458(7237): 475‐480. 

Portis,  A.  R.,  Jr.  y  M.  A.  Parry  (2007).  "Discoveries  in  Rubisco  (Ribulose  1,5‐bisphosphate carboxylase/oxygenase): a historical perspective." Photosynth Res 94(1): 121‐143. 

P á g i n a  | 190  

 

Portis  Jr, A. R. y M. E. Salvucci  (2002). "The discovery of Rubisco activase  ‐ yet another story of serendipity." Photosynth Res 73(1‐3): 257‐264. 

Puthiyaveetil, S., T. A. Kavanagh, P. Cain, J. A. Sullivan, C. A. Newell, J. C. Gray, C. Robinson, M. van der Giezen, M. B. Rogers y  J. F. Allen  (2008). "The ancestral symbiont sensor kinase CSK links  photosynthesis  with  gene  expression  in  chloroplasts."  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A 105(29): 10061‐10066. 

Quelle, D. E., F. Zindy, R. A. Ashmun y C. J. Sherr (1995). "Alternative reading frames of the INK4a tumor  suppressor  gene  encode  two  unrelated  proteins  capable  of  inducing  cell  cycle arrest." Cell 83(6): 993‐1000. 

Rolland, F., E. Baena‐Gonzalez y J. Sheen (2006). "Sugar sensing and signaling in plants: conserved and novel mechanisms." Annu Rev Plant Biol 57: 675‐709. 

Rolland, F., B. Moore y J. Sheen (2002). "Sugar sensing and signaling in plants." Plant Cell 14 Suppl: S185‐205. 

Ross, J. (1995). "mRNA stability in mammalian cells." Microbiol Rev 59(3): 423‐450. Scarpeci,  T.  y  E.  Valle  (2008).  "Rearrangement  of  carbon  metabolism  in  Arabidopsis  thaliana 

subjected  to  oxidative  stress  condition:  an  emergency  survival  strategy."  Plant Growth Regulation 54(2). 

Scebba, F., M. D. Bastiani, G. Bernacchia, A. Andreucci, A. Galli y L. Pitto (2007). "PRMT11: a new Arabidopsis MBD7  protein  partner with  arginine methyltransferase  activity."  The  Plant Journal 52(2): 210‐222. 

Scorilas,  A., M.  H.  Black, M.  Talieri  y  E.  P.  Diamandis  (2000).  "Genomic  organization,  physical mapping,  and  expression  analysis  of  the  human  protein  arginine  methyltransferase  1 gene." Biochem Biophys Res Commun 278(2): 349‐359. 

Schmitz,  R.,  S.  Sung  y  R.  Amasino  (2008).  "Histone  arginine  methylation  is  required  for vernalization‐induced epigenetic  silencing of  FLC  in winter‐annual Arabidopsis  thaliana." Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 411‐416. 

Schneider, R., A. J. Bannister, F. A. Myers, A. W. Thorne, C. Crane‐Robinson y T. Kouzarides (2004). "Histone H3 lysine 4 methylation patterns  in higher eukaryotic genes." Nat Cell Biol 6(1): 73‐77. 

Schoning, J. C. y D. Staiger (2005). "At the pulse of time: protein interactions determine the pace of circadian clocks." FEBS Lett 579(15): 3246‐3252. 

Schor,  I. E., M. Allo y A. R. Kornblihtt (2010). "Intragenic chromatin modifications: A new  layer  in alternative splicing regulation." Epigenetics 5(3). 

Schor, I. E. y A. R. Kornblihtt (2009). "Playing inside the genes: Intragenic histone acetylation after membrane depolarization of neural cells opens a path for alternative splicing regulation." Commun Integr Biol 2(4): 341‐343. 

Schor, I. E., N. Rascovan, F. Pelisch, M. Alló y A. R. Kornblihtt (2009). "Neuronal cell depolarization induces  intragenic  chromatin  modifications  affecting  NCAM  alternative  splicing." Proceedings of the National Academy of Sciences 106(11): 4325‐4330. 

Schwechheimer,  C.  y  X. W.  Deng  (2000).  "The  COP/DET/FUS  proteins‐regulators  of  uekaryotic growth and develpment." Seminars in Cell & Develpmental Biology 11: 495‐503. 

Seo, J. y K. J. Lee (2004). "Post‐translational modifications and their biological functions: proteomic analysis and systematic approaches." J Biochem Mol Biol 37(1): 35‐44. 

Sheth,  N.,  X.  Roca,  M.  L.  Hastings,  T.  Roeder,  A.  R.  Krainer  y  R.  Sachidanandam  (2006). "Comprehensive splice‐site analysis using comparative genomics." Nucl. Acids Res. 34(14): 3955‐3967. 

Shyu, A. B., M. F. Wilkinson y A. van Hoof (2008). "Messenger RNA regulation: to translate or to degrade." EMBO J 27(3): 471‐481. 

P á g i n a  | 191  

 

Simpson,  C.  G.,  G.  P.  Clark,  J.  M.  Lyon,  J.  Watters,  C.  McQuade  y  J.  W.  S.  Brown  (1999). "Interactions between  introns via exon definition  in plant pre‐mRNA splicing." The Plant Journal 18(3): 293‐302. 

Simpson, C. G.,  J.  Fuller, M. Maronova, M.  Kalyna, D. Davidson,  J. McNicol, A. Barta  y  J. W.  S. Brown  (2008).  "Monitoring  changes  in  alternative  precursor messenger  RNA  splicing  in multiple gene transcripts." The Plant Journal 53(6): 1035‐1048. 

Sims, R. J., 3rd, R. Belotserkovskaya y D. Reinberg (2004). "Elongation by RNA polymerase  II: the short and long of it." Genes Dev 18(20): 2437‐2468. 

Sineshchekov,  V.  y  C.  Fankhauser  (2004).  "PKS1  and  PKS2  affect  the  phyA  state  in  etiolated Arabidopsis seedlings." Photochem Photobiol Sci 3(6): 608‐611. 

Smirnoff, N., P. L. Conklin y F. A. Loewus (2001). "BIOSYNTHESIS OF ASCORBIC ACID IN PLANTS: A Renaissance." Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52: 437‐467. 

Smirnoff, N. y G. L. Wheeler (2000). "Ascorbic acid  in plants: biosynthesis and function." Crit Rev Biochem Mol Biol 35(4): 291‐314. 

Strasser,  B., M.  Sanchez‐Lamas, M.  J.  Yanovsky,  J.  J.  Casal  y  P. D.  Cerdan  (2010).  "Arabidopsis thaliana life without phytochromes." Proc Natl Acad Sci U S A 107(10): 4776‐4781. 

Sullivan,  J. A.  y  J.  C. Gray  (1999).  "Plastid  translation  is  required  for  the  expression  of  nuclear photosynthesis genes  in  the dark and  in  roots of  the pea  lip1 mutant." Plant Cell 11(5): 901‐910. 

Surpin, M., R. M. Larkin y  J. Chory  (2002). "Signal transduction between  the chloroplast and the nucleus." Plant Cell 14 Suppl: S327‐338. 

Tognetti, V. B.,  J.  F.  Palatnik, M.  F.  Fillat, M. Melzer, M. R. Hajirezaei,  E. M. Valle  y N.  Carrillo (2006). "Functional  replacement of  ferredoxin by a cyanobacterial  flavodoxin  in  tobacco confers broad‐range stress tolerance." Plant Cell 18(8): 2035‐2050. 

Tognetti, V. B., M. D.  Zurbriggen,  E. N. Morandi, M.  F.  Fillat,  E. M. Valle, M. R. Hajirezaei  y N. Carrillo (2007). "Enhanced plant tolerance to  iron starvation by functional substitution of chloroplast  ferredoxin with  a  bacterial  flavodoxin."  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  104(27): 11495‐11500. 

Tusher, V. G., R. Tibshirani y G. Chu  (2001).  "Significance analysis of microarrays applied  to  the ionizing  radiation  response."  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the United States of America 98(9): 5116‐5121. 

Walters,  R.  G.  (2005).  "Towards  an  understanding  of  photosynthetic  acclimation."  J  Exp  Bot 56(411): 435‐447. 

Wang, X., W.  Li, R. Piqueras, K. Cao, X. W. Deng  y N. Wei  (2009).  "Regulation of COP1 nuclear localization by the COP9 signalosome via direct interaction with CSN1." Plant J 58(4): 655‐667. 

Wang, X., Y. Zhang, Q. Ma, Z. Zhang, Y. Zue, S. Bao y K. Chong (2007). "SKB1‐mediated symmetric dimethylation of histone H4R3 controls flowering time in Arabidopsis." EMBO Journal 26: 1934‐1941. 

Waterston,  R.  H.,  et  al.  (2002).  "Initial  sequencing  and  comparative  analysis  of  the  mouse genome." Nature 420(6915): 520‐562. 

Wong, J. H., N. Cai, Y. Balmer, C. K. Tanaka, W. H. Vensel, W. J. Hurkman y B. B. Buchanan (2004). "Thioredoxin  targets of developing wheat seeds  identified by complementary proteomic approaches." Phytochemistry 65(11): 1629‐1640. 

Wysocka,  J.,  C.  D.  Allis  y  S.  Coonrod  (2006).  "Histone  arginine  methylation  and  its  dynamic regulation." Front Biosci 11: 344‐355. 

Xing,  Y.  y  C.  Lee  (2007).  "Relating  alternative  splicing  to  proteome  complexity  and  genome evolution." Adv Exp Med Biol 623: 36‐49. 

P á g i n a  | 192  

 

Xing,  Y.  y C.  J.  Lee  (2005).  "Protein modularity of  alternatively  spliced  exons  is  associated with tissue‐specific regulation of alternative splicing." PLoS Genet 1(3): e34. 

Yang, M., J. Sun, X. Sun, Q. Shen, Z. Gao y C. Yang (2009). "Caenorhabditis elegans Protein Arginine Methyltransferase  PRMT‐5 Negatively  Regulates DNA Damage‐Induced Apoptosis."  Plos Genetics 5: e1000514. 

Yanhui,  C.,  et  al.  (2006).  "The MYB  transcription  factor  superfamily  of  Arabidopsis:  expression analysis  and  phylogenetic  comparison with  the  rice MYB  family."  Plant Mol  Biol  60(1): 107‐124. 

Yeh,  K.  C.  y  J.  C.  Lagarias  (1998).  "Eukaryotic  phytochromes:  light‐regulated  serine/threonine protein kinases with histidine kinase ancestry." Proc Natl Acad Sci U S A 95(23): 13976‐13981. 

Yu,  J., et al.  (2002). "A draft sequence of  the  rice genome  (Oryza sativa  L. ssp.  indica)." Science 296(5565): 79‐92. 

Zentilin,  L.  y M.  Giacca  (2007).  "Competitive  PCR  for  precise  nucleic  acid  quantification."  Nat Protoc 2(9): 2092‐2104. 

Zentilin, L. y M. Giacca (2010). "The renaissance of competitive PCR as an accurate tool for precise nucleic acid quantification." Methods Mol Biol 630: 233‐248. 

Zhang,  D.,  N.  Abovich  y  M.  Rosbash  (2001).  "A  Biochemical  Function  for  the  Sm  Complex." Molecular Cell 7(2): 319‐329. 

Zhang,  X.,  J.  Byrnes,  T.  Gal,  W.‐H.  Li  y  J.  Borevitz  (2008).  "Whole  genome  transcriptome polymorphisms in Arabidopsis thaliana." Genome Biology 9(11): R165. 

Zhang,  Z. W.,  S.  Yuan,  F.  Xu,  H.  Yang,  N.  H.  Zhang,  J.  Cheng  y  H.  H.  Lin  (2010).  "The  plastid hexokinase  pHXK:  a  node  of  convergence  for  sugar  and  plastid  signals  in Arabidopsis." FEBS Lett 584(16): 3573‐3579. 

    

P á g i n a  | 193  

 

Apéndice de tablas Tabla A: muestra el valor del cociente entre la isoforma más pequeña (isoforma X) y el total de isoformas del

evento para cada tratamiento. Sor, sorbitol; Osc, oscuridad; Sac, sacarosa. Se presenta (p) el valor p de un

test de Student realizado para la diferencia entre el cociente en luz y en oscuridad (Luz-Osc). El ID está

relacionado con el par de primers utilizado y nos sirve para encontrar en la tabla C qué gen está

representado por cada evento.

ID  Sor Osc  ES  Sor Luz  ES  Luz‐Osc  p  Sac Osc  ES  Sac Luz  ES  p  Luz‐Osc 

3  0.40  0.104  0.80  0.017  0.401 0.067 0.41 0.027 0.71  0.039  0.002  0.297

13  0.18  0.018  0.25  0.002  0.074 0.018 0.21 0.010 0.26  0.004  0.028  0.044

19  0.36  0.015  0.29  0.021  ‐0.065 0.035 0.42 0.005 0.31  0.018  0.014  ‐0.113

23  0.46  0.015  0.56  0.002  0.098 0.009 0.47 0.006 0.54  0.008  0.001  0.064

30  0.61  0.023  0.71  0.013  0.098 0.053 0.74 0.016 0.79 0.013  0.087  0.048

36  0.63  0.018  0.53  0.020  ‐0.106 0.034 0.59 0.026 0.51  0.017  0.072  ‐0.087

42  0.54  0.021  0.57  0.009  0.029 0.164 0.57 0.000 0.58  0.017  0.601  0.006

43  0.87  0.036  0.84  0.041  ‐0.033 0.577 0.82 0.032 0.60  0.042  0.031  ‐0.214

47  0.33  0.019  0.35  0.010  0.024 0.072 0.34 0.021 0.26  0.044  0.052  ‐0.077

48  0.73  0.030  0.85  0.006  0.126 0.024 0.83 0.008 0.85  0.028  0.240  0.026

49  0.85  0.002  0.88  0.024  0.027 0.666 0.88 0.003 0.91  0.015  0.148  0.023

50  0.30  0.024  0.41  0.042  0.105 0.067 0.35 0.019 0.40  0.016  0.170  0.041

59  0.52  0.124  0.30  0.069  ‐0.219 0.097 0.52 0.087 0.26  0.091  0.021  ‐0.259

63  Control  ‐  ‐  ‐  ‐   ‐ ‐ ‐  ‐     ‐

66  Control  ‐  ‐  ‐  ‐ ‐ ‐ ‐ ‐     ‐

68  0.23  0.040  0.17  0.003  ‐0.058 0.134 0.12 0.002 0.12  0.005  0.037  ‐0.002

70  0.13  0.023  0.13  0.003  ‐0.007 0.674 0.12 0.002 0.12  0.005  0.649  ‐0.002

72  0.63  0.097  0.64  0.008  0.009 0.368 0.62 0.020 0.63  0.008  0.482  0.013

75  0.41  0.021  0.38  0.006  ‐0.026 0.114 0.50 0.009 0.39  0.008  0.008  ‐0.107

89  0.29  0.043  0.39  0.011  0.098 0.072 0.34 0.012 0.36  0.008  0.162  0.023

102  0.93  0.127  0.86  0.119  ‐0.064 0.450 1.00 0.000 0.83  0.019  0.005  ‐0.165

105  0.35  0.006  0.22  0.004  ‐0.124 0.002 0.35 0.006 0.25  0.015  0.003  ‐0.101

107  0.30  0.012  0.24  0.021  ‐0.053 0.095 0.30 0.013 0.28  0.035  0.232  ‐0.026

108  0.64  0.022  0.50  0.012  ‐0.135 0.018 0.61 0.004 0.50 0.004  0.001  ‐0.108

110  0.52  0.128  0.17  0.015  ‐0.349 0.045 0.42 0.025 0.17  0.034  0.017  ‐0.249

113  0.91  0.151  0.41  0.135  ‐0.507 0.045 0.93 0.129 0.63  0.030  0.083  ‐0.298

127  0.13  0.004  0.09  0.009  ‐0.040 0.025 0.12 0.008 0.09  0.006  0.054  ‐0.033

128  0.48  0.067  0.53  0.033  0.055 0.659 0.49 0.026 0.50  0.018  0.718  0.011

133  0.44  0.027  0.37  0.020  ‐0.073 0.322 0.45 0.003 0.40  0.007  0.012  ‐0.052

136  0.04  0.025  0.05  0.028  0.014 0.266 0.15 0.036 0.18  0.122  0.689  0.024

137  0.50  0.019  0.46  0.008  ‐0.043 0.269 0.53 0.018 0.49  0.019  0.258  ‐0.032

142  0.14  0.025  0.17  0.013  0.023 0.185 0.17 0.032 0.20  0.039  0.211  0.028

144  0.52  0.046  0.41  0.011  ‐0.110 0.032 0.42 0.020 0.39  0.050  0.224  ‐0.033

P á g i n a  | 194  

 

146  0.87  0.010  0.85  0.002  ‐0.022 0.084 0.87 0.002 0.84  0.010  0.046  ‐0.031

148  0.28  0.037  0.27  0.023  ‐0.015 0.469 0.27 0.010 0.30  0.021  0.199  0.028

149  0.25  0.027  0.26  0.014  0.014 0.291 0.24 0.006 0.26  0.007  0.085  0.023

152  0.38  0.039  0.31  0.007  ‐0.065 0.105 0.38 0.002 0.34  0.008  0.006  ‐0.043

154  0.22  0.121  0.14  0.045  ‐0.079 0.277 0.08 0.015 0.05  0.017  0.076  ‐0.027

158  0.24  0.081  0.38  0.044  0.143 0.067 0.37 0.060 0.53  0.043  0.092  0.159

165  0.47  0.075  0.43  0.019  ‐0.042 0.385 0.46 0.054 0.40  0.013  0.247  ‐0.060

168  0.35  0.000  0.38  0.020  0.032 0.229 0.41 0.044 0.37  0.054  0.244  ‐0.036

169  0.33  0.007  0.27  0.009  ‐0.062 0.014 0.35 0.021 0.32  0.003  0.200  ‐0.026

170  0.17  0.015  0.11  0.006  ‐0.058 0.036 0.20 0.006 0.11  0.009  0.011  ‐0.082

171  0.80  0.022  0.69  0.006  ‐0.106 0.016 0.77 0.005 0.72  0.003  0.001  ‐0.052

174  0.74  0.017  0.77  0.032  0.030 0.497 0.79 0.017 0.79  0.017  0.970  ‐0.001

179  0.41  0.052  0.40  0.016  ‐0.002 0.938 0.41 0.008 0.39 0.021  0.093  ‐0.023

181  0.62  0.030  0.65  0.009  0.035 0.116 0.63 0.014 0.63  0.025  0.864  ‐0.002

182  0.34  0.011  0.33  0.016  ‐0.010 0.458 0.35 0.008 0.36  0.013  0.244  0.005

188  0.29  0.032  0.17  0.008  ‐0.125 0.023 0.29 0.019 0.18  0.001  0.010  ‐0.110

189  0.98  0.029  0.94  0.010  ‐0.042 0.149 0.92 0.004 0.88  0.027  0.091  ‐0.043

191  0.04  0.001  0.02  0.001  ‐0.011 0.009 0.03 0.010 0.02  0.003  0.396  ‐0.008

198  0.44  0.074  0.72  0.021  0.281 0.033 0.41 0.048 0.68  0.038  0.017  0.266

205  0.79  0.078  0.86  0.022  0.069 0.326 0.75 0.063 0.88  0.015  0.083  0.124

217  0.22  0.006  0.19  0.014  ‐0.022 0.139 0.25 0.025 0.22  0.006  0.260  ‐0.031

223  0.71  0.091  0.73  0.051  0.022 0.816 0.75 0.024 0.77 0.032  0.370  0.018

224  0.65  0.086  0.64  0.032  ‐0.011 0.846 0.63 0.078 0.64  0.016  0.842  0.009

227  0.38  0.034  0.25  0.026  ‐0.126 0.014 0.30 0.002 0.21  0.029  0.031  ‐0.092

229  0.46  0.064  0.78  0.106  0.326 0.014 0.54 0.031 0.67  0.014  0.008  0.132

239  0.68  0.009  0.56  0.006  ‐0.121 0.002 0.65 0.019 0.55  0.011  0.016  ‐0.102

246  0.59  0.012  0.47  0.027  ‐0.115 0.014 0.60 0.004 0.48  0.011  0.001  ‐0.126

249  0.26  0.039  0.27  0.011  0.008 0.801 0.30 0.005 0.28  0.003  0.025  ‐0.017

254  0.65  0.011  0.54  0.051  ‐0.111 0.053 0.70 0.022 0.57  0.003  0.008  ‐0.123

264  0.25  0.069  0.19  0.010  ‐0.056 0.340 0.21 0.022 0.21  0.032  0.639  0.007

270  0.22  0.005  0.33  0.003  0.111 0.001 0.26 0.016 0.33  0.004  0.021  0.076

272  0.24  0.077  0.30  0.011  0.064 0.011 0.24 0.012 0.32 0.011  0.002  0.075

275  0.51  0.026  0.23  0.018  ‐0.272 0.009 0.51 0.008 0.24  0.001  0.000  ‐0.264

277  0.75  0.013  0.67  0.014  ‐0.076 0.026 0.74 0.004 0.68  0.039  0.032  ‐0.062

285  0.37  0.015  0.54  0.014  0.177 0.069 0.49 0.023 0.59  0.039  0.021  0.100

288  0.91  0.070  0.95  0.018  0.031 0.488 0.85 0.027 0.85  0.110  0.997  0.000

289  0.54  0.014  0.58  0.056  0.036 0.056 0.57 0.017 0.66  0.011  0.020  0.087

291  0.31  0.020  0.47  0.028  0.157 0.027 0.30 0.025 0.49  0.012  0.012  0.188

292  0.25  0.016  0.17  0.008  ‐0.079 0.024 0.26 0.007 0.19  0.016  0.006  ‐0.075

298  0.45  0.024  0.70  0.042  0.245 0.022 0.55 0.053 0.75  0.018  0.014  0.204

314  0.37  ‐  0.31  0.013  ‐0.059 ‐ 0.27 0.022 0.29  0.007  0.280  0.020

P á g i n a  | 195  

 

315  0.99  0.000  0.99  0.001  ‐0.001 0.961 0.99 0.003 0.99  0.003  0.742  ‐0.001

322  0.84  0.017  0.78  0.013  ‐0.055 0.032 0.82 0.009 0.77  0.042  0.467  ‐0.045

326  0.87  0.021  0.95  0.008  0.078 0.015 0.91 0.010 0.96  0.007  0.044  0.044

327  0.91  0.002  0.93  0.014  0.025 0.105 0.88 0.021 0.92  0.027  0.060  0.047

333  0.97  0.005  0.97  0.005  0.000 0.398 0.98 0.002 0.98  0.003  0.184  0.003

338  0.32  0.037  0.24  0.009  ‐0.085 0.039 0.36 0.053 0.21  0.015  0.057  ‐0.156

342  1.00  0.000  0.91  0.010  ‐0.094 0.004 0.99 0.012 1.00  0.000  0.423  0.007

343  0.81  0.101  0.58  0.023  ‐0.228 0.037 0.50 0.049 0.39  0.039  0.077  ‐0.105

344  0.07  0.005  0.08  0.019  0.010 0.366 0.06 0.002 0.05  0.011  0.155  ‐0.016

346  0.10  0.092  0.37  0.007  0.267 0.034 0.21 0.022 0.32  0.025  0.044  0.103

373  0.86  ‐  0.81  0.027  ‐0.051 0.111 0.85 0.019 0.82  0.043  0.480  ‐0.031

374  0.90  0.086  0.80  0.013  ‐0.099 0.193 0.85 0.004 0.85  0.028  0.927  ‐0.002

375  0.51  0.000  0.76  0.022  0.249 0.046 0.52 0.037 0.73 0.050  0.022  0.210

378  0.49  0.076  0.73  0.023  0.232 0.048 0.54 0.048 0.69  0.024  0.009  0.151

380  0.35  0.047  0.40  0.128  0.047 0.656 0.28 0.012 0.32  0.012  0.122  0.036

381  0.55  0.202  0.37  0.010  ‐0.184 0.258 0.31 0.022 0.30  0.014  0.321  ‐0.011

383  0.13  0.019  0.15  0.009  0.027 0.190 0.11 0.005 0.15  0.003  0.020  0.039

393  ‐  ‐  0.42  0.160  ‐ ‐ 0.38 ‐ 0.46  0.103  ‐  0.082

 

Tabla B: clave del código de colores de la tabla A.

   RNA Binding, processing 

   Transcription factors 

   Stress related; ABA 

   Sarah Assman; Stomatal ABA signalling 

   also involved in stress 

   Flowering Time 

   Miscellaneous 

  Transcription factor; Nucleolar mis‐splicing database 

  Stress related; Nucleolar mis‐splicing database 

   U12 intron 

   Controls  

P á g i n a  | 196  

 

Tabla C: clave del código ID de la tabla A. Permite asociar cada evento de la primer tabla con el locus

correspondiente y la clase de splicing alternativo que sufre. 5’SS, dador alternativo; 3’SS, aceptor

alternativo; int ret, retención de intrón; y Exon S, salteado exónico o exón cassette.

ID  Locus  Descripción  Tipo de evento 

3  At1g09140  SF2/ASF‐like splicing modulator (SRp30)  3'SS 

13  At1g79650  DNA repair protein RAD23  3'SS 

19  At2g32320  Unknown protein  3'SS 

23  At2g39730  Rubisco activase (Auxin regulated)  5'SS 

30  At3g53270  Unknown protein  5'ss & 3'ss 

36  At4g12790  Unknown protein  3'SS 

42  At5g04430  Putative RNA binding protein  3'SS 

43  At5g09230  Transcriptional regulator (Sir2)  3'SS & Int. Ret. 

47  At5g20250  Seed Imbitition protein‐like (DARK INDUCIBLE 10) 3'SS 

48  At5g35680  initiation factor 1A putative  3'SS 

49  At5g41150  Repair endonuclease (RAD1)  3'SS 

50  At5g43910  Unknown Protein (pfkB‐type carbohydrate kinase family protein)  3'SS 

59  At5g66010  Putative protein (RNA binding / nucleic acid binding / nucleotide binding)  3'SS 

63  At3g12110C  Actin 11 (ACT11)  Constitutivo 

66  At4g02560C  Ld.1 LUMINIDEPENDENS (LD)  Constitutivo 

68  At1g23970  Unknown Protein (Auxin regulated)  5'SS 

70  At1g54360  TATA binding protein associated 6b (TAF6)  5'ss 

72  At2g04790  Expressed protein  5'SS 

75  At2g36000  Expressed protein  5'SS 

89  At4g38510  vacuolar‐type H+‐ATPase subunit B2  5'SS 

102  At1g27370  squamosa promoter‐binding protein‐like 10 (SPL10)  Exon S, 3'SS & 5'SS  

105  At1g33060  no apical meristem (NAM) family protein  3'SS 

107  At1g59750  auxin‐responsive factor (ARF1)  3'SS 

108  At1g30200  F‐box family protein  3'SS 

110  At1g72050  zinc finger (C2H2 type) family protein  Exon S 

113  At1g72650  myb family transcription factor  5'SS 

127  At2g43010  phytochrome‐interacting factor 4 (PIF4)  3'SS 

128  At2g15530  zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein  5'SS 

133  At2g32250   far‐red impaired responsive protein, putative  3'SS 

136  At3g07740  transcriptional adaptor (ADA2a)  5'SS 

137  At3g14740  PHD finger family protein  3'SS 

142  At3g12250   bZIP family transcription factor  3'SS 

144  At3g23280  zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein  Exon S 

146  At3g24120  myb family transcription factor  3'SS 

148  At1g76510  ARID/BRIGHT DNA‐binding domain‐containing protein  5'SS 

149  At2g27230  transcription factor‐related  5'SS 

152  At3g58030  zinc finger (C3HC4‐type RING finger) family protein  3'SS 

P á g i n a  | 197  

 

154  At4g01060  myb family transcription factor  3'SS 

158  At4g32730  myb family transcription factor  5'SS 

165  At4g16420  transcriptional adaptor (ADA2b)  3'SS 

168  At5g18240  myb family transcription factor  3'SS 

169  At5g24520  transparent testa glabra 1 protein (TTG1)  3'SS 

170  At5g28770  bZIP transcription factor family protein  3'SS 

171  At5g18620  DNA‐dependent ATPase, putative  5'SS 

174  At5g13220  expressed protein  5'SS 

179  At5g48150  phytochrome A signal transduction 1 (PAT1)  Exon S 

181  At5g05550  expressed protein  Exon S 

182  At5g16820   heat shock transcription factor 3 (HSTF3)  3'SS 

188  At5g02840  myb family transcription factor  3'SS 

189  At5g43270  squamosa promoter‐binding protein‐like 2 (SPL2) 5'SS 

191  At5g18830  squamosa promoter‐binding protein‐like 7 (SPL7)  5'SS 

198  At4g36690  U2 snRNP auxiliary factor large subunit  3'SS 

205  At3g61860  arginine/serine‐rich splicing factor RSP31  3'SS 

217  At1g16610  arginine/serine‐rich protein, putative (SR45)  3'SS 

223  At2g29210  splicing factor PWI domain‐containing protein  3'SS 

224  At1g15200  atPinin  3'SS 

227  At4g24740  protein kinase (AFC2)  Exon S 

229  At4g35785  transformer serine/arginine‐rich ribonucleoprotein  3'SS 

239  At1G31500  endonuclease/exonuclease/phosphatase family protein 3'SS 

246  At5g59440  Thymidylate kinase like  3'SS 

249  At1g72560  tRNA export mediator exportin‐t  5'SS 

254  At5g50240  L‐isospartyl methyltransferase  3'SS 

264  At5g65430  GF 14 Kappa isoform  3'SS 

270  At1g53650  RNA‐binding protein  5'SS 

272  At3g23900  RNA recognition motif (RRM)‐containing protein  5'SS 

275  At5g19030  RNA recognition motif (RRM)‐containing protein  3'SS 

277  At3g23830  glycine‐rich RNA‐binding protein, putative  3'SS 

285  At3g19840  WW domain‐containing protein  5'SS 

288  At3g12570  expressed protein  3'SS 

289  At3g12570  expressed protein  Exon S 

291  At2g46270  G‐box binding factor 3 (GBF3)  5'SS 

292  At4g36730  G‐box binding factor 1 (GBF1)  3'SS 

298  At5g09880  RNA recognition motif (RRM)‐containing protein  3'SS / Exon S 

314  At2g43410  FPA  int ret 

315  At4g31120  SKB1  Methyltransferase  int ret 

322  At2g33480  putative NAM (no apical meristem)‐like protein;COLD  5'SS 

326  At1g69250  NTF2 (RRM)‐containing protein;COLD  int ret 

327  At5g59950  RNA and export factor binding protein, putative;COLD  int ret 

P á g i n a  | 198  

 

333  At3g16800  protein phosphatase 2C, putative / PP2C, putative;COLD  int ret 

338  At5g57630  CBL‐interacting protein kinase 21 (CIPK21);COLD  5'SS 

342  At3g01090  putative SNF1‐related protein kinase (KIN10);Dark, sugar, hypoxia  5'SS 

343  At3g29160  SNF1‐like protein kinase (AKin11);Dark, sugar, hypoxia  5'SS 

344  At3g29160  SNF1‐like protein kinase (AKin11);Dark, sugar, hypoxia  3'SS 

346  At4g23260  protein kinase family protein;COLD  int ret 

373  At3g13224  RNA recognition motif (RRM)‐containing protein  int ret 

374  At4g36960  RNA recognition motif (RRM)‐containing protein  int ret 

375  At3g20270  lipid‐binding serum glycoprotein  Exon S 

378  At3g62190  DNAJ heat shock N‐terminal domain‐containing protein  3'SS 

380  At5g08185  npcRNA 78; MIR162a  Exon S, 3'SS 

381  At5g53450  fibrillin fused protein kinase  3'SS 

383  At2g43640  signal recognition particle 14 kDa family protein / SRP14 family protein 5'SS 

393  At2g26150  HsfA2  Exon S  

 

Tabla D: genes cuya expresión aumenta en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra

el locus y la intensidad del efecto en veces de cambio ([expresión en prmt5-5]/[expresión en wt]). En los

casos donde hay más de un loci, se debe a que las sondas que reconocen más de un gen, razón por la cual no

se puede asegurar cuál de ellos está alterado y se señalan ambos.

 

Locus  Veces de cambio 

AT2G46670;AT2G46790  6.45 

AT1G12730  5.62 AT1G13650  4.68 AT1G36180  4.32 AT3G27930  4.16 AT2G25760  4.11 ATCG00600  3.98 ATCG00360  3.91 AT4G22950  3.69 ATCG01070  3.65 ATCG00150  3.60 AT4G16870  3.54 AT1G48260  3.48 AT1G18710  3.42 AT3G47340  3.42 

AT3G19670  3.41 AT3G46210  3.40 AT3G16360  3.37 AT3G24515  3.32 AT3G04460  3.26 AT2G25760  3.26 AT5G28030  3.15 AT5G10140  3.11 AT5G01510  3.07 AT2G41705  3.07 AT4G31150  3.05 AT3G04810  2.98 AT1G44780  2.98 AT2G26810  2.97 AT3G44990  2.96 AT1G03750  2.95 AT5G42690  2.89 AT3G13225  2.86 

AT5G47240  2.85 AT3G28130  2.78 AT5G50550;AT5G50650  2.76 

ATCG00680  2.76 AT1G68820  2.73 AT2G25740  2.72 AT2G32150  2.71 ATCG00690  2.69 AT3G12170  2.66 AT3G22190  2.63 AT2G39250  2.61 AT1G51280  2.60 AT2G18770  2.60 AT1G61660  2.58 ATCG00500  2.57 AT1G73980  2.55 AT1G53885  2.54 

P á g i n a  | 199  

 

AT2G18600  2.54 AT1G74810  2.48 AT2G05540  2.46 AT4G34650  2.44 AT1G32090  2.44 AT1G68190  2.43 AT1G61890  2.42 AT3G02740  2.40 AT4G34140  2.39 AT5G42400  2.39 AT1G70700  2.39 AT2G26770  2.38 AT5G02810  2.38 AT1G77890  2.38 AT3G20910  2.37 AT3G20450  2.35 AT2G42160  2.35 AT5G44660  2.32 AT5G06190  2.32 AT3G61570  2.31 ATCG00140  2.31 AT3G16690  2.30 AT1G02205  2.29 AT3G14660  2.28 AT1G80800  2.26 AT2G47410  2.26 AT5G44750  2.26 AT3G19350  2.25 AT4G33790  2.23 AT1G19340  2.22 AT5G41140  2.22 AT3G54230  2.20 AT1G08890;AT1G08900  2.19 

AT3G53920  2.18 AT4G18750  2.18 AT5G05600  2.16 AT4G17150  2.15 AT1G14660  2.15 AT2G27480  2.14 AT5G50160  2.14 AT5G08500  2.14 AT2G24120  2.13 AT5G11800  2.12 AT4G16566  2.12 AT1G19690  2.11 AT4G21170  2.11 AT5G11950  2.11 AT5G09410  2.10 

AT5G60890  2.10 AT1G62510  2.07 AT4G29100  2.07 AT2G32700  2.07 AT2G34780  2.05 AT1G09440  2.05 AT3G47530  2.05 AT5G40910  2.04 AT3G16840  2.03 AT3G53370  2.03 AT3G20440  2.02 AT4G14970  2.02 AT2G01860  2.02 AT1G61400  2.02 AT1G20030  2.01 AT3G18500  2.01 AT5G02940  2.01 AT2G43430  2.01 AT1G15960  2.01 AT2G02710  2.00 AT1G62290  2.00 AT1G12350;AT5G02080  1.99 

AT5G25270  1.98 AT5G57100  1.98 AT2G31530  1.98 AT1G53710  1.98 AT1G53440;AT1G53450  1.98 

AT1G70570  1.97 AT1G77080  1.97 AT1G71720  1.96 AT5G19210  1.96 AT3G23480;AT3G23470  1.96 

AT1G73920  1.95 AT3G51530  1.94 AT3G59300  1.93 AT1G79700;AT1G79690  1.91 

AT5G56380  1.91 AT3G48110  1.91 AT2G22190  1.89 AT2G33820  1.89 AT3G01490  1.88 AT1G28340  1.88 AT2G22840  1.88 AT1G05200  1.88 AT2G17340  1.86 AT5G24740  1.86 

AT4G30330  1.85 AT5G05040;AT5G05060

1.85 

AT1G26190  1.85 AT5G05310  1.84 AT3G16750  1.84 AT3G07590  1.84 AT2G22830  1.83 AT5G45300  1.83 AT5G57660  1.83 AT1G10320  1.83 AT3G50430  1.83 AT2G15690  1.82 AT1G03160  1.81 AT1G26770  1.81 AT3G09560  1.81 AT3G59430  1.81 AT3G50240  1.81 AT3G13340  1.80 AT5G35910  1.80 AT5G23690  1.80 AT3G16340  1.79 AT5G39060;AT3G29120;AT1G62766;AT1G08105 

1.79 

AT2G28360  1.79 AT3G26690  1.79 AT3G01150  1.78 AT1G42470  1.78 AT1G29750  1.78 AT5G50730  1.78 AT5G52100  1.78 AT1G08810  1.77 AT4G16770  1.77 AT3G02890  1.77 AT3G48200  1.77 AT2G38760  1.77 AT1G30550  1.77 AT1G10570  1.76 AT5G03200  1.76 AT4G37460  1.76 AT5G06970  1.76 AT1G54440  1.76 AT1G60860  1.76 AT2G25710  1.76 AT3G48500  1.75 AT5G57960  1.75 AT5G65205  1.75 AT1G34340  1.75 

P á g i n a  | 200  

 

AT5G16970  1.75 AT3G15590  1.75 AT1G32640  1.74 AT4G32910  1.74 AT4G33490  1.74 AT1G56300  1.74 AT5G63530  1.74 AT5G50740  1.74 AT2G33830  1.73 AT5G63700  1.73 AT2G19080  1.73 AT2G02740  1.73 AT4G16590  1.73 AT5G18630  1.73 AT1G22740  1.72 AT5G48640  1.72 AT3G43220  1.72 AT5G58390  1.72 AT3G27690  1.72 AT5G57630  1.72 AT1G80050  1.72 AT3G06380  1.72 AT2G18440  1.71 AT1G80920  1.70 AT1G28330  1.70 AT3G22660  1.70 AT2G43360  1.70 AT1G73750  1.70 AT5G01370  1.70 AT3G28530;AT1G36770  1.70 

AT4G21470  1.70 AT5G13740  1.70 AT3G06530  1.70 AT5G51660  1.70 AT2G40435  1.69 AT5G39350  1.69 AT1G47500;AT1G47490  1.69 

AT4G32320  1.69 AT1G63680  1.68 AT1G14040  1.68 AT3G29320  1.68 AT5G64220  1.68 AT5G04490  1.68 AT5G60120  1.68 AT5G53050  1.68 AT2G46610  1.68 AT4G02020  1.68 

AT5G51940  1.68 AT3G61780  1.67 AT5G62990  1.67 AT5G40500  1.67 AT5G15320  1.67 AT4G32880  1.67 AT2G40960  1.67 AT3G27610  1.67 AT1G09660  1.66 AT1G73660  1.66 AT2G15960  1.66 AT1G50730  1.66 AT5G43790  1.65 AT5G01390  1.65 AT2G22990  1.65 AT1G72450  1.65 AT3G53800  1.65 AT5G63780  1.65 AT2G16940  1.65 AT3G63520  1.65 AT2G22980  1.64 AT2G28550  1.64 AT5G23330  1.64 AT1G76360  1.64 AT4G00620;AT4G00600  1.64 

AT3G09310  1.64 AT5G11040  1.63 AT5G51410  1.63 AT1G06780  1.63 AT4G08310  1.63 AT3G06500  1.63 AT2G40316  1.62 AT3G62550  1.62 AT5G16000  1.62 AT3G10520  1.62 AT3G20430  1.61 AT4G39900  1.61 AT5G66540  1.61 AT2G30600  1.61 AT2G02170  1.61 AT5G18640  1.61 AT2G15890  1.61 AT1G61065  1.61 AT2G26870  1.61 AT1G08660  1.61 AT2G21380  1.61 AT1G71440  1.61 AT5G19180  1.60 

AT1G69523  1.60 AT3G04610  1.60 AT2G43400  1.60 AT3G15840  1.60 AT2G16630  1.59 AT1G78080  1.59 AT2G29210  1.59 AT2G44650  1.59 AT1G72090  1.59 AT5G08400  1.58 AT3G62220  1.58 AT3G45240  1.58 AT4G00180  1.58 AT1G32750  1.57 AT1G54260  1.57 AT1G42540  1.57 AT3G18110  1.57 AT4G01510  1.57 AT4G38110  1.57 AT5G59130  1.57 AT2G42270  1.57 AT5G41870  1.57 AT4G17960  1.57 AT1G77480  1.57 AT2G34640  1.56 AT2G03530  1.56 AT1G74950  1.56 AT5G52380  1.56 AT1G19970  1.56 AT1G76730  1.56 AT3G20720  1.56 AT3G10140  1.55 AT3G16000  1.55 AT3G60180  1.55 AT1G60490  1.55 AT3G50440  1.55 AT1G34150  1.55 AT4G18270  1.55 AT3G33530  1.55 AT5G06750  1.55 AT5G09880  1.55 AT1G19750;AT1G27840  1.54 

AT1G52880  1.54 AT3G56070  1.54 AT5G44250  1.54 AT5G22280  1.54 AT1G27520  1.53 AT5G47220  1.53 

P á g i n a  | 201  

 

AT5G42030  1.53 AT1G17680  1.53 AT3G16940  1.53 AT1G53590  1.52 AT3G54720  1.52 AT3G19510  1.52 AT4G16146  1.52 AT4G04340  1.52 

AT4G27820  1.52 AT5G56750  1.52 AT5G55700  1.52 AT5G37850  1.52 AT1G73350  1.51 AT5G61830  1.51 AT1G48460  1.51 AT5G10940  1.51 

AT1G22335  1.51 AT2G23930  1.51 AT1G59750  1.50 AT4G05040  1.50 AT4G10920  1.50 AT1G18620  1.50 

 

Tabla E: genes cuya expresión disminuye en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra

el locus y la intensidad del efecto en veces de cambio ([expresión en prmt5-5]/[expresión en wt]). En los

casos donde hay más de un loci, se debe a que las sondas que reconocen más de un gen, razón por la cual no

se puede asegurar cuál de ellos está alterado y se señalan ambos.

Locus  Veces de cambio 

AT5G24770;AT5G24780  0.18 AT2G39030  0.21 AT1G72260  0.23 AT5G22460  0.25 AT5G03350  0.26 AT5G10760  0.26 AT3G50480  0.27 AT5G55450  0.27 AT4G23220  0.27 AT5G59670  0.28 AT2G14560  0.29 AT3G26960  0.32 AT4G01700  0.33 AT1G34750  0.33 AT5G60900  0.34 AT2G40100  0.35 AT1G09740  0.36 AT2G32160  0.36 AT3G50280  0.37 AT1G56500  0.38 AT1G76020  0.39 AT1G26260  0.40 AT3G48080  0.40 AT3G56710  0.42 AT5G25440  0.42 AT1G69730;AT1G69720  0.42 

AT5G18690  0.42 AT2G33810  0.43 AT5G53370  0.43 AT5G58770  0.43 AT1G08450  0.44 AT5G58120  0.44 AT4G21650  0.44 AT3G57700  0.45 AT5G08100  0.45 AT1G22550  0.46 AT5G37600  0.46 AT4G02330  0.46 AT4G32870  0.47 AT4G00050  0.47 AT2G17220  0.47 AT5G40780 0.47

AT3G26200  0.47 AT5G64550  0.48 AT2G39210  0.48 AT4G02420  0.48 AT3G29030  0.49 AT1G62500  0.49 AT3G14620  0.50 AT3G53970  0.50 AT3G16770  0.50 AT3G52470  0.50 AT1G07000  0.51 AT4G08470  0.51 AT1G12110 0.51

AT5G47550 0.51

AT5G48540  0.51 AT5G39020  0.51 AT1G56430  0.51 AT2G25590  0.52 AT1G74210  0.52 AT2G17120  0.52 AT1G59960  0.52 AT1G72910;AT1G72930  0.52 AT5G02230  0.53 AT5G23850  0.53 AT1G03370  0.53 AT5G64120  0.53

AT3G26170;AT3G26180  0.53 AT3G10620  0.53 AT5G19240  0.53 AT2G14900  0.54 AT5G36220  0.54 AT5G52540  0.54 AT4G38220  0.54 AT2G20630  0.54 AT4G03200  0.54 AT5G46420  0.54 AT5G48830  0.54 AT1G16260  0.55

AT4G21860  0.55 AT5G52810  0.55 AT4G13510  0.55 AT1G71040  0.55 AT2G25850  0.56 

P á g i n a  | 202  

 

AT4G26070  0.56 AT2G30695  0.56 AT1G06830  0.56 no_match  0.56 AT5G01810  0.57 AT3G28940  0.57 AT4G17090  0.57 AT5G46780  0.57 AT1G04040  0.57 AT4G35090  0.57 AT3G07990  0.57 AT1G77760  0.57 AT3G04480  0.58 AT1G05630  0.58 AT2G35960  0.58 AT2G37970  0.58 AT4G14365  0.58 AT5G51830  0.58 AT3G49720  0.58 AT5G37260  0.58 AT3G16700  0.59 AT1G63260  0.59 AT2G41310  0.59 AT1G72800  0.59 AT2G23600;AT2G23590  0.59 AT5G11970  0.59 AT1G16670  0.59 AT4G39710  0.59 AT4G17890  0.59 AT2G15320  0.59 AT2G31880;AT2G31890  0.59 AT1G04530  0.59 AT1G04350  0.60 AT1G03820  0.60 AT4G33050  0.60 AT2G32580  0.60 AT1G18010;AT1G18000  0.60 AT1G55840  0.60 AT2G48030  0.60 AT1G14890  0.60 AT3G50960;AT3G50950  0.60 AT5G59030  0.61 AT1G53000  0.61 AT2G42610  0.61 AT1G02500  0.61 AT5G53120  0.61 

AT5G51560  0.61 AT2G01540  0.61 AT1G62660  0.61 AT5G48485 0.61

AT2G37710 0.61

AT5G06310;AT5G06320  0.61 AT3G62290  0.61 AT1G20830  0.61 AT4G37800  0.61 AT1G35720  0.61 AT1G28680  0.62 AT4G26480  0.62 AT4G26940  0.62 AT4G36660  0.62 AT5G62140 0.62

AT4G20070  0.62 AT5G40850  0.62 AT3G11280  0.62 AT5G23760  0.62 AT2G14530  0.62 AT1G64740  0.62 AT4G17070  0.63 AT1G31690  0.63 AT2G19130  0.63 AT2G03550  0.63 AT3G23600  0.63 AT5G19250  0.63 AT2G39780  0.64 AT5G47560 0.64

AT5G21100  0.64 AT2G19940  0.64 AT1G66970  0.64 AT1G64230  0.64 AT1G72770  0.64 AT2G32080  0.64 AT2G38010  0.64 AT4G25900  0.64 AT3G27110  0.64 AT3G57790  0.64 AT1G73650  0.65 AT2G19460  0.65 AT3G14220  0.65 AT4G32590 0.65

AT5G49630  0.65 AT1G78300  0.65 AT1G04680  0.65 AT3G23810  0.65 AT5G44130  0.65 

AT1G19140  0.66 AT1G04620  0.66 AT5G21090  0.66 AT4G25450  0.66

AT4G29810  0.66

AT4G28400  0.66 AT4G19880  0.66 AT4G39730  0.66 AT4G14410  0.66 AT1G55000  0.67 AT1G05810  0.67 

P á g i n a  | 203  

 

Tabla F: expresión de los genes del reloj en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje (prmt5-

5/WT). Se muestra el locus, el nombre del gen y el efecto sobre la expresión.

Locus  Nombre  prmt5‐5/WT 

AT2G46790  APRR9  6.452789006

AT5G10140  FLC  3.112795227

AT5G02810  APRR7  2.378587694

AT1G22770  GIGANTEA  1.603213802

AT5G24470  APRR5  1.467408812

AT2G40080  ELF4  1.303192227

AT5G60100  APRR3  1.303121888

AT2G44680  CKB4  1.272015759

AT2G31870  TEJ  1.228709965

AT2G21070  FIONA1  1.064196713

AT3G60250  CKB3  1.023464374

AT5G59560  SRR1  1.009499579

AT5G57360  ZTL  1.00329631

AT1G10470  ARR4  0.999703521

AT5G61380  APRR1/TOC1  0.981512433

AT2G46830  CCA1  0.97181703

AT2G46340  SPA1  0.932983438

AT3G22380  TIC  0.927199743

At5g08330  CHE  0.926412588

AT5G64813  LIP1  0.915418621

AT2G25930  ELF3  0.885075825

AT3G46640  LUX  0.877506862

AT1G09340  CRB  0.722319719

AT1G01060  LHY  0.689107513

AT5G37260  CIR1  0.584675909

P á g i n a  | 204  

 

Tabla G: intrones mayormente retenidos en la mutante prmt5-5 con respecto a la planta salvaje. Se muestra

el locus y las sondas que reconocen a los intrones.

AGI Intrón afectado 

Sonda 1  Sonda 2 AT5G42030  gcctcttccttgttctgtgaaaaaa  taagggcggattatgattgaacgga AT1G71695  cgattccgtcgtcctagtaaccaca caaaccattagtctacaagtcacac

AT4G39900  gaagtgggaaaacatctgcatcgca catgatacactgatttagaagagca

AT5G58140  cattgcgcctgtatagtgatgcatt  gtgtttcagtttattcatggtttac AT5G02160  tcatagtttattgtccggttcaaca  gattgtacattgtgagtttaagctc AT2G17340  gcttccagaaactactcttgatgta taaataaggtcggaagagagaagta

AT1G03160  tatcgtgatgctcgtgaggtttatc  tatgtcttttccttgatagtctctg AT1G78630  gaagaagctaatggccctgtaacga  ggcttgaaacctttattgagtgtat AT1G76730  ggctaactgcaccaagaattcaaat ttcgctaactaaggcaaaacctaga

AT4G27520  gcgtagctaaaatctgcaagaatcg gaaatgacacaaacgggtaagagag

AT2G21370  tatgtccctcacagtacagcttttt  cggttaagtgtatagctgagatata AT1G69620  ttggtttgtttgtgcttattgacgg agttgtttcagccattttccttcag

AT2G43430  tataagatagccaaacaaagactac ggctaaatctggtaccaaccacaaa

AT3G14660  tccgtagtcccagtttagctttatg  ggttctgaaccaatttgtgtcctct AT3G48110  gaaaggaaatgaagcagttctcagg  tagtggtccatatttaaagcatcca AT5G04490  caaaatgtctccttcttgacgacga gaactgagatgagtttgctactaaa

AT5G58870  tgtactctgtgtatacctcacagct  gtgcacatggccttaacttaaacaa AT4G17150  gtatacctgttctctttcttgctag  ccgttgcttggtctatcccttttga AT4G01690  gaccgtcacctccagtgtgtattct tctgctcatgttcttagagtttggc

AT4G25170  cacttgaaaatgtgtgattctttgg tgtgttctgtttacgtgttggagta

AT3G53920  attgatagttcggattattgatgac  cagaaacaataaaggaaaacaagtg AT1G29750  aatcctgctgcattgtttaaaacca  gaacaacagattccaccgtaataag AT1G13650  taacatatatcctaacatgaagatc tgaaaaacagtttattgccgtttga

AT1G68190  cttataaccggtgtaagatctcggg  tatagctgatgtaccgatgattttg AT1G17580  gactggtgaagctatttaagcgaac  catttcctcatctcgcatttttata AT2G35040  gattcaattaaagcccgattatttg aacgtaactgaaaatcgatcactga

AT2G19950  tactgaattaaaacccgtggccaga  gacaacttcccaatatgactttgat AT2G47410  taacttttgcatgcaattcatctga  taccctaggtctttgattaagtaga AT5G57960  tacttgaacagcaaatactaatttc taagcacttttctccgtttccgagc

AT3G23700  gaatattagttacacactggaacca caaagagctgactaggactgcatag

AT1G31970  tttcctttgtcgtaagcagcagaac  caacgggaatcatattttcgagtta AT3G54840  gctttgtttcttcactgattcctgc  taccactaacttttggattcacttg AT2G28360  gactctgattcaagtacaaaggttg ttttttcttattcggtagcctctca

AT1G09440  gcaagactgcacatgaaaacaaaac  cagcagaacatatgtgaaacaccaa AT3G19670  cacagtcttactggatttaaaagga  aagtattggaatcagaattttctgg AT4G37300  caaactcatgttcggttatctctaa tcttcacataaaccaacatctttcg

AT3G59300  tatagccgggaaacaacacaaacca  gagtatgcgtgaacacggtattcat

AT5G54440  cctgtcaatctagggttggtgcaca  tatcgatcacagtgtccttttctcc AT3G19670  tcccactaccttgctagagagcaga tgtcagtacaatgtagcagcagaag

AT4G24750  tgtcactagatcctgctatcacata gttatcgatgttgtagaatcttgca

AT1G11060  cacattttgacttccgctcgttcta  tctgattactggttggactgatggc AT1G02205  tatcgtcactgagcccatcacttgt  cctaactagtagcttttatctgtat AT2G43360  tgtctatgaacctgagcctgaaacc tagagtagctagaacaacaaagaga

AT1G68820  gccatatgggaaacacttcctgtaa  taacttgtctctgcaggttgtctct AT3G01590  ccacaggtttggcatctcagatcat  tgaataaccctttgctctagtttcg AT5G25270  aggtaacacaaaggtaaggtgagca  cacactggtaatggtgaaagaaagt

AT2G35630  tgcaatgacggtgactcatctaaaa ccgtcttatcagtttccaacagtga

AT1G07110  taatacaattttgacgggaatggtg  taaaagacctgcagaaactatgacc AT4G02700  aattggtctcatcctctccgtacgt  tttcattacttactcttctgtgcca AT1G59750  aaatggtccaaaacacatcagttgc cattttgctgcaaatccaggctgac

AT3G04610  gccatgactagagcgctgacataaa  gcgaggaaccctagaattgacaatg AT5G08600  atttcgcagtcccaagataaaaagg  ctttgctcgctttgtgtatttactc AT3G33530  cggctcgttgaggttactgtgtatg acttctgcgatctttaatttccaac

AT5G22080  tcttaagctcttctgcatttcacag gaaggttgtcgtcacgactcacgag

AT1G06550  tgtagaatctgtcctcattcaagct  gcggatatatttacatcctgaatca AT4G24750  ttccttcccttaactatgcaaacaa catgaaccataatcactccaatgtt

AT2G17320 cagccttcaagaaatcccgcatatc  gacccatgagcagtatctaaatgag AT2G48020 caacacccttgcaacataaatatca  caattgcatgattttgttggaacag AT1G08190 gttgaaccttttatttgtcttcgca  cataagcctggaaaatcttgttcga

AT4G21960 ctacctacaccaaccccacacagtt  aaaacagcatgcagttttgtcacca

AT2G46915 tacagggaaaagctcactggcagaa  gacactcatgatgtagatgtactat AT1G28090 gtctcccgctcttttccgctttgaa  cagttccatcttctatatttccttc

AT2G26280 tgacccactgggttcctgtttcatt  tgtttcggataaaagatcatgttac

AT5G25610 gtaataatacaagtcaaacacatct  aaaaaacagttaattatggagagag AT5G10940 taagatgtagcagacagtgagcttg  tagagtatcttaatatcaatcaggc AT3G50240 gatgagcttcttgaacttccctgca  ttggatcttagtgtggaaatatgga

AT2G35390 caaacaaatgtattctgaagaaaga  tcaatctaggaacctcaaatccgga AT1G05270 tcaacgaagacaacctgtgatatca  caaacctcagtcctcaatgaacaca AT4G36210 gagtagatgagttcactttttgcac  taaggagcgtttacaatgtcactgg

AT5G65010 gtcgctgtcactgtactttctcttg  aagtgttggcctttgttccttgctg

AT1G68890 tcccccttttatgcgtgaagaagta  catttactcatgtgttttgtttaca AT3G44670 actggtttgtcctcttgatttctac  gaccattttgtcataacggttgtat AT4G20150 cacatgctcccacggatctaacata  tagcatttttcgattggtggacgac

AT3G16030 tctgaatctcatagtccatgtaatg  tgttaatattctcagcttgccttct AT2G33040 ggtttttccatcaagtaacgctaga  tcaatattcaataccgatgcaagcc AT4G34140 ccattttccttctaaccgagccttg  aacctggtgtgctctgttatatggg

AT5G08650 gatatggatcataataactgcagca  catactgttttctctagaaaaggca AT2G39250 ggtcgtacgctctgatatgtatttg  taagtcaactaatatttctctaaag AT2G27860 aaaaccaacgcattacacaatcatc  catcaccgatctcaatacattgcga

AT4G18270 gccagaatacacatccatcatcagg  tgtgttgcgattgtgagttaagaaa

AT4G20970 tcttcctcatcattcttctacggtt  tccatgtatgggtgatgatcttaat AT1G65470 tctcgtctacaacatcaaataaaca  cattaaatgacatcaccaaagagta AT5G44650 aagtcgcggtttgttcccatatcac  gattgatatttctcctgccttttgt

AT1G22730 tattatttgtttctttgcgatttta  cagatttggttattgaatccgttga AT3G02860 acagctcaagcccaatccccagaac  ggaattgtagaaacccagaagtgac AT3G18520 aaacaaatctgtaagctgcccaaat  ttttgtgagttgaccttgtttgaac

AT2G17787 gagtcagccccttgatggtaggcat  ggtctgtttgcttatggtgtcattc

AT5G20280 catgtagaatttggaggtctgagta  tctcattaaggtgatatagattgct AT1G15030 gacatgcgtatgtactttgttccac  gcattgtctctcttagaatccatta AT3G14720 tttggacggtatgcacccttgtcta  tgtcagaattggtcgctcaatattc

AT1G50140 gaattcaaaggtacacagtttacca  atacaaactagcaattttcaaaaag AT5G13700 tacctctgaaattagtagtataaag  caatcaatctgcgacattattatca AT1G50120 aattggctgtttcatctcttctcac  cattgcctgcatctgacaactgttt

AT3G51830 taaaaatctgtatgcacatcgacgc  cctcgatcgtacacatcaaattaat AT4G39850 catgtttaatcttctatacttcaag  cacagtacaattctttcggtctggt AT3G47930 gcatatgtttctctcccttgtgtga  ttcgtctttatcttgtgctttgagg

AT3G18580 caaaaacacaactcggcctgtaagg  aatggagttttaggggttgagccat

AT1G10360 cagagataaaccacttccattcata  cccggtatactttattacatgcaat AT2G05590 gaggaaatatcaggcaggctagcta  tctctttaggtgtttttgatgatag AT3G22760 tgtctgttcgacttttcttcattga  caaagtgtttttttgtgcaatgcag

AT1G60990 tcccttcacaaacgagcagatagat  taccaatcacagaggcaacaatata AT5G17510 cacaggttgtaagaatacacgcaat  tatactaattgctgcggctttgatg AT1G12730 cagttactcgtaagcagttgttgga  tgtagtacgctcatccctgtcgttc

AT4G16770 catctccttggaatcacctgtttgt  caatttcatgagctattatactatc

AT4G32330 gaaagcgctgatgggtattgagtcc  tgtcatctagaccttggtgctaagt AT2G18770 gcattcgcattcgttttatgatcgg  tattgtctgatcttaatagtggtaa

AT3G45740 tatgttcacattttttcctcatttg  tgcatgattgagtttgaatacatac

AT2G32700 aatctgggatgcttctgatgtatac  gactaactactaccaatttgtgcag AT4G10340 cggattggtacattactctctagtc  gctattactcatgggaaaatgacta AT3G60150 tcatctctctcagtcatgttcctaa  gaatcaattaatggtgctttttgca

AT2G21380 tgcaaaactgccttagaagaacaac  gataacatctctagtcacctaacct AT3G16170 gaagcagaaggaaagtttctaggta  taatttttgccaccttacctcaagc AT4G29010 gaaataactgagaattcacacaacc  gtgcatgatctaatcaatcacagag

AT5G07660 agtttctgtgccttgtgattgttcc  catgcgtttatctcttattgataca

AT5G39790 tgaacagctttagtgggagaaaaaa  tcattccagggatttgatgagcgcc 

P á g i n a  | 205  

 

AT1G25420  tctggtgtcaatcgtactgttagta tatcttgagagatgcattttggaag

AT1G14270  actgcctgggaacaaaattaatctc ccataacagagagattatctttcag

AT5G48220  tatagttcaagataacattgcccac  ggttcacctgatcttagctcccatg AT1G61210  ttgtctctgctattattctttttaa  cgtgtctttttttcctgcttgtgag AT1G19690  catcacagttaagacagtgttatca taagctctaatgataaaagctggag

AT1G02120  aatgtctcgttctttgtcttatcag  cattgactggatgcagaagtttcat AT4G33620  gaatgcctacaagccaaaagcaagg  cataacctagttcgaagcagcttgt AT4G39745  tctctgtgatcgtcatcggattcat gcgatcgcactaatcgttggtttta

AT3G48360  tcatcctccgtcaaactaaaacaga attgtgtagtaccggaaataaccat

AT5G62000  tcggaggcaatttgaggtgaaattg  taatgtcaaggagctaaactagtgg AT4G18240  gcttttgttgtacggcttgatctta cgtaattcattttgtttaggataca

AT2G24350  gctccttcaggtactattttgcttc gatcttctgaatatatgacgagtga

AT1G60200  ggataccggagaagccctgcataaa  tagttccccttcactactttaagca AT2G45990  gctgcagtaactcacgttctatata  ccattagtttacaatccctatgcat AT4G27830  aattgactttgctagatcagaatct ggctttagtagcgatgtaaaccaaa

AT2G34890  catcatagttcaaatacggatctag  aatggctttaggttgagtgccccac AT4G32660  ctgtagcatgtctgtgaattgttcc  tatgtcccggttcagcagctgtagt AT3G14910  gtttcatgggtctttaatccctaca ccatctgtggtgcttaactttgtta

AT3G16840  taagagcgtgctaagttcctgcgga catcaacatataattcgtaatacga

AT2G44350  gtctcgcgtcgtaagtatttgaaaa  taatcgattgattggtgatcgaatc AT1G64150  gcaaatcggttccaccaaacctgtg  cattgacgttcagcatcatcatgga AT4G39680  tgaacacatctatcaaacaaagctt taagagatggaaacatacatagagg

AT2G47960  tctgcttcttcctcagtccttcggg  tctctctttcgtttctcctgcagat AT1G53210  tccatgtggttagaaagactgttga  gacttgggtcacaaaacttatctgg AT3G17510  aatccgtcatcctaaaatgccaaag gctgtgatatgctatggttttaaga

AT5G12130  ttttcgcagggtgtgtagagcttac gattttcacttaactcttcaaggag

AT1G10760  tgagggaagtgccaacacagtttaa  taacaggtgtattaaattcttgaga AT1G49580  caagccttgagtcagtcatttttaa tagttttatgtctcctgtcttttgg

AT5G37130  actagtctgctctgttggtgctgaa actatggatggtgctgaatgtttaa

AT4G34960  gatattgatggccaacgcttaggta  tgttgatttcgctttctgtgattga AT3G19800  tctgtcgacctctctgtccaaaggg  gaagctgtcttctctcttacctaat AT5G18100  tgttatcaattttagttctgctgag taaaggaaccatttggatagctgat

AT5G35170  gttatggtcaaggtactaggcaatt  tgtggtttggtatcatctcattcga AT2G42220  caggtaatactagttccctcaactg  gactcctttgtataattcgccaagt AT5G10520  tcactgttcttgttatctgttaatg  aagtcagttctataacatgtctgcg

AT1G80760  aactctcccacctgtaatcttgtga gacgtccaaaatttcaagactcttc

AT3G45240  taacgaaacctacaagaaacattga  caaaatccaaactcaagagtaccaa AT3G18390  cattgcaatgcaacgccacgaggtt  gatgatcacagggttcttttatgac AT3G09800  gacttgagatgtacctgaaacagtg tcaagactcaaataggcagcaatgg

AT3G01150  cccaatttctagctcccgggatttg  gactcttcaagctttcgttttggcg AT3G21070  cggcgattactacacgatcagaaat  gagagtgagtataacagaatcggca AT1G53590  cagcggtatccgtgtctaagaaata gctggtattgacatctattacgatt

AT1G04200  ggtaagcaacctctacacatatcca gctcttatctttcttccacttttct

AT5G61120  tccaccagaggcaatgaaaaacaag  tgatttagaaaaagaaggaattagc AT1G03380  tgtttctgcccctaaaatattcttg tctagggtcgttttaattcaagcca

AT4G24280  tatgaggtacagttaatttttccag gacttagtactttcacaagcatctg

AT1G71691  aatacttatatcagcctcgttccag  ggaaaacttattataatgcatagag AT5G52100  cacagggtgagatgagatactcgca  aaatctaatttcgtctctgcttgcg AT1G21170  tttatcaatagatctttctttgcca tgaaccctgccgtttgttccttgca

AT4G17150  gacctcattctcaagtgctatgcgg  taattgcggtttttatgttcaagca AT3G53970  tgggaccaccacacccgtaaaatca  cacacacatagagatacacagccat AT4G21660  gcaaaaatgaaaccccgctgagatg  atatacaatagatatctacacaacg

AT1G22490  tacggtggattttcttgttaatata taagaatgaccctgaccaaatgata

AT3G21465  gatcagtttgttgctcatttttcag  gctctgatttccatggcttattaat AT5G65960  gagtgaggtttgacattgatgatga  gatacacgcttcattcttctcacct AT5G59650  cactaggttcgtaagcttattagcc taaaatgactttccttctggtggac

AT1G31660  catcatctcagaaacttgagaacca  tcgcagaaggaatggatagaacaaa AT4G34830  tttgcataggcctttacaaaacagc  tctgagcctcaaagaatgaggaaag AT1G26940  tcttgatcgccaggtcagattgcta gactattggctttatcttaagatga

AT3G46210  gaactgcttctagctcaacagtagg  ggacacacgaatcaacacagagcta AT1G70100  caggtataacagagacatgcatcac  tattactcatcgtgtcttgtttgaa AT4G31130  ccagatgttatcctacacgacaata aatggtctagctactgtgttcttga

AT4G10770  taacacctaaacatcattcacactt gaaaccataaactcgatcaaaatca

AT1G76630 tattcaggtttggtttcaattggcc  gctgcaatctgtctttattgtcttg

AT4G33210 actgacctgcactcactgcaattga  aacagagtttacgaatcatgcatga

AT1G53165 tcctcaggtttcatattctaaatat  gcgaagccacctttcagagctagat AT4G03415 agcttcccctatcagacccacaaaa  ttagataaatgcatacaagccagga AT1G27520 gccttggtaatatactagcctgaaa  cgcaatctctgttatgacacttaag

AT4G28080 caagctgtaaaaggatttccagaaa  tgagcaaccattaagaccaacgcat AT3G48860 ttgaactggttgtcttgagtagtcc  tgttgcgtcttgaaattctgactga AT3G61080 tgatcctgcctgttactgtataagc  gttttgatctcattcctcctccaca

AT3G25660 gagactggaactcaggcacatcctg  cattacaatgcaggaaaccaactac

AT5G40380 ttttatatttggaccattactccta  catgtttaggcttttttacgcatta AT5G66540 catgcttgcctgatttaacgtttat  tatgcaaacacaaaaacccaggaaa

AT5G64813 ggatggttagtgtcattaccacacc  gtcagatttctaagacacccttccc

AT4G14220 tccaggatccttccactgtcagatt  tccgatatctaaagctttccgatgg AT2G42750 ctatgccgttctcggactcgtaaga  tgtgactttaataactctcctttgc AT1G80050 tactcctgcatacatcaatctatgt  ggcaaagactaattaaatagcgact

AT5G15020 gatgaaagaaagtaacgtaaggaca  tataagtatcaacacatgcagacct AT4G18640 gactaaactatgagaagatgagacc  taactatgttctgataaatgttttg AT5G13740 gaaggtggcttctttgttaccgcta  gcatcttctcctatcttattatcaa

AT3G12550 aaggttggctctttaactttatgtg  taccgtgtttttaaccttagatgca

AT5G43130 ttaacccggctttagccactgccag  tatgtaagcttcgtctccaagtgat AT5G14030 gctcccttcattctagttcttggaa  gaattactttctgttgttgtggccg AT5G51540 tcctgtatgctggttcaaatttcat  cattttcttacactccgcctgttga

AT4G10050 catcgtacctgcagggcaactaaca  tcttaatattcaaccgtctcaggaa AT2G28305 ccagtaatcattttgcttccatttc  tttcacatacgtcctaaccaaagta AT1G72175 taactctgttcaatgagatcggaaa  cactggtctaattacgaagtttgcg

AT4G31990 tctggagcttcctgtacattttaca  caactaaaacatagccttctaggac

AT4G36210 tcgtatagttatttcttccagaaca  gattttgtgtctcctttcattctta AT4G20020 tttgcttagcctcttccacgctgac  gacaatttagccaaaagcaacgaat

AT5G40870 ctgtaggatttgtaagcataggttc  cctaatttgttttctgaggatgtta

AT3G04420 ccctctgtttttgctctttaccgtg  cgattctgaggtttgtcgatctcaa AT2G32700 caaagcgtattctaacaccccaagg  gatacaagtagacgatataaatata AT1G70180 ccgattcttcacgtattttaatact  ccccggaatcttatggtatattcta

AT3G03330 cctagaagaagaatacagagtcagt  cgtgtcaacaaaaagctcacaattg AT1G53510 caatggcgctgcaagtgaaaaagta  taaaaagccaggcagaggtacgcga AT1G59750 cctggtattctgtgttcttttctct  tgttcttctttgtggcggctcttgc

AT5G40810 caatcagtcgtgagctttttccctg  tttgttgagcatacaccttcttgtg

AT5G05030 tcctgtctctttgtcctttaataaa  aatatatactgtgttaggttttcta AT1G79270 cacacgtgtttaatctgtgttgttc  aatctgatctcttcgggaacgtttg AT4G17610 agcaccaaaacctttggaacaacag  tagttactatgggaaagccacaagc

AT3G31310 tcaactttcattactctggagccaa  cgatgaataggatggtgcaatccca AT1G76850 cactctcttgagacagatcctatcc  tacataacaaggctcttgacaatat AT4G14720 caagatgaatgatcaaaaccatacc  ttttcaggctggacagaattatgtg

AT3G53040 acttcccttcccttcttcacctctg  cattgggttaaatcgctttcaggac

AT2G02090 cactatcttcaggtttgagctttaa  catatatctgtattaactctggcaa AT3G56510 tccacccacctgcagttaatgaaca  caagggaaaagccaataactagcgg

AT1G21880 ccatgtaagtagaaatacattcact  tcttatcaacatacccctactaatg

AT4G21470 gggacttcctccattccaagactgt  aacatgttcatctcggtaatgagac AT2G44450 tgcaacatctgcttaccaggtactt  aaaaaggtccgatcactggttagag AT1G10600 tgtatatctctctcttctagctccc  gatctgtttatctactttgtcttga

AT5G53550 caagtattaactcgattttttggca  agctctctttcaccactaattctag AT2G42380 tggtgcatcgtaatcaaatctgatg  tacgtgcatgcatgttcttgaataa AT2G20470 tctgctctaacatgcttcgcctgtt  aaatcacgctccatttgcaaagaag

AT5G17930 cgtttctccttttccgacttctgag  caaaaaccaacattacccatcaaca

AT3G10060 gcagtacggttgtgaatacgtttcc  ggacatgtaaatgctaacagtttta AT3G14930 tcatcgccaaccaggtccgataaag  gttctttcgattactgttatgccaa AT2G16950 tgcagcagctggctaaggttccatt  catgcttttgttttccgtttgatca

AT3G11880 caggttcatgtgatcttttgttccc  cgaaatttgtgtgcttttgtcatct AT1G16880 tacttgacactgtaaggaaggatac  actttagattgagttttgagctgac AT2G45540 cctgcgcacatgaaataaatgataa  actgggaatggcagtaattgtggca

AT1G28260 gactgcaatggagatgacctgttct  cattgcagataacagagaagtatca AT3G63520 gatttcttcccgtgaaattctctca  ctaagggttatttagtattcttatg AT5G15940 tgccgctttatccacacccgtaata  gatctgattttcttacttacacata

AT3G54020 tggttgatccctttactcttttgaa  ttaagctcttcttgctttgtttggg

P á g i n a  | 206  

 

AT1G63770  gttctttccaaggtttgtgtacaca catttctattgtcagaatcaatcaa

AT3G07180  ccggatggaatatatctgacaagat cataataagcaaggatgggcagagt

AT3G45100  aatgtgagttacaaaaccccagctc  gaatcattctgccatttctcattag AT1G42440  catcgtcctgaacaatgagcaagtt  caatgaagctacaagtactgttttg AT4G03110  gacctgacaaggatctaagcatcct gaagaacaaatagtcagagaaatga

AT1G77800  cttggatctcttgtaagcgccagaa  gacagtttctgttgttctctcggct AT2G33860  gatctgacaaaacaggtgaaacatg  tgggcatataaaacacaggtgtgca AT5G66190  gaacatcacaaacactaagaacagt  taaacgatccatcacagacacattg

AT2G27210  gataccagcatgctgcagtatgaga tacttcttttagctagttccatcag

AT3G49720  aaactgctgataaattgatcgatgc  taacttaagcacatgtactgaacaa AT5G13960  ttcctttttttgtctctaggctcta  aataaatttcgtttttgctgtgttg

AT2G34410  aactcttgaacctacagccttctcg tcttctcatgaaccctacgattaaa

AT5G40240  gcgacatgaacctgttccactcaag  cagaaatgcccataaatctagaagc AT1G09620  aaacgcaaacctctaatttagatat  taagtgcaacacaaaaatcggtaga AT4G27400  tccacttggtaatcatagaaactca catttttgtaggttgcgattgtttc

AT2G44280  tacacaagactacaaattttgtgtg  caattgcagcatcccttgagaacaa AT2G39970  gtctgttggcgcgtatttacctaat  gattatccagaagaattaggtgacg AT2G11000  tagtacaaagcaaggacaccacacc  tacacacttatagcaacctcacaat

AT4G35360  tgatgtcacaaagcccaaattcatg cataaaatgcaaaacagaatcacga

AT3G01610  gaactatatgacgaaaataagaccg  gatcaaatgcatttcgatgttccag AT3G17770  aaggagattctattattcttctggc  caactgtgaagtagcaataacgagc AT3G21180  agttcattatggttctgcttgtgca ggtcatcttccctttctatttgcta

AT5G51140  tctgacacatcaaagtcatgcagct  aagttggaaattagagacagttaca AT1G47870  ctaggcttaaggttcattgtgacaa  tccccattactgaccggttacatat AT4G33380  tccaataacgataatggttcctact gaagcagctctgttggttttttgtt

AT2G29390  tcgccacaaagaagggtcagtgtca gctagtccaagctccaacaacaata

AT3G25585  aataactttcttcttgctcgatcaa  ttgtcctcactaactttctctcttg AT4G04970  tagaggtctaaaagcttctcctttg tacggtaatatgtgttttgagttgg

AT5G50950  gatacttgctctgacctaaatggtg tcttgacctcagttcaatgtggtac

AT3G19870  ggtatgaccatgacacccacgtaaa  ttatgaattgtgatgacgttaactc AT4G27340  aatccgtatccgctgcaagtccaaa  gatgtggtttttcatccttttagac AT4G04955  gataggaagaacaaactgcaattgg  tttttgtgctctcacagtttctaca

AT1G10090  tggctatgttcttatactcctacag  cagtaagcgtgaaatgaaccaaggt AT3G48870  gaaaccgatcactgctcattcaaga  caatgttctgtgttggtgaaagact AT1G76050  cagtcttctgcaagtgcaccaacca tgttaactgatactgatatatgcta

AT5G43080  ccctacaagcaacacgtttctaagg agtttattgtctcattgcgttttgc

AT4G11820  gtttccacatttctgttcattccca  aacatgagcggtccacgtatttaca AT5G17920  ttcttaggaaattactgtttgctcg  tttttttctacgaagttctgatctg AT3G18810  catatgggtcttgcctgtgtaaaaa gaggaaccattaatgtgatgaatat

AT2G31870  tcgaacggacaggtaagaaaagcaa  tactcaagagtcaggaatagaacca AT5G08450  tacacaacctagagcaaaacacaga  caccagactaaacattgaatcccta AT5G25880  tacttctttgaatctcatttctatc  gtttcttatgctcatctttgtgtgg

AT5G62090  cacactgccattcatcctgcaaatg ccgtaagatcagcataaagagtatg

AT5G56610  ggtgtgcttgctttttaccttcatt  ctttctgttacttattatgcagtcc AT3G08930  gcctcttgaatgtagcattagcatt aacatattcctgtctctggctatca

AT4G20320  taaggactccaaatcagcaagactg cgcatctctttgacattttaagcta

AT5G40480  cctccgtttatagggtattgatgct  gctcgttcttgacttgactcttatt AT4G04920  tattcctgtgtcctctttattttga  gaggcttaggcttaatctggtcaat AT4G39800  caaacccccaagaaaatcagtcatg tgattgatcaatgagtgattaaaac

AT3G46220  gctgatacacttcttcatggcttgg  aatcatgcttcgattttcaatacag AT4G38930  gcaatgtttacaaccccaattctaa  gagccacttacatccatcactgttt AT5G03830  ccgatttcgtgaagttactctgcta ttttaattcgttgtttgatctttga

AT5G57160  cactcattcccagtttcaaatctgt gatggaaactttatgtgaagaaact

AT5G44070  aatcttttcttatctttcgcttagg  ctgtatcatggatgtaatatttcta AT2G01990  gaaaccacatgtatctgcaaacata  tcaatattttacgattgaaaaaaca AT5G13300  gcttccagacccctaaacatcaaat ctttatgaacaccataccgtttgca

AT4G16990  tgctacgttgggatatacccctatg  cacatgcaatgcataactctcttgc AT1G50030  ccaaacatcatttctcagcaagcag  ccgccactggtattgcaattataaa AT4G00180  taaatgaaatcagcaaactaattgg gaaaagccctaattattactctctg

AT4G28080  gcagcaaaaagaagtcagtctcact  aaatgtttacatttttttagccatg AT4G21323  tctcgaatgatccaaagcttgtgat  taaagttgcctttccatgacctgtt AT2G35510  ttgatacccttcctggctcctgctt caatgactgcttgaaaatgagaatc

AT5G35910  gcttgaagcctaacaaaatgccaga taaaataagtatgtagaccctctca

AT5G16190 tcacgaggtagaaagatctacatgc  ctggctagttactactatgatgtga

AT4G38170 catccaggggtaagcgaatactggt  acattgatgtcctctgttccttggg

AT1G15460 gagcctggtttttaaaagcaagagc  tcttgatttttctttcaccggaaca AT1G52710 ccttccctatacaaggagaacacaa  aactaagtttctgatctccgaaagc AT5G02130 gcaaacacaaacagggactagtgat  tcacactaggacctgtatgcacaag

AT4G08980 tctccagtggtagcttctgagttag  ggttttgtggagttttagctctcag AT1G48840 tctatttccctgtaaggaatgatgt  tgtattcacttcttttcttactggt AT5G47770 ctcttcttccctagtcatatttggg  gatcccgtgacaagctgtgtttttc

AT5G23510 tatctttttatatgaatgagatcat  gattggttcccttaaatatgtagca

AT2G44220 gacggtatgttctccttttcagcag  gcgtacttatctcttctactataca AT2G24420 tgttctctcgtcttgcactctaaga  tgttgcttcctttatcagcttaaaa

AT1G08910 caagcaataggctgttttggaggtt  gatatctttagttcctctcctcata

AT1G20090 gcaatacttttcctactgtaaatct  ttgatcttgaagctactgtgttttg AT4G25990 cctaaatcgtagctcaaataaaatg  accttcattctacccttgttgacag AT5G05930 taactgatgtacatgagggacctaa  ccataaatgtggcaaaagaggacga

AT1G06900 aaaaagcatgtgttcttcaccaaac  gcattcaaaatgtagttcaaactca AT5G58140 tctactcatgagatttatcatgcct  gatatggatatgtgcaaagtggttg AT3G07660 gttgttgatgttctgtaccatttca  tttacacagaaacccatgaagagac

AT5G17550 tccaaggcacctgagaaagacccag  tatagaaaacgaacccacaagaaca

AT1G52810 tgcggttgatggaaataccaaggag  ggagttaggcatggaggctcataca AT5G01510 tgcagtcctacaatttaacacggta  gatattcttacaatcccaacttgag AT1G55250 gttggtgtgccaattatcgattcat  taacggctattgaaaattcacattc

AT5G63880 tatgttttgtatccggcatcgtctc  tatggctttctcaaactttcatgtg AT4G01540 cacaagttctttgccagccaaacaa  gaacacacatcaatcaaacaactca AT5G37630 tattcgagttgttatgctttggaga  gtttctttctaatggctaattacag

AT2G18465 tctgtgccatcctagtataccaaac  tacatacagcagaaaagagccaagg

AT2G28090 tcctattgacaaaatcacatactca  gacacagattaaaatggccgcaaac AT5G02130 gcaatgttacctattatcatgtagt  aataatcaggtttcttcaaggctag

AT5G35570 gaaaacaactgtatgcaaatactag  gggccccaatatggctatattaacc

AT3G27925 caccaacctgaacatgagagaaaca  caactttagtctcccgttagtggat AT3G48820 tttgcactctgcatcattagatcag  caaacggatcaagagggtataacac AT1G68010 gagggatggcttcctcatctgtatg  gaacttgagaactgttgtaatcgcg

AT1G78900 ccatgcttcaggtttgcatgtatct  cttgcaaacgtaaattttaagctat AT3G48420 ggttctactacttcagtttcctgag  ggaaatacttttctcatttcttgcc AT1G51340 tagctggccaggtttttagataatg  ttgcatccttttacgattaagcgcg

AT5G19150 tccaaactgtcgaaaaaagtcgata  gacgaaatgtttttgtggattctct

AT3G12270 tatctttctcactctatattggcca  gcagatcctttgattgtttaagtca AT3G50430 catctgcctcactcgggattttaga  tccagctctcatactcactcatttg AT4G19710 atggtaaactttgcgttcctgttat  gaggccaagtacaaacttctgatca

AT1G68370 cattccatcagcatcgagtgcctaa  ggcaacataaggtgtgaaacaactc AT4G30150 tactgtatgaacacgaagtaagtca  gcgctatatccagacattcatttga AT1G74670 tagaaagtgtaagttttataattca  aaaaactcgattatcatgattgcag

AT5G42490 aaatgcattgtttagcatagcgagg  tcgacgaacaaaaggatggattaac

AT3G28030 ttacacagaaggaatcaggttagct  ctgcataaggtcaaagttccgctct AT3G60600 cccttgtaagctttattcataactc  cgcatgtcttattgccccagatcta

AT1G26110 gaaagaatgcccgtttggctgagaa  tccagctaactaagacaccagcaaa

AT2G34860 tctccgtttctatgtaacatctcta  ctgttcctttccgacattgtttata AT5G50375 tccggcggagcgattatgtcaggta  cattccctgatttttttgatttaca AT1G79750 tttttaacctgtagacaaagcgtgc  tagaaagggtaagtgaaacctgaca

AT2G03070 caaggaatgatgcaggttaaactag  cattgtctttcgaggttcatgtctt AT4G25100 tccgggaaaaacactaatgcgtaga  gacatttgccgacaatatcaatctt AT2G35260 gctgtacaggtttggtttcatttaa  gaatctttgattgagttatcactga

AT5G06910 taaaatctctgccttcgtttcttaa  tcaaacttaaccttgttgtgaccac

AT5G23390 ccaacgtaaaccacaattttcatgt  tatgcagagatctctccagaagttc AT2G43650 cgagattgacgcctgtaaacttcta  taacgattctgatgagatatgtgtg AT1G33270 caataagttcattaagctccatgga  gagagaatgggaacagaacaacaca

AT5G09420 caagcatgtctggatgttgtcaggt  gttgccttttccttactcttcagtc AT3G09100 tcatagaaaggcctctgctccattt  gagggtaatggcagctacagtattt AT4G30310 tatgttggataagggagatcatggc  tagagattaactttgacattgataa

AT4G16444 taacgtaattcaccaatctgctcga  catatagaatgagatcgtcgtgagt AT1G47870 gaaagttgtgagtctcttcgtttac  cgttttggtgattgtaatgctattg AT1G34210 gcttcgctttctgtaagaacactta  gtggtctgagtttttgttgcaagga

AT5G56850 tatctctacctccaaaaaccctcaa  gactgtgccacattgaatccaagaa

P á g i n a  | 207  

 

AT1G03270  tgatttgttaccctagtttttctga  aaattactgtctttgtgcacctcag

AT3G12210  caactaggatgattcttgaaacatg ggactcttgaatcagatatggattg

AT1G02080  cttgatggagggagaaacagtatgc  tgttttggctagtgaacttgtttta AT3G51850  ttgaagcggtgcacatatctttccc  cacgttcactatccaggttcactaa AT1G65050  catcacaagttaagaacgtctattg agctcctaatttatcccatgcgaaa

AT3G09100  caatacacaataacttggatcacgg  caaagcaaggagaaagaaattccag AT3G19420  cgatctctgaggttttccccttcaa  ccttttttcctgatctgaattcgag AT1G31800  ggcaattgaaaattcactactggtt ttacctttttactttgatgttgtgc

AT3G08850  tgagcttgctaatagctggtcaagg tcaattcaggcgactagtataggta

AT4G04320  gaagatagtttcgaatcagttggta  cggttgtatctgacactgatggttg AT1G51070  tgactttcttgttcttgctatgcaa aaagttttccttcttactgctgcag

AT1G74910  gccgaaatcgagtgcctgtgcatca caatcgagatttcacagtcatttgc

AT1G26370  gaacattcgcaagtccattccacaa  ggcaggaacaatatttagatcacca AT2G41700  tatattgtgcaacctaaatggccaa  ctgccagtacatgcatccagagata AT3G16320  cctttgtggccacgagtacaattct taacataccggtctcaccttggctg

AT5G40155  catcatttctggttagtcctcgtcg  aatccgaatctgttttagattggcc AT2G18450  tgatttatcccctgcctttttccaa  gatcgatgattcaaacaatgtctcg AT5G59840  cgaatccagtttctaatgtctgcaa gagaaaagatccagaacaaagcaga

AT1G18030  gagttggtctgtcttacttggttca tacaactgttttcatgtcattcact

AT5G63170  tcggctgcattcatttttcacccca  cgtgaaaatgattataactcttaaa AT1G74700  tctcgtcatggaggtgaatatctgc  gaagatttcatatatccttaaactg AT5G25270  tctggaatcgcctgcagtagtaaaa taatcatggaaacaagggagctcgt

AT2G39340  tcatcccatccaccttctcaacagg  tcatgggggtcctttttattgaata AT5G04370  ttttttcggtttgttgaatccatga  tggtgcgattttggatacaacgagt AT5G58450  caggtgacttggctttgtttcaaca ccttgtactggtttacccattgttg

AT4G23470  cccatccaaagtgccattcttataa cccaattttaacctattgtcctgat

AT1G17580  ccatatttaggtttaggagcagaga  ccgttcatgtattttggttgattca AT4G05631  tcaatccaacagatttgaacccctg gaattcttctcagttgctataccag

AT4G39050  gccgtcatttctgctgtaagtcaca gaaacctcatgtctcttcttttatc

AT4G20400  tctctccccgcacgtaattaaggtg  gcctacatgaccaaatttccatatg AT5G58160  gggtgagtttgaaattgtaatgtgt  gaatcttatcttttatcctgctcta AT5G62890  ctttatctgtcggtggtgtgtgtag caatgagttcctttggaattctgca

AT1G21650  cccgagcagtctagcatacatcata  ggatgaacaagaaggcacacttagt AT2G16750  ctacctcttggttcgttggttctct  tcgaacctgttgaccagaaatgggt AT1G53110  gattccgaggtttgtcttgtcagtc gtatctgagattcgagcatttgttc

AT1G06700  gagataggaccagatgtgtgagcca cgaaatccaaaatcattcagataaa

AT1G27770  gcgcgtttcctgagacccacagtag  taacagagaagttagttgcaatccc AT3G49470  agcttcaggttaagacgattttacg  tttacttcttagtctcacgctcgag AT1G72380  caagctcataaggtttcaatttctc gtatcgtttattgacagtacctaga

AT3G11830  accgcactgcaagcactttggtttg  ggttcttttgttgccttactcacta AT1G05570  aatgatcgatcacttagaagacggc  gctaaacttagcagagaaattcatc AT4G14030  tctattccagttccttcaaagccaa gattcgatctggattctaaaacagt

AT3G61450  tcgctcttaatcttggagagttgaa catcttctttatctttatttggcga

AT3G63140  gccgctaacaatttcctgtcgacag  aggttcggtctgaatcggattcaaa AT1G57600  tccattgagcatcagaaacatccta cacagataatgagcttcaaagcaat

AT4G00905  ggcatgaatcatccatagtttttcc ccttctatagtcaatggtggtagca

AT5G18190  tttgcccaacctataaaccaacaga  taagaacgagaaaaaagccagcaac AT1G71440  ggacatacctgcgaccatccaaaga  tactgacgctgaaccaaacaacaag AT3G53570  tgttgaaaccatttaaacccatgcg gcattttcccctcaaacttgtcaaa

AT1G70410  gcaagcaaacaccagaaactgccat  aaagcttgtcacactcttttgttcg AT1G26190  cgggtatacctacataaacagtgag  caattggcagctcatatactaaacc AT1G58320  caatgttccaccctttgtttgtagt tgcaacggtgacaaaaacaacaaaa

AT4G28780  taggtttacacattaggtttataga cacgttcttctacttatgtgataca

AT1G73960  catttatctccaacaagctctcagt  taaaacctatcaaatcattaacatc 

AT2G07050 tagaggtattgtctgtgtgcctaga  tgccttagtcccctttgcttgaggt

AT3G02070 gaagtgtcttatgagttctgaccga  gagaatgttctgtttcatactcata

AT1G72320 tgtatggctgtatatgatcctgtga  agttgggagttactgtgaatgcaca AT3G24160 gatactgaacttccaggtgccctat  tttaagtcttactttggatattctg AT3G07950 tgtaagtaacctaccaccttacaca  cgtgttctttgttttctcctggcta

AT5G14720 tgatgttaagtaagaacaagatgcg  gagacattccgtatttaatttcatg AT4G17330 tttcacttgcctgctaacaacatca  cagttatgtatttggtttacgtcca AT3G01310 gacacagtataagcaaattaatcaa  tctcagatcctgactaaacagagag

AT1G33360 aaggttctgccttttcacttaacat  tgatcatggtcctgtgcttcatttg

AT1G27150 aaggcttgttgtagagtcttactaa  cgtcttgcttagtatgatgataaac AT2G39320 tatgggagaagtccatatgatcaac  aaatcttcggatgagttttaagctg

AT3G59890 gtgatcaaatcccagacaagaacaa  gaagagagtgaatccagtttagaaa

AT1G58060 caaacatatattcatgatggtggaa  caactcggaaattttagtgcaacag AT4G23380 tatccatctgcctgtttaaatcaat  tatatctcactaagaccatgccaag AT3G60920 tcaaaatacatggaagaagcactac  tggcatcccaaaaggcacgcgtaaa

AT1G76730 tcacctacatttacacaacacaatg  caattttgcggccaaatgtttgaag AT1G18700 taaaatcttttttcaacatcgtcca  agttcttgtctccttcctgattaga AT1G70740 tctaccatgaaacaccaacaaacaa  gacacaagaagatatgtaaatgagc

AT2G36390 catttgcgcttttgttcagtattac  tgatacctctctccggttctctcaa

AT5G41350 aacccattctcgcagtcatgtaagg  tatgtttttgagatgtgggaaaggc AT3G48000 gcaacattgcccctacaaaaacatt  caagaactagctaggaaaatgagtc AT1G19130 taactgcagagattcagaaaaatat  caaaggaagacatagatagatgcaa

AT4G19410 gatattaagcaacactgactttagg  catggttgaagagaattagcaattg AT2G36900 ttctgcaacaaaactcccaaacttg  catagatcatccaaatttgcttgcg AT2G29550 tgtgagtgaagtttcaatactaatc  ttgactcataatcgaagaacattgg

AT2G42040 cgtctcttcaatacaaggtacacca  tagttgcaccattcaccgtttgtat

AT2G22870 atcagttttctttggctaaatttgg  tcttgctttcagataaacgttatta AT1G17830 cctaaatccgcattaaaagttcaag  tcgaggccagaaaccaattgcaaat

AT2G41460 tacggttctgtctgaaatcttttaa  catttagctgatgtttggaatctca

AT1G17760 ccttttgcctgctcacatgattaga  caacaaagccaagagaatgaagttc AT3G58080 cagcaaacacttggttacaaacacc  tgccattaaagtcatagtcatatat AT3G48120 tccgccatcgaggtttactgagtca  tcagagcttcagacagtttatatgg

AT1G42430 taacattccctttaccagatatagc  cagttttcgcgctgctagattctta AT5G38070 tacaacgttgcaggcaagagagggt  aacttgttcctttatgctctatttg AT5G65440 tatgtactctctagttgtcttccaa  tctggtttttgttctcacagccacc

AT3G26840 taccttctcgttgccctttcgaagc  gatagttaatgcgagttaaagcctt

AT1G11930 caaagtgaagcctttgctatgtaaa  tattgagttactaaattgggtgtaa AT5G47010 gatgaacaaggtatcacatttcagt  gtgaccatagcttttactctttttg AT5G58370 cctgtctgagaactacttgcttgta  taataacaaagggtttatgaagtgc

AT5G18630 catatggtagaggtggtaatgcaac  gaggctacgaaggagttaagactga AT2G47410 agcatcaggtttgtcttctctcccg  catcttgctgttatccttgcttgcc AT5G23690 ccaattcaggtaaatggaatcaggg  gtctctttgttgcaccttattacta

AT1G18700 tctttcaccaccttgaactgagtgt  gataatgcatgattaggaaactgat

AT5G60990 aatctggattgcaagttctctggag  caaagtaaacactagaagaaactag AT4G30870 catttgatttcttggatagatgtca  tcggaattacggagaataattggaa

AT1G71720 gaaaacgtaaagcaagagtttcatc  ggctttactgttctgcgttttctca

AT5G19350 aaagcttactgatgtgatgtatgac  tgctgtgttcactgaatgtggttga AT2G36390 ggctcccgtgtgaaggttacatgtt  cgtacttttgattgtatgtcatgca AT5G49340 cttcctggtaataacctttcctgca  gaaggtttttctcatagttcacata

AT3G01310 gagaaatgtcctccctgcatatcaa  taatgtgactcttcccaaggactac 

 

   

P á g i n a  | 208  

 

Tabla H: intrones mayormente retenidos en la mutante dart5 con respecto a la mosca salvaje. Se muestra el locus y las sondas que reconocen a los intrones.

Locus Intrón afectado

Sonda 1  Sonda 2Dmel_CG8266 AAGATACTTAAAGGCCGGCGGGCAC TTTACACGAGCAGCACGAAGGGACA

Dmel_CG1578 CATAGCGTTAGTAATCGATTTAGCA GCCCAATGAAAGTGATAGCATAGAG

Dmel_CG33208 TATCATTTTGAAAACGGCAAATTGC GGGCACGTAATTGCACCCGTCACTT

Dmel_CG11255 TACCAGTCAACATTGCGTTCAACCA AGTCTTCTTACACTTTTCTATTTGG

Dmel_CG4268 TATTAATCTCAATTGAATGAAACAC GATGGGACGGACACCACTTAAAGCA

Dmel_CG9163 GGGTAATGCTACAATATCACACAGT TAGAGTATGACACTGTTTTGTGAAC

Dmel_CG15899 GCGGTTCGTTCGATGGTTCATTGGA TAACGAACGGAAGGTATAATTGAAT

Dmel_CG1909 TGTTTAAATCTCAAACTCATTGCGC AAGAATGTTTTCAATGTTTTAACAA

Dmel_CG8108 CTTTTATTGGAGTCTTGAGTTATTC TAACACCATTTCCTCATTGATCCGC

Dmel_CG40045 GAAAAAGAATACAATGTTCATAGCA GTAATGGGAGTTACATACAAGTGAC

Dmel_CG12020 TCCTTTTCTGTTGGAGGTTTCAATA TGATAGTTTCTCTGTTTCTTCTGCA

Dmel_CG1099 GACGAAAAAGATGTTGGTTCATTAA AAATGAAGTGGTAACGGGCTGTGTC

Dmel_CG9086 GAAGAGATTACACGCTTCATTAGTC TAGGTGTTCACCTAACGTTGGCAAG

Dmel_CG8177 TTTTGTACTCCGCTCCACGAGCTAG GATTATACCCTACTTAAATTGAATT

Dmel_CG11798 CATTGCGTTTTCGTTGGTTTTCACT GACATTTTTATTCACTTATCCTTGC

Dmel_CG11853 TAAAACAAGACCTTGCCAATGAAGT CCTAGATAGACACCTACCTCTACTT

Dmel_CG17698 GTTCTACTCACAATATTCCAATCCA CAAATACCCGTATACACGAAGATCC

Dmel_CG18646 AAGGGTTTTCATTCGGTGCAATGCA TCGATAACACCATCACCGACTGGCG

Dmel_CG6706 TAACCAAAGATTATACTACGCGGTC TACAAAACTTCCTTACTACCAGTCT

Dmel_CG14180 GAGGCACCACTGTAGTCTAGCGGAG GAGCGCTTTATCCAAATGTGAACAA

Dmel_CG3540 GAGAAGAGGGTTGATATTTGTTTAG TGTTGTAACTGTGTGATTAGCGTAC

Dmel_CG34405 TTCTGGTGGATGTTCAGATGCAGCT TCAACACCTGAGATATTATTAATCA

Dmel_CG7199 ACAAAAGTTGATGAGAACGGAAGGC TTGGTTATAGCTTGAGACGACGACT

Dmel_CG9366 ATAGAGGCGTCACAATCGGGATTGC CGAGGATGAACTTAGTGGGATACGA

Dmel_CG2818 TATGTACTGACCGACCCTATACGAG CCAATAACATTGCTAAGAGATTCCC

Dmel_CG9176 CATCGTTGTGAGAACGTTGAACATT GGCCGATCTGAAACAGATATATTTA

Dmel_CG33518 ATTTGAGGTTAGCAAGAAGAAAGAG AATCTTGTTCAGTGCCATCTATATA

Dmel_CG1522 CATTTTGAATTTATCGAATTCATCA GAGCGGATTGAGTGATGGAATATTT

Dmel_CG10693 TTTTGCATTGTACAAAATAAGTTTG GGGCGATCGGGAACTGATTAACTTT

Dmel_CG7535 TATGCTTCTTAACCACGTATAAATG AAACATCTTCCATCACATGCAACAT

Dmel_CG2818 TATTTACGTCATCCACTGATAAGGG TAGCTAAGGATTATATATAGATATT

Dmel_CG15307 TAATGTATTGTGTGTACGAAGAACG CTGCTCGAAGGACCACAAACGTAAA

Dmel_CG15611 TAAGTACAGCTGAGAGTGTCATAGC AGTAATGACCATCCACTTTGTCCAG

Dmel_CG12071 CGGAAGGGTAACAGAATACAGAATG GTTGCTGTGGTTTCAGTTCATTTGG

Dmel_CG41439 CGACCACACACGTACTCAGTATGGA TATCGTATTGGACTTGTCGTTAAGG

Dmel_CG8408 AATGGATTTCAATTGGGTCAAGGTA TGTACTTTTGGATTTGGTAAAAGGA

Dmel_CG1086 TTATTTGCCATGTTGTGTAATTAAA CCCGCTCCCCCGCTGAATTGTTCAC

Dmel_CG3126 GAGTGGTGTTAGAAATGGTCAAAAA TAATAAGCGGGATTTTAAGTACGAT

Dmel_CG11473 GATTGAAAAAAGGTGGAAGGTGAAA TTGCTCTGTGCAGTCCTGCTCCCGA

Dmel_CG17761 GATTAGTTTGCGAGGCGAAGGACTC GGGCAATCCTTGTAGCGAGTATATC

Dmel_CG34405 TAGCCGTAGGATCTCGCCAAAAGCT CAATTCAAAGAACACTGCTGACTAT

Dmel_CG9412 GATTTAATTATTGGAATTGCTAAGG TCTCCTTACTTTTACTGTGATCAGA

Dmel_CG8253 ATGCCCATGTCCATGGGCAGGAACA GCATCTTGCATCTATCGATTAGTAA

Dmel_CG4294  ATAGTAGCATAGAGCTCCACCCGTT CACGCCGTTCTGGTTGCTGTTGTGG

Dmel_CG32717  TACGGTTACCCCATTACCCATTATC TCTTCTTTTCGATCCGCTCGATACG

Dmel_CG8639  TTTGCAGGCCCACCAACAATCCAAT GCCCAGCACCCTGTGACTTATGAAG

Dmel_CG12746  GACGCCTGGCTTGTTAAATCCATCG TAATGACTCGTCGTTTGGTTATCTC

Dmel_CG4699  TAAACATGACGAAATTCGATAATTG TCTCCGTTTCGTCCCCGTTCCGCAT

Dmel_CG31203  TCGTTTTGTGTATCCGTACAGCGTT GAATAAGCTTGCTAGATTCTGGTAT

Dmel_CG11248  GCTGGTTTGCATACGCCCACAAAAG CACAAACTCACCCTCCTAAAATAAA

Dmel_CG9813  GATTAGAGCCTAAGATTCGATTGCA CACGCCAACATTGATGCGAATGCAA

Dmel_CG33472  GAGTCCATTGCATTTCCAAACCAGA GCGTACTATAACCAGAAGTTGACAA

Dmel_CG12295  CACCCACTTCCGGTTACATCCATTT GGATTCTTTTGACGCTGGAAATTTG

Dmel_CG6477  TGCGATGGATTACAAAAAGGCATGC AGTAGGCGAAGTCCAAATGCACGAC

Dmel_CG12090  TACGTAACAAAACCAAAGGAAATGA GCCTTAGATATATTTGTTGGAGTCG

Dmel_CG9734  GGAATTAAGTCCATTTACTTCGGTC GCCCGCTGCTTTGCGGCTCTTTTAT

Dmel_CG31973  AGTAAGAAAATCATAGCAGATGGAT GAGACCCTCGAAAATGGCAACACGG

Dmel_CG10077  TCGAATTTGAAAATTGAAGAATGTG CATTTAGGGCCCCACAAAGGCTACG

Dmel_CG4019  GAGAAGCGCTTGAATAATGCCACAC TTGAATTTCTTTGGTTTCGAGTGCC

Dmel_CG17510  CAATAGGTACGCATTCTGTCTGGTC TTTATAACAATCAGAACTAAAATAA

Dmel_CG3707  TTAGAAGGTTGTGCAGTTTGATGGA GATGGATTAAGCTATCGATCTGAAC

Dmel_CG32019  GTAAGTCGTTTCAAGCCATTTGTTG TAGCATTAACCGTGGAATATGTCAA

Dmel_CG15270  TAGTTGTTGGTTGGATAGATCGATG TACTTCTCGCTTTTTGTGCGGCACA

Dmel_CG8266  GTCTTATCAGTCGAAAAAGAAAAAC TCTGGGAACCATTTGAGGTGTATTC

Dmel_CG15096  GGGTTTAGTCAAGGCATTCAATAAA CTGACAAGGATATCAGGCAAGGATA

Dmel_CG2621  TCAATTGAATCTGGCGCTAAAAGTA TAACAATGACACTTTCCCTTCACAG

Dmel_CG9734  GTTGAAAACTGAGCGCGGGCAAATT AGAGTTTGGACAGAGGCGTAGTTCA

Dmel_CG31772  GATCCGATACGTACTCGTACCCGTA TCTCAATGATCCCTATTAACTAAGG

Dmel_CG8421  AGTAAAATATCTAATTGCTTGTTGG AAATGGTTTTCTTATTTGTTGCTAA

Dmel_CG11783  TGGGTGCAGACAAGATTTCATCGTT GCTCACCTATGAACGACTTGAATCT

Dmel_CG1522  TGTTTTTCGGTTTTCGATTCAATGG GAACAGTTTGGTAAACTTTGAATTG

Dmel_CG11325  AAGACCACCACATTAGGTACCGGGA CCAGGTTGTAAAATGCTGGTCGGAA

Dmel_CG30048  GAGGGCTAAATATCACTGGAGTCTA TGGGTTAAGTGAGTAGTTCCGTGTA

Dmel_CG32490  TAACTATATCCATGAATATATCTTG CAATGAGGTAAAGTATAAGAATACA

Dmel_CG31814  TTCATTAGAAAAGTACGCTGTATAG TATGCAACTCTTGCAATGTGGCAAA

Dmel_CG32387  GAAATGGTTAGCTAACTCGGAAAAT TGTTTAGCTTTTGCGATGGGTACGC

Dmel_CG9042  GAGTGTTGTTCGCTGGTTGCCAATC TTCCTTATCACAGTAATTAGAAAAG

Dmel_CG6866  AATTTCGGCGAGAGTGTCAACTGGA CGCTATTCGTCGGTGATGTATCGAT

Dmel_CG8034  CAATCGTGTGTTAGAAATTCCAATC TGAATATTTCTACTCCCGGATGACG

Dmel_CG5125  TGTTTGAAGCCCTGTGAAGTGGATA CATTTTATGATAGACCCAATTCCCA

Dmel_CG17927  TAGAATTTTCATGCATTTTGGACTT GATTATCATCATCTATATGTGACCA

Dmel_CG10384  AAAAGTGCGGCCTACTTCTAAAAGA TTTGATGGTAGTAAAAGTATAACCG

Dmel_CG18076  ATTAGAAGTTCTTCAAACCCGGTGA GATATGGATGATTTTGGAGGATTTC

Dmel_CG8604  TTTGCAGATGATGTAATTATATAAC TATTGAGTTCAGTTCTTTATTGCCA

Dmel_CG7971  AAGAAAAAGTATGTGCCTCAATCAT TCTGGTTCCCCCCTTCATTAAGTGG

Dmel_CG32387  ATGTGGTGGCAAGAGGTCACATTAA TTTTGCCCACTAATATTTACAGCTT

Dmel_CG8166  TGCATTTCCCTCAAAGGCTTCCGAG CTTTTGATTTCTAAACTGCCTGTGC

Dmel_CG33217  GGTTTGTTACTTTCTGGAACTACAA GGTTTGTTACTTTCTGGAACTACAA

P á g i n a  | 209  

 

Dmel_CG17364 GTGTCAGCCAGTTGAATCGATGTGG GAAAGATCTAGAGTTTAGAGATAGA

Dmel_CG13506 CGTATCCTCGCACTATCACTCAGTT CCATTTTCCCACACGATCTTTATCT

Dmel_CG11848 ATCTACACTAGCCTGTTTAAAACAA CATACATGAAAGAGTATGAATTTAC

Dmel_CG5748 AATAATCATCGAGTCGGACAAACGG CAAGAAATTCTACTCAATGTTGATA

Dmel_CG17077 AACATTAGTTATATTGTAATACAAC AAAAAACATGAAAGTGCGGACTGTA

Dmel_CG8002 GAAATCTCGATTAGCGAAGGTCTTA CAAGATTTAAGTCAAATTATGTACA

Dmel_CG4128 AAATTGGATTAGTGAGCTTCGGGCA AGAGAAATAAGCGTAATGAGGTTTG

Dmel_CG11661 TTTGCAAAAAGTCTGCGGGGCTATG TTTTGCATCATGTGGAATTCCAGGA

Dmel_CG6695 GAGAGAGTGGTAAAGTAGAACAGCC GGGCCTGTATCCTTGTAATTGTAAT

Dmel_CG1049 TAAGTAGTCAAGAGTTAGGATGCAA GTTGAATAGCCCAACTAATCGGGAA

Dmel_CG2040 GCGGGAAATAAGAACACTGGGAAAA CCGTCCAGTGAGTGAAGGTCAAACG

Dmel_CG4128 CGCAATTTAAATCAAAGTCGAACGC GGTTCTGTGTTTGGACTAACGCGAT

Dmel_CG3164 GGTGTTAAGCAGGTTATTAGCACGT GTTATCAAATTCTTCCTCTCGGGCT

Dmel_CG6584 GCCATTTCGTGGGATTAATTGGATA GATGGATCCGCCTTCGATGGCGTCG

Dmel_CG9181 AATCAAATGTTCTAATTAGTCGCGG AAACGCCGACCGCTGGTCGCGCATA

Dmel_CG10691 TGCGTGTTTTTATCCCCTGTTCTTC ACGCAGTTAGCTCGGCTCGCTCATA

Dmel_CG32018 CATCATTTGGAAGTTATAATCGTAA TCAGACAGAAATATACTCCAGAGTA

Dmel_CG10693 TGTTGTTTATCCATACCAGAAATTA TACACACCGAATCTGATTTACCGAG

Dmel_CG1544 TTCCCATACCCCTCCCGAAATCGTC CCGGCTGCGTGTATTTGTCTTGTGA

Dmel_CG10353 TTAGTCGGAAGTACTGGCACTCGCA GCATGACAACGGGTGCGATTTTCGA

Dmel_CG8532 TTGCTGCCGCTAAAGTTGTCGTTGC TTTCGCGAAATGAAACATTGAAATA

Dmel_CG2086 CTGATTCATGCCGTAATGTGTGCAA TAATTGTGAAGTTACTAAGCCTGCC

Dmel_CG3191 TACGGGTATGTATGTTTTTGGAACA GGAAAGGGAATCTTTTCTCCCAATA

Dmel_CG13503 TAGCTGAATTCATTTTAGGTCCTCC GCTGGATTACTAGGGTGTTACTGAA

Dmel_CG1056 TCACCTTTGAATACAGATTGGCAAG GAGATTCACATATAAAACTCATAGA

Dmel_CG10537 ACGATACGATAACGATTTTGATATT CGCTCAATGGATTGTCGGTGGTTTG

Dmel_CG34405 CTCTAGCATTCTCCGGCGAACTTTC GATATTTGGGAGTTACTAATCCTAT

Dmel_CG18646 AAGAATGTGAGTTTCGATTTGGATC GATTCGGATGCCACAGTGTCCAATA

Dmel_CG2534 TAACACATAATTAAAGGGATGCGAT CCTTTAGTCCACAGCTTCACATTAT

Dmel_CG3625 AAGAGCATTTGACGTGTGTGAGATA GAGTGAACTTTAAACCACGCTGCGT

Dmel_CG9473 CCAGGATCAGTGTTGGGAAGGCTAC CAATCTCTTACAGCATCTAACACAA

Dmel_CG32019 TGAAAACCTCCTTGCGAACAATGCT AACTGTATGCAATCATCCTAACCTA

Dmel_CG10537 TGGAATGAAGATCAGGATTCGATCG CGCCGCATTATGTACGATCTTTACC

Dmel_CG9057 CATTAACGAGGGAAGCAAGCAATTG GTTACGGGTTATAAACAAGTCATTG

Dmel_CG4829 GAAAAGTGCTCTAAAAGTGTCTAAA CATACTTTTGTGAATAGAACTCGAT

Dmel_CG10693 CAGAGATCAGGCCACTCACCTAAGA TCTAAATTACGTCTCTAACCCATAG

Dmel_CG5695 CACAGGAATCGCAAGAACAATTAGC GGTGTTAGTAATTTAGTTAGTATGA

Dmel_CG32809 AACACACAATTAGGCGGTAAAACAC CGTTTTCTCTCCAGGCACTTCGGAT

Dmel_CG9936 GACATCGTGTTAGTGAAACAAGCTG GGTTTTTGGGTCGTCACTTTCACTC

Dmel_CG33208 AAAGAAGAAGTATTGATTAAATTTA TAATATAGCATTATTGATCCCCGGC

Dmel_CG9907 GGTATTTGGTTTAGGGCATTCATTA GCTAAGCACATTCCAGCTAGAAATA

Dmel_CG6859 GATGAGTGGAGGACGCTCCTCTGTT CACCCTACGCACACAGGTGAACTTT

Dmel_CG6238 AAATGAAAATAAGTTGTCGCTGATT TCCCAGGATATCAATAGTGTGGCCT

Dmel_CG1830 CTAACTGATCTTGATTGCGACCATA CATCATGTAATCCTTCACTAACCAA

Dmel_CG17212 CAAAGTAGGGATCGTGTAAACATTA TAAATTGCGGTTTCCAGCTGACTGA

Dmel_CG5958 TAGTTTTTCCTAATCCACTGATTGC CTTGCCCGATCATTTGGGTTAGAAA

Dmel_CG4019 TCTGTGTCTATATAATATTGCGTAA ACCAACTTTCTGTTTCACTGTGTTA

Dmel_CG8779 TATAATCTTTCTTAGACTTCATGTC CATAACCCCTTAAAAATTTGACAGC

Dmel_CG32046  GCAAAGCGGTTAGAGGAAAAGCGAT CGAAACTCCGAACGACTATTCAAAA

Dmel_CG9990  TGGCATGCACCACGTGGCTAACCCG CCATCTGTTTGTGGTTTTGAACTGG

Dmel_CG7007  TATTTCGCGGCTTGAGTTTGACTGA TCCGTCGCGAGTGCTATTTTCTTGA

Dmel_CG3725  GGAAGAGTGTGGTCGTAACTAAGTT GGTGGGTTTCTTTGTGCTGCTGCAC

Dmel_CG32698  TAAGATCGATCTTCTACTTCATCAC TCACTCATTTTCCATCGCTCTTCTG

Dmel_CG10693  GTAAGTCACGCAGCTGGCAGTTTTC TACTTTAGCGAACTTACTAAATGCC

Dmel_CG34405  TCAAAACAACCACACCGACTCATTA GTTACTGTTATTCCAACTACTAAAC

Dmel_CG9057  CACATTACGATGAAAAATACGGATT CACCCGGAGGAGGTCTTATTTTCAT

Dmel_CG4999  TTGCGCGCGCTCAATCAAAACAGTG GTGCTCTTCTGTCCGCTCTACCAAA

Dmel_CG1522  TCGAAAAATTACTTCCCTGTGTGCT TGATTTTTGATTGAGCTTGTTGGAC

Dmel_CG15015  AACGAAATATTTGAAGAAGTTGCAA TAATGTATGTGGGTGAAAGATATAT

Dmel_CG9932  AAATAAGTCAACAATTAGTATAGCT GGCGGCTCGCTTCGGTTTTTCAATG

Dmel_CG1770  CAGGTTAGTTACTCATTCCTATCAT AAAACCATGGGCTAATGAACTTGAC

Dmel_CG2999  TTTGATTTGGGTTTTTAGACATTCC CAACAGAAAACTAGGACGGTGAGAG

Dmel_CG7149  TACAGATCGCAATTTGAAAGATTCA CCCATTGCGATAATCACTTCAGTAC

Dmel_CG8176  ATTTTTCATTTACATCGTTGTATGG CATCCATCAACCACTGCTCATCCAA

Dmel_CG9042  GAAAGTTATCGGGAACGGGCAACAA GTTTGATATAATAACTATGCATCTC

Dmel_CG2146  ACAGCAATTGACTAACCCTAAACGA ACACACGACCTACTAATTTCGCCTA

Dmel_CG2165  GCATTCCAATTGTTGCCTTTGTGAG TGTTTCACTGTTTCTAATAATACGA

Dmel_CG5594  GGTCCATATCCGAAGCGACTCTCAC CATACTCCTCATGGTGACATTTTCA

Dmel_CG6671  CAATTGCCAGTTAGTCTCTTCTTCG CAAATTGCATAAGGATCTTAGTAAT

Dmel_CG9795  TGTGTGCCAAATTCCGCTGAGACGC GCTTAACAATACTTAACTATCCGTA

Dmel_CG16932  GGTTTCTCGATCAATAATTAGGCTA TACAGAAATCATGAGAAACTGAAAC

Dmel_CG17759  TGTGTGCAGTTTACTATCATAGGAT TCAAACTAACTACGCCTTCTTTTCT

Dmel_CG1871  GGAACATTAATGTTATTGGCGGTGA TAGTGTGCGTTTCATTACATTACGT

Dmel_CG3620  GTACTGAACGAAACACGGCCGCAGA CCAAAATCCAACTGCCGCTTCAAAA

Dmel_CG11148  AAGTTCTATACTGTTGTTCAATAAC TGTGCTCATATGTGTAGGAGTAAAA

Dmel_CG33513  AGGCCCGGTGCTCATTTTGACTACA CGGATGCAAGCATGCAGAGCACACA

Dmel_CG1318  TAAGGCAATGGTTCAGGAAAGAGGC ATGTTTTCCGTTGACTCTATGAGTA

Dmel_CG8233  TAATTAGTGTTTAATACCGACAAGA TGATATGATGCCTTTAGTTTAAACA

Dmel_CG5215  CAATGGAGAAAATGTGACAAAGACG TCAGACTGCAGGAGGCTGGACTTGT

Dmel_CG34240  CAAAAATGTCGTAGTATTATTGTTA CCTAACCGCTCTATTTGATTGAAAT

Dmel_CG5455  GAGTGAGCGTGCTTTGTCGGATCCA CGTCAAGGTGCCGTTCCAGTCGGTC

Dmel_CG32387  GGGATCAGCCAAGGATTGATGAGCC TTCGGCTTCTCCTTTCACATACTAA

Dmel_CG15078  TATGAGTGTTGATTTTCGTAGTACT GGAGTTGCGTGTTAGGTGAAATAAC

Dmel_CG33092  AAATATTGAAACTATTGCATCACAA CACATATTTTCTAACATTCAATCTT

Dmel_CG9042  CCATCGCCAGATGCACTTACATAAT TTTTAATCTAAACCTTGCGCCCTTG

Dmel_CG1333  AAGATTCCGGGTATTTCCATCGCTA CTGACTTCCTCATCTGCATCTTGTA

Dmel_CG11066  CAAATCAAATCAGGGATAGTCAATC TCGAAATTTGTGGTCCACAGTTAAT

Dmel_CG5237  GTTTTGGCATCAAAGCCCAGAGGCG CCGGATCGAGGATCTTGCTGAGCAC

Dmel_CG15817  GCCGTTCTAGACACCTGCACATGTT AAAATACTAATAATCCTGTTCCTTG

Dmel_CG8877  TAGACAAAGTACATCATGTGGTCAT GATTTTAGAATGGTAATTTTTGAAG

Dmel_CG10737  TCTCCGTCAGCTTTTCATCCTTTTC CCAATACCCAATACTAATTTATTGA

Dmel_CG18076  TTGTTTTGGGAGGGGCGGTGGTGTC TTTGATTCGATGAGATGCCTTAATA

Dmel_CG8604  TTTGAAACTAACAACTAAGTAACTA CATAAATACCGACTAATGGCAAATC

Dmel_CG9425  CCGGAGTTTACAAGAGCTTATCCCT GCAATCATTACCCTTTTCCAACTTT

Dmel_CG31149  TGGACCACAGTGAGTACCTCTAATG AACAGCTGCCCATTTGACTATGTGA

Dmel_CG10209  ATTAGCAATCCCACATTCCAATGAA GAATCGGACGATTCGTAATTTTTGG

P á g i n a  | 210  

 

Dmel_CG1799 CGTTATCCAAATCTCATGTCATTGC TCCGAAATTCCCGACAATCCCGAAA

Dmel_CG7047 AATTCGTTAGAACACGGTTGCCAAA TCATAGCTGGCTAGGTCTGAGACCA

Dmel_CG32018 ATTAAATCAAACATTCAAAGTCGTG ATATTTTCACTCCTTAACATTAATG

Dmel_CG17927 TATACAACATAATTAATACACTAGC TATGATCGATTATTAACGTGTGAAT

Dmel_CG9291 TAATAGTTAAAGAAACGACTTTTGA GGCTGTGCCTTTGGTGGAGCCAAAC

Dmel_CG5670 TCACTAACCTCAACCTTTAAAAGGA ACCACCACAAACGTTTGCACGTTTA

Dmel_CG7293 TTGCTCATTAGCTCAAGTGGCTGAC TGCGTCAGGAGGGAATTATTGATTT

Dmel_CG30165 TGTTATGGAGTATCAGTCCGTAGGT GGAGAAAGAGGACTTGATCCTTTTA

Dmel_CG32423 CACAGGTGGGTTAAATAGCATTCCG TGGAAGCCCATTCAGATATGTTATG

Dmel_CG11098 TTGGACCTCCGGCACAGCCATGTCT CATAATTAATTTTGCGTTTGTCTGG

Dmel_CG32387 TTGGAGGAGCGTGGAAAAATGAAAA CCAGTGGATAGCATCGATTTGCGCC

Dmel_CG4128 TGAAAAATACAATAACAACCACACA CGTACTTTAAGCTATAGCGTTTTAA

Dmel_CG9042 GAATGTTTAACATTCCCCAAAGAAA TTCCATCCATTACAAATTAGTTTCC

Dmel_CG4481 AAATGAATACTGGCTTAAAAGTGGC TCCAAGCATTGATTCTAATCCACGC

Dmel_CG5444 ATCCAACCACCATGCTGTCACCCTG GACTTTGAAAATGTGATGAGATGAA

Dmel_CG10023 TAAAAAGGATTTGTTACTCGCGGCT GATTGCTGTCATCTAATCCTACGGC

Dmel_CG17603 TTATTATCCTTACTTCGTGTTTGTG GAGTACGCTCTTTCTAATGCGTGTT

Dmel_CG11051 TAATTATAAAGCAATCATATCAAAA GTATTTTCCATAAAGTATTTACGAA

Dmel_CG1517 TAGTATGTTGAATATGTGATTATCC AATATAAGACTTTCCCTTTCGGCAG

Dmel_CG7971 GCCTTTAAGGATAAGTATTTCACTT ACATAAGCTATTAAAAGCGTGGTAC

Dmel_CG32464 CAGTCGACACTGTTGACTTTTAATG AGAAGATGTTTGTATTCCACCTGAC

Dmel_CG17762 GAACATTAAGATCGACAGAGCATAT TTGTATTCTGCAGACTTGTTGGTAT

Dmel_CG3028 GGATATGTTAACTATATGTTAACCA TACATTTTTCTGACTCATCCGATAT

Dmel_CG13320 CAAATTTGTCTGGAATGTATGTGTA AACTCGTATCCTCCTTTACCATTTC

Dmel_CG1522 CACGATTCAGATATCGGTAAAGAAT GAAATCAGGATTTCCGGTTTTGACT

Dmel_CG9065 GATAAGAATTTTGTTGTTAGCCATG CATGGGATGCAAAAGGTGCACACTC

Dmel_CG9499 TAATTAGCTATGTCTCTTAATACAT CAAATTACGGGATTATAGAAGCTAT

Dmel_CG33203 CAGAGGGTTAATGACCATATTAGCG CCAGCCAAAAACGTACAGTTATAGA

Dmel_CG2467 CGATTTAGGTTGTGCGCATATAGGA TGAGAAGTAATTGGGATTCGATTCG

Dmel_CG11352 GATAAGAGGTTATTATTCAAGGATG CTTAAGCGTAACAGGATGGAATTCA

Dmel_CG4533 GCTTTGATCAAGAAACGAGACGATA TCTTCACTGTTCAATAAATTCCGCG

Dmel_CG4596 AAAGCCCCATCTATTCATGTTCTAA ATGTTTTTGTGGTTATAAGGATTAT

Dmel_CG6588 GAAAATCTATACTGTGCATAGGGCA CGAGGAAATGCTGTTTGTCGTCGGC

Dmel_CG15441 TGCAACACAGAGGTCATAATCAAGT AAGATGGAAGTTGCCCTCATCCCTA

Dmel_CG17193 AAATCTGGGTAAATCAAAACCGGCA TTACATGGGCCATATGGCTAAGGGC

Dmel_CG2671 TGTACAGATATAATGTGGGCCCGTG GTAGATACGTACAAAACAGCAAATT

Dmel_CG33141 TAATTATTGCAACATAACATACATA TATAGTACAGGGTACAGGGCGGACC

Dmel_CG18319 TCTAAAAACCATTGTTTTTGTCCAA TGGTTAACTTCACTCCGATCTCGTT

Dmel_CG8002 TAAATAACTTTGTAACATCTTGCAT TACTCTTTCAAATTCGTGGGACACG

Dmel_CG8390 TACCCAAAGGAGTTGTGTTCTTTAA CGGCTAATTACGGTTAAGAATTGTA

Dmel_CG2818 TGAGTCCTTGAATTAATTGCCAAAC GCTATCATTAACTTTGTACTCCATT

Dmel_CG6236 GCAAATATCGGACCAGACACATGAG TTCGCATTATTGCTGCACATACAGC

Dmel_CG34313 GTTCAACCCGCGGAGTAAAACTCCA CACTGAACATACTACAGTTTCCACA

Dmel_CG8095 AAAGAACCTCTTGTTCGCAAATGGA TTTTACATCACAACTATATACAGTG

Dmel_CG1553 CAAATAAACATAGATGTAAGTACGG CTAGTTTTTCTGTTTCGGCTATACA

Dmel_CG9572 CGTATTCGTAGTCTTACCGCACCAG GTGCATCACCTCACCGCCTGTGCCT

Dmel_CG2999 TAACAAAATAGAATTAACAAGATAT GCAGGATTACTTTAAGTTTCACTTA

Dmel_CG7720 GAAGAAACAGTTTGATTTGTTAATT GCGATAGTAGTTGGCTTCCGTTTTC

Dmel_CG9911  CATATGTACGATTGTAATGTGTTAT CCAAATCGCCTTGCCTAAATATAAG

Dmel_CG1643  GGAACCAACAGTTTGTGTACCCTAG TACACAAACTGGTATGGCGATTTCT

Dmel_CG16833  AATGCCTTTTTGTTAATTGTCCTGC GTTCCCCATGTTGTAAATAACCGCC

Dmel_CG5794  AAATGTAGGAAACTTTGAACACACG GAATGGTTGTTTGATTGATTAAAAG

Dmel_CG34405  ATTGACAAGTGCCTATTCACCCACC GATTGCCTGACACTAATGCGTACAT

Dmel_CG1513  GGGTAATGCAAATTGAGCTTTCGCA GCTTGACCCTGGCTCGATGACCAGT

Dmel_CG32490  TGTGACCAGGTTGTTTTGATTGGCA TACTAATTTCTTCTACTTCCCCGAC

Dmel_CG11284  GAGATCTGAGATCATTGATCACTTG TATTTGGCGAATTCTAATGTCGATG

Dmel_CG34403  TAGATTGTCGGGTTAGCAGGCATTT TACGGAATGCAAATACTTGGCACTC

Dmel_CG32000  GAACGCATCACATTGCCTTAATATT ATCTATTTACGAATTTTCAGAGTGT

Dmel_CG1903  TTTTTGCAGCAAGTTGTTTTGGATA CATGTTCATGTATCCGTGCTCTTGA

Dmel_CG3902  GATAACGATAAGGTTTTAGTTTGAA GAAAACGAAGCTAGGGGGTATAATC

Dmel_CG3606  TGTTATCCACTTTTAGTATTTCGCT CCATACTGCATTAAAACCAAAATCA

Dmel_CG11051  TAAAATGCTCAAAGTCCTGGCACAC GCAGGACCTATTTTCAGAGATAAAC

Dmel_CG9565  CAAATGAAGTAGCTACCATATGGTA GATTATTAGATACACGTTGGTAGGC

Dmel_CG10155  AATGAATCAGGTTTAGTCATCATAA TAGTTGGGGCTCAGCCATGAGGATT

Dmel_CG9578  TTGGTATAGCCCAGTTCCAATGGCC ACACTCAATGTAATCCCGTCCTGCA

Dmel_CG9009  CATATAAGAAAGCTTTTAAAATACG AAAGGTCTTTATAATCTAGTAATAC

Dmel_CG8408  ACCGAGACGAGGTGTAAACACAGTC GAGGCCACTTAACACCTTACAGGTG

Dmel_CG33543  AAGTATGTTAAGTGCACTTCGACCG TATTGATAAGTATGCCAATAAATTG

Dmel_CG6292  TAGGAATTAACGACTCTTTCTAGGA GCGATCTCTAGGAGGGATTACACCA

Dmel_CG34356  CTGCACACACTTTGGGTTTTGTTGT TATAATGCCGAGTAATAAGCTTTTG

Dmel_CG8440  CATATGATTATACAGTAGAAGTTCG CATATTGAATGTCTACCTTTTCCAT

Dmel_CG5473  GAGATTATGTATGTCGCATTCATCA GAACTGCGTAACAACTAAACACTAA

Dmel_CG33547  TGGTTGGTTGTTGTCATAAATTTTG ACGAACGAACGCAAAATGGAAACCA

Dmel_CG8085  ATGGAATGGAAAAAATAACACACAA TCTCTCCGCGTTCCTATGGTTGAGT

Dmel_CG12085  ATTGGGAAGAGGGATTAGTGCATCT TTTTTTCAATATTAGATACTGCATA

Dmel_CG7583  TTTTACGCAATCTGAGTTGGCGCCG TGAATGTGATCGCAACTAATGAATG

Dmel_CG32296  AGAAAAATCATATTTCGGAGACGGA GATCCTTCAAGAGCGGCACACAACT

Dmel_CG6498  TAAAGTTCCAAATCGAGTGTTAAGC TGAGAACTTAGAGCTGGGAAGCGCC

Dmel_CG18646  TAAGTTTCAAACTGGCAATGCTGTA TCCAACCTCAGACAAAAAATAACAC

Dmel_CG16704  TTTTTAGCACAACACAGCGAGACCA TGATCGCTTTCTCCGTTATTACTTA

Dmel_CG10289  GCGACGACGCGTAACTGAGACATTT ATCAGCACGGATCGAGTCAACCTAC

Dmel_CG10693  TATAAAAACTATAATTAAATCCTAT TGGCACCTCTCAATCAATCTAAATG

Dmel_CG6174  CATTAAATGCGGGTAGCTTTGTGCA TAAAATAAGCTGACGCAACTAACTA

Dmel_CG1507  TCATCTGATTAGAATTTTGTTATCA AAATTCACAACCATGGAACGTTATG

Dmel_CG5723  TATTCGGCATAGATTCCGACAACGA ACAATATTTTGTTCTTGACTATAAA

Dmel_CG2252  CGCGGCGTGGAGAGAGGGAATGGAA GCCCTGACATTGAGTCACTGGATTT

Dmel_CG31973  TTGGGAACACATTTTGGAATCACGA GCCTCCATTTGTATTTCTAGCAGAG

Dmel_CG13778  TTTTACCGCTCGCATTCACCGTTAA TCAGAATTAAAAACTATTAGCAACT

Dmel_CG11328  GGTGTTTTCTAATTAATGCGGAATA AATTTATCATTAATCTTTGAAAAGG

Dmel_CG2252  TTTCAAACCAATAGAGCGACGATGG TAGTTACAAACTTACAATATGGCTT

Dmel_CG7555  GCACTTGTAGTCTCAAACCTTGGTT TGAATAAAATAATCGATCCACCAAT

Dmel_CG33013  GGCTCCGTGCTTTTACTTTTGTGGG GGTTGGCTGCCTCGTGATGTTAACA

Dmel_CG31771  TGTATCGGTTTAACCATTATCATTC CATACACACAACAGGCATAGAGGCA

Dmel_CG11348  CCGAAAATTATAACCGAATCACAAC GTGTGTGTACACTCTTCCGTTGTTT

Dmel_CG5627  GAATCGATCCCACCACGCTTTCATG TACGAATTCGTTTTCGGATCCATAG

Dmel_CG1511  TAATAAAATCCGTTCAAATATCTTG TAATCACATTCATGCTTATACAAAG

P á g i n a  | 211  

 

Dmel_CG4894 TAAAAGTCATTGGTAAAGGGTATCT CCCTGACGTTCCAAATCATTTCCAA

Dmel_CG9317 TAATTATTTCATCAGTTATTTCAAA AATGGGCTGACTTGATTGCCTTAGC

Dmel_CG11155 AATTTATTGTTGCTTCTATAAACCT TAAGAGATTAATATACTTTGTAACA

Dmel_CG1965 AGAGGGACCAAGTCCGATTTGTGAC TTAACCTTTGCTCACTCCTCTGCAG

Dmel_CG14372 TGTTGGAATTAAAAAGTACGACGTC GTCCATTATTTATTGACCCCAACAA

Dmel_CG1848 TCAATAATTAGCAAAGTGTTACTAC TGCTTTTAATTCAACTCAGGCACAT

Dmel_CG1715 GGTTAATCGGTGTCAAGTCTTCGCA CGCTTCGATCTGTTTATTTCGGCCT

Dmel_CG17816 TATAAATGGTAGTTCTGCTCAGTTT GTTTATTGAAGAGTTTGGTTTTTGA

Dmel_CG6703 TCAATTAGCGCGTGAACAAAGACAG TTTGGGCGTAATGGGATGAGGAAGA

Dmel_CG11023 AATATATTGATGTCTTTCGTACCCA AACGTTGTGGTGCTTGCGCTTTAAA

Dmel_CG4700 TAAGCCCACCGACTTTCGGAGCGAT TTTACTTTTTATCCCGCGCGCGCAG

Dmel_CG9834 CAGAGGGCAGAAAAAGACCGTGAGT TGCAATAAGGAAACCCCATCAAATC

Dmel_CG10076 AACAGCACGTAAAACCGTAATGCAT TGACTGAATGCGTTCTCCTCTCTTT

Dmel_CG5554 CGAAAGGGTGGCTCTGAGTAGTCCC TCGGCAGCTGTGTTAAACATATGTT

Dmel_CG10975 TATTTCTGCCCCCATAAAGATGGAA TCTGATCATTTTTCGATCTTTTCAG

Dmel_CG34405 CAACAGTTTTAACTCCGAGGAGCTC TAATGTTATGCCATCTCTGACGCAA

Dmel_CG2086 GAATTCAGACAATTAGATCGTTGTT CAGAGCACTACACGGAATGGTTCTT

Dmel_CG11473 TGCAGTAGTAGAGGCGTTAATAGGT TCGTCTTACTTAACTCAGTCTCGCT

Dmel_CG2082 GTTGGTTGGTTGTTAGGTTCAAACA AATGGCCCAGTAAAGCTGGCGCGGA

Dmel_CG7524 TAATATTAAGATGCTAGATTAGCTC AATTAAATTGTAATGGATGCAGGGC

Dmel_CG11111 ACATTTTTCATCTGCGGCCTGGAAA TCCTTTGCGCTTTGGACCTTACTCT

Dmel_CG4898 AATTTGCTACCCCTTGGTTTGGGCA GGTTCTTTCGACCATCGAACGTTTG

Dmel_CG8400 TATTGGTTAATTGACTCAGGCAGCG TCCAGATCCAGCAGGATCCAGTAGA

Dmel_CG7875 TGTTTATAAATTCAAGCAGGGTACT CAGTTCCTTAATGTGCACGGATTAG

Dmel_CG32019 TGCAAATGAATTAGTGTTCCAGAAA AATTAATATTCATAACATTTGCGTC

Dmel_CG12253 GACTCGCGAATTTGTATGTACATCA TGAAAACTAAGATTTGTTACTAAAT

Dmel_CG8727 GATAACGCAAGGAGAAAACTTAAGT GAATCTCACACTTTCGCATGGCCAC

Dmel_CG5945 TGCACTATGAAGAACGATGCCTGCT TTAATGCACATTCTAACGCTTGTGA

Dmel_CG8201 GCGTAAGTCCCACTTTGGGGCTAAC AAGTACCCATTTTAATGTACGATAA

Dmel_CG1506 GTAATCAAGGCGGACGGTTATCAAT CCAACTTATCTGTAGTGGTTAGGCA

Dmel_CG12071 TATTGCACATAGTGTGTAGTATTAC GCTTTTCTCTGGACTTTCTCATGTT

Dmel_CG1976 GCGTCCGATTGATTTCCTACCCCAG CAAAGCGCGTCCACATTAATATTGA

Dmel_CG11883 GAGTCGTGGCTTTTCATTTGCATAA CGTTTTCAAGCAACTATTACCCCAT

Dmel_CG3525 CATTTAAGTTTACAGAATTCGAGTA CATATACGTATGTTGTCTCGTTACC

Dmel_CG13363 GGGATTTCGATTAATATGAATTGCA CACCACAGAGGCGAGTAACCATGCT

Dmel_CG1695 GTGAGTGTGCTCATCCCGAAAGTAT TTTCTTTGTCATCCCCGAATCGCAG

Dmel_CG1522 CGATTCGATCCAGAAACGATTCAGT TGGAAAGACAACAACGACATGTAGA

Dmel_CG34405 ATTGGCCTATGCTCCTGCCCGGTCA CATAACTGTGGATTGTATATATATA

Dmel_CG18815 GTAAGTGGGGTCATCCTCATTCAAA ACTGCAAACAAAACTTACCTAAGTA

Dmel_CG7535 TTTAAACTCCAAACAGCTTATGGTT ACTTTCATGTCAAACGGCGTCGCAA

Dmel_CG32387 AAGATCAGGCGAAACGGGTTAAGAT GATTCGAAGGACTCGAGTTCCTCAT

Dmel_CG11111 CGTAGTTGCCCGCTAAGAAAGCAGC TTAAATTCGTATTGCCAACTAACTG

Dmel_CG17759 TGCTGCCAGTTCTGTGTTTGGTCAG CTAATAAAACAACGATCTCTTGGTA

Dmel_CG4532 CATGAAATTTATCAAAAGGATCGTT TGTTTGTGTTGCCATTTTCAGCAGT

Dmel_CG6775 TTCACACATAATTCTCTTCGGATGT CTTCCTTCCACTTCTAACTCTAATA

Dmel_CG2999 AATACACATAACTATTAAAATTAGG ACAATTATTTGTGCTCTGCTAAGAA

Dmel_CG7892 CAGCGCTGAAGAGTGAAAATTGGGC AACTCTTCCCTCTTCGAATCGATCA

Dmel_CG6634 TGTGGTACTGAGATACTCAGATGCG CAGCTATGTAAATTTCAATCGACTT

Dmel_CG32484  AACCCCCTTTTGACTTATGTGGATC CGTAATCCGATTATCAGTCTTGTGT

Dmel_CG2505  GGCCAAGAGTGCATGGTCAATGTCG GTCAGTCTGTCTACTATTATCCCCG

Dmel_CG8325  TATATTAGTTCTTTCGACAAAAGCT GATAGTGAGATATGAATAAGTCAGA

Dmel_CG32335  TGGAAAGCTTTATTTGACGTATCCG TTTTATCAGCTATTCCACGCGGGAG

Dmel_CG1862  TGAAAAAGATGTACCAAAAAAGGAA ACGGCTACAGCGTTTTGTTGTAAAA

Dmel_CG10541  CATGGTGGAGTCATGGCAACTATCA GAAACCCCAACATGTGTGATTGACA

Dmel_CG17248  AAAATGATGCAAGAATTAGTAGGGC AATAAATAAAAGATTGCTCTCGCTG

Dmel_CG8770  GCTTATATTAATTACCAAGAACAAC GTATTCATTACACCCACCCAATTAT

Dmel_CG17686  GTCGATTAGTTAGCGAAGGCAACGG CTCGCCAGGCTACCCTAGACAAAAT

Dmel_CG3664  TTATAATGGAGACGGATAAAAACGA TACACTTTTACCGATGTCCCACAGA

Dmel_CG16926  TGCAAAATTGATGCGTATGAGCTCC GATCGAGATCGTGGATCGTCATGTG

Dmel_CG13654  TTAATTGACATTGCAGCGGAACGTA CATTGTGTTTAGACTGCATATGCAT

Dmel_CG7875  ATACAAAGTGTACGGAACCCAAGAG GAGCAACTGCATCCCTACACCACCC

Dmel_CG2519  CGTTTACCGTTTCATGATTCATTGG AACGACGCTGTCTCGTGACCGCAAA

Dmel_CG33547  TGCATCAGATGGTGGCATGGAAAGT TGGCCATTTTGTTGGGTGGTTCGTT

Dmel_CG8884  CACTTTGATTGGTAACCAAATTACA CGTCAGTGGAGTGAAACTTATCGCA

Dmel_CG5098  ACCGTCGAGATCAAGCTGCCAGTTA ATACTGGCCAATCCGTTTTAACTAA

Dmel_CG34408  GAGCTCTTGAACTCATTCCATTTTG TGTATTATTTAATTGCCCACCTTTT

Dmel_CG2910  TAAAAACGATCTGAATTGCTCTGAT TGCATTTCGCCCGTACTTTCACAAA

Dmel_CG8739  TTTTAGCTCACTGCACCAGATATCT CAGTTAGACACAGCACTATGTTGTA

Dmel_CG7555  TCTGTATTCCCTAGGGTGCACGTTT GAATTTTAGATGTGTAGACGTCTAG

Dmel_CG34126  TTTTGGTGCGACATTTTTCCTTTTA GCACGATATGCTTTCTAACCCCTTC

Dmel_CG7611  CTTAGCAGACTTGATGCACCAAAGC TCACCTAACTCCAATAGAGCACAAT

Dmel_CG5247  GGGTTTTAATGTGCGAAGTCTGTTC TAAATATATAGCAATCCGTACACTA

Dmel_CG1522  TACGATAGTTAAATGCATTGAACAA GAAGTGGCTTCATCGTTAAAATAAA

Dmel_CG9163  GGCCATCGGGTTACCCACATTCACG ACCTTAGACACAGGGAGAAGTTTCT

Dmel_CG17058  GACACTTATGGACACATCAAGTTAG GTTCCTAACAGTTGCACAGTGTGTA

Dmel_CG32464  CACCAACTGGTTTTGTGGTCCGAAA TCCCTTTTGGATCCCTTTGCCAGAT

Dmel_CG8739  AATGTGTTAGTATTGAGACCGAAAC TACTAGTCAGAGTTTACTAATATGG

Dmel_CG33514  TAAGGATTTTGACGCCAGCTAACTA TATCAATGCAATTCTGTCAATTCAG

Dmel_CG12072  TCAAACGAAAATTGTCACACGCTCA CGTTGCATTTTCACCAGGCATTTTC

Dmel_CG6214  TATGTCCGATACAAATCGCCATCGC CACGCTTTTGCCTAGAAAATCAATT

Dmel_CG8421  TAAGTGTTAGCCATAGGATATACAA GAAAACAATTTGTTCTAATTCAGAT

Dmel_CG32169  TGCAATTTTAAACTTTGCCCAGGGA CGAGGGAGAGGTTTGCGCTTTAACT

Dmel_CG33130  TACGAAAAGTCACAAAAACAGAAAA GATAAATGCGATGCGGTGCAAAGTT

Dmel_CG4086  GAACAGACACTCAAGGTTAAAAGAT GATTACTTGACCCTGGTTAACTTAC

Dmel_CG8996  GATTATGTAAGATTATCTATCGCAC CCACCCTAATGTGAGACTTCTTGGG

Dmel_CG32387  CCGAATGGGAATTGGTAAGTTCTAC CCTTTCTCCGGACATATTTTCTCAT

Dmel_CG16899  TATGTCTTCCAGAAGCACAAGACGA GACGATCAGTCTACATAATTTACTT

Dmel_CG4532  CTTTATATTCCACCGCCCAGGCACT GGAGAATATATTGACTAACATTACC

Dmel_CG33275  AACTGTGCTACTTCTTCTAGGCCCC TATCCAATATGTGTAAATATCCCCC

Dmel_CG10693  TCTACTGTTACCAATAAGCATACGA ACTCCTATTTATATGTCTCTGTGTG

Dmel_CG8929  CAACTACCAGCAAGCAACTGCATAG GCTTACCTTTTACCTCTCAACCTTG

Dmel_CG4376  TTTTATTTCAGGAGGGTTGTTGTTG AAGTGTATCGTGGTGAAGTTTAGTC

Dmel_CG4894  GAAAGAATCCCTCCAAAATCCTCTG CCCAATCGAATATTGGCAATAAATA

Dmel_CG1200  TAAGAAGCAATCTGGCGAAGCTTGC AGTTCAGTTTCATCAGTAAAGCCCT

Dmel_CG9163  GAATACTCAAACGATTGTGAGACTA TCTCTATGCGAACATCACCTGCTCT

Dmel_CG33995  CATACCGACCTACTCAGAATGATAT CAGTGACTCATCGATTTCTGCATTT

P á g i n a  | 212  

 

Dmel_CG4662 AAAGCGTTAACAAGTGTGCTAAGTG GATTAATCTCTTCCAACATCCTCGA

Dmel_CG9765 CGAGAAATTTATACATAAACTTGGA TTTTCTACCTTAAGAGATTTCTGGG

Dmel_CG33208 GCAGTGTTTGTAGGCGTGTTTTGGG CGTGCAAAGCGAGAACGGGAGATTC

Dmel_CG34363 TCCACCAAGTTTGGCGATCGTTAGT TGTGTGGGTGTAATAGGAATAATAG

Dmel_CG32031 TCTGCTCTGCTTCTGGTCTGCAGAA TACTTGAACGTCTGAAATTTTCACT

Dmel_CG1522 TAGTAAGCCAACTCCATGGTCACCA GTTTAAGGGGCTGAATAAATGGTTA

Dmel_CG11943 TTCTCCTTGATTTTGGCATTTAGCA GCATTCCACATTTGGCTGATCCATT

Dmel_CG31149 GCCTTCTTTTGCCTAAGTTTACGTA TTATGTATTCTGTGCTCTTGCTCTC

Dmel_CG18375 CAAATGGGCGATGGTACTTTGTGCT TGTTGCGACTTTAATTTTCTGCCAG

Dmel_CG18250 TTTTGGGTTAGTCACAGCGAATGAG ACCGAAACAAATATGGCGAATTGTC

Dmel_CG31092 GATCAAGATCATGGAAATACGTAAT TGTGAGATGGAATAATTCATTCTTT

Dmel_CG34231 CAGAGATGGCTTCAAAAAGTATGAT CAAGATCTTTTTTATATAGTGTTCC

Dmel_CG14741 TAGTTTGCTTTACACTCGGCGAAGA GAATGTGAATTGAAGGACATGCAGC

Dmel_CG6123 CACCGATTCCTGATATCTGATTCCA TGTTCTCAGTGTTTGATTCAATGGA

Dmel_CG31211 TGGGCGGCAGGGTTAACTGACTCTC TGCAGGCTGTCGATTAAACATTCCC

Dmel_CG4952 AACCTTATTTGAAAACTCGTGTATA TAAATTATCTTGTAGATTACAATGC

Dmel_CG1976 CCAAAACAAAACAGCCGAAGACGCG CAACTTTGCGGGAATTCCCCTGCTC

Dmel_CG11199 CAAGGTATGCACTCGAACTAATATG CATTAAACTCGCTGGCTGAAACCAT

Dmel_CG1354 TAGTTTTCCATTGCTTGTAACAAAA CACAATCGAAAGTAATAAGTATTTA

Dmel_CG7555 TATCATCCGCTATGCGCTAGCAGCA TACGTTGTGCTCTATCTTTCATGAC

Dmel_CG2534 ACGAAATAAGTGGATTCGGACGAGA AACCTGGCCTTTTTAGGCCGCTCAC

Dmel_CG2999  CTCTTCCTTAATATTAACGTAGCGA CCACCATATGTTAACATTTTGATAA

Dmel_CG7050  CATTGATATACACAATACAACTTTT TGTATCCCTGATTTGGTAAATAATC

Dmel_CG1693  GTGGCGACGGTTTTCAGTAAAAGTC TGCATTGTTTGCTTAGGGTTGCATA

Dmel_CG1417  AAATGCCAACAAGTAACCGAAATAC CAACAACCAACCATCGATTGATCCG

Dmel_CG9364  GCCTAAACAAATGTGCACATAGTTC GAGCTATAGATACTTCCTGTTTTTA

Dmel_CG4952  AAGTATCAGTATAATCATTCCAAGC CAAGATAATATGTTTCAGGCTCTCA

Dmel_CG3302  AGAATAACAGAAATATACAACTTTA CACTTCATTCCTACTTATTTTCTTG

Dmel_CG10895  TTTTATTTGGGTTCGAATGTGTTGC TACGACTACTGCGAACACATCAATC

Dmel_CG34114  GTTGATTTGTGGCACCTCGGCACAC GCACTCACCGACTGTTTTTCCCGTT

Dmel_CG32647  AAATGAAGGGAAATGTGAAAACAAA GTCCTTTTTACAACCGACTGTTTGC

Dmel_CG2139  CTGTCGGAATGATAGAAGCGAGAGC GGGGAGGGGGCCTCTGCGAAAGACA

Dmel_CG2041  GATATTTATTAAAATACACCATAAA AAATAAAATTGGTAACTGACATTAA

Dmel_CG4128  TATATAGATTGCTCGATGGTCTCAA TTTAGGTTTATGATTTATGATGGCG

Dmel_CG32346  TCCATTTTTGATGTGCTACAGTTGA TATCTAACACAGAATAACGATTCCC

Dmel_CG5621  TTGAGTTACATAAGCAGGAATTTGC GAAAACTAGTGTCACTCTCTCAGAA

Dmel_CG15666  GAAAGGATTTGGTACATAGTAAACG CATAAGAGATCTTCAATTCTTTGTA

Dmel_CG34387  GATGCTTGTTATGTCGATCCTGCAA CATTTTCCAAATCTCCGACTTGCAG

Dmel_CG9847  CATTAATTTAATTGTAGCTACTTTA TGTAACAAAAGTGCGATCCATACAT

Dmel_CG33950  TCGTCAATAGGACACCAGATACACA AGCTTTTGCGGTGAGGATAGAGACA

Dmel_CG1511  TGTTGCTCTTATTTTCAATTTTTAT TTATGTACCGATACAAAATATCTCC

 

 

P á g i n a  | 213  

 

Tabla I: intrones mayormente retenidos en la mosca salvaje que en la mutante dart5. Se muestra el locus y

las sondas que reconocen a los intrones.

Locus Intrón afectado 

Sonda 1  Sonda 2 

Dmel_CG31660  GATTACATATGCAATGATAGACTGA  TGATTATTTATGACACAACGCAATT 

Dmel_CG10833  GTTTATTCAAAACTTATCTCGTGCT  GGCCCTGATACCCTTATCAATTGAA 

Dmel_CG4795  ACGAGAAAAACATGAGACATGGCAA  AACTGCCTCTTAGGTAAGTCAATCC 

Dmel_CG3159  GCTTTGGTGTTAGGGGACAATGTTT  ATAGGTTTTTGGACGTGCAGGGATC 

Dmel_CG8665  TAAATAAGTCGCTTTAAGAATAAAC  TGTTCCTTTTTATTTCAATGCGCTT 

Dmel_CG3835  GCAGATGCTGATATTGTTTTCGCGC  CCTGGTGTCCCTGCTATCAGTGCGA 

Dmel_CG5020  TAAGCGGTGACCTCGAAAGGATCAC  TTGAGCCCTTTTACTAACGCGTTCC 

Dmel_CG3036  GCAAATGTTGCTTACAATCTGATTC  TAAAATTCGTCTAACCTCTGGTATA 

Dmel_CG3743  TCGGAGGACTGATAGCCACCGGAAT  GCGGGCCCGGCCCTATTAATCTGTA 

Dmel_CG18466  AATTGAATGAGATTACACTGTACTA  TTAGCCAATTTTCACTAGCAGCATA 

Dmel_CG4244  TCTTTCTGGCGTGCGTTACATGACC  GGTAATCTGTAAACCTAGCAAAAGT 

Dmel_CG3036  TGTGATATGATAGGTGCCCACCCAA  CCAATGCCTTGGATTCTATTATTAA 

Dmel_CG7635  GGCGGAAACGGTGTATACTATAGAT  CATATTCATATTCCTAACATCCCAT 

Dmel_CG8591  GTTTTGGTGGCGACCCACAGCGGAT  TGTAATCCCGCTTGATTCAATTCAC 

Dmel_CG1851  GAATTGGATTGAACTCGGATTAGTA  TTGAAGATAATGAAACAATCGGGCA 

Dmel_CG4894  CATACAACTCCAGCTGGAGAACGAA  TGCATTTCCCTTCGTACCACGACAG 

Dmel_CG17998  TCTCATTAATCAGCTTGAAATCACC  CATTTGGTAATTCGAATTATGTATC 

Dmel_CG3469  CGTGCGGGCGCAACATCATTGGAAG  CACCCATAAGTTCCTCATTTAACAA 

Dmel_CG31022  AAATGCATGCGAGAAGTAAGGAAGT  GATACTCACTGACCAAATTTATTAT 

Dmel_CG4269  CCTGTCCCTGAATTCGATTGCTCGA  CAATTAACGAATTCCTCAACTCTCG 

Dmel_CG6772  ATTGATGGCATTCGCAATGACGGTC  CAATAATCTGACTTAGTTTTCTAAA 

Dmel_CG31324  AAATCTCCCGGCATTAGCATCAGCA  TCAATTAATCAACGCGGCGGCTAAT 

Dmel_CG9395  TACTGGTTTTTCCTGTGGATTCTCC  TGGCGGAGATGACGATACACTGCAT 

Dmel_CG17800  GGTGGAGAGAATCAAAAGTAAAGTA  TGAAATCAAATACAAAACTTAAAGC 

Dmel_CG14616  TATTACCGATTATTTCATAGCTACA  GGTGAGGTGACTATCCAATTTCTGC 

Dmel_CG4019  CCAATGGTAGGGAACGAGGTTAATA  GGCAGGTAAGGATTAGCCAACTGTT 

Dmel_CG14322  AAAGTTCTCTAGAAAGTAAAATGAA  TATGTAATATTAAAAAACGGATCCA 

Dmel_CG16974  GTGTTATAATCAACTATGTTCACTT  CCCAATAAGCTAGTCACTCAATAAA 

Dmel_CG34365  CGTTTACAGTTGTTTGCCGCGCGTC  ACATTTGTTGTAAGTCCAGTGAGTG 

Dmel_CG31760  CTCTTAACCCATTAAGGGGGCCAGA  TAAGGTGTATTTTTTAAATCCATAT 

P á g i n a  | 214  

 

Apéndice de figuras 

Figura A: El splicing de RSp31 y la oscilación del mismo están alterados en la mutante prmt5-5. Relación

entre dos de las isoformas (mRNA1 y mRNA3) de RSp31 en plantas salvajes (A), prmt5-5 (B), prr7;prr9 (C),

y prr7;prr9;prmt5 (D). Ambos ARNm fueron medidos por RT-PCR radiactiva en plántulas entrenadas en

ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz continua. Los datos fueron normalizados al

máximo detectado para prmt5-5, representan la media, y la barra de error, + el error estándar (n=4). El

tiempo se considera 0, cuando comienza el período de luz continua; H: horas. Las barras blancas y rayadas,

indican el día y la noche subjetiva, respectivamente.

P á g i n a  | 215  

 

Fig. C. PRMT5 afecta el funcionamiento

del reloj circadiano a través de PRR7 y PRR9.

Período circadiano (H: horas) calculado a

partir del movimiento de las hojas en

condiciones de libre corrida, en plántulas

salvajes y en las distintas mutantes. Los valores

representan la media y la barra de error, + el

error estándar. ***P <0,05 n=6.

Figura B: regulación del splicing alternativo de At5g57630 por PRMT5. Relación entre la isoforma que

emplea el sitio 5’SS distal y el total de mensajeros detectados. Las distintas isoformas fueron medidas por RT-

PCR radiactiva en plántulas entrenadas en ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz

continua. . Los datos fueron normalizados al máximo detectado para la planta salvaje (WT). Puntos, media +

error estándar (n=4). El tiempo se considera 0, cuando comienza el período de luz continua; H: horas. Las

barras blancas y rayadas, indican el día y la noche subjetiva, respectivamente. Ver apéndice de primers ID

338.

 

P á g i n a  | 216  

 

Figura D: alteraciones de la actividad locomotora en la mutante dart5/prmt5 de Drosophila melanogaster.

A) Actograma representativo. Las moscas se mantuvieron en un fotoperíodo de 12:12 por cuatro días

después de la eclosión, y luego se las transfirió a condiciones de libre corrida (oscuridad continua), lo que se

indica con una flecha. Las barras blancas y negras superiores, indican el día y la noche respectivamente. Las

barras negras y grises inferiores, indican la noche y el día subjetivo, respectivamente. Porcentaje de moscas

rítmicas (B) y FFT (fast Fourier transform) promedio, como medida de la robustez de los ritmos (C),

calculados para ambos genotipos en condiciones de oscuridad continua. Barras, media + el error estándar;

n=70; ***P <0,001; **P<0,01.

P á g i n a  | 217  

 

 Figura E: expresión circadiana de genes centrales del reloj biológico de Arabidopsis en la mutante prmt5-5. Expresión de

CCA1 (A), LHY (B), TOC1 (C), PRR3 (D), PRR5 (E), PRR7 (F) y PRR9 (G) medida por PCR en Tiempo Real en plántulas

entrenadas en ciclos de luz-oscuridad y luego sometidas a condiciones de luz continua (corrida libre o free running). Los

datos fueron relativizados a la expresión del gen Actina (ACT) y normalizados al valor máximo de cada gen. Puntos, media

+ error estándar (n=4). Tiempo 0 al comienzo de la oscuridad. H, horas. Las barras blancas y rayadas, indican el día y la

noche subjetiva, respectivamente.

 

P á g i n a  | 218  

 

Figura F: expresión circadiana de genes centrales del reloj biológico de Drosophila en la mutante dart5.

Expresión de per (A), clk (B), tim (C), y Pdp1 (D) medida por PCR en Tiempo Real a partir de cabezas de

moscas entrenadas en ciclos (12:12, L:O) y sometidas luego a oscuridad continua (corrida libre o free

running). Los datos fueron relativizados a la expresión del gen rp49 y normalizados al valor máximo de

cada gen. Puntos, media + error estándar (n=4). Tiempo 0 al comienzo de la oscuridad. H, horas.

 

 

 

 

 

 

   

P á g i n a  | 219  

 

Apéndice de primers 

… y condiciones 

Aquí detallo los primers que utilicé en la tesis, sus secuencias, la concentración de 

magnesio usada con los mismos, y la temperatura de anillado (annealing). 

PCR radiactiva 

primer ID  directo  reverso MgCl2 (mM) 

Annealing (°C) 

RSp31  CGGTTGTTCGACAAGTATG   TGTAGGCTTCAGATTTGAAG   3  63

RCA  TGTCAAGAGAGTCCAACTTG   AGGTTTACTTGCTGGGCTC    2  56

RSZ33  TCCTTCAATCCCCAGCTTG  TCTTGCATCATCAGCATCAC   2  60

AtPP5  GCTGTCGCCAAGATTGAATC  TATGCCATAGGCTTCACATC     2  60

PP5 juntura  TTCAGTAGCTGAGTCCATTG    TGAGAAGATCGTAGAACTGAC  2  60

PRR9  TGATGTCTTCTCAAGATTC   ATTTGCCATTCTCCATCAG   2  58

PRR9 E2‐E4R  TTTTGCTCTGCTTGCTTTGG  ATGAGCAGTAGGATCATCAC   2  58 

PCR en Tiempo Real 

primer ID  directo  reversoMgCl2 (mM) 

Annealing (°C) 

RCA L  GCGGAACTTTCTACGGTAAAACAG GGATCAGTACACCCTTCAGGAAC 5  68

RCA C  GTCCAACTTGCCGAGACCTACC   TACTTGCTGGGCTCCTTTTCCG   5  68

RCA TOTAL  CTTGTGTTGTGACGCATACTCG    CGTTGCTCTTCTTGTTGCTCTG    5  68

RSp31 mRNA3  AGTGTTCGTCGGCAATTTCG  GCAGGAAGAAGAAGAAGATGGC  4  68

RSp31 mRNA1  AGTGGACATGAAATCTGGATATGC  CTTTGCCCATTCAACTGATAACC  4  68

RSp31 total  TGTGTATCGTAGGCGTCCAAGT  TTGGGACTGGAGAACGACTTC   5  68

PORc total  CTGCCTATTCTCTTCTTCCTTCTACC  TTCTGTCTTCTCTGTTCCTTGATGG  5  68Ubi (cx1580‐1630)  TGCTGCCCAACATCAGGTT   GGGCACTCAAGTATCTTGTTAGC   4  68

   

P á g i n a  | 220  

 

Primers del panel de RT‐PCR 

 

ID  Primer directo o forward  Primer reverso o reverse  Locus 1  GGCCCCCGCTCGAAGTCAAGG  GGTAGAGGAGATCTTGATCTTG  AT1G02840 

2  GGAAGAAAGAAGAGTCAAG  GGATTATCCTCAATCCTTAGG  AT1G04400 

3  CCTGCTAGATCCATTTCCCC  GATCTTGATCTTGATTTTG  AT1G09140 

4  CGCCTCCACAGATCTAATCGC  CCATCTTCGTGTTGACAAC  AT1G10590 

5  CCAAAACTGGCAAGCACGGTC  CCATCCTCAGTGATATCAATC  AT1G26630 

6  CCCGTTGCAGACTGCTTCTAGCC  CCATCAACAAAGGCCTTTCC  AT1G52500 

7  GGAAGTCGTTTGAGCAGTTTGG  GGTTTCTTTCTGTTCTCTTCTG  AT1G55310 

8  CCTTCAGCCTCGGTTTCAGC  CCTTTCCATTTAGGATCAGAGTC  AT1G63970 

9  CCCTGCTACAACTGGAACAACC  CCCTCTGACAATTGTACAAAAG  AT1G65480 

10  GGATATATGACTAATGATG  GGTTCAGCCTCTATCTCTCCAGG  AT1G71696 

11  GGGATTATAATAGAAAGAGCATG  GGTACAAGCAACCGATGATAG  AT1G71696 

12  CGTCAACTGTGTTTTTGCATCC  CATCAAATCCACGGTTACCC  AT1G72320 

13  GGAGAACAAAGTTACGGAGG  GGAACAGGTGAAGACTGGG  AT1G79650 

14  GGAGTGTTTCCAATTCATTTG  GGCCAATCTGTATCAATGGCCG  AT2G09960 

15  GGAAAACAGGGAAAGTTACGG  GGCAGCAACAAGGTGATCATAAG  AT2G16060 

16  CCATGGATCTACCAAGGTTGAC  CCATTGCAGACATCATCAGATC  AT2G20820 

17  GTCAGACTCGTCGTGCTTGCGG  GGTCTCCAAGTGAAGATCCAAG  AT2G29930 

18  CCGTCTCTGATCTTTCGCC  CCGTACTTAAGAAGCTTGTTAC  AT2G32235 

19  CTTTTGGAATGAGCACTCC  CCGTAGGCAAAGGCAATATCC  AT2G32330 

20  GGGATAATTGATGATTATTTTG  GTTCTGAACAACACTACACGG  AT2G37290 

21  GGACCCGAGACCTTGAACG  GGTAATGTCTTGCATCATCAG  AT2G37340 

22  GGAGACTACATGGAAGCCTATG  GGCGAATCGCGCCACGAGG  AT2G38860 

23  CCTCCCGTGTTCGAGCAACCC  CCGTTGGATCAAAGTTTTCAGCC  AT2G39730 

24  GGAGGGATCTGAAACAAG  GTGCTACACATGCGCATAGG  AT2G40910 

25  GATCCACGATCCGATTCTGG  GGTCTCTAACAGTTTGTCCG  AT2G43160 

26  GGTTATCGATGGAGAAAGTACGG  GGTGAACTTAGAGAGGAACTG  AT2G46130 

27  GGGAAGCTGGAAGGAAATTTG  GGAGCCAAAACGGTATGTGG  AT3G13170 

28  CTGTTGATACTACAAGCCAGC  CCCCTGCTGCTTGTGCTAC  AT3G18520 

29  GGAGAAAAGGGCACGGCTTGG  GATCTCAGGGTCTTCGATGG  AT3G51800 

30  CCAACATCATCATCTTCTC  CCACAAACTCGTCTATCAGC  AT3G53270 

31  GGCGACATACTTGCAGTATTG  GGATCAGTACATGTCTCAAG  AT3G54380 

32  CCTTTTCTTCTTCCAGCCTC  CCAACGAACAAGTCTGGACC  AT3G54790 

33  GGTGGTAAGACTACCTAAAGG  GGTTATCGCTGAGCGCGGGAG  AT3G57520 

34  GGATCATATGATTTCATAGG  GAATTTTGCATGTAGTAGGAG  AT3G60130 

35  CTCTCCTTCTCACGCCATACCC  CCCGTAAGCCATGGAATAC  AT4G00550 

36  GGTTTTGAGAGCAAAGAAAAACG  GGTTAACAACATGCATTGTTCG  AT4G12790 

37  CCATATCTTACATTGTTCCC  CCATTGCGATATAGTCATTCC  AT4G14160 

38  GATCTCTAAAGAGATTTATCG  GGCTTCATAGGTTTCCACG  AT4G20260 

39  GTCTATCTCCTCAATTTGG  GCACATTAGATGCTCCTCTAGG  AT4G20380 

40  CCATCAAAAGCTACAAGGGC  CCTTCTCGGAATATGCTATAC  AT4G25080 

41  GGCCTTGGTTCGAAGGGCTG  GCTTCTCAGCAGCAAGAGG  AT4G30480 

42  CCTTCGAGGAGCAGATGCGGGC  CCTCCAGAACCGTTGGGTGC  AT5G04430 

43  CATCCGCCATTAACGACCTC  CTCACAAACCGTCTGCATCC  AT5G09230 

44  GGGTACCAAGGCAAAGGTTTG  GCAATCTCTTCACAGCTTGG  AT5G13730 

45  CCTCTTGACCCTCATTGTCC  CCAGTTGTTGTAGCAGGAGC  AT5G15230 

46  CCATGTTTGGAGCAGATCATC  CCAAGACATTCTGGATTTCGACC  AT5G19660 

47  CCATTCAAATCTCACATTCCC  CCCGTCGGAAATACGAACCGCC  AT5G20250 

48  CCTAATCACTTTCAACAACTC  CCGTCAATGCACATAACGTC  AT5G35680 

49  CCATCCTGACATGGGTTTTGTC  CCAGTTCCTTTCTTCCGCCTGC  AT5G41150 

50 GGTTGTGTGATGCTTGAGAG  GGTTGTGTCTATGAGTTCCG  AT5G43910 

51 GGAGAAAGTTGTTGTAGGAG  GGTGGAGGTACATCACTGTGG  AT5G45510 

52 CCGTCTCTCACTTTTTCGCC  CTCTCAGGACCATATTTCTCC  AT5G50850 

53 CCTCGCCAATCCGATTACGC  CCTCCAGCATAAGGACTCTC  AT5G53300 

54 GGAAGTTTCAGGTGAAGGATGG  GGTCCATACAGAGCGAGACGG  AT5G56180 

55 CCTTCCATGATTCAATCTGCC  CTTCGAAGTGTAGTTCATGCC  AT5G59090 

56 CCTTCGTGAATTCGATTCC  CCCATAACCATAATCATCAGTCC  AT5G63770 

57 GGTCCAAGATCCAAGCTTTGG  GGGAAGGAGGTAGATTCCATG  AT5G63870 

58 CAAAGATCATTGATCGTTAC  CTTCACTTCCCCCATCATTAGTTC  AT5G65050 

59 GGCGGCAGGTCATGTACGG  GGGAAGACCCCTGAGGCGAACG  AT5G66010 

60 CTGGTTTCGCTGTTTCGTTCC  CTACATCCATTGGTCCACC  AT5G46800C 

61 CTCGCCATTGAGGGTCCCTCC  CAACACCACCAAGAGCAACGCC  AT1G79900C 

62 GGACAAGGAAGGCATTCCTCCGG  GACGAAGCACCAAATGAAGGG  AT5G03240C 

63 GGCTCCTCTCAACCCCAAGG  GGTAATCAGTAAGGTCACGG  AT3G12110C 

64 GTCACCGGAGGTGAGGTCGG  GATGACTAGAGCCGCTGCGG  AT5G60670C 

65 CAGGGTCAGTCATATACTCC  CCTATTCCTGGGATAGTCCCC  AT5G13480C 

66 CGCAAATTGATTCGCAGAGTC  CCACCATCTGTACTTTCCTGC  AT4G02560C 

67 GGCTAAAGGAGCAGGGCGTGG  GCTACAGACTTGTTCTTGGGG  AT1G20693 

68 CTTGCACATGATCCCGATCC  CCATCGCCCAATGCGCCACC  AT1G23970 

69 CCTCAGATCTCACGTCCGATC  CCTTGTCCAAATCCAGCTGC  AT1G29040 

70 CCTTCCATTCCACAGAATTC  CCAGATTGAGTCAAAGCCCAC  AT1G54360 

71 GGACAACAATGAGGCTGAGG  GAGTACACTAATACATATTG  AT1G78810 

72 CCCTGAAAGCATAGAAGCAGC  CCCATGACTTATTAAACTCC  AT2G04790 

73 CCGGAACTTGAGAGAGAGAGC  CCATGAGGGCTTGGCTCGTC  AT2G21620 

74 GAGCGAGAGCATAGCGGTGG  GGAACGGCGATACATGAATG  AT2G35550 

75 CTCGTTTAGTTTGGAGAATC  CTTCATCAGCATTCATTAC  AT2G36000 

76 GGGGAGATCTAACCATGGGG  GCTCTTGCTCCTCACAAGG  AT2G36340 

77 CCCTTATTCACAATCTCCTGCC  CTTCCTAAGTGGGTTTGAACC  AT2G41070 

78 GGAAGAAATTGAGGTCGGAG  GGTGCAATATAGTGAACGAGG  AT2G48060 

79 GAATAAAGACCATGAAGAGG  GAAGCATTTCCACAATCAATG  AT3G03890 

80 GGTTAATAATAGTCCTGTCG  GACCTCTTGGCATATGCGGG  AT3G10770 

81 CTCATAAATTCTTCAAAGC  CTCTTCTTTAGTCCAGCTACC  AT3G11280 

82 CCTTTCGTCTTCACCGCAAC  CCAAGCCATTCTCGGGAGCC  AT3G14230 

83 GGCTTTGTAGCATCTCGCCG  GGAGAATCCAACTTAGGTGAG  AT3G25585 

84 CGATGTCCGAGAGAGATTCC  CCCTAGAGAAGAAATACCAC  AT3G55630 

85 CCTTCTGAGCTAGCTCAGCTC  CGTTCGAACACTATCATTTCC  AT4G16280 

86 GGATTGTTCTTGTCCATTTTG  GCAAGCTCTGTTGCCTCGGG  AT4G16845 

87 CCACCACAACATTGTCTTTTC  CCAGCGTTAGGAATAGATCTC  AT4G35450 

88 GATGGTGGTGGAGTCAGAGG  GGTCGACCGGTCTCGTCCGG  AT4G37070 

89 CCTCTACACAGATCTTTGGATTC  CTTGACCACGTCGGGTAGTTCC  AT4G38510 

90 GGTGCTTTGTCGGCGGCCTTG  GGCTTTCTCGTCCTTGAAGG  AT4G39260 

91 CCATTTATAAATTTCTTCAC  CCGATCGCAGTGAACTTCAC  AT5G05270 

92 GGAAAGACCAGGCCAACCTG  GGAGATGCAGTATTGTTGTTG  AT5G16540 

93 GTCGGGATTCTACCACGCGG  GGACTGACCACCTCACCTGCG  AT5G27290 

94 GTCTCATGGGTCAAACAGAAG  GAATTGTACAGAGTTGATTGG  AT5G37850 

95 GAATCGCAAAACCAAATTTGG  GTCCGGAGGGAAGTGAATGG  AT5G41700 

96 GCGAAATTCAAAGGGTAAGG  GGCGCGAATATGCATCCCGG  AT5G63090 

97 GCGAATTAAGATAAAGATGAGG  GGAAAATTGTCGAGTTTGCG  AT3G61860 

98 GTGCTCGAAGCCCAGAATACG  GGTCATAACCAGGGCTCCTTTG  AT3G61860C 

99 GGAGTTAGCTGCGGAGCACGAGG  GGGATGGTAGTGGAAACTGG  AT1G20440C 

P á g i n a  | 221  

 

100  GGTGATGATGAATATCTTGATGG  GGCGAATCCTTACCGAGAACAG  AT5G52310C 

101  CCTAGCTGAAGTCTATGCTCC  CTCTCGTCTAGTTCGCGAAC  AT1G54390 

102  CCTCCTTCTCACTCTCGCTC  CCCACGGGAACGAAGATACC  AT1G27370 

103  CCAACCACCAATCCCTTCTGC  CTTGCTCTTGATTGTCTGCGCC  AT1G30500 

104  GGTTGGAGAATCCTGGGAGG  GGATACCCCAATTTGCAGCTG  AT1G57820 

105  GGCTAATTTAAGTGCTCAGGGG  GCTACATTTCGCATCACTTG  AT1G33060 

106  CCTTGTATTCGCATTAACCC  CCAGGTCCATGCTTTATAACTCC  AT1G49950 

107  CCGTCTTCACAACCTCAGCC  CCCACCATGACCAAACGTAGC  AT1G59750 

108  GGAACCGTTTGGGACTGTG  GCAGATTCATTCGACGCAGG  AT1G30200 

109  GATCTTGAAGAAAAAATTCAG  CCTAGCTCTACTTACGGACAG  AT1G77080 

110  GGTTGATGAGGAGTCTTCAAG  GGACACTTAAAGAGCTTCCC  AT1G72050 

111  GGACATGGTCTATGTCTCGTCC  GCTTTAGAGTCTCCAAGCTG  AT1G61660 

112  CCGTCTTGTGCGTCGATTTG  CCTGTCTTGAGCAGATTCAAGC  AT1G09530 

113  GGTTTATTGCATTCTGATAATG  GGTGGACTTGATCCTCCTC  AT1G72650 

114  CCCTTGCTGGATCTGAAATTG  CCAACAAACTTGCTTACTGAG  AT1G72650 

115  CTTAAGAACATGACTAAGTC  CCTCCTCCGTTGGATGAAACC  AT1G79580 

116  GGATTCACCTTTAGTGACTG  GAGACTCTTTGAATGATTGG  AT1G18660 

117  GAAACTGAAGATCATGAAGGG  GAGACGAAATATCTTGAAGG  AT2G22670 

118  GGGGAGCTTTCACCAATTAG  GCCTTATCATTAACCACCGG  AT2G02960 

119  GGTTGCTGATGCTGCAGAG  GGCCAGAAAACTGCATATTGG  AT2G36960 

120  GGCTGCTGCTAGAGCTTACG  GGTCCAGGCATACGACTGG  AT2G41710 

121  GGATGCAATAAGGTCACAGG  GGTCTAACGGAAACAATGG  AT2G18300 

122  CCAAAGATGGAATGCTGGACC  CTCAGGTCTCTTAATCTTTCC  AT2G36010 

123  GGTTCCTTGAACTTTAAGG  GGTTATACTGCCCCGACTGG  AT2G42830 

124  CCCTCTCTGCCTCCTCTCTTCC  CCCATTAGCAGGAAGACCTC  AT2G37060 

125  GGATTTGCCATCTATATCTGG  GCTTTGAGCATGAGCAGTAGG  AT2G46790 

126  CCGCTATGAACAGCCGGTCC  CCATGGGTGGTTATGCTCAG  AT2G34830 

127  CCGGTTATGGATCAGTCTGC  CCGTCGGTGGTCTTCGTCGGC  AT2G43010 

128  CCCAGAAATTGAAACTACC  CCCTTGCATTGGATTCATACC  AT2G15530 

129  CTAGGGTTTCTCATTCCGATCC  CCGTGAAGGCGGACAGCACGC  AT2G40830 

130  GCTTGATTACTCAGAACCAGGG  GAACCGCAGAACCTTGTGG  AT2G38185 

131  GGCAACATTAGGATTTGAGG  GGAAACAATAAACCAAACG  AT2G38880 

132  CCAACAGCAGCAGCAGCAAC  CCAAAAGGTTTCTTCTACGTACC  AT2G31370 

133  CCCATCGATTTCTTCCATCC  CTTCGATGTCATAGCAGCC  AT2G32250 

134  CTATCAGAGTTCCTTGGTGGCC  CATTGAGTTTCTCCTGTGTCC  AT3G08505 

135  GGAGTTACATGAGATCTCAAAG  GATAAATCCTTGACAAAACGG  AT3G54480 

136  GGGAAGAAGTGCGAGCTTGG  GGTGGAAATTGATGCCGCAG  AT3G07740 

137  CCGGAAGTTTACTTTGAGGATCC  CAACAATCTTGTACTTTCC  AT3G14740 

138  GGAATGGGCTGATGATGAAGG  GGTCCGATTCGATATCCAGTGG  AT3G10490 

139  GCACTGCAAATGCAAATAGAGG  GGCAGCTTCGATCCCAGCTG  AT3G04030 

140  GAAGAGGAGCAGCACGACGG  GGCCATTGACTACACAAACCG  AT3G15030 

141  GGGAGTGATGAATCTGAAAAG  GGATCTGCAGTTAAGCTTGAG  AT3G51880 

142  GGACAACCTTTTACTCAGACAGG  GGTATCAGCCATACTAGTTTCTG  AT3G12250 

143  CCCTCTAGTGTGAAACTCTGC  CCTTTGATCGATCACTGGAATC  AT3G12250 

144  GCACAGTGATGCCTTTGTGG  GGCTGTCACCTTCAGTCGAAGG  AT3G23280 

145  CCAACGACCCAATGGGAACTC  CGTTTAGCTGTAGAGACTCC  AT3G17609 

146  CCAAGTCACCGAAGCTCTAC  CCAGCAAAAGTAGCAGCTTGC  AT3G24120 

147  GGGAAATTGCACAATTAATG  GGTTTCTATTTACAGAACTCTGG  AT3G02290 

148  CCGTTTCTCGCTTCTTTTTCTC  CCTCTACAACACCTTTGGTACC  AT1G76510 

149  GGCATGTCGGAGTATGATCG  GACCTTAAAGCTTCTCTTAG  AT2G27230 

150  CCTGATTACTGTTTTGTCGG  CCTGACTAGAGTTGCAGAGC  AT3G20810 

151  CCTTCTTCGTGCTGCTGGTTTTC  CCTTAACGGAGAATCATTGCC  AT3G47550 

152  CCATCTCTATTCGTAATTAGC  CCCAAGATTCAAATCCAGGTTC  AT3G58030 

153  CCATCCCGGTTTAGTATGTC  CCTATTTTACCCATATGAAGACTGTC  AT3G59060 

154 GGTGCCGTTTGACATGGATAACC  GTCACCGACAAGCTTATGCATTC  AT4G01060 

155 GGTTCTTTCTTTGTGAACAAC  GGGAAACTCCTTAGACAGCAG  AT4G27050 

156 GGGCTTCCATTAAATCTCTTCACAG  GGAGACCTCTTCTGCTTTTTTG  AT4G34430 

157 GGGAACTCGGGTGCTGCTTTTAG  GGTAGCCTCGGTCTGAAGAGTCTG  AT4G38900 

158 CTCAGCGTCTTAATTACTTCAG  CCTTGGAGACTCTCTAGTGGAG  AT4G32730 

159 CGAGGATCAAAGACAATCATTCC  GGTTTTGCCCTTTCAACATC  AT4G37180 

160 CCTTCTCTCGACGATGATTTCG  CCAATACTAAAGACTTCATCTGG  AT4G14410 

161 CCATGCTGGATGATGTTATAG  CCTAGGGAAAGGTATGAATGC  AT4G28790 

162 GGAGACGGATATCACCGATG  GGAAGGAGTTCTTGCAAAGCC  AT4G28790 

163 CCTCCTCACTAACTCGGAGAC  CCTCTCCTCCCCCTCGCAGC  AT4G13100 

164 GGGAGACTCTTTGAGTTCCTTAAG  CTTAGTTCTTAGATAGATGTTCTC  AT4G09960 

165 GCAGAACATGAAAGAAGAGTAC  GCTCAGCATCATTGTCATATTC  AT4G16420 

166 GTTCGGAGAAAGTGGTATGAGAG  CGTAGACCACTTAAATTCCTTG  AT4G25990 

167 CCGATCATTGCATCACTACTAC  CCTTATGAACAACATGCTGC  AT4G18020 

168 CCCATAAGTGATGCCCTTCAAATG  CCCAGCTGCACCTAGGTTCTG  AT5G18240 

169 GGTCTTCTTCGCAGCCTGATTG  GGAGCGCAAACCAAACCTAC  AT5G24520 

170 GGTGTTTCCGTCTCCTCTCC  GGAAGAAGCAAGAGAGGCTTG  AT5G28770 

171 CCATCAAAACGACCTTCGGG  CCTTGTCTCTAAGGAGCTTC  AT5G18620 

172 GGTACAGGTGCCATCGCTATATC  GGGCGAAGAGAACGACCAACGC  AT5G60580 

173 CCATGGACATGACTTAGCCTCC  CCAACGGTACATGTTGTTGTTATC  AT5G23260 

174 CCCATCGCAAGGAGAAAGTC  CCAAATCCAAAAACGAACATGG  AT5G13220 

175 CACAACTTCACAGAGAGAGAG  CCATGATAATATCTGTAAAAGG  AT5G56420 

176 CCACGTCTTTGCAGTTGTAG  CCATCTGTTGAGACTGATGTTC  AT5G06960 

177 GGACCGTGGACAGAACAGGAGG  GGCGTGAAGCTCAAGGACTAAAC  AT5G59780 

178 GCGAATCACATTTGATCTATG  GCTTAAGAACTCCAGCTTTAAG  AT5G67580 

179 CCTTGTCTCCGACAACTTTC  CCTAAGCTTCTCAACAGAGTTAG  AT5G48150 

180 GGTACATTCGAAGAAGTTCC  GGAAGTTAGTCTTCGCGCTC  AT5G25390 

181 GGAGAAGCAGAGAATGGAAG  GGATCCTCCAATTTCAATGAG  AT5G05550 

182 GGAGAATAATGACTTGGTATTGG  GGTAAATCTTTTATGTTTCTTC  AT5G16820 

183 CCTGAAACAAACAATGAGCAC  CCTTCTTCCTATGCTCCACAC  AT5G22000 

184 GGAGAGAGAAAATCCCTCCG  GGAAGAGAAGCGTCTTCCTTGG  AT5G23090 

185 GGATCCAATGGATATAGTCG  GGAGCAATCGTCCGTTTATCC  AT5G23090 

186 GGATTGATGGGAGCATATGG  GGCACGTGCTTTTCTTCGCC  AT5G12840 

187 CAGTTTGTTTGTTTGTTTATAG  CCAATTTCAGAATCATCATC  AT5G02470 

188 GCTGTTGATGAGAAACCTCAC  GCTGGTAGAGAGTTGTTGCG  AT5G02840 

189 CCTCTGGGATCCATAAGTTTTG  CCATCAATTTCCCACTCCATTG  AT5G43270 

190 GGGCAAAATGTCAAATTAGG  GGAAGCAATGACAGTATGCGC  AT5G56370 

191 GGAGCCAGACAGTCTTGTTCAC  GGATCAGTCTCTTTTCCGCC  AT5G18830 

192 CCTTTTTTCTCTCTCTCTCTCTATCC  CCACAGTTTTGTAAGTAAATGGC  AT2G46370 

193 CCTTGTCCTGGACCCATGGAC  CTCGAGCAGTTCTCAGCCCC  AT1G07350 

194CCTCCGAGTATTGTTGGCTTCAGACC  CCTAATGTCACCGGGCAAGTTACC  AT3G49430 

195 GGCCAAAGAAGCACTGGAAGG  GGGTTCTGCCAACCTGCTGGTGG  AT3G01150 

196CCATGAGATTGTTAACAATCAGAGTCC  CCAGCAGCTTTCTCAAATGTGGC  AT3G01150 

197GGAATTTCGACTATGATACTCGCCATTCG  GGCCCATTCAACTGATAACTTGCG  AT2G46610 

198 GGATGAGCTTAGAGATGATGAGG  GGCCTGCCACTGGCTGACCATTGG  AT4G36690 

199 GGGAGATGGAGAGAGAGTTGTGG  GGCTCCTTTCGGGCCTTCTTGG  AT1G79880 

200 GGCCTCCTCCTTCAACGAAG  GGCCATCTTTGCTCTTGGTG  AT1G79880 

201 GGAGAAGTTTGAGAAACTTGAAGG  GGACGTAGGGCCTGGCCTGAGG  AT5G27640 

202 GGAGGCCATTTGAGCAGTTTGG  GGTTTTCTTCAGCAAATACGACAG  AT3G13570 

203 CCAGAGCTCTGCTGCAGGGGTAAC  CGCAAACAACAAGCAGAGTGAC  AT1G11650 

204 GGAAACACTCGCCTCTATGTTGG  GCGTCATCAGCATCACGAGG  AT3G53500 

205GGCAATTTCGAGTATGAAACTCGCCAGTCGG  GGAAAATTGTCGAGTTTGCGAATAG  AT3G61860 

P á g i n a  | 222  

 

206 GGCGTCCGGTGATGTTGAGTATCGG  GGCTTTCTCATCCTTGAAGG  AT2G21660 

207 GGCGTTTAAGACCTTTAAGCACAAAGG 

GGTTTTGGACAAAGAGAATATTATTTGG  AT2G47580 

208 CCGTCGGTTGTACTGTATATCAAAAACC  CTGCATTAGCCTCACACCAAGAC  AT1G09230 

209 GGAGTCAGGAAAGAGAAAAGCTTGG  GTTCTCTGATCTCTTTCAGG  AT2G16940 

210  CACATGCGTAAAGGAGGAGAAG  CCGAACATATTCATGAGAAAAC  AT4G02430 

212 CCTGCAAAATCTACATCGAGATCTCC  CTGTCCTAGCTCGATGGGTCC  AT4G02430 

213 GGATGTTGTGGGGAATGTTCTTCTGG  GGTATCCGGCTGTCTTCTCGAAAG  AT5G53180 

214  CTCGCTTCGACCTCTCTTTC  CTAACCACAGAGACTTTGTTCC  AT1G31600 

215  GACCATGTCCTGACCTTAAAGG  GGTAACAAGAAAAGCCCTGG  AT1G31600 

216  GTACACTTACAAGATGCTGGTGG  GGAAGGGAACGATGTGCAATGG  AT2G42890 

217  CCTAAACCTGTCTCAGCTGCACC  CCTTCTAGGTGATAAGCCTCTCC  AT1G16610 

218  CCACCGAATCAATCAATCTACATCC  CAGTGACTTCACTAAAAGTAACCC  AT2G30260 

219  GGTGACCTGGAACGACTATTCAGG  GCGGTCAAGTGCTCGGATGG  AT4G25500 

220  CCCTTTGAGAGGTTTGGACC  CCTGTTCATGCTTCTTTGAGCC  AT3G55460 

221  GAATCCAAAGCAAGATCTGCATGG CCTCAACATCAAGTTCCTCAAGTGCTCC  AT5G23080 

222  GGAGCCACCGTCCAGCAAGG  GTCGCAGTCTGGCCACCAAGCGCTG  AT5G06160 

223 GCAAATGAAATAATGAAGAAGAGGG  GTCAGCCCTTCTCCCATCCTCTGG  AT2G29210 

224  CAAAAGAAATTGGAATTGCTTTTCC  CCTCACTTGTATCTTCTTCC  AT1G15200 

225 CCGGCGATCAAATTACGACAGCGAC  CCGATGAGGGAATTCAACATTCC  AT3G53570 

226  GGTGTGAAGAAATACCGTGAGG  GGAGACTAACAGAATATTTTCTGG  AT4G24740 

227 CCTCATACTCACATGGATCGTCGTCC  CCATTTCCTTCCTCTCCCTATCCC  AT4G24740 

228  GGGGTGCTGAGAAATATTTCAGG  GCTGTGAGACGCTCAGATGG  AT4G32660 

229  GGTGCATTAAATATCTCAACCAG  GGAGCTTTTCAAGCCAAGATAGTGG  AT4G35785 

230  GGCAGCTGAGGCGGAAAGTGG  GGAGAGCGCGAGAGAGAACCC  AT3G11930 

231  CTTACGTTGCTTCATGTTCACC  CCCGTGTGAATAAGTTTGTC  AT3G58450 

232  CCACGGCGGCGCGTCTCCTCCGCC  CCAACGAGAAGCATCGAAGCACC  AT1G48960 

233  GGTGGAGATGATGATGGAGATG  GGTGATATATTACTTAGATCCCACG  AT5G54430 

234  CTACATCAATGGATTTTCTTGCC  CCAACTTTAACTCTTCAGTTTCACC  AT1G55870 

235  GGAGAAGACGAATCTTGTG  GGCATGTTGTTTCTTCTGG  AT1G69080 

236  GGATCTTCGTCGCTCAACG GGAGCAAGCATAAGAGCAGCTTCAGG  AT1G04950 

237 CCATTCTCTGTGGCCGTCACCGTCGCC  CCGAATCGTCGAGGCAGCTGCTGC  AT1G07830 

238  GGCAAGCTAGTTTTCTGACTGG  GTGGATAGTCGTATCTCCGG  AT1G08750 

239  CTACAACTCTGCATCATCTTCC  CCTTCAACAGATTCAAATTTGC  AT1G31500 

240  CCA ACA CTC ACC CTG CGT CC  CCTTGAGAAACGAGAATTATC  AT1G54260 

241  CAAAAAACATCGTAAGGAAGC  CCCATCTTCTTCGTAGTCC  AT1G02090 

242  CTAAATTGCTCAATTCTCTCGGCC  CCGGCAGGGACGTCAGGGAGATC  AT1G60850 

243  CCGGACCTAAACCGGAGCATGGCC  CCGATCCTGGCGTCGTCGGAGTTCC  AT2G33830 

244  CATACAGTTCTGGTTTCAAACC  CCTGGTTGTGCTGCAGTGAACC  AT5G09230 

245 GGCGATCAACGGAGGAGAGAAAAG  GAAGAATCCAGTGACTAGCCATGG  AT5G46110 

246  GAAACGGATCTGCTCGGTTTCAAG  GGTTCTGACACCAGAAGAAAAG  AT5G59440 

247  GGAAGAGGATATCCAGATG  GGCGAATCGCGCCACGAGG  AT3G13170 

249  GGCTTCAACAAAACGGGAGTCACG  GGATGGTGAAAGCGAACCTTG  AT1G72560 

250  CCTTCAATCTTTCGTTGTTC  CCTTTAAGTTGTATATCAGAGAC  AT1G37150 

251  GGACAAAGAGTGATTGCTGAAG  CCATCAGGATGAAGCTCATAC  AT1G37150 

252  CCATAGATTGATAAAGAGATGACC  CATTCTTCTAAGAGAGTAAACC  AT2G03810 

253 CGAGAAGATAGAAGAAGCTGCAAAGCC  CTCTGTCGCTACATTGAGATTCC  AT2G26980 

254  CCGCTACAATTCATCATCATC  CCTCTATCTAAAGCCTCCATAAC  AT5G50240 

255  CTACTCTCAGTAGCCGTCTCC  CATCAAGCTCAGGATCAGCTCC  AT1G23380 

256 CCAGAGGTTACTGATGCAGC  CCATCAGAGCTATGTTTGTCC  AT1G54080 

257 GCAATCTCGCCTCCCTCGGTGG  GGCTGCGATTGCGGTTGTGG  AT3G54770 

258 CCCTAATAAGATCAATTTCAC  CATTCTCTATTGCCATACTCC  AT3G09150 

259 GGGACTTTTGTTGGTGTTTACG  GGTATTTCTTGCCACAGCTCTG  AT3G17090 

260 CCAACTATTCTTCTTCCTCTTCC  CCACTGATTACTTCGCATGC  AT3G26740 

261 CTCATGTGTGTGGTATTCACC  CAGTGTTAGATCAGGCACACC  AT4G10100 

262 CCGGAGTCTCTAAGAATGAGC  CCACGCATGAAGCTTCACTC  AT5G20040 

263 GATGATGAAGAATCAAAGCCTGG  GGATCTGGTCACATATGTCG  AT5G26570 

264 CCGATCAGGCTTGGTTTGGC  CCGTCTTTTCTTCCATTAGACC  AT5G65430 

265 GGAGACTAGGAAGTTCTTCAAG  GCTCAGGTGTGTCATAACGG  AT4G35790 

266 GGCAGCTAAACTTGCAACAG  GTAAATTACCAACTCCGGTTGG  AT5G26040 

267 CAGGGTACATATGGGACTCC  CCCTAATTAATCTTCTTACGC  AT2G42245 

268 CCGTTGCAAGTTAAGTATGC  CCCTCTTAGAATCTGTAGATCC  AT1G03457 

269 GTTCGATAGAAGCAGAGAGAAAG CCTAACTGGTCTCCCTACCCTTCTTTCTG  AT3G21100 

270 CCATGTTCAAGAAACTCAATCC  CCTTAGAAGCTCTTCCAGGTAACC  AT1G53650 

271 CCGAAGCGAAATCCCTAATTTCC  CCTCCTCCACTTCATCCTCC  AT4G00830 

272 GGATTATTCTTAAGTCATAGG  GGAGTGAAGGTGGTTCTTGG  AT3G23900 

273 GCTAGAAGTTCATCTCCAGG  GGAAAAGAAGATAATCTAAAAG  AT3G07810 

274GGTTTTCGGATTCAGTGAGTGAAGG  GGCTTCGACAGCCGACTGTG  AT5G19030 

275GGACTCGGCAGTCACTAGGATACGG  GGAAATCGGAATGTGGTCTCCGG  AT5G19030 

276 CCTAATGTTGCTGAAAGAGTC  CCAGGTGATCCCTGAAGGCTGC  AT5G47620 

277 CCTCTTTTCTCACTCACTGTTAC  CCATTTGAGCTCTGAGAAACCCC  AT3G23830 

278GGCAGCTTTTGTCAGAGGATCCTAGG  GGAGTTGCTTCAGCACTAACTCCGG  AT2G02570 

279 GGAGAGATTTTAGAAGAAGATGGG GTTAGACTGCCTGCTGTTTGACGG  AT3G25840 

280GGTACGTGGGAATACACAGTTCTGG  GGAGATGGTTCAATCTGTTGTAG  AT5G11200 

281 CCAAAGTGTTTGAGTCCATGCAAC  CCACCTCTCCCGTTGTACCTC  AT5G47210 

282 GGTGACAAGACCCAATCGG  GGTTCGACCAATCCTATGG  AT5G63120 

283 CCAAGTACCACCACCTCTAATGTCC  CCTACCTTGCATAGCAATGGGCC  AT3G01540 

284 GGAGAAGAAGCTGAAGAAGAGG  GAAAAGCTTTTATCTTTTTGAG  AT4G33060 

285 CCATATTCTGGTTCTCATCC  CCAGGCATCTAACCGATTTCC  AT3G19840 

286 GAACTCGATCCTCCTCCATGG  GAGGGCTAGCTTTTTCCAAG  AT1G67210 

287 GCGGGAAAAAGAAAGCTCGG  GGCTACGGCTACGATGCCTCGG  AT3G63400 

288 CCATGTGTTGTACTAGTGCC  CCATGGATAGCAGTGTTGAC  AT3G12570 

289 GGGATCATTTTGATAGGAGCG  GGTGATAGTTCTCCATAGACAGG  AT3G12570 

290 GGGAAGTTCTTGAGCTCAATG  GGCTGATCTATCAGTCTCTTG  AT5G08470 

291 CTCATTTCATTCTGTTTCTCC  CCTTAATCTTGACCTTCTAGC  AT2G46270 

292 GATGAAAGTGTCACAGCGGG  GGCTTCATGGGCACCGAACCTTGG  AT4G36730 

293 CCGATGATGATTATGTCAACAACC  CCATAGAAGGAAGAAGCTTC  AT2G20180 

294 GGTCTATCACCCCAACGCACTTAGG  GGTGTAGACGAGCCCGAAGG  AT3G26520 

295 GGCTTGATTATGAGTATATACCAG  GGTAACAAAGGTGGCTCAGGG  AT2G02390 

296 CACAAGATTAATTTTATCCATTCC  CCTTCACCAATTTTAGAAGCC  AT1G67980 

297 GGTGGATGTTTCGTATTGTCGG  GGTCAAGTGTAAAACATCTGG  AT3G44300 

298 GGGATGTGCGATTGATCATGG  GGGCTTAACCATCACAGG  AT5G09880 

299 CCTCAGGCTCGGCAGATCATC  CCGAATCGAAGACAAACACCC  AT5G11330 

300 CCGAAAATTCACAAAATCAGAACC  CAGGAGGTCCGATAATGGTAAC  AT5G59300 

301 CCCATTGTTGTTCGTGTCCCC  CCGTTAATGCAGAAGCAAGTGTTCC  AT5G09790 

302 CATCCTCCTGGTGATGATCC  CCTCAACGTTTGCTGGAGATTC  AT5G09790 

303 GGACTCAGTGGAGAAGAAGAAG  GAGGAACGCAACATTCTCCGG  AT3G46460 

304 CCGATCATCAATGGCCGCCGTGCC  CCACTGAGAATGATTTCCAAC  AT5G18800 

305 CCCGGTGAGATGATAAGTC  CCATCTTTGATCTCCCCAAAC  AT1G01060 

306 GGACTGAGGAAGAACATAATAG  GGTTTACGCTTAGGCCGTGG  AT2G46830 

307 GAGAAGGCTGCACTTGAGAGG  GAATCTGGATCTATCTTAAGG  AT3G11540 

P á g i n a  | 223  

 

308  GGAGGAACACCTTGAGACTG  GAGTCACCGGAAGATTGTCGG  AT5G10140 

309  CAAGGAGTTACTAGAAATAGTCC  CCCGTGACATTCCTCTGTCACC  AT5G65060 

310  CCGTCGCTCTTATCATCATCTC  CCGGTGACATTGCTCTTGCATCC  AT5G65070 

311  GTCAACTCTCAATTCTCTGTGG  GTGGCCAGAGCTATTTTCCGG  AT5G65080 

312  GGGTTACTTAAGAAAGCTCG  GTAGGATGGAACATAGTGGG  AT5G13790 

313  GGAAGAGATGTCGAACCGTCG  GCTGCTTTCAAGTAAGTCGG  AT5G37055 

314  GGGCTGGCTCTTACGATAACAG  GATGGCCTCCTCCAGTTTGG  AT2G43410 

315  CTCAACGAAAGTCAACAACC  CCAACCCAGTACGAACGGCC  AT4G31120 

316  CGAAATTGGTAACTCCGGTTCC  CCAAGAGTAAAGTTGATATC  AT2G28550 

317  CTTGGGAATCTCTTTATCGACC  CCCCAGTTACTCATCATCCC  AT2G28550 

318  GGACGCTCTTGTGTCAAAGG  GTTGAGATTCATTGTTGGGG  AT5G48560 

319  CCTCTGGTCAGAAACTCACC  CATTGTTCAATCTCCAAGCC  AT5G65640 

320  CCCTGAGGTTACAACCACC  CCACATCCTTTCGTCATAGTTTCC  AT5G24590 

321  CGATCTCTACAAGTTCGATCC  CTTGTAAATTCGACACAACACCC  AT4G27410 

322  CCGATGTTTGTAAATCCGATCC  CTGTCTCTTTCTCATTCTCC  AT2G33480 

323  GGGTAACTACGCGTCAATGG  GATTCAACTCTTTGCAAATCGTGG  AT1G76580 

324  GGGATCCATAAGTTTTGAG  GCTTGAAGAATACAGAGAGG  AT5G43270 

325  CCACGGATGTTCCTCCTCTGCC  CGAACCTTGCGTGATTCATACC  AT2G47890 

326  GGTCCTATCAAAGAAAACGGG  GGTCTGCAAGCATGAAGGGCG  AT1G69250 

327  CTGCTCCATACCAATCAGCC  CCACTTCTATCAAAATGAAC  AT5G59950 

328  GGTCAATGAGAAGGATCAAG  GATTGTGGTGACTCTTCAACGG  AT5G52310 

329  GCAGTTCGGTTGTTGATGATGG  GGGGTGGAAAACATTGAGTG  AT4G17615 

330  CTCCTTATGTATCTATTCACC  CCGCTTCTGTCCTTATCAAACC  AT3G10300 

331  CTTCACTTTTCTTTAGTCTTC  GGTAAAACAGTGAGCATGAAG  AT3G10300 

332  GAATATTCATATCAGAGAAG  GGCTATCACATGTCCCCATGG  AT3G16800 

333  CCCGGTTCAGCTCTCGGTAGAC  CCTCTTACTATCTCCACTGCC  AT3G16800 

334  CCATCATTGCATGTGGTAGAGC  CAGTATTCCAGACTACATCC  AT1G01140 

335  CAAAGACGGGTACATAACGCC  CCTCTTGCATCTAGTGCACC  AT5G66210 

336  GTTGAAGTTGATCCTACTGG  GAGCCTCTCTAGCTCTTGAGG  AT5G28080 

337  GTCAAGATTGGAGATCTTGG  GAGTCTAAGGGACACTGTGG  AT5G28080 

338  CAGATGCTAGAAAACTTTTCC  CCATACATCTACTGCTGCTCC  AT5G57630 

339  GTAGATACTTGTTCTTCAAGG  GGATGATTTAGCTTACGAAG  AT4G13020 

340  CGAGTTTCTTCGAGTCATACC  CTGCGTCGTAACGACGATTCC  AT5G63990 

341  CACTATCGCTGCTAAGAACC  CTACGAAAGCAATCCATTTACC  AT2G15970 

342  CCGAATTTTCTCCTCCGCC  CCAATACCAAGAGTTCTCCC  AT3G01090 

343  CCTGACTCAGCTCTGCGTCACC  CCCAATTCCAAGAGTTTTACC  AT3G29160 

344  CCTGTTATTGGATAACCGGTTCC  CCAAGAGCCCATTTTCGATCAAC  AT3G29160 

345  CTAAGCTGCATCACCGTAACC  CTTGATTTAATATCTCTATGAC  AT1G49730 

346  GGGAAGTGTATCCCTTCTCTGG  GGAAAAGTTGCTTGTCGCCG  AT4G23260 

347  CCAACTCCAGGTCTATCAGCC  CCTGTACACAAGGCACTTCC  AT4G34460 

348  CGCCTCCAGCTCCTCGATACC  CTTGAGATGCACTGACAATCC  AT4G34460 

349  CTTTAGGAGGTGACAAAGCCC  CCCTGGGTGAGTTCATCATCC  AT5G40280 

350  CAGCGGTGAGGCTAAGAAACC  CAGGATCCACCGTGAATAGCTCCC  AT1G77740 

351 CACTAGCAGAGCTATCTTCC  CGCTGAGAAGTCAAATTCCC  AT2G18960 

352 CTTACCGGAATTTTCTCTCC  CCCAGACTCCACATCGCCTCC  AT5G57110 

353 CGAAGCACTTCGAACTCTTTGCC  CTCACCAAAGTATGCTTATCC  AT1G27770 

354 CTTTTGCTGATACACTTCTCTCC  CGTCTAAGCGACTGTTGTGCC  AT5G23450 

355 CTCTCTTTGTGGTCCGAACACC  CCCAAATCGATCGTTGTGTGTCCC  AT3G16785 

356 CACTAAATGTATCATGTATCC  CGTTGAGAAGCTTGCACCAC  AT3G56860 

357 CATTTCTTCGATACGATCAACC  CCATATTTTAGCTGCTTCCTC  AT1G54100 

358 CCGTTACAGATAAATAACACC  CCATTACCAGGACTTTCGTC  AT1G09000 

359 GGAAATGCAGCTGAACATGCTGG  GGACCAGTCCCTTCATGTAG  AT2G38170 

360 CTCTACCAATGGGTGTATTCC  CCCGATTCACTGTATTCATC  AT3G06510 

361 CCTTAAGGGATGCTTTTGCTC  CCTCCTCTGTTTAGAAACCACC  AT4G13850 

362 CCTTCAAACTTGCTAATCAATC  CCTGCGTCGGTGAAGTAAGCC  AT4G26070 

363 GAGTTTGGTGAATTTGTCCGG  GGCAAAGTCATGTTCTTGATG  AT5G24270 

364 CCATCGATGCTTGACTGGGTCC  CCGAAACGCAACAATCGTCGCC  AT5G67030 

365 GGTGCAGTTCTGGAGAAAGTG  GCATCCCATTCCCCATGGCTGG  AT4G34000 

366 CCTCTGATCTGTCTTCTTGGTTC  CCAACGTTCACGGCGGTTCC  AT5G25610 

367 CCACCTAGTCTCGGCCCAATC  CCCTCTCTAAGCAGACGAACC  AT1G71860 

368 CTTCCCAAGAAGATCAAATCC  CCTATGGTTCATGATTTCTC  AT1G78290 

369 CGTCTCAGCTCAATTCTCTTCC  CTCTTAGCCAAGTAGTGCTCC  AT4G31720 

370 CAGCAGAGTTTTCTTGTCCACC  CCAAGGATCTTTCTTGATTCC  AT5G35410 

371 GGACGGATGACGACAATGGG  GGGCAGTGTCTTCTGAGCCACGGG  AT5G37370 

372 GGTCGATCCAAAGGATATGG  GGAAGTGGTTGCTGATACGG  AT1G76460 

373 GTTGGTGGTATACCCTCAACGG  GGGTGACTACCGTAAGAAGG  AT3G13224 

374 GTTTAGGGCATCCTTGTGGG  GTAATCCTTAAGCCCATCGG  AT4G36960 

375 CTCAGGGATTACTTACTACC  CTCCGCGGAATAAATTAGCCC  AT3G20270 

376 GGGAGAAGTAGCTTCATCCGG  GAGTAGATCCTAGCTGAACAACG  AT1G64625 

377 CCGTCGTCGTATGTCTCTCTC  CCCATACTCCAACATAAACACC  AT3G51530 

378 CCTGATGATCAGAAGCTTGTTGCC  CCGAGGAACCCCAGTCTTGAC  AT3G62190 

379 GTTTGTTGTGTGTGAGACTTTGG  AGATGAGCTTTCTTCCATGG  AT5G04275 

380 GTCCATTTGGTTTCATAAGG  GCTTTCCCAGAAAAGTAATCGG  AT5G08185 

381 GGGAAAGAATCAAACTTTTG  GGTTTCGTTTATAACCAATG  AT5G53450 

382 GCAAAATTCAAGATAGACTGG  GGCTGTAAGGATGCCTGCAG  AT1G44910 

383 CCTTTTTACCGAAGAGACTCC  CCCTTCTCTTTGCTTTTCTC  AT2G43640 

384 GTGTCACCATATCGATGAGG  GACATCTCTATGCTGAGTGG  AT4G02200 

385 GGCTGCTTCATCGAGCGGAAG  GTTGAGCTTGACAACAACTGG  AT2G43810 

386 CCGGTAGCGTCACTAGCAAACCC  CTTGTTTACGGGCTAAACAACC  AT4G01250 

393 GGAAATGGAGGAAGAAACGG  GCCTCAACCTAACTACCTCAG  AT2G26150 

411 GGAGAAATAGTGACGGTGAG  GATCTTGTGGATGTGGTTGG  AT3G26744 

412 GGATTCAGCAATAATCTCAAG  GCTCAGCTGATCATCAGCTGG  AT4G29810 

413 CCTTCTTCTAACAACAAGTTTACC  CCATATCTCTTGTTGAAATCC  AT2G33120