Regolazione dell’espressione

genica in eucarioti

-Regolazione spaziale e temporale dei geni eucariotici

-Regolazione a livello trascrizionale

-Regolazione a livello traduzionale

Alcuni elementi per la regolazione genica negli eucarioti:

• Promotori: fattori di trascrizione e repressori

• Enhancer• Stabilita’ dell’RNA• Splicing alternativo• Risposta ormonale• Rimodulazione della cromatina• Metilazione del DNA

Stabilita’ dell’RNA: più è stabile e più cicli di traduzione effettua

• Assicurata dal CAP5’ e dalla polyA

• La lunghezza del polyA può determinare la stabilitàdell’mRNA (mRNA per gli istoninon hanno il polyA ed hanno una breve emivita)

•La struttura della regione 3’UTR non

tradotta influenza la stabilita’ dell’mRNA(sequenze AUUUA

ripetute nella 3’UTR determinano breve

emivita dell’mRNA)Se si trasferisce la

sequenza AUUUA ad un mRNA stabile, questo

diventa instabile

SPLICING ALTERNATIVOdeterminazione del sesso in Drosophila: gene Sex-lethal

Esone rimosso

Esone incluso

Proteina non funzionale

Proteina funzionale per lo sviluppo femminile

Risposta ormonaleOrmone steroideo Ormone peptidico

L’espressione genica indotta da un ormone è mediata da specifiche sequenze sul DNA, chiamate elementi HRE (elementi di risposta all’ormone)

ENHANCER

Enhancer: vi si legano fattori di trascrizione speciali, che a loro volta interagiscono con i fattori di trascrizione posti sul promotore e con la RNA polimerasi

-agiscono a distanze molto ampie

-agiscono in entrambi gli orientamenti

-effetti indipendenti dalla posizione (a monte o a valle del gene)

Gal10

L’enhancer UAS di lievitoAttivazione dei geni del

metabolismo del galattosio

GAL4, fattore di trascrizione che si lega all’enhancer UAS

(Upstream activating sequence)

Gal4 zinc-

finger èespressa costitutivamente

DBD

AD

Struttura Gal4

TWO-HYBRID SYSTEMCOME DETERMINARE L’INTERAZIONE

TRA 2 PROTEINE

DBD

AD

BYTE (PROTEINA NOTA)

E’ BASATO SULLA COSTRUZIONE DI 2 TIPI DI IBRIDI:

1-DBD-BYTE

2-AD-PREY

PREY (PROTEINA INCOGNITA LEGANTE)

PROTEINA NOTA

PROTEINA INTERAGENTE

La cellula in cui c’e’ interazione tra le 2 proteine sopravvive su terreno in cui l’aminoacido che viene

espresso o esprime il marcatore LacZ

Saccaromyces Cerevisiae

Attivazione del reporter essenziale x

la sopravviven

za della cellula

L’attivazione di un gene richiede cambiamenti nello stato della cromatina

per avere accesso al DNA

Geni attivi ⇒ eucromatina

Geni inattivi ⇒ eterocromatina

Alcuni attivatori trascrizionalimodificano gli istoni acetilandoli

Alcuni repressori trascrizionali li deacetilano

Una volta stabiliti, i cambiamenti cromatinici possono persistere attraverso le divisioni cellulari, creando uno stato epigenetico

Eredita’ della condizione di inattivazione

2 tipi di condizioni in cui si trova un promotore eucariotico

Stato inattivo del promotore

Stato attivo

Se si legano prima gli istoni al

promotore la trascrizione èbloccata; se si legano prima i

fattori di trascrizione la trascrizione è

attiva

Transcription factors or nucleosomes may form stablestructures that cannot be changed merely by changingthe equilibrium with free components.

Chromatin remodeling

Il complesso SWI/SNF permette il

rimodellamento della struttura cromatinica e

lo slittamento dei nucleosomi lungo il

DNA rendendolo accessibile da parte

della RNA polimerasi II e dei fattori di

trascrizione

I cambiamenti cromatinici possono compromettere la funzionalità del promotore, di un intero gene, o di

un intero cromosoma

I cambiamenti nella struttura della cromatina iniziano attraverso la modificazione degli istoni, nella coda N-terminale, soprattutto degli istoniH3 e H4.

Tipi di modificazione degli istoni

Tutti gli istoni possono essere acetilati: l’acetilazione è incrementata nei geni

trascrizionalmente attivi e la cromatina acetilata è più sensibile alla DNA-asi I

L’acetilazione è un fenomeno reversibile

• Enzimi HAT (acetiltransferasi)

• Enzimi HDAC (deacetiltransferasi)

MODULAZIONE DELLA CROMATINA•La struttura dei nucleosomi influenza la trascrizione•Il dna più trascritto è più facilmente attaccato dalle nucleasi

Acetilazione degli istonida parte di HAT

Apertura della cromatina accessibile

alla trascrizione

Acetilazione attivazione

La metilazione è associata ad inattivita’ trascrizionale

• La metilazione avviene sugli istoni(lisina 9 dell’istone H3) ad opera di metiltransferasi

• Avviene sul DNA a livello delle isole CpG sia di promotori sia di sequenze geniche codificanti, ad opera di metilasi

METILAZIONE DEGLI ISTONI

BLOCCO DELLA TRASCRIZIONE AD OPERA DELLE METIL-

TRASFERASI (DNMT)

L’attivazione del promotore

richiede il legame di

diversi fattori

La formazione di eterocromatinanon è rigorosamente definita dalla

sequenza

Quando un gene è trasferito, per traslocazione, trasfezione o integrazione, in una posizione adiacente all’eterocromatina, può diventare

inattivo, eterocromatinizzandosi

Effetto epigenetico o variegazione per effetto da posizione

-L’inattivazione si diffonde dall’eterocromatina alle regioni adiacenti per una distanza variabile

-In genere l’inattivazione di un gene avviene durante le prime fasi dello sviluppo embrionale e successivamente il gene è ereditato come tale dalle cellule discendenti

Fasi dell’

eterocromatinizzazione:

-nucleazione (inizia in sequenze specifiche)

-propagazione imprecisa lungo il cromosoma

Le proteine leganti la cromatina hanno domini comuni

• Cromo-domini

• Bromo-domini

HP1, hanno come target l’eterocromatina

Presente in una varietàdi proteine che

interagiscono con la cromatina aperta, in

particolare con le istoneacetilasi e fattori di

trascrizione

La proteina HP1

H3 →deacetilato→metilato→ legato ad

HP1

Inattivazione del cromosoma X femminile:compensazione da dosaggio

Inattivazionerandom di un X, ereditata dalle cellule discendenti

Aumenta l’espressione

dell’X maschilecromosomi politeniciiperattivi

I 2 X degli ermafroditi

esprimono in modo ridotto

Si riattiva durante

l’oogenesi

Il cromosoma X• Elementi LINE• Sequenze Alu ricche di GC• Sequenze ripetute invertite e LTR• Ricco di geni sesso-specifici, come geni

espressi nel muscolo, nel cervello, e geni della prima spermatogenesi

Inattivazione dell’X nei mammiferi-Il centro dell’inattivazionedi uno dei 2 cromosomi X è il locus XIC o centro dell’inattivazione dell’X

-Se questo locus viene inserito in un autosoma, questo viene inattivato

-Xic è un locus cis-agente da cui parte l’eterocromatinizzazioneche si estende su tutto il cromosoma in entrambe le direzioni

-Di tutto il cromosoma X inattivo c’è il gene Xist (X inactive specific transcript) che è attivo solo nel cromosoma inattivo

-Xist codifica un trascritto privo di schemi di lettura, quindi un RNA che non produce proteina (ncRNA)

-L’Rna di Xist si trova solo sul cromosoma inattivo

-Studi condotti sulle cellule di topo, hanno dimostrato che Xist e’ prodotto precocemente da entrambi i cromosomi, ma essendo l’RNA molto instabile, viene facilmente degradato,e solo sul cromosoma in cui viene stabilizzato, va a ricoprire il cromosoma poi inattivato

-Il cromosoma inattivo e’ visibile durante l’interfase come corpuscolo scuro associato alla membrana nucleare, detto Corpo di Barr

- Il cromosoma X inattivo si replica piu’lentamente degli altri a causa della sua cromatina molto condensata, ricca di istoni H3 e H4 ipoacetilati

-Il locus XIST da solo non basta, ma servono elementi che

percepiscono il numero dei cromosomi X e della scelta

del cromosoma da inattivare

- L’elemento della conta sembra essere

localizzato a valle di Xist (3’)

- L’elemento della scelta sembra risiedere nel locus XIC

- E’ veramente random la scelta dell’X da inattivare?

Sembra che nei marsupiali e nei tessuti extraembrionali

di topo l’inattivazione dell’X e’ imprinted (o paterno o

materno), Importante un elemento a valle di Xist, che

modifica il rapporto 50:50 dell’inattivazione

Geni che sfuggono all’inattivazione dell’X

• Sono geni che hanno dei loro omologhi nel cromosoma Y

• Il loro escape dipende dalla sequenza genica e non dalla loro posizione

• I geni che sfuggono all’inattivazionedell’X hanno una regione 5’ meno ricca di CpG

• I geni attivi nell’X inattivo sono circondati da INSULATORS

Insulator Sequenza di DNA agente in cis, che previene il passaggio di effetti

attivanti o inattivanti

-Lo 0.7% del genoma umano contiene doppietti CpG

-Il 2-7% delle citosine del DNA dei mammiferi sono metilate

-La maggior parte dei gruppi metile si trovano nelle isole CpG

- La metilazione avviene ad opera di Metilasi e demetilasidel DNA

Le isole CpG

La metilazione ha vari tipi di targets

• CpG di promotori, che sono metilatiquando il gene e’ inattivo o demetilati nel gene attivo

• CpG di DNA satellite, che, metilato, stabilizza il DNA centromerico

Le metilazioni del DNA sono responsabili di:

-IMPRINTING

-patologie

-espressione tessuto-specifica

-Differenziamento cellulare

-Vecchiaia

-Carcinogenesi (ipometilazione di promotori di oncogeni o ipermetilazione di promotori di oncosoppressori → riprogrammazione dello stato cromatinico)

-Inattivazione dell’X

IMPRINTING• Alleli materni o paterni sono ereditati

metilati o no ⇒ differente comportamento tra gli alleli ereditati da ogni genitore

Se l’embrione e’femmina il gene

viene metilato nei gameti durante la

gametogenesi

Se l’embrione e’maschio il gene materno deve

essere demetilato

Se l’allelepaterno attivo

porta una mutazione l’embrione presenta il

fenotipo malato

L’IMPRINTING e’ regolato dallo stato di metilazionedi una sequenza cis-agente vicina al gene, chiamata DMD o ICR (imprinting control region); la sua delezione rimuove l’imprinting

Geni con opposto imprinting regolati dallo

stesso ICR, che funziona da insulator

IL REPRESSORE Kox1 che porta il dominio KRAB

Proteine che contengono domini zinc-finger e Kruppel-associated boxes

Domini di legame al

DNA

Domini di repressione

trascrizionale

Domini di repressione

trascrizionaleattivi sulle RNA

polimerasi I,II e II

Condensazione reversibile della

cromatina

Come funziona la repressione trascrizionale operata da

Krab?

Sistemi ibridi TetR-KRABper accendere e spegnere

l’espressione genica eucariotica

TetO TetA TetR

Proteina di efflusso della tetraciclina

Proteina repressore

Repressore TetR che blocca l’espressione

dell’operone Tet

La tetraciclina stacca il

repressore da TetO e attiva

l’operone

Proteina di fusione KRAB-TetRGeni eucariotici inducibili e reprimibili

basati sul repressore procariotico TetR-TetO

KRABKRAB

tTRtTR

Repressore della tetraciclina tetR

Repressore KRAB

QUALI SONO LE MUTAZIONI GENICHE RILEVANTI NELLO SVILUPPO E MANTENIMENTO DEL TUMORE?

STUDIO DELLA GENESI DEL MELANOMA DIPENDENTE DALL’ESPRESSIONE DIH-RasV12G IN TOPI INK4a -/-, QUINDI PRIVI DELL’ATTIVITA’ DI SOPPRESSIONE DEL TUMORE

MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI

ANIMALE TRANSGENICO →tutte le cellule nucleate contengono il transgene

ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

a

b

Progenie con cellule germinali portatrici del transgene

Eredita’ mendelianadel transgene

Cellule germinali aploidi

50% + 50% -

RISOMMINISTRAZIONE DI DOXICICLINA

TetO P RasV12G

KRAB

KRAB

tTRtTR