Referencyjna Diagnostyka Chorób Pasożytniczych w CDC

Norman J. Pieniążek

Division of Parasitic Diseases

The findings and conclusions in this presentation have not been formally disseminated by the Centers for Disease Control and Prevention and should not be construed to represent any agency determination or policy.

Hasło „CDC” w Wikipedii

Centers for Disease Control and Prevention (CDC) - (pol. Centrum Zwalczania i Zapobiegania Chorób) to jedna z agencji rządu federalnego Stanów Zjednoczonych wchodząca w skład Department of Health and Human Services (DHHS) (pol. Ministerstwo Zdrowia i Usług Społecznych). Jej siedziba główna znajduje się w Atlancie w Georgii w sąsiedztwie kampusu Emory University.

Zajmuje się zapobieganiem, monitoringiem i zwalczaniem chorób (ze szczególnym uwzględnieniem chorób zakaźnych), zagadnieniami zdrowotnymi związanymi ze środowiskiem naturalnym, środowiskiem pracy, a także z szeroko pojętą profilaktyką i poprawą stanu zdrowia społeczeństwa USA.

CDC ma znaczenie także w wymiarze światowym jako instytucja mająca ze względu na posiadane środki materialne i potencjał naukowy w profilaktyce, rozpoznawaniu i zwalczaniu chorób i nowo pojawiających się zagrożeń zdrowotnych (np. bioterroryzm, AIDS, gorączki krwotoczne).

Historia CDC

• 1942-1945: Malaria Control in War Areas (MCWA)– Instytucja powołana w celu kontroli malarii w Południowo-Wschodnich stanach

USA gdzie znajdowały się poligony do szkolenia żołnierzy do walki na terenach Pacyfiku i Azji Południowo-Wschodniej. W drugiej połowie 1942 roku MCWA zaczęła także zwalczać malarię na terenach objętych działaniami wojennymi.

• 1 lipiec 1946: Communicable Disease Center– Biuro U.S. Public Health Service zajmujące jedno piętro budynku w centrum

Atlanty i obejmujące MCWA

– Nazwa instytucji była zmieniana kilkakrotnie: Center for Disease Control, Centers for Disease Control i wreszcie Centers for Disease Control and Prevention. Ale akronym (skrótowiec) zawsze był „CDC”

• 1947: CDC kupiło za symboliczną sumę dziesięciu dolarów 15 akrów (6 hektarów) ziemi od Emory University (CocaCola) na Clifton Road

Historia CDC c.d.

• 1949: Utworzenie serwisu epidemiologii w CDC– Pierwsze zadanie: czy w USA jest jeszcze malaria?

• 1951 – 1954: Rozbudowanie epidemiologii podczas Wojny Koreańskiej• 1955 – 1957: Poliomyelitis (Choroba Heinego-Mediny)• 1962 – 1977: Wyeliminowanie ospy czarnej• Ebola, Borelioza, Choroba legionistów, AIDS, Hantawirus,

Zanieczyszczenia w pigułkach z L-Tryptofanem, Zespół wstrząsu toksycznego, SARS, Kryptosporydioza, Zatrucia pokarmowe Cyclospora cayetanensis i Escherichia coli O157:H7, Wirus Gorączki Zachodniego Nilu, Spory wąglika i Bioterroryzm, Ptasia grypa, itd.

Statystyka

• Budżet CDC na rok 2008: 8 800 milionów dolarów ($8.8 billion)

• CDC zatrudnia 15 tysięcy pracowników w tym ponad 6 tysięcy osób na kontraktach

• W CDC pracuje 840 oficerów U.S. Public Health Service Commissioned Corps (USPHS CC), jednego z siedmiu rodzajów sił zbrojnych (umundurowanych) Stanów Zjednoczonych. Większość z nich zajmuje się epidemiologią lub kwarantanną.

• W CDC rozróżnia się 170 specjalności zawodowych pracowników

• CDC wydaje i rozprowadza bezpłatnie „Morbidity and Mortality Weekly Report” (MMWR) oraz „Emerging Infectious Disease Journal” (EID)

• Budowa nowych budynków CDC od 1998 do 2008 kosztowała ponad 4 000 milionów dolarów ($4 billion). Nowe budynki zastąpiły stare biurowce i laboratoria zbudowane w latach 40-tych i 50-tych XX wieku. Powierzchnia laboratoriów znacznie się zwiększyła, polepszono też funkcje socjalne dla pracowników a także bezpieczeństwo i komfort pracy w laboratoriach i biurach.

Lokalizacja CDC

• CDC ma oddziały w 10 różnych miastach USA oraz kilka stacji badawczych poza USA (w Afryce, w Centralnej i Południowej Ameryce a także w Azji).

• Pracownicy Działu Kwarantanny CDC stacjonują we wszystkich przejściach granicznych USA.

• Centrala CDC mieści się w Atlancie w stanie Georgia i tutaj pracuje około 90% personelu tej instytucji na 9 różnych kampusach. Laboratoria badawcze w Atlancie funkcjonują tylko na dwóch kampusach: Roybal i Chamblee.

Kampus Roybal na Clifton Road

Kampus Chamblee na Buford Highway

Budynki na kampusie Roybal

Budynek 18 Budynek 21 Budynek 23 (w budowie)Laboratorium i BSL-4 Biura i socjalny Laboratorium

Budynki na kampusie Chamblee

Budynek 106 Budynek 109 Budynek 110 Biura i socjalny Laboratorium Laboratorium

Laboratoria i biura

Chamblee Budynek 110 Roybal Budynek 18 Roybal Budynek 21 w nocy Laboratoria Laboratorium BSL-4 Biura i Socjalny

(Hot Lab)

Epidemic Intelligence Service (EIS)

• Program szkoleniowy powołany w CDC w 1951 roku podczas Wojny Koreańskiej z powodu obaw przed użyciem broni biologicznej.

• Przyjmuje kandydatów z całego świata, którzy już uzyskali stopnie naukowe w medycynie czy w dziedzinie zdrowia publicznego.

• Szkolenie trwa dwa lata i szkoli „detektywów chorób” (ang. Disease detectives, EIS Officers)

• Szkolenie koncentruje się na „shoe-leather epidemiology” a nagrodą za szczególne osiągnięcia jest oprawiona w ramkę skórzana podeszwa z dziurą, symbolizującą przejście pieszo wielu kilometrów podczas prowadzenia badań.

Prawne ograniczenia funkcjonowania CDC

• CDC nie prowadzi szpitali ani przychodni poza przychodnią dla pracowników

• CDC nie wydaje rozporządzeń a tylko zalecenia nie mające mocy prawnej

• CDC nie może przeprowadzać żadnych badań w USA bez zaproszenia ze strony władz lokalnych (stanowych lub powiatowych)

Division of Parasitic Diseases (DPD)

• Organizacja: CDC/CCID/NCZVED/DPD

• Podział organizacyjny– Office of the Director (OD)

– Parasitic Diseases Branch (PDB)

– Malaria Branch (MB)

– Entomology Branch (EB)

Podstawowe fakty o DPD

• Zatrudnia 222 pracowników: 154 etatowych i 68 kontraktorów oraz zmienną ilość osób, które przyjechały na szkolenie z własnymi pieniędzmi na kilka dni lub dłużej

• Budżet DPD na rok 2008 wynosił około 24 milionów dolarów

• DPD utrzymuje stacje badawcze w Kenii i w Gwatemali

Kierunki badań i usług w DPD

• Nowe choroby infekcyjne (EI)

• Diagnostyka referencyjna

• Bezpieczna żywność

• Bezpieczna krew

• HIV/AIDS

• Malaria

• Oporność na antybiotyki i inne leki (AMR)

• Bioterroryzm: przygotowanie na zagrożenia a także do szybkiej reakcji na zagrożenia

Zespół diagnostyki w DPD/PDB (DPDx)

• 18 pracowników na etatach i 8 na kontraktach

– Epidemiologia: 4

– Laboratorium: 22

• Budżet – około 5 milionów dolarów

– Pensje etatowych pracowników: 35%

– Odczynniki, aparatura, kontrakty, delegacje (podróże): 65%

• Kierunki pracy

– Serwis diagnostyki referencyjnej pasożytów dla szpitali, klinik, lekarzy i specjalistycznych laboratoriów diagnostycznych (USA i Świat)

– Żywność (np. Toxoplasma, Cryptosporidium, Cyclospora, zakażenia robakami)

– Krew i organy: transfuzje i przeszczepy (np. babezjoza, malaria, choroba Chagasa)

Diagnostyka w DPDx

• Diagnostyka referencyjna i rutynowa– Potwierdzenie lub stosowanie testów opracowanych w

CDC– 10 000 próbek rocznie

– Serologia – 14 chorób– Testy molekularne – 5 objętych CLIA i 6 w trakcie

opracowania– Mikroskopia/morfologia – ponad 100 medycznie

ważnych pasożytów– Porównanie testów komercyjnie dostępnych z testami

CDC

• Opracowanie nowych testów– Testy serologiczne– Testy molekularne

Szkolenia i nowe metody konsultacji w DPDx

• Strona internetowa DPDx

• Telediagnostyka

• Przekazywanie technologii do laboratoriów stanowych i innych

Strona internetowa DPDx i CD Techniki molekularneTelediagnostyka

Szkolenia

Laboratoria stanowe finansowane przez DPDx

Telediagnoza DPDx

14

3753

74

102

144

193

244

0

50

100

150

200

250

FY99 FY00 FY01 FY02 FY03 FY04 FY 05 FY 06Rok budżetowy

Konsultacje przez system telediagnozy

Pasożyty diagnozowane w DPDx

• “Robaki” – nicienie, tasiemce i przywry

• Pierwotniaki – np. malaria, Babesia, Cryptosporidium, Cyclospora i Naegleria, Acanthamoeba, Balamuthia, Entamoeba, Trypanosoma cruzii, Leishmania spp.

• Stawonogi – np. świerzb, pchły i wszy

• Różne – np. Blastocystis, mikrosporydia i Pneumocystis

Dwa przykłady badań z 2008 roku

• Marzec – sierpień 2008: analiza przesłanych z Afryki izolatów nitkowca podskórnego (Dracunculus medinensis) w celu oznaczenia gatunku w ramach programu eliminacji drakunkulozy prowadzonego przez CDC/WHO/Carter Center/Bill & Melinda Gates Foundation

• Lipiec 2008: potwierdzenie diagnozy i oznaczenie gatunku przekazanego przez transfuzję pasożyta Babesia i eliminacja zakażonej krwi z banków

Cykl życiowy nitkowca podskórnego (Dracunculus medinensis, riszta, robak

medyński)

Drakunkuloza

• W miejscu, gdzie nitkowiec przebija skórę robi się na ogół bolesna, piekąca rana

• Pasożyta nie można zabić lekiem, bo pacjentowi może grozić gangrena

• Pasożyta można usunąć operacyjnie, lub stosując tradycyjną metodę przez powolne nawijanie na patyczek

Eliminacja drakunkulozy

• W byłym ZSRR na terenach republik Centralnej Azji drakunkulozę (ros. riszta) wyeliminowano latach 30-tych XX wieku przez likwidacje cystern z wodą pitną. Zesłano bądź zlikwidowano też roznosicieli wody, którzy stanowili rezerwuar pasożyta.

• W latach 90-tych Fundacja Carter Center w Atlancie przy pomocy CDC i WHO utworzyła program eliminacji drakunkulozy znacznie mniej drastycznymi metodami szkoląc sanitariuszy prawie w każdej wiosce od Bangladeszu po Zachodnią Afrykę. Rozdawano proste filtry do wody z siatki nylonowej (np. z rajstop), pomagano w wierceniu studni, rejestrowano chorych i dbano, aby nie moczyli bolącej nogi w wodzie. Stosowano też preparaty zabijające oczliki w małych zbiornikach wodnych przerywając cykl życiowy pasożyta.

• W 2008 roku, drakunkuloza występuje już tylko w Południowym Sudanie, Nigerii i Ghanie.

Czy jest to D. medinensis, inny nitkowiec, czy też kawałek sznurka?

• WHO i CDC oficjalnie zatwierdzają, że jakieś państwo jest wolne od drakunkulozy. Wiąże się to z zaprzestaniem finansowania programu eliminacji w danym kraju.

• Jest więc istotne, aby móc stwierdzić, czy przesłana z jakiegoś kraju próbka jest rzeczywiście D. medinensis a nie nitkowcem, pochodzącym z jakiegoś zwierzęcia (jest wiele gatunków nitkowców), lub kawałkiem sznurka.

• Ponieważ próbka jest tylko cienką rurką i badania mikroskopowe są bezużyteczne, stosuje się w celu identyfikacji gatunku nitkowca techniki PCR i sekwencjonowania DNA.

Rozdział produktów PCR na żelu agarozowym

Babezjoza, Indiana 2008 – historia choroby

• 73-letnia pacjentka miała przeszczep wątroby w lipcu 2006 roku. Operacja (przeciętny koszt od 100 tysięcy do 400 tysięcy dolarów plus leki kosztujące rocznie około 12 tysięcy dolarów) była zalecona z powodu silnego zniszczenia wątroby przez wirusowe zapalenie wątroby typu C. Podczas operacji usunięto pacjentce śledzionę. Przed tą operacją pacjentka nigdy nie miała transfuzji.

• Pod koniec czerwca 2008 roku pacjentkę przywieziono do szpitala z objawami ostrej niewydolności nerek i wątroby. Szpital wykonał rozmaz krwi i stwierdził obecność organizmów podobnych do Babesia w krwinkach. Pacjentce podano dużą ilość krwi (transfuzja wymienna) a także chinidynę i klindamycynę. Po transfuzji parazytemia (procent krwinek, zawierających pasożyta) zmalała z 45 – 50% do 5 -10%. Pacjentka jednak zmarła na drugi dzień po przyjęciu do szpitala.

• Lekarz prowadzący pacjentkę skontaktował się z DPDx poprzez Stanowy Ośrodek Zdrowia Indiany. Przesłał także do DPDx próbkę krwi pacjentki.

Diagnoza babezjozy u pacjentki z Indiany - mikroskopia

• Przesłana przez szpital krew pacjentki była przechowywana przed wysłaniem przez kilka tygodni w lodówce. Na zabarwionym odczynnikiem Giemsa preparacie było widać jakieś kropki w krwinkach, ale nie przypominały one Babesia.

• Szpital przysłał oryginalny rozmaz, zrobiony w dniu przyjęcia pacjentki. Z obrazu krwinek było dla nas oczywiste, że jest to Babesia, ale nie częsta na Północnym-Wschodzie USA B. microti, ale raczej Babesia podobna do występującego w Europie gatunku B. divergens.

Diagnoza babezjozy u pacjentki z Indiany - serologia

• Krew pacjentki nie wykazała przeciwciał na antygeny B. microti i B. divergens. Nie jest to dziwne, bo pacjentce po operacji podawano silne leki immunodepresyjne.

• CDC zwróciło się do szpitala, który przeprowadził przeszczep wątroby w 2006 roku z prośbą, o uzyskanie z banku krwi próbek krwi lub osocza dawców, od których pochodziła krew i płytki krwi podane pacjentce.

• Do DPDx przesłano próbki osocza z 9 dawców krwi i dawcy wątroby. Wszystkie próbki nie wykazały przeciwciał na B. microti ale jedna próbka wykazała przeciwciała na B. divergens.

• Zwrócono się do Amerykańskiego Czerwonego Krzyża i Zrzeszenia Banków Krwi o wyeliminowanie krwi pochodzącej od tego dawcy, ponieważ istnieje ryzyko zakażenia się Babesia przez pacjentów, którym podaje się leki immunosupresyjne albo cytostatyczne. Krew tego dawcy jest także niebezpieczna dla ludzi po splenektomii i chorych na schorzenia układu immunologicznego.

Diagnoza babezjozy u pacjentki z Indiany – metody molekularne

• Krew dawców i pacjentki była negatywna w bardzo czułej reakcji nested-PCR ze starterami (primerami) na Babesia microti.

• Stosując startery uniwersalne, powielające kompletny gen kodujący rybosomalny RNA małej podjednostki rybosomu (18S rRNA) uzyskano pozytywny wynik z krwią pacjentki. Krew wszystkich dawców, a więc i dawcy mającego przeciwciała na B. divergens, była negatywna w tym teście. Należy pamiętać, że reakcja z tymi uniwersalnymi starterami nie jest bardzo czuła i przez to nie nadaje się do wykrywania Babesia u nosicieli.

• Sekwencja genu kodującego 18S rRNA jest standardowo stosowana w taksonomii (systematyce) molekularnej. Wykazano, że pacjentka była zakażona Babesia identyczną do B. divergens MO1.

Babesia MO1

• Pierwszy przypadek infekcji tym organizmem opisano w 1996 roku. Pacjent pochodził ze stanu Missouri (stąd skrót MO). Pacjent był chory na toczeń rumieniowaty układowy (lupus) i był leczony sterydami (prednisone 10 mg/d). W 1973 roku przeszedł splenektomię, ponieważ miał hemolityczną anemię i trombocytopenię. Był przyjęty do szpitala 1 lipca 1992 roku i już następnego dnia stwierdzono, że na rozmazie krwi widać zakażenie Babesia. Pomimo leczenia pacjent zmarł trzy tygodnie po przyjęciu do szpitala. Dopiero testy na zwierzętach i sekwencja fragmentu genu kodującego 18S rRNA pozwoliła określić, że chodzi o nowy gatunek tego organizmu, nieznany do tej pory w USA i podobny do B. divergens.

• Drugi przypadek został opublikowany w roku 2002. 56-letni pacjent z Kentucky został przyjęty do szpitala z silnym bólem głowy, był bardzo osłabiony a kuracja amoksycykliną nie spowodowała poprawy jego stanu. Ponieważ pacjent przeszedł splenektomię, zrobiono rozmaz krwi i wykazano obecność w krwinkach pasożyta, podobnego do B. divergens. Po właściwej kuracji klindamycyną i chinidyną pacjent wyzdrowiał.

Pełna sekwencja 18S rRNA z Babesia MO1

• W roku 2004 opublikowaliśmy przypadek pacjenta ze stanu Waszyngton, który był zakażony organizmem, podobnym do B. divergens. Przeprowadziliśmy bardzo dokładną analizę sekwencji europejskich izolatów B. divergens i izolatu MO1. Wykazaliśmy, że MO1 różni się w sekwencji genu kodującego 18S rRNA w trzech miejscach na 1724 nukleotydów. Sekwencja tego genu z pacjenta ze stanu Waszyngton różniła się od sekwencji B. divergens w ośmiu miejscach. Mamy więc do czynienia najprawdopodobniej z trzema gatunkami Babesia: B. divergens, Babesia MO1 i Babesia Washington.

• W roku 2005 naukowcy z Massachusetts i Teksasu opublikowali sekwencję genu kodującego 18S rRNA kilku izolatów Babesia pochodzących z dziko żyjących królików amerykańskich Sylvilagus floridanus. Ponieważ sekwencja 18S rRNA Babesia wyizolowanego z tych królików była identyczna z MO1, wydaje się, że króliki stanowią rezerwuar tego pasożyta i że może być przenoszony przez kleszcze na człowieka.

Niektórzy pracownicy DPDx