Redox-potenciál mérésen alapuló gyors mikrobiológiai módszer
-
Upload
oliver-reichart -
Category
Technology
-
view
70 -
download
3
Transcript of Redox-potenciál mérésen alapuló gyors mikrobiológiai módszer
Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 1.
Klasszikus (tenyésztéses) módszerek
Hosszú inkubációs idő (1-4 nap) A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-
hatósága és költsége tartományfüggőNagy koncentrációknál:
Hígítás és telepszámlálás a30-300 cfu/ml tartományban
Alacsony koncentrációknál:MPN módszerMembrán szűrés
Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2.
Gyors mérési módszerek 1.(sejtszámlálás alapján)
Direkt számlálás Számlálókamra Flow cytometer
Csak tiszta folyadékban alkalmazható
TurbiditásmérésCsak tiszta folyadékban alkalmazható
Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2
Gyors mérési módszerek 2.(Anyagcseretermék detektálása alapján)
ATP mérésCsak 105 sejt felett alkalmazható
Impedancia mérésen alapuló módszerek Malthus Rabit Bactrac
Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 3.
Impedimetriás gyors módszerek
Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon drága berendezés.
Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot igényel.
Probléma a szelektív szubsztrátokkal. A mérő cellák geometriája és térfogata adott. Kis koncentrációknál megbízhatatlan.
Redoxpotenciál mérésen alapuló módszer elvi alapjai
Kémiai reakció általános formában:
a A + b B c C + d D
[C]c [D]d Q = ------------ [A]a [B]b
Biológiai rendszerekben
Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez.
A környezet redukciójának okai lehetnek:Oxigén elfogyasztásaRedukált komponensek feldúsulása
Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai rendszerekben:
[Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]
Nernst egyenlet:
RT [reductant]
Eh = E0 - ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+]
RT [oxidant] [H+]Eh = E0 + ----- ln -------------------
nF [reductant]
Eh : a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott
redoxpotenciál (V)E0 : A rendszer normál redoxpotenciálja (V) R: Gáz-állandó R = 8.314 J/mol K F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V
mol)n: elektronok száma a redox-reakcióban
(n=1)
Mikroba-szaporodás redox-görbéje
E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 60 120 180 240 300
t (min)
Eh
(m
V)
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
lgN
(N
=cf
u/m
l)
Eh mV lgN
Különböző baktériumok redox-görbéi
Redox görbék TSB-ben
-400
-200
0
200
400
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh (m
V)
steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt.
A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére
E. coli in TSB
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 120 240 360 480 600 720 840 960
t (min)
Eh (
mV
)
Steril steril lgN=0,09 lgN=2,38
lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80
Detektációs kritériumok
Impedimetriás módszerek RABIT: admittancia változás > 5 S/6minBACTRAC: impedancia változás > 5%
Redox-potenciál mérés:|E/ t|>1mV/min
Detektációs idő (TTD):A detektációs kritérium eléréséhez szükséges idő
A kezdeti sejtszám hatása a detektációs időre
E. coli in TSB
0
1
2
3
4
5
6
2 3 4 5 6
lgNo (CFU/ml)
TT
D (
h)
Mérőcella hatása a redox-görbére
Enterococcus kémcső, mérőcella
0
100
200
300
400
500
600
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh
(m
V)
Kémcsőben Mérőcellában
Enterococcus faecalis különböző cellákban mérve
Enteroc. faecalis 1/2 TSB-ben y = -1.0833x + 9.857
0
1
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5 6 7 8
lgN (cfu/cella ml)
TT
D (
h)
üveg aerob üveg anaerob kémcső
Teszt-mikrobák és táptalajok 1.
Microorganisms Redox potential
Plate counting
Escherichia coli BBL, TSB TSA, Tergitol Enterobacter aerogenes
BBL, TSB TSA, Tergitol
Citrobacter freundii BBL, TSB TSA, Tergitol Klebsiella oxytoca BBL, TSB TSA, Tergitol Acinetobacter lwoffii BBL, TSB TSA, Tergitol Pantoea agglomerans
BBL, TSB TSA, Tergitol
Teszt-mikrobák és táptalajok 2.
Microorganisms Redox potential
Plate counting
Pseudomonas aeruginosa
Cetrimide, TSB
TSA, Cetrimide
Pseudomonas fluorescens
Cetrimide, TSB
TSA, Cetrimide
Enterococcus faecalis
Azide, TSB TSA, Slanetz-Bartley
Total count TSB TSA
A módszer validációs jellemzői 1.
Szelektivitás
A szelektív médium által adott.
Linearitás
1-től 107 cfu/mérőcella.
Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben
Enterobaktériumok, B. subtilis és Enterococcus faecalis azid levesben, kémcsőben
0
100
200
300
400
500
600
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh
(m
V)
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E. coli és Enterococcus faecalis Cetrimid-levesben
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440
t (min)
Eh
(m
V)
Ps. aerug. Ps. fluoresc. E. coli Enterococcus
Enterococcus faecalis meghatározás linearitása
Entroc. faecalis Azid y = -2.0214x + 18.192
R2 = 0.9983
0123456789
10
2 3 4 5 6 7 8
lgN (cfu/cella ml)
TT
D (
h)
Pseudomonas aeruginosa meghatározás linearitása
Pseudomonas aeruginosa in Cetrimide
y = -154,75x + 1440,6
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN
TT
D (
min
)
E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel
TTD (min)
y = -56,429x + 566,38
R2 = 0,9995
y = -64,951x + 625,54
R2 = 0,9593
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4lg N (cfu/flask)
TT
D (
min
)
TTD (min)s TTD (min)m
Impedimetriás és redox-módszer összehasonlítása
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10
lgN (CFU/ml)
TT
D (
h)
Rabit Bactrac Malthus redox
A módszer validációs jellemzői 2.
Érzékenység
Kimutatási határ (Detectation limit)
1 cell/test flask.
Meghatározási határ (Quantitation limit)Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum (1 log egység), ami megegyezik a kapott
kalibrációs görbékkel.
min13060Nlg
TTD
A módszerek érzékenysége
E. coli
0,81
1,21,41,61,8
Redox Bactrac Malthus Rabit
Methods
-DT
TD
/Dlg
N
A módszer validációs jellemzői 3.
TartományA kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend. 10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz
problémát, 107 sejt felett a TTD túl rövid a tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-,
redox-egyensúly, lag-periódus).
IsmételhetőségA kalibrációs görbékből számítva:
SDlgN = 0.092
SDN = 100.092 = 1.24 = 24%
A módszer validációs jellemzői 4.
Zavartűrés (Robustness)
Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely két módon befolyásolja az eredményeket:
szaporodási sebesség hőmérséklet-függése
redox-potenciál hőmérséklet-függéseA mikroba szaporodási optimumán mérve, a szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon belül nem változik.A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint elhanyagolható.
Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
25 30 35 40 45 50
T (°C)
Eh
(m
V)
phyz. Salt Azid BBL Z-broth RCM
A hőmérséklet hatása a mérési módszerekre
Impedimetriás módszerek: A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő. A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5%
növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual).
Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási követelménynek (T=±0.002°C).
Redox-potenciál mérés: A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-
szaporodás határozza meg. A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.
Impedimetriás és redox mérési módszerek hőmérséklet-érzékenysége
Impedimetric method
Redox-potential
1°C változás hatása (Szubsztrát-függő) 20-200S 0.4-1.4mV
Hamis pozitív eredményt adó hőmérséklet-változás
0.004°C/min 0.7-2.5 °C/min
Szokásos méréshez tartozó kritikus hőfok-csúszás
0.025°C/6min 7-25 °C/10min
A redox-módszer alkalmazása
1. Víz mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Coliform, E. coli Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis
2. Nyers tej mikrobiológiai minősítése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae
3. Hús mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae
4. Felületek mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Enterobacteriaceae
5. Penész- és élesztőgombák számának meghatározása
Víz mikrobiológiai vizsgálatokÖsszcsíra
Water in TSBy = -60,807x + 525,03
R2 = 0,9973
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TT
D (
min
)
Víz mikrobiológiai vizsgálatokColiformok
Coliforms in BBL
y = -67,611x + 596,28
R2 = 0,9865
y = -81,034x + 773,78
R2 = 0,9941
y = -101,94x + 1020,2
R2 = 0,9958
y = -132,3x + 1190
R2 = 0,9621
y = -88,257x + 855,63
R2 = 0,9714
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 2 3 4 5 6 7lgN
TT
D (
min
)
Citrobacter aerob Citrobacter anaerob Klebsiella anaerob Enterobacter aerob E. coli
Víz mikrobiológiai vizsgálatokPseudomonas aeruginosa
Pseudomonas Cetrimid y = -153,21x + 1422,5R2 = 0,9882
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TT
D (
min
)
Víz mikrobiológiai vizsgálatokEnterococcus faecalis
Enterococcus AZIDy = -95,238x + 793,33
R2 = 0,9859
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TT
D (
min
)
Ipari validálási eredmények 1.
72 palack vizsgálata Coliform mikrobákra
Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra.
Redox-potenciál mérési módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
4 membrán behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 12 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra
Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpensio (lgN = 3.66)
Ipari mérések eredménye 1.
72 bottles in BBL
-300,0
-200,0
-100,0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
0 200 400 600 800 1000 1200
t (min)
Eh
(m
V)
1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72. Citrobacter
Ipari mérések eredménye 1.
Minták 1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72.
Laboratory negative negative negative negative negative negative
Redox negative negative negative negative negative negative
72 palack vizsgálata coliform mikrobákra
Ipari validálási eredmények 2.
66 palack vizsgálata Coliform mikrobákra
Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra
Redox-potenciál mérési módszer Membran szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
3 membran behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 9 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra.
Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpenzió(lgN = 6.66)
Ipari mérések eredménye 2.
66 bottles
-400,0
-300,0
-200,0
-100,0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
0 200 400 600 800 1000 1200
t (min)
Eh
(m
V)
1.-9. 10.-18. 19.-27. 28.-36. 37.-45. 46.-54. 55.-63.64.-66. Water1 Water2 E.coli (+) Negative
Ipari mérések eredménye 2.
Minták 1.-66. Bottles Water sample 1. Water sample 2.
Laboratory results negative negative negative
Redox method negative negative negative
66 palack vizsgálata coliform mikrobákra
Nyers tej össz-mikroba száma
Nyerstej 0,1/100ml y = -1.3345x + 12.981
R2 = 0.9634
0
2
4
6
8
10
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
lgN (cfu/test cell)
TT
D (
h)
Enterobaktériumok tejben
Enterobacteriaceae in EE broth y = -0.935x + 8.2116
R2 = 0.9924
012
3456
789
0 1 2 3 4 5 6 7lg cfu/ test cell
TT
D (
h)
E. coli Enterobacter cloacae Citrobacter freundii
Salmonella abony Klebsiella oxytoca
Nyers hús össz-mikroba száma
Meat in TSBy = -2.6833x + 20.498
R2 = 0.9633
y = -3.15x + 19.456
R2 = 0.965
y = -2.3979x + 18.226
R2 = 0.9302
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 1 2 3 4 5 6 7lgN (cfu/test cell)
TTD
(h)
Chicken Pork Beef
Enterobacteriaceae húsban
Meat in EE broth y = -0.92x + 12.653
R2 = 0.9975
10.50
11.00
11.50
12.00
12.50
13.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
lgN (cfu/test cell)
TT
D (
h)
Felületi tamponos vizsgálatok
E.coli, tampon y = -1.0860x + 8.8565
R2 = 0.9900
01
23
45
67
89
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
lgN/Petri
TT
D(h
)
Redox-potenciál változás gombák szaporodása során (indirekt mérés)
Saccharomyces cerevisiae
200
250
300
350
400
450
500
550
600
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00
t (h)
Eh
(m
V)
ch1 ch2 ch3 ch4 ch5 ch6
Saccharomyces cerevisiae kalibrációs görbe
Saccharomyces cerevisiae y = -6.9146x + 39.37
R2 = 0.996
05
1015202530354045
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/test cell)
TT
D (
h)
Aspergillus niger kalibrációs görbe
Aspergillus niger y = -6.1936x + 55.984
R2 = 0.9858
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/test cell)
TTD
(h)
A redox mérési módszer előnyei 1.
Egyszerű mérési technika. Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást. Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú
fertőzések esetében. Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás
mérések kis vezetőképességű, speciális tápleveseket igényelnek).
Különösen alkalmas membrán-szűréses módszer kiértékelésére.
A redox mérési módszer előnyei 2.
Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére.
Nagyon hatékony módszer táptalaj-optimalizálási kísérletekhez.
A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus módszerekhez viszonyítva, különösen null-toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus, Pseudomonas, etc.) meghatározásánál