Realtime Pcr

Indice

Rodrguez M & Rodrguez W 2

IBT-UNAM

Mtodos fsico-qumicos enBiotecnologa (2006-II)

Presentado a:

Dr. Roberto P. Stock Silberman

Indice


INDICECAPITULO 1 INTRODUCCIN..................................................................................3

CAPITULO 2 RESEA HISTRICA ..........................................................................4

CAPTULO 3 PCR EN TIEMPO REAL ......................................................................7

3.1 DEFINICIN ............................................................................................................73.2 EL ENSAYO..............................................................................................................73.3 PRINCIPIO QUMICO DEL ENSAYO ..............................................................................8

3.3.1 Qumica no especfica .....................................................................................93.3.2 Primers marcados con fluorforos ................................................................12

3.4 INSTRUMENTACIN PARA EL PCR EN TIEMPO REAL.................................................193.5 ANLISIS DE LOS DATOS.........................................................................................23

3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta................................................................263.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa .................................................................26

3.6 ESTRATEGIAS DE NORMALIZACIN .........................................................................303.6.1 Cuantificacin de ARN mensajero..................................................................31

CAPITULO 4 APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL.............................36

4.1 VIROLOGA ...........................................................................................................364.2 MICROBIOLOGA CLNICA (COSTA, J. 2004) ............................................................374.3 INVESTIGACIN BIOMDICA....................................................................................39

4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNA.................................404.3.2 Identificacin de mutaciones .........................................................................40

4.4 ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS (GMO) (BUSTIN, 2005) ..................414.5 APLICACIONES FUTURAS Y PERSPECTIVAS (VALASEK ET AL., 2005) ........................41

CAPITULO 5 TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL.................................43

5.1. CALIDAD DEL ARN...............................................................................................435.2. DETECCIN NO ESPECFICA....................................................................................445.3. DETECCIN ESPECFICA.........................................................................................455.4 LINEARIDAD DEL PASO DE REVERSOTRANSCRIPCIN................................................465.5 ANLISIS DE LOS DATOS.........................................................................................485.6 EL NIVEL UMBRAL..................................................................................................50

CONCLUSIONES ........................................................................................................52

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................53

Introduccin


CAPITULO 1

INTRODUCCIN

En los ltimos aos, la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) hasurgido como una metodologa robusta y ampliamente utilizada en investigacin biolgicaya que puede detectar y cuantificar cantidades muy pequeas de secuencias especficas decidos nucleicos. Como herramienta de investigacin, la principal aplicacin de estatecnologa es la rpida y precisa valoracin de cambios en la expresin de genes comoresultado de la fisiologa, la fisiopatologa o la evolucin. Este mtodo puede ser aplicadoa sistemas modelo para medir respuesta a estmulos de tipo experimental y para adentrarseen los cambios potenciales a nivel proteico y funcional. De este modo, la fisiologa puedeser correlacionada con eventos moleculares para tener un mejor entendimiento de losprocesos biolgicos.En el campo del diagnstico clnico de tipo molecular, el RT-PCR puede ser usado paramedir cargas virales o bacterianas, o en evaluacin del estado de enfermedades como elcncer.En la presente monografa se discuten los conceptos bsicos de la tcnica de PCR, laqumica e instrumentacin del RT-PCR y se incluyen aplicaciones presentes, desventajasy perspectivas futuras para esta tecnologa en las diferentes ramas de las cienciasbiomdicas y bioqumicas.Esperamos que este documento sea una herramienta til para los nuevos estudiantes ycuriosos que quieren obtener informacin bsica de calidad y en idioma espaol acerca delas tecnologas de punta para el desarrollo de procesos biolgicos, bioqumicos ybiotecnolgicos.

Resea Histrica


CAPITULO 2

RESEA HISTRICA

El concepto de producir muchas copias de una molcula especfica de ADN mediante unproceso cclico utilizando una enzima ADN polimerasa y oligonucletidos quefuncionaran como primers fue expuesto por primera vez en un artculo en 1971 porKleppe y sus colegas. En ese momento la demostracin prctica de esta teora no fueposible debido a la dificultad y el costo de produccin de los oligonucletidos, el nocontar con polimerasas termoestables y la ausencia de termocicladores automticos.

La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa(PCR) fue llevada a cabo por Kary Mullis en 1983 (Saikiet al., 1985; Mullis et al., 1987), razn por la que recibi elPremio Nobel una dcada despus. La gran utilidad de estatcnica se difundi a principios de los ochenta por toda lacomunidad cientfica. Los nuevos equipos y las avanzadastcnicas de secuenciacin, as como los programas decomputacin para la manipulacin de datos que se fueronsucediendo, permitieron el desarrollo de mejores ensayosde PCR. La aparicin de la Internet hizo posible el accesoa bases de datos como GenBank, EMBL y DDBJ, lascuales permitieron la comparacin de secuencias en todo el

mundo. El uso de la Taq ADN polimerasa fue uno de los impulsos ms importantes dadosa la tecnologa de PCR (Saiki et al., 1988). Esta enzima fue incluso obtenida de formarecombinante, con lo que se eliminaron funciones no deseadas de la enzima original. En1990 ya se contaba con buffers de PCR, dNTPs, MgCl2 y Taq polimerasa de formacomercial. El mejoramiento de los buffers increment considerablemente la actividad y laestabilidad de las polimerasas.

Dr. Kary Mullis

Resea Histrica


A principios de los aos noventa Higuchi y sus colaboradores del Roche MolecularSystems y de Chiron (1992; 1993) desarrollaron una tcnica de PCR en la cual incluyeronel bromuro de etidio (EtBr) en el medio de reaccin, la cual se llev a cabo bajo la luzultravioleta. Desde el ao 1966, Le Pecq y Paoletti reportaron que este agente intercalantedel ADN de doble cadena fluoresce bajo la luz UV. Esta propiedad fue aprovechada paragrabar la acumulacin de ADN utilizando una videocmara. Esta sencilla reaccincombinada con la videografa permiti el nacimiento del PCR en tiempo real, el cualcombina la enorme sensibilidad de la tcnica de PCR con la precisin que asegura elmonitoreo in situ de los productos generados por esta reaccin a travs del tiempo.La primera compaa que desarroll la instrumentacin necesaria para llevar a cabo elRT-PCR fue Applied Biosystems en el ao 1996, y desde entonces otras compaas comoBioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han desarrollado nuevos equipos. Una parteimportante de estas mquinas se utilizan en investigacin acadmica, y de acuerdo a unestudio realizado en el ao 2003, de 406 investigadores entrevistados, el 48% piensarealizar RT-PCR en su futuro trabajo (Arlington, 2003). La figura 2.1 muestra el numerode publicaciones en la base de datos Medline que contienen la palabra real time yPCR en el ttulo o en el resumen. Como vemos, ocurri un incremento del 43% entre el2003 y 2004, donde aparecieron 3522 publicaciones (Valasek et al., 2005). Estos datosdemuestran que la tcnica de RT-PCR se perfila como uno de los mtodos de vanguardiaen las ciencias biomdicas, fundamentalmente en el diagnstico molecular y la fisiologa.

Figura 2.1 Curva de utilizacin de latcnica de PCR en tiempo real. Sepresenta el nmero de publicacionesen la base de datos de Medline quecontienen las palabras Real-time yPCR

Resea Histrica


Por qu el PCR en tiempo real?Mediante la tcnica de PCR es posible amplificar un segmento de ADN de maneraexponencial, ya que despus de cada ciclo se duplica la cantidad de ADN que existe si lareaccin ocurre con mxima eficiencia. La realidad es que las reacciones de PCR alcanzanun plateau o meseta debido al agotamiento de los reactantes luego de numerosos ciclos(Wittwer et al., 1997a). Adems, la autohibridacin de los productos cada vez msnumerosos contribuye al efecto de meseta, por lo que se hace imposible calcular lacantidad de ADN de partida midiendo la cantidad de producto final. Es esta caractersticadel PCR convencional la que impone la necesidad del PCR en tiempo real. Dado que lareaccin de PCR en sus inicios amplifica el ADN de manera eficiente, y existe unacorrelacin entre el ADN de partida y el ADN formado durante la fase exponencial, esposible cuantificar la cantidad de ADN de partida.La principal meta del RT-PCR es distinguir y cuantificar de manera especfica unasecuencia de cido nucleico en una muestra incluso cuando sta se presenta en pequeascantidades. Durante la amplificacin, la velocidad en que se llega a un nivel determinadode fluorescencia (umbral) correlaciona con la cantidad de ADN que tenemos al inicio.Adems, el producto final puede ser caracterizado si se somete a incrementos detemperatura para determinar en qu momento la doble cadena se separa. Este punto defusin es una propiedad nica que depende de la longitud y de la secuencia nucleotdicadel producto.Otra de las ventajas de la tcnica de PCR en tiempo real es la cuantificacin de ARN. Estoes posible gracias al uso de las reverso transcriptasas, enzimas que generan ADNcomplementario (ADNc) a partir de un templado de ARN. Bajo condiciones apropiadas,la cantidad de ADNc generado por reversotranscripcin es proporcional al nmero demolculas de ARN presente en una muestra dada. Entonces este ADNc puede ser eltemplado para una reaccin de PCR en tiempo real, utilizando su sensibilidad y precisinpara determinar cambios en la expresin de genes. Esta tcnica es conocida como RT-PCR en tiempo real y se ha convertido en el mtodo ms popular para la cuantificacin delos niveles de ARN mensajero (Bustin et al., 2000). Todo esto demuestra que la tcnica dePCR en tiempo real permite cuantificar con alta precisin tanto los niveles de ADN comolos de ARN.

PCR en tiempo real


CAPTULO 3

PCR EN TIEMPO REAL

3.1 DefinicinLa Reaccin en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, tambin conocida como RealTime PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reaccin dePCR a medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR yno al final como se realizaba antes. Este mtodo revolucion la forma en que se usaba latcnica de PCR para cuantificacin de ADN y ARN. El RT-PCR usa molculas de unreportero fluorescente para monitorear la amplificacin de productos durante cada ciclo dereaccin. Esta tcnica combina los pasos de amplificacin de ADN y la deteccin en unnico ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productosamplificados. Un anlisis apropiado de los datos y/o de la qumica tambin permiteeliminar la necesidad de realizar pruebas de Southern Blot o secuenciacin de ADN paraidentificacin de los amplicones. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con supotencial como tcnica en aplicaciones futuras y la evolucin hacia nuevos conocimientosde la qumica, adems de la confiabilidad en la instrumentacin y protocolos mejorados,han hecho del RT-PCT una tecnologa altamente competitiva para la deteccin de ADN yARN.

3.2 El ensayoLa tecnologa del RT-PCR est basada en la deteccin de una seal fluorescenteproducida proporcionalmente durante la amplificacin del ADN blanco (Fig. 3.1). Antesque revisar la cantidad de ADN blanco producido despus de un nmero fijo de ciclos, laspruebas de RT-PCR determinan el punto en el tiempo durante el proceso de cicladocuando se detecta por primera vez la amplificacin de un producto de PCR. Este se

PCR en tiempo real


determina identificando el nmero del ciclo en el cual la intensidad de la emisin delreportero marcado se levanta sobre el ruido de fondo.

Fig. 3.1 Representacin esquemtica de un ensayo de RT-PCR usando el mtodo Taqman

Este nmero del ciclo est referido como el ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct sedetermina en la fase exponencial de la reaccin de PCR y es inversamente proporcional alnmero de copias del blanco. Por lo tanto cuanto ms alto es el nmero de copias inicialesde los cidos nucleicos a amplificar, ms pronto se observa un aumento significativo enla fluorescencia, y son ms bajos los valores de Ct. Los ensayos de RT-PCR sonaltamente reproductivos (Fig. 3.2(A)) y pueden discriminar fcilmente entre valoresdiferentes de cantidad de templado (Fig. 3.2 (B)).3.3 Principio qumico del ensayoEl RT-PCR puede utilizar fluorforos generales de unin no especfica a ADN como elBromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrlisis (Sondas 5 nucleasa), sondasde hibridizacin, molecular beacon o sondas de secuencias especficas (Ej. Scorpions).

Desnaturalizacin

Alineamiento del primer/ hibridizacin de sonda

PrimerSonda

Fluorescena

PolimerasaHibridado

Extensin

PCR en tiempo real


Fig. 3.2 Reproducibilidad y precisin del RT-PCR. Anlisis de una placa de 96 pozos que contiene rplicasdel mismo templado. El ensayo fue llevado a cabo en un instrumento Stratagene MX 4000 usando el mtodoTaqman. El promedio de Ct para las 96 reacciones es 230.3. (B) Dos reacciones mezcladas, ajustadas portriplicado. Una contiene 1x103 copias de templado de ADN y marca un Ct de 23.10.15. La otra tiene 2x103copias de templado de ADN y marca un Ct de 24.10.1. Esto corresponde exactamente al valor esperado deDCt de 1. (Bustin, S. 2005)

3.3.1 Qumica no especficaEn general, los agentes intercalantes usados en la qumica no especfica son fluorforosque aumentan notablemente la emisin de fluorescencia cuando se unen a ADN de doblecadena (ADNdc). El ms utilizado en RT-PCR es el SYBR Green I (Fig. 3.3), el cualinteracciona con el surco menor del ADNdc, emitiendo 1000 veces ms fluorescencia quecuando est libre en solucin. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en unaumento proporcional de la fluorescencia emitida. El SYBR Green I absorbe luz en unalongitud de onda de 480 nm y la emite a 520 nm. (Fig. 3.4) (Valesek M y Repa J, 2005).

Ciclos

Ciclos

Fluorescencia

Fluorescencia

PCR en tiempo real


Los polimorfismos biallicos pueden ser detectados por la combinacin deamplificaciones aleloespecficas con la deteccin de SYBR Green I. Las amplificacionesalelo especficas toman ventaja de la inhabilidad relativa de la Taq polimerasa paraextender primers que estn mal apareados con su blanco en el extremo 3. El ensayo esllevado a cabo en dos tubos separados, cada uno de los cuales contiene un par de primersespecficos de una u otra variante de SNP. Aunque estarn siendo amplificados los aleloscon errores de apareamiento, esto ocurre mucho menos eficientemente que para los alelosbien apareados, retardando su amplificacin y obteniendo valores de Ct mucho mayores.La especificidad del ensayo puede ser mejorada con el uso de primers tipo tallo-asa parael PCR alelo-especfico, ya que estos son mejores que los lineales porque discriminanentre secuencias cercanas relacionadas. (Hazbon, et al., 2004)

Figura 3.3. Representacin de la interaccin de SYBR green I con el ADN de doble cadena.

Una ventaja importante en la qumica noespecfica es que el diseo y ajuste de losensayos es directo y los costos de materialesson bajos (sin tener en cuenta el costo delaparato de RT-PCR). Esto hace que seaparticularmente atractivo para el anlisis depolimorfismos de nucletidos simples (SNP),el cual ha llegado a ser el marcador deseleccin para la identificacin de mltiplesgenes asociados con enfermedades complejascomo cncer o diabetes.

Figura 3.4 Fluorescencia del SYBR green I con elADN de doble cadena.

PCR en tiempo real


El uso de anlisis de curvas de disociacin para identificar diferentes amplicones, evita lanecesidad de realizar reacciones de amplificacin separadas. Siguiendo el ensayo de PCR,el producto de ADNdc es fundido en ADN de cadena sencilla (ADNcs) por un ciclo en elque se incrementa la temperatura y colectando los datos de fluorescencia en cada escalnde temperatura. La magnitud de la reduccin en la fluorescencia del SYBR green se debea su relajamiento desde el ADNdc, suministrando una cantidad de ADNdc disociado encada paso, mostrado en cada ciclo de la curva de disociacin. (Fig. 3.5).

Adems, como diferentes amplicones pueden fundir a diferentes temperaturas, el SYBRGreen I puede ser usado para distinguir diferentes alelos por su temperatura de fusin(Tm). Por ejemplo, la enfermedad de Huntington es causada por un nmero expandido derepeticiones CAG en el gen de Hungtington y la curva de disociacin de un sujeto normalmuestra un nico pico de fusin, mientras que los individuos que padecen la enfermedadpresentan dos picos. (Elenitoba-Johnson, et al., 2001).Muchos sistemas de tubos cerrados que han sido desarrollados pueden usarse encombinacin con el anlisis de punto de fusin de productos del PCR para identificartanto variantes homocigotas como heterocigotas, (Wittwer, et al., 2003) y ha sido posibledesarrollar ensayos triples que usan SYBR Green I y curvas de disociacin paraidentificar diferentes genes blanco en el mismo tubo. (Hernndez, et al., 2003).El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debidoque se unen de manera indistinta a los productos generados inespecficamente o a dmerosde primers, muy frecuentes en las reacciones de PCR. Para mejorar la especificidad se

Fig. 3.5 Anlisis de la curva de disociacin deSYBR Green I. A primera vista, se observa lavelocidad en que se pierde el SYBR green I amedida que aumenta la temperatura. El ejemplomuestra un rango de datos entre 72C y 90C. Elpequeo pico en 74,5 C se debe probablementea la formacin de producto dimrico, ya que estees el nico pico que ocurre en la muestra NTC.EL pico principal aparece alrededor de 85,5Caunque hay algunos con una diferencia de perfilfcilmente distinguible y un pico en 86.5C.Estos diferentes perfiles muestran diferentesproductos de PCR. (Bustin, S. 2005)

PCR en tiempo real


deben emplear condiciones de reaccin ptimas y una seleccin cuidadosa de primerspara disminuir el riesgo de formacin de dmeros. (Costa, J., 2004). Adems, esrecomendable iniciar reacciones de sntesis de ADN a temperaturas elevadas (Hot startPCR), lo cual disminuye de forma notable el riesgo de amplificaciones inespecficas.

3.3.2 Primers marcados con fluorforosA pesar de su atractivo, hay varios problemas asociados con el uso de marcadores noespecficos. En particular, hay un ensanchamiento del rango de fusin y la compresin dela Tm entre genotipos, lo cual puede dar resultados ambiguos. Adems, los agentesintercalantes de ADNdc pueden redistribuirse durante la fusin liberando el agente desdelos heterodplex de bajo punto de fusin y redistribuyndose hacia los de alto punto defusin.El uso de primers marcados para el anlisis de fusin evita estos problemas pues tienen laventaja de que no se usan sondas especficas para cada ensayo. El uso de un primer confluorforo marcador y otro primer sin marcar posibilita obtener perfiles de fusin delamplicn inmediatamente despus de que se completa la reaccin de PCR y resultan encurvas de fusin de forma distinta para diferentes alelos, incluyendo aquellos que tienendiferencias en una nica base. (Grundy et al., 2003)Otro mtodo hace uso del principio de transferencia de energa fluorescente medianteresonancia (FRET). En este, se presenta una interaccin dependiente de la distancia entrelos estados excitados de dos marcadores diferentes, en los cuales la excitacin setransfiere de una molcula donadora a una molcula aceptora a distancias alrededor de 70 100 sin la emisin de un fotn. Como resultado, la emisin del fluorforo reportero esreprimida. En general, uno de los primers de amplificacin tiene el reportero y undominio represor unido a una estructura tallo-asa en su extremo 5 .Cuando est ensolucin, la emisin de fluorescencia del reportero es reprimida. Una seal fluorescenteslo se genera cuando los oligonucletidos marcados se incorporan en el producto deamplificacin. (Fig. 3.6).

PCR en tiempo real


La sntesis de primers marcados se ha simplificado mucho recientemente mediante el usodel mismo tipo de estructuras tallo-asa, pero solamente con un fluorforo reportero, elcual se autoreprime con base en la secuencia que sigue. Estos primers, conocidos comoLUX, se reprimen cuando estn libres en solucin, fluorescen dbilmente cuando sedesnaturalizan y emiten una luz fuerte cuando se incorporan al ADN. La fluorescenciadiferencial de los primers marcados permite el uso de PCR para determinacin especficade alelos en un solo tubo. (Fig. 3.7)

Sondabeacon

Gen blanco

Gen blanco

Emisin de fluorescencia

Fig. 3.6 Sondas marcadas con fluorforos. a) Eldiseo original usa un p r i m e r con unaestructura tallo-asa que tiene en su extremo 5un fluorforo y un represor al final de laestructura. b) Durante el primer ciclo de PCRlos primers se extienden y se vuelventemplados durante los siguientes ciclos dePCR. Esto lineariza la estructura tallo-asa,separa el donador y aceptor y resulta enemisin de fluorescencia desde el fluorforo(Mocelln et al., 2003)

Fig 3.7. Primers LUX. Un primer contiene unfluorforo, el otro no se encuentra marcado. Elprimer fluorognico tiene una secuencia corta finalde 46 nucletidos en el extremo 5 que escomplementaria al extremo 3 del primer. Laestructura tallo-asa resultante provee un a represinptima del fluorforo atacado. Cuando se incorporael primer dentro del producto de A D N d c, elfluorforo deja de reprimir y se emite una seal.(Bustin, S. 2005)

PCR en tiempo real


Sondas de hibridizacin especficasSon sondas marcadas con dos tipos de fluorforos, un donador y un aceptor. El procesotambin se basa en la transferencia de energa fluorescente mediante resonancia (FRET)entre las dos molculas. Las ms utilizadas son las sondas de hidrlisis, conocidascomercialmente como Taqman, las sondas conocidas como molecular beacons, losscorpions y las sondas FRET.a) Sondas de hidrlisis: Son oligonucletidos marcados con un fluorforo donador en elextremo 5 que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3 queabsorbe la fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las molculasdonadora y aceptora deben estar espacialmente prximas. Adems, el espectro de emisinde la primera se ha de solapar con el espectro de absorcin de la segunda. En la tabla 3.1se relacionan los fluorforo ms empleados y sus espectros de excitacin y emisin.Mientras la sonda est intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por elaceptor. Sin embargo, durante la amplificacin de ADN templado, la sonda se hibrida consu cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su accin desntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5 exonucleasa,hidroliza el extremo libre 5 de la sonda, producindose la liberacin del fluorforodonador. Como donador y aceptor estn ahora espacialmente alejados, la fluorescenciaemitida por el primero es captada por el detector (Fig. 3.8).Las sondas de hidrlisis ofrecen precisin similar que la que ofrecen los ensayos seguidoscon SYBR Green I (Wilheim et al., 2003a), pero stas adems dan gran seguridad dealcanzar la especificidad. Debido a esto, el uso de sondas de hidrlisis es un mtodorecurrente para la genotipificacin. Dos sondas fluorognicas, marcadas con dosmarcadores espectralmente diferentes, pueden ser utilizadas para discriminar entre alelosnativos y mutantes. Si se detecta la amplificacin de una muestra de ADN desconocidopor la identificacin del fluorforo del alelo nativo y no por la del alelo mutado, lamuestra se considera como homocigoto del tipo nativo y, de forma inversa, si se encuentrafluorescencia del marcador de identificacin del mutante, se clasifica como homocigotode la cepa mutante. Si se presentan marcajes de ambos fluorforos, esta se designa comoheterocigota para los dos alelos.

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TABLA 3.1 Principales molculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real(Costa J, 2004)

Fig. 3.8 Resumen de la qumica asociada a las sondas Taqman

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b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molculadonadora en el extremo 5 y una aceptora en el extremo 3 pero, adems, presentan unaestructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin especficacon el ADN diana.Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que conlleva aque donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin la fluorescenciaemitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre, alejndose donador yaceptor, pudindose detectar la fluorescencia emitida por el primero (Fig. 3.9).

Fig. 3.9 Molecular beacons

El uso de los molecular beacons proporciona un nivel adicional de especificidad, ya quees muy poco probable que falsos amplicones o primers-dmeros posean secuencias blancopara ellos, la generacin de fluorescencia es exclusiva de la sntesis de los ampliconesanalizados. (En: www.molecularbeacons.org)

c) Scorpions: Son molculas bifuncionales que contienen un primer covalentementeunido a una sonda (Fig. 3.10). Las molculas tambin contienen un fluorforo que puedeinteractuar con un represor (quencher) para reducir la fluorescencia. Cuando lasmolculas se usan en una reaccin de PCR, el fluorforo y el represor se separangenerando un incremento en la luz emitida (Fig. 3.11). Las ventajas de los scorpions sebasan en que la sonda est acoplada fsicamente al primer. Esto significa que la reaccinque se lleva a cabo para generar la seal es un cambio unimolecular. En contraste con lascolisiones bimoleculares requeridas por otras tecnologas tales como Taqman omolecular beacons. Las ventajas de un cambio unimolecular son significativas, pues lareaccin es instantnea y ocurre antes que cualquier reaccin inespecfica o colateral

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como los realineamientos de los amplicones o el plegamiento inadecuado del templado.Esto conduce a seales ms fuertes, a un diseo ms confiable de la sonda, a tiempos dereaccin ms cortos y a una mejor discriminacin. Los scorpions son primers con unaestructura tallo-asa que contiene un fluorforo y un represor. La estructura tallo asa estseparada del primer por un bloqueador, el cual es una estructura con modificacionesqumicas que previene que se copie la estructura tallo asa del primer. Durante la reaccinde PCR, los primers scorpions se extienden para formar los productos del PCR. En laetapa de alineamiento del ciclo de PCR, las secuencias de la sonda en la cola del primer securvan para hibridar la secuencia blanco en el producto del PCR (Fig. 3.11). Como la coladel scorpion y el producto del PCR forman parte de la misma hebra de ADN, lainteraccin es intermolecular. La secuencia blanco generalmente se escoge para estar a 3bases del extremo 3 del primer scorpion.

d) Sondas FRET: El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuenciasadyacentes del ADN blanco. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3 y la otraun aceptor en el extremo 5. Cuando las sondas estn hibridadas, los dos fluorforos estnprximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energa al aceptor que, a su vez, emitela fluorescencia que detecta el lector del equipo (Fig. 3.12).

Fig. 3.10. Elementos de un primer Scorpions

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Fig. 3.12 Sondas FRET

Fig. 3.11 Reaccin de un primer Scorpion

Fig. 3.12 Sondas FRET

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En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con unaumento de hibridacin de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma proporcinde fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad de la deteccin ypermite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su costo es ms elevadoque el SYBR Green I y la optimizacin de las condiciones de la reaccin resulta msdifcil.e) Otras sondasHay ms qumicas de sondas disponibles, todas con ventajas y desventajas. Entre ellas secuentan los Hybeacons, los cuales requieren solo un fluorforo y hace uso de laspropiedades de represin del ADN. Esto los hace fciles de disear y sintetizar. (French etal., 2002). Las sondas Light up estn compuestas de naranja de tiazol conjugada apptidos de cidos nucleicos (PNA) y combina las excelentes propiedades de los PNA,que permiten el uso de sondas ms cortas con un extraordinario aumento en lafluorescencia. Las sondas Eclipse son sondas lineales que tienen un marcador del surcomenor (MGB su sigla en ingls), un represor en el extremo 5 y el fluorforo en elextremo 3 (Bustin et al, 2004a).

3.4 Instrumentacin para el PCR en tiempo realUn requerimiento imprescindible para llevar a cabo con efectividad esta tcnica es lautilizacin de una instrumentacin adecuada que permita detectar la seal fluorescente ygrabar el proceso de la reaccin de PCR. Los instrumentos deben emitir y detectarlongitudes de onda especficas simultneamente, por lo que el basamento qumico de estatcnica y la instrumentacin estn estrechamente relacionados.Hasta el momento existen tres formas fundamentales para suministrar la energa deexcitacin para los fluorforos: mediante lmparas, diodos emisores de luz (LED) o lser.Las lmparas son instrumentos de emisin de amplio espectro, mientras que el de losLEDs y lsers es ms restringido. Los equipos que presentan lmparas (generalmente detungsteno halgeno o cuarzo tungsteno halgeno) pueden incluir filtros que limitan la luzemitida a longitudes de onda de excitacin especficas. Entre ellos se encuentran el ABIPrism 7000 de Applied Biosystems, el Mx4000 y Mx3000P de Stratagene, y el iCycler iQde Bio-Rad. El sistema de LED est representado por el LightCycler de Roche, elSmartCycler de Cepheid, el Rotor-Gene de Corbett y el DNA Engine Opticon 2 de MJ

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Research. La nica mquina que utiliza lser para la excitacin hasta el momento es elABI Prism 7900HT (Valasek et al., 2005).Para colectar los datos, la energa de emisin de los fluorforos tambin debe serdetectada en longitudes de onda especficas. Los detectores estn representados porcmaras acopladas a dispositivos de carga, tubos fotomultiplicadores u otro tipo defotodetectores. Generalmente se emplean filtros o canales para detectar pequeos rangosde longitudes de onda. Usualmente se pueden detectar varias longitudes de onda discretassimultneamente, lo que permite correr mltiples ensayos en un solo tubo de reaccin.Otra porcin importante de la instrumentacin consiste en un termociclador efectivo parallevar a cabo las reacciones de PCR. Es muy importante que estos mantengan unatemperatura consistente a lo largo de todos los tubos de ensayo dado que pequeasdesviaciones de la temperatura resultan en errores graves de cuantificacin (Wilhelm etal., 2000; Zuna et al., 2002). Un bloque de calentamiento (Peltier o por resistencia) o elcalentamiento por aire, o una combinacin de ambos, son los ms utilizados. Los bloquescalentadores cambian la temperatura ms lentamente que los calentadores de aire, lo queresulta en ciclos ms largos.La instrumentacin del PCR en tiempo real no estara completa sin un hardware decomputacin y un software de anlisis de datos apropiado. Los softwares simplifican elanlisis de los datos arrojando los resultados en forma de grficos que muestran laamplificacin y disociacin de los productos. Las curvas de amplificacin permiten elanlisis cintico y la cuantificacin del ADN de partida, mientras que las curvas dedisociacin revelan las caractersticas, entre ellas la pureza, del producto final de lareaccin.

El primer termociclador de PCR en tiempo real fueproducido por Appied Biosystems de forma comercial en1997, el ABI 7700 (Fig. 3.13). El sistema de deteccin deeste equipo consiste en un termociclador conectado a unlser y a un sistema ptico CCD (dispositivo de cargaacoplada, el cual genera una respuesta elctricaproporcional a la luz que capt). Este equipo detecta unrango de fluorescencia desde 500 a 660nm. La

fluorescencia se induce emitiendo luz lser simultneamente a todas las muestras a travs

Fig. 3.13 ABI 7700

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de un arreglo mltiple de fibras pticas. Las emisiones de fluorescencia resultantes de lainteraccin con los fluorforos viajan en reversa y son detectadas por la cmara CCD, lascuales son medidas cada 7 segundos y posteriormente se analizan por el software. Esteinstrumento puede utilizarse para anlisis basados en agentes intercalantes, molecularbeacons y sondas de hidrlisis. Las corridas demoran aproximadamente 2 horas.Posteriormente, Roche Diagnostics comenz la distribucin del Light Cycler (Fig. 3.14),el cual utiliza pequeos capilares de vidrio como tubos de reaccin (Wittwer et al., 1989;1997b; ). Estos capilares se colocan en un muestrario en forma de carrusel dentro de unacmara de aire termostatada, cuya rotacin asegura la homogeneidad de la temperatura delsistema. La combinacin de un volumen de muestra pequeo, la forma cilndrica de loscapilares y el ajuste de la temperatura mediante el aire, permite obtener gradientes de

temperatura muy pronunciados que se traducen en tiempos mscortos de reaccin, con el consecuente incremento de laespecificidad. Este sistema utiliza un potente diodo emisor de luzazul para la excitacin en vez de un delicado lser y lafotodeteccin se realiza con tres diodos que tienen tres filtros delongitudes de onda diferentes, lo cual permite combinar distintosfluorforos simultneamente. Una corrida completa de PCR con40 ciclos puede tomar slo de 15 a 20 minutos..

El Rotor-Gene de CorbettResearch (www.corbettlifescience.com, Fig. 3.15)utiliza un diseo de rotor de centrfuga que tienenumerosas ventajas (Fig. 3.16):1-Uniformidad ptica: Cada tubo pasa frente lamisma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa lasparedes laterales, y la fluorescencia emitida retorna almismo sistema de deteccin, en este caso un tubofotomultiplicador. Esto determina que no hayanecesidad de realizar la calibracin ptica del equipo,por lo que no se necesita un fluorforo de normalizacin.

Fig. 3.14. Light Cycler

Fig. 3.15. El Rotor-Gene

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El Rotor-Gene utiliza varios LEDs de diferentes longitudes de onda que estn. acopladosa un filtro de banda estrecha. Este equipo adems tiene un paso ptico pequeo y menoscomplejo que el de los sistemas que utilizan fibra ptica, los cuales tienden a ser lentos,frgiles y caros. De acuerdo a las necesidades del operador, el sistema de deteccin cuentacon filtros band pass (que permiten el paso de rangos discretos de longitudes de onda ypor ende se prefieren para los ensayos de multiplexing) y filtros high pass (a travs delos cuales pasan todas las longitudes de onda por encima de un valor de cortedeterminado, lo que incrementa la sensibilidad de la deteccin).2-Rpida recoleccin de los datos: Todos los tubos pasan por el detector cada 150milisegundos.3- Al igual que en el Light Cycler, la rotacin garantiza la uniformidad de la temperaturadel aire del sistema. Adems no hay diferencia entre los tiempos de equilibracin trmicaentre pozos durante los cambios de temperatura. Los fabricantes garantizan que entremuestra y muestra la variacin de temperatura es menor a 0.01 grados Kelvin. El rotoropera a velocidad normal cuando est calentando (Aproximadamente 500 rpm), y alenfriar incrementa la velocidad, por lo que la fuerza centrifuga que se ejerce sobre cadamuestra asegura que no haya condensacin y las burbujas de aire son eliminadasautomticamente.

Fig. 3.16. Vista Interior del Roto-Gene

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3.5 Anlisis de los datosEl anlisis cuantitativo de los datos se traduce en la evaluacin de las curvas deamplificacin, en las que se representa la fluorescencia detectada versus el nmero deciclos de PCR (Fig. 3.17). La sensibilidad del equipo est determinada por el ciclo al cualla fluorescencia emitida se incrementa por encima del ruido de fondo. El nmero decopias del templado se puede determinar con alta precisin a partir del nmero de ciclosque se suceden para que la seal alcance un determinado nivel de fluorescencia llamadoumbral, el cual debe interceptar la curva en la fase exponencial, y es determinado demanera arbitraria. Este punto debe seleccionarse entre dos ciclos sucesivos, por lo quedebe ser un nmero fraccionario.

Ploteo Rn vs Nmero de ciclo, donde Rn = (Rn+) (Rn-) siendo:Rn+ = Intensidad de emisin del PCR con molde Intensidad de emisin de la referencia pasiva

Rn- = Intensidad de emisin del PCR sin molde (NTC) Intensidad de emisin de referencia pasiva

Fig. 3.17. Curva de amplificacin

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Donde la referencia pasiva debe ser un cido nucleico idntico a la muestra que estamosanalizando pero sin el fragmento de secuencia correspondiente al templado, de esta formatenemos un control negativo perfecto.Las curvas de amplificacin constan de tres partes diferentes:1) La fase inicial donde no se puede medir a acumulacin del producto de PCR pueshay pocos cambios en la seal de fluorescencia, lo que define la lnea basal2) La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida que se forman msproductos3) La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar deque se siguen acumulando productosPara cada muestra, el nmero de ciclos necesarios para interceptar el valor umbral sellama ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct es inversamente proporcional alnmero de copias iniciales del ADN muestra. Por tanto, si graficamos el logaritmo de lacantidad inicial de ADN de estndares de concentracin conocida versus el Ct, elresultado es una lnea recta. En cada corrida de PCR en tiempo real debemos analizarmuestras estndar de concentracin inicial conocida, de esta forma estamos determinandoel rango dinmico de deteccin de nuestro mtodo, requisito indispensable para publicarresultados de calidad. Se pueden analizar diferentes diluciones decimales del mismoestndar, preferentemente en cuadruplicados. Para presumir la reproducibilidad denuestros resultados, debemos tener desviaciones estndar menores a 0.2 unidades de Ct.Por cada unidad de Ct que cambia en el resultado de una amplificacin, se incrementa aldoble la concentracin inicial de muestra calculada.Para lograr una mayor exactitud en la cuantificacin es necesario calcular al eficiencia dela amplificacin.Durante la fase exponencial, la seal S puede ser representada por la ecuacin 1 (Wilhelmy Pingoud, 2003):

S= pNoc (1)

Donde p es un factor de proporcionalidad que relaciona la concentracin del producto dePCR y la seal S, No es la cantidad de templado, es la eficiencia de la amplificacin(12; donde =2 significa una eficiencia del 100%) y c es el nmero de ciclo.

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Si despejamos c tenemos la siguiente ecuacin:

c= -(log)-1(logNo +logp-logS) (2)

donde m=-(log)-1 y b= -(log)-1(logp-logS) y resulta la ecuacin 3:

c= mlogNo + b (3)

Esta ecuacin describe la relacin lineal entre los valores de Ct y el logaritmo de laconcentracin de templado No. Los parmetros m y b pueden determinarse por regresinlineal a partir de valores (S;Ct) de estndares de templado de concentracin conocida.Despejando No obtenemos:

No = 10(Ct-b)/m (4)

La eficiencia puede ser entonces calculada como:

= 10-1/m (5)

Si sustituimos en la ecuacin 4, obtenemos la ecuacin 6:

No = (b-Ct) (6)

El mximo valor de es 2.0 (si se duplica la cantidad de producto en cada ciclo), pero losvalores experimentales de fluctan entre 1.5 y 1.9. Si la eficiencia es baja disminuye lasensibilidad del ensayo pero permite cuantificaciones con mayor precisin (mayorreproducibilidad entre repeticiones).El error en los valores de Ct resultan del ruido de fondo y del mtodo de clculo de Ct. Enensayos altamente optimizados, podemos obtener errores estndares menores de 0.2ciclos, asumiendo una eficiencia de amplificacin del 100%, lo que implica que el errorrelativo mnimo para la cuantificacin est entre el 10 y el 20%.El rango dinmico de esta tcnica es extraordinariamente alto, con ms de seis rdenes demagnitud .Para calcular la concentracin inicial de nuestro templado se grafica el logaritmo decimalde las concentraciones de los estndares versus el Ct. El resultado es una recta cuyapendiente deber ser tericamente igual a 3.32 si tenemos una eficiencia deamplificacin del 100% (Ecuacin 5). En la prctica, un ensayo es aceptable hasta con un92% de eficiencia.

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El clculo del rango dinmico se puede realizar en amplificaciones monoplex (un soloblanco biolgico) o en modelos multiplex (para dos o ms blancos biolgicosamplificados simultneamente).Curvas de desnaturalizacin

Estas curvas representan la relacin que existe entre la fluorescencia y la temperatura(Fig.3.18.a). Se realizan para corroborar la identidad del amplicn luego del ensayo dePCR, puesto que debe tener una temperatura de desnaturalizacin (Tm) especfica. Ladeteccin se puede realizar con intercalantes del ADN como el SYBR Green o con sondasespecficas como los Molecular Beacons. Otras como los Scorpions no pueden utilizarsepues forman parte del producto de PCR, como tampoco se utilizan las sondas TaqMan,dado que su seal depende de la hidrlosis de la sonda. Para la caracterizacin de losproductos de la reaccin de PCR se utilizan ms los agentes intercalantes del ADN,mientras que las sondas especficas se usan para otros estudios como los degenotipificacin. En estas curvas la seal decrece gradualmente como resultado de ladisminucin de la fluorescencia dependiente de la temperatura y posteriormentedisminuye de forma abrupta debido a la separacin de las dos hebras de ADN. Latemperatura de desnaturalizacin o Tm se identifica como el punto ms alto de la derivadanegativa de la curva de desnaturalizacin (Fig. 3.18.b). En esta representacin adems, elrea bajo el pico es proporcional a la cantidad de producto, por lo que las curvas dedesnaturalizacin tambin permiten cuantificar la cantidad de producto que tenemos sicontamos con estndares de concentracin conocida (Wilhelm et al, 2003).3.4.1 Ensayos de cuantificacin absolutaEl objetivo es determinar el nmero exacto de molculas de ADN o ARN presentes enuna muestra. El resultado estar expresado en las mismas unidades que los estndares dela curva de calibracin (nmero de copias, ng/mL,). Este tipo de cuantificaciones seemplean para la deteccin y cuantificacin de cargas virales, agentes patgenos o en laterapia gnica.3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativaEste tipo de cuantificaciones permite determinar cuantas veces (ms o menos) cidonucleico se tiene de un templado o una muestra biolgica determinada con respecto a untejido o muestra de referencia. Los resultados son expresados de manera relativa por loque no se necesita una curva de calibracin con un estndar de concentracin conocida.

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La aplicacin ms utilizada de este mtodo es la comparacin de los niveles de expresingnica (mRNA) entre diferentes tejidos o en el tiempo, o la respuesta de un tejido adiferentes tratamientos.Primeramente debemos realizar una normalizacin de la cantidad relativa de cada muestrarespecto a un gen normalizador, preferentemente de expresin constitutiva en la clula(control endgeno). Estos genes mantienen un nivel de expresin constante an endiferentes estados fisiolgicos de la clula y no deben afectarse en respuesta a lostratamientos que estamos evaluando, en caso de que as sea. Para que este mtodo seaexitoso el rango dinmico de la muestra y del control endgeno debe ser similar. Unmtodo sensible para evaluar si esta regla se cumple es calcular el Ct para diferentesdiluciones de la muestra y del gen normalizador.Ct = Ct (muestra)-Ct (normalizador), donde Ct (muestra) y Ct (normalizador) es el cicloal cual la muestra y el normalizador respectivamente alcanzan el nivel umbral defluorescencia en el ensayo de PCR en tiempo real. El clculo de Ct se realiza paradiferentes diluciones del templado y de la referencia, y se grafica la dilucin analizada vsel resultado del Ct para cada una. Esta evaluacin tiene como propsito determinar laeficiencia de amplificacin entre diferentes concentraciones de ARNm tanto para lamuestra como para el control endgeno, y demostrar que para una misma muestra, laproporcin obtenida entre el mARN templado y la referencia sea siempre la misma. Si la

Fig.3.18. Resultado de una curva de desnaturalizacin de un producto de PCR y un controlnegativo. El producto de PCR tiene una Tm aparente de 87.5C, mientras que el control negativocontiene dmeros de primers con una Tm aparente de 83C. a)Curva de disociacin. B)Representacin del pico de desnaturalizacin

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eficiencia de amplificacin de la muestra y de la referencia son similares, el resultado deesta grfica debe ser una lnea recta de pendiente prcticamente 0 menor de 0.1, como semuestra en la Fig. 3.19.

Aqu como vemos el valor de la pendiente de la grfica es de 0,0471. Es de esperar que elvalor de Ct sea mayor en la muestra que en el normalizador, teniendo en cuenta que elnivel de expresin del mensajero sea mayor en el normalizador, por lo que Ct debe serun valor positivo, aunque puede ser negativo tambin.Luego procedemos al clculo del Ct (Livak y Schmittgen, 2001):Ct =Ct (muestra)- Ct (calibrador),donde la muestra puede ser el nivel de expresin mRNA en rin, pulmn, etc de un genX y el calibrador puede ser el nivel de expresin de ese mismo gen en cerebro (tejido dereferencia).Entonces el Ct se calcula para diferentes tejidos as como la expresin relativa demRNA, que est dada por la ecuacin:Expresin relativa = 2 -Ct

Si el tejido de referencia a comparar es el de menor expresin de mensajero, su valor deCt ser el mayor y el nivel de expresin de las muestras siempre aumentar respecto a lareferencia, pero de igual forma puede disminuir.

Fig. 3.19. Ejemplo de una curva de calibracin.

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Para ejemplificar este modelo, mostramos la evaluacin de la expresin del gen c-myc encuatro tejidos diferentes: hgado, rin, pulmn y cerebro. Se emplea como controlendgeno o normalizador, la expresin de la enzima gliceraldehdo 3-fosfatodeshidrogenasa (GAPDH) en estos tejidos. La normalizacin de los tejidos se lleva a cabocalculando:Ct pulmn = Ct (c-myc)pulmn- Ct (GAPDH)pulmnCt hgado = Ct (c-myc) hgado Ct (GAPDH) hgadoy as sucesivamente con los otros dos tejidos.Luego calculamos Ct y la expresin relativa de c-myc en pulmn, hgado y rintomando como referencia el valor de Ct en cerebro:Ct pulmn = Ct pulmn - Ct cerebroCt hgado = Ct hgado - Ct cerebroCt rin = Ct rin - Ct cerebro y graficamos la expresin relativa de c- myc tomando como referencia los niveles encerebro como se muestra a continuacin:

Otros ensayos de cuantificacin relativa se han realizado utilizando como controlesendgenos la expresin de -actina, 2-microglobulina y ARN ribosomal. La seleccin delcalibrador depende del tipo de relacin que queremos calcular. El diseo ms simple esutilizar el control no tratado como calibrador, en el caso en que estudiemos expresindiferencial entre muestras tratadas y no tratadas. En este caso, el Ct del calibrador es 0y su expresin relativa 20 es igual a 1, por definicin. Un resultado similar se obtiene

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cuando analizamos el aumento de la expresin de un gen a travs del tiempo y elcalibrador representa la cantidad de mensajero a tiempo cero.

3.6 Estrategias de normalizacinEl principio de cuantificacin mediante la tcnica de PCR en tiempo real parece muysimple: mientras ms copias de templado tenemos, menor nmero de ciclos de PCR sernnecesarios para alcanzar el nivel umbral. Pero en la prctica, la relacin entre el nmerode copias del templado y el Ct no es tan sencilla. En primera instancia, lograrcuantificaciones reproducibles a partir de templados que se encuentran poco abundantes(

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sin embargo generar resultados cualitativos, pero debemos ser muy cuidadosos siqueremos realizar un anlisis cuantitativo. Afortunadamente, con la tcnica de captura pormicrodiseccin utilizando lser se puede cuantificar la cantidad de ARN mensajeroproveniente de un corte de tejido como nmero de copias del templado por rea dediseccin (Fink et al., 1998).

3.6.1 Cuantificacin de ARN mensajeroEl PCR en tiempo real es muy utilizado para la cuantificacin de los niveles de ARNmensajero, pero existen muchos problemas que pueden afectar la calidad de losresultados, entre los que se encuentra la variabilidad inherente al ARN, la variabilidad delos protocolos de extraccin y diferencias en la eficacia de la reverso transcripcin, entreotros. Es por esto que se hace imprescindible utilizar un mtodo de normalizacin de losresultados que nos permita una cuantificacin lo ms cercana posible a la realidad(Huggett et al., 2005).

A) Tamao de la muestraLa primera forma de minimizar el error experimental es partiendo de masas o volmenesde tejido similares a partir del cual aislaremos nuestro cido nucleico templado.Desgraciadamente grupos de muestras del mismo tamao no siempre son representativosentre s. Cuando trabajamos con cultivos celulares en monocapa, muchas veces sedificulta la estimacin de la densidad celular, no slo por la prdida debido a lamortalidad sino por cambios morfolgicos y fisiolgicos que pueden ocurrir en lasclulas. Se hace evidente entonces que asegurar muestras de igual tamao, densidad opeso, minimiza los errores pero no es suficiente.

B) Cuantificacin de ARNUna cuantificacin precisa y de calidad del ARN que queremos reverso transcribir esesencial para lograr muestras de partida homogneas. Existen muchos mtodos paracuantificar ARN, y entre los ms precisos est el uso del reactivo ribogreen, el cual seintercala de manera precisa en los cidos nucleicos de doble cadena y es mucho mssensible que el bromuro de etidio. De esta forma, si tenemos una preparacinrelativamente pura de ARN celular y medimos la cantidad de ARN ribosomal (el cual

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consta de muchas estructuras secundarias) por unin al ribogreen, podemos inferir que elresto de nuestro ARN, sea mensajero o de transferencia, tambin conserva una buenaintegridad. Se utiliza el ARN ribosomal como referencia pues representaaproximadamente del 85 % al 95% de todo el ARN celular, mientras que el ARNmensajero se encuentra entre el 2 y el 5%, por tanto se asume que la relacinARNr:ARNm no cambia entre grupos de anlisis, lo cual no siempre es vlido. Losniveles de ARNr varan menos en condiciones que afectan a los de ARNm (Schmittgen yZakrajsek, 2000), por lo que su utilizacin como normalizadores se ha vuelto msconfiable que muchos genes de referencia. Un reporte reciente donde se comparan losniveles de expresin de ARN entre clulas nucleadas de la sangre en resposo o activadas,revel que el ARNr 18S es el blanco de referencia ms estable.En este tipo de anlisis podemos realizar una electroforesis, donde debemos observar dosbandas bien definidas que corresponden al ARNr 28S y 18S, siendo la de 28S mucho msintensa debido a que, en condiciones normales, este ARNr se encuentra al doble de laconcentracin del ARNr 18S (Fig.3.20.a). Tambin podemos utilizar un bioanalizador(Agilent Bioanalyser) donde, de manera similar a una cromatografa, separamos los ARNry se visualiza el cromatograma por tincin con ribogreen. Los tiempos de retencin de losARNr 28S y 18S ya son conocidos (Fig.3.20.b). No obstante, la normalizacin de unamuestra respecto al ARN total tiene la desventaja de no controlar las variacionesinherentes a la reverso transcripcin o a las reacciones de PCR.

C) ADN genmicoLa cuantificacin de ADN genmico para la normalizacin pudiera parecer una buenaestrategia, por cuanto no se necesita hacer un paso previo de reverso-transcripcin, pero larealidad es que existen inconvenientes. Por ejemplo, cuando las clulas estn proliferando,tenemos mucho ms ADN, lo que puede representar el doble de la informacin genticapara clulas eucariotas. En el caso de las bacterias o las clulas tumorales, podemos tener8 copias o ms de la informacin gentica de un cierto loci comparado con clulas que nose replican. De esta forma aunque partamos de una cantidad de clulas similar, existemucha variabilidad en la cantidad de ADN genmico extrado. Otro problema es lacarencia de protocolos altamente estandarizados para una purificacin de ADN genmicode calidad.

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D) Genes de referenciaSe utilizan en los ensayos de cuantificacin relativa que describimos previamente. Una delas ventajas de esta tcnica es que tanto el gen a cuantificar como el normalizador, sondetectados utilizando el RT-PCR en tiempo real. Existen numerosas publicaciones quesubrayan el hecho de que no existe ni un solo gen de referencia universal, pues todos seregulan de alguna forma y ninguno se expresa constitutivamente en todos los tiposcelulares y bajo cualquier condicin experimental. Muchos de los genes de referenciaclsicos ampliamente utilizados como normalizadores en los RT-PCR en tiempo realson genes regulados, hecho que se conoce desde mucho antes de que surgiera la tcnica dePCR en tiempo real. Tal es el caso del ARNr 18S, el cual se sobreexpresa frente a unainfeccin con citomegalovirus, o del gen que codifica para la GAPDH, el cual setranscribe de manera similar en diferentes tejidos de rata, pero esto no correlaciona con lascantidades de ARN mensajero encontradas en dichos tejidos. A pesar de estas evidencias,estos genes de referencia se siguen utilizando como normalizadores sin un proceso previode validacin. Reportes recientes han demostrado que muchos de estos genes no puedenutilizarse como normalizadores. Una de las peores situaciones que se pueden presentar esque el gen de referencia se vea afectado por las condiciones que queremos evaluar.La validacin de los genes de referencia est sujeta tambin a los problemas de lanormalizacin. El grado de variabilidad aceptable para un gen de referencia depende de la

ARNr 28S

ARNr 18S

b

Fig. 3.20. Ejemplo de una cuantificacin de ARNr de buena calidad mediante (a) Gel deagarosa y (b) Agilent Bioanalyser.

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resolucin requerida. An cuando el gen de referencia seleccionado sea variable, esto nointeresa siempre que la diferencia entre grupos sea mayor que la variacin del gen dereferencia. Si un ARN de referencia tiene un error de 1 log puede no ser ideal, pero essuficiente para medir cambios en los templados de 2 log o ms.Existen muchos programas sustentados en la plataforma de Excel que permiten el anlisisde muchos genes de referencia. El programa Gnorm permite la eleccin del gen dereferencia apropiado mediante el clculo de la media geomtrica de la expresin delADNc candidato. En este programa se toma como factor de normalizacin la mediageomtrica entre pares de genes internos de referencia que muestran un perfil deexpresin similar, partiendo del principio de que pares de genes que presenten patrones deexpresin estables entre s, son genes de control adecuados. (Vandesompele et al., 2002).E s t e s o f t w a r e s e e n c u e n t r a d i s p o n i b l e e n e l s i t i o(http://www.genomebiology.com/2002/3/7/research/0034/). No obstante, este modelorequiere de una extensa validacin prctica para identificar la combinacin adecuada degenes de referencia para cada experimento en particular, siendo los mejores candidatospara esto los genes coexpresados. El programa BestKeeper tambin selecciona el gen dereferencia menos variable a partir de las medias geomtricas y se encuentra disponible enel sitio http://www.gene-quantification.de/BestKeeper-1.zip.Un tercer programa llamado Norm-Finder, no slo mide la variacin del normalizadorsino que establece una gradacin entre los genes de referencia potenciales en trminos decunto difieren entre los diferentes grupos de estudio, entendindose esto como diferentescondiciones experimentales.Muchos autores han sugerido utilizar diversos genes de referencia en vez de confiar en unsolo transcripto. Este es un mtodo robusto de normalizacin altamente favorable cuandodeben realizarse cuantificaciones muy precisas. Esta tcnica no obstante est limitada porproblemas de disponibilidad de la muestra o el costo de las mismas.

E) Molculas artificialesEstas molculas de ARN artificiales pueden ser obtenidas a partir de otro organismo enel cual sus genes hayan sido clonados o pueden generarse de forma sinttica. Dado queconocemos su cantidad exacta, pueden ser adicionadas a la muestra en las etapas deextraccin de ARNm y as estarn sujetas a todos los errores experimentales que afectan

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al ARN de inters. Adems no se vern afectadas por las fluctuaciones propias de lossistemas biolgicos que muchas veces afectan a los genes de referencia. Sin embargo, lageneracin de estas molculas alien no es asequible a muchos laboratorios, sobre todolos que realizan pocos ensayos de RT-PCR en tiempo real. La adquisicin comercial deeste tipo de estndares para la normalizacin permanece todava como una idea tericaque no ha sido validada.En trminos generales, una adecuada normalizacin es crtica para obtener resultadosbiolgicos relevantes. Dado que no existe una sola estrategia que sea aplicable a todas lascondiciones experimentales, la clave para una buena normalizacin en los ensayos dePCR en tiempo real es la demostracin de que el gen utilizado como referencia ha sidocorrectamente validado (Bustin et al., 2005).

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CAPITULO 4

APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL

La emergente tecnologa del PCR en tiempo real ha demostrado su versatilidad y utilidaden diversos campos de la investigacin biomdica y el diagnstico biomolecular, siendo lalimitante la imaginacin de investigadores y fabricantes de nuevos equipos, productos yservicios asociados a estas ramas del conocimiento.Entre los campos de accin que ms recurren a esta tecnologa se cuentan la virologa, lamicrobiologa clnica y la investigacin biomdica, aunque existen otras como lasindustrias alimenticias y farmacuticas que han hecho o harn uso de esta tecnologa.En el presente captulo se revisarn algunas de las aplicaciones actuales y las perspectivasfuturas de la tecnologa del RT PCR.

4.1 VirologaEl PCR en tiempo real ha sido extremadamente til para el estudio de agentes viralesasociados a enfermedades infecciosas y ha ayudado a clarificar en alguna medida losprocesos infectivos de dichas enfermedades. La mayor parte de los ensayos que seencuentran en la literatura muestran un aumento en la frecuencia de deteccin de viruscomparndolos con las tcnicas tradicionales, lo cual ha hecho ms atractivo el uso del RTPCR en muchas reas de la virologa.El RT PCR se ha hecho valioso en estudios generales de virologa, desde la simpleconfirmacin de la presencia o ausencia de virus de diferentes enfermedades, o delmonitoreo de la actividad de genes especficos como resultado del crecimiento bajocondiciones manipuladas. Tambin se puede seguir la entrada alterada o replicacin de unvirus causada por la modificacin tejido-especfica y permite comparar entre replicacinviral y expresin de genes celulares. (Mackay et al., 2002).EL RT PCR ha mejorado la velocidad y el alcance de la medicin de cepas virales y lasdiferencias entre ttulos de pacientes que muestran diferentes sndromes debidos a

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variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). Tambin, los estudios epidemiolgicoshan avanzado ya que con la tcnica de RT PCR se puede medir con precisin la cantidadde dos cidos nucleicos blanco en una sola reaccin. El uso de nuevas estrategiasqumicas ha permitido una mejor discriminacin de mltiples genotipos virales en un solorecipiente y ha provisto una alternativa a los mtodos de deteccin de virus basados enensayos de morbilidad y mortalidad.El uso del RT PCR ha suministrado datos ms profundos sobre el papel de algunoscompuestos que tienen inhibicin en la reaccin de PCR como tambin ha dado luz sobrela eficiencia de diferentes mtodos de extraccin de cidos nucleicos de un diverso tipo demuestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena unrequerimiento importantsimo para un sistema ideal de deteccin, que es capaz de aplicaruna tecnologa sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la deteccin decidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodosurbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, clulas sanguneas mononucleares,plasma, suero, saliva y orina.Tambin, condiciones crticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelialy desrdenes linfoproliferativos pueden ser fcilmente estudiados para investigarrelaciones directas o indirectas con infecciones virales. Tambin, el seguimiento de lacarga viral por tcnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento depacientes a quienes se les han trasplantado rganos.Esta tecnologa se est convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento devectores de terapia gnica viral antes de su uso en pruebas clnicas. Adicionalmente, elestudio de virus emergentes ha sido complementado con la tcnica de RT PCR comoherramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales nicas, sealesclnicas y sntomas de cada paciente.La velocidad y flexibilidad del RT PCR tambin ha sido de utilidad para los interesescomerciales y ha sido usada para la deteccin de contaminacin microbiana enpreparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresin eucariticos.

4.2 Microbiologa clnica (Costa, J. 2004)Las aplicaciones del RT PCR en el campo de la microbiologa clnica no difieren muchode las que utilizan comnmente las reacciones de PCR convencional. Entre ellas se

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cuentan el diagnstico etiolgico, el control del tratamiento con antimicrobianos y lacaracterizacin gentica de agentes infecciosos. No obstante, es previsible que gracias asus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la RT PCR haya ido reemplazando ala PCR convencional y que su aplicacin se extienda a un nmero cada vez mayor deagentes infecciosos, implementndose progresivamente en la rutina asistencial. Algunasempresas de diagnstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya unaapuesta decidida por la nueva tecnologa y tienen disponibles, o los tendrn en breve, kitspara el diagnstico de los agentes infecciosos de mayor inters comercial mediantesistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin embargo, haymuchas enfermedades infecciosas, con menor inters comercial, en las que el uso demtodos moleculares de diagnstico aporta indudables ventajas. La PCR a tiempo real,combinada con los nuevos sistemas automticos para la preparacin de las muestras,ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebasmoleculares para la identificacin o cuantificacin de esos agentes infecciosos. Es el casode muchos virus, (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC,virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropherymawippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente comoMycobacterium tuberculosis. Tambin, de micosis invasivas, especialmente porAspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por Toxoplasmagondii en lquido amnitico o en lquido cefalorraqudeo (LCR).Otro campo potencial de aplicacin del RT PCR es en la identificacin de organismosfcilmente cultivables, cuya deteccin rpida sea beneficiosa por algn motivo. Porejemplo, la identificacin de Streptococcus del grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales.La colonizacin del tracto genital de mujeres parturientas por este agente se relaciona conun mayor riesgo de infeccin neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento deesta bacteria mediante cultivo es de 1-2 das, mientras que por PCR a tiempo real suidentificacin se puede llevar a cabo en 30 min. La reduccin del tiempo de diagnsticopuede mejorar la prevencin de esas infecciones en recin nacidos. En otros casos, comola sepsis, la supervivencia del enfermo puede depender de un diagnstico precoz delagente causal que permita establecer el tratamiento antibitico especfico en etapastempranas del proceso. Probablemente en pocos aos se habrn optimizado protocolos de

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PCR mltiple a tiempo real para la identificacin de los 10 o 20 agentes ms frecuentes dela sepsis en unas pocas horas.Lgicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo, porque la sepsispuede estar ocasionada por una variedad de microorganismos mucho ms amplia, pero lademora en el tratamiento se podr reducir en un nmero considerable de casos, lo que sinduda puede mejorar el pronstico de este grave proceso.El xito de un tratamiento no slo se basa en un diagnstico etiolgico precoz, sino que enmuchas ocasiones la determinacin rpida de la sensibilidad del agente causal a losfrmacos antimicrobianos puede ser determinante. La PCR a tiempo real proporcionamtodos giles y sencillos para la identificacin de mutaciones puntuales asociadas conresistencias a frmacos antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas una hora se puededeterminar la presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina, facilitando elcontrol de la transmisin de este patgeno en los centros sanitarios. En los ltimos aos sehan desarrollado mtodos sencillos para la deteccin rpida de mutaciones asociadas conresistencias a meticilina en Staphylococcus aureus y a rifampicina y a isoniacida enMycobacterium tuberculosis. Tambin se han descrito procedimientos para laidentificacin de mutaciones asociadas con resistencia a agentes antivricos, como lalamivudina en VHB. Hoy da ya estn disponibles kits comerciales para algunasaplicaciones comentadas en este apartado y en el futuro irn apareciendo muchos otros.Incluso para las enfermedades infecciosas menos frecuentes estn, o estarn disponibles,protocolos bien optimizados, sencillos y rpidos para que puedan ser implementados en larutina asistencial.No obstante, hay que hacer hincapi en que esta potente metodologa slo ser til si loslaboratorios de microbiologa clnica participan en programas de control de calidad biendefinidos por entes gubernamentales.

4.3 Investigacin biomdicaGran parte de los desarrollos alcanzados en la tecnologa de RT PCR tuvieron sus iniciosen investigaciones puntuales que llegaron a trminos comerciales. Este estudio primariode diferentes fenmenos asociados a las disciplinas de biomedicina, bioqumica ybiotecnologa es necesario tanto en empresas de diagnstico como en empresas cuyosdepartamentos de Investigacin y Desarrollo son cruciales para sus futuros desarrollos.

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El RT PCR ha llegado a ser absolutamente comn en la investigacin bsica dentro de lasciencias biomdicas. Cuando se requieren datos de expresin gentica para un proyectode investigacin, est tecnologa puede ser utilizada. Sin embargo, hay usos adicionalesque son particularmente tiles a la investigacin bsica. El RT PCR se puede utilizar paragenotipificar modelos de tipo knockout, knockin o de ratones transgnicos o paradeterminar la eficacia de los mtodos en sistemas de clulas animales o en cultivoscelulares. Con el uso del RT PCR para la discriminacin de alelos, la deteccin depolimorfismos en un solo nucletido (SNP), que pueden predisponer a individuos aenfermedades particulares, puede determinarse en poblaciones, facilitando as los estudiosepidemiolgicos.

4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNADebido a la confiabilidad del PCR en tiempo real, muchos investigadores utilizan elmtodo de cuantificacin relativa o absoluta de la expresin de genes para validar ycorroborar los resultados de los microarreglos de DNA o arreglos de oligonucleotidos(Por ej: Affymetrix GeneChip). Los microarreglos son usados porque permiten que uninvestigador observe de una manera imparcial cmo la manipulacin experimentalpuede afectar algunos de los miles de genes presentes en el microarreglo. Algunosmicroarreglos pretenden contener el genoma entero de un organismo modelo y puedenser as tericamente probados para determinar cambios en la expresin dentro deltranscriptoma entero. El problema es que puede haber artificios, y es difcil conseguirdatos cuantitativos confiables o con poder estadstico adecuado con la actual tecnologa dearreglos. As muchos investigadores escogen el RT PCR como tcnica de soporte paravalidar y para cuantificar mejor los genes de inters de sus microarreglos.

4.3.2 Identificacin de mutacionesEl RT PCR se ha usado idealmente para el anlisis de mutaciones, incluyendo lospolimorfismos de un slo nucleotido (SNP), substituyendo a menudo otras tcnicas talescomo la secuenciacin, anlisis del polimorfismo conformacional de una sola hebra, yanlisis de polimorfismos de fragmentos de restriccin. Para detectar mutaciones en lasecuencia, el anlisis de la curva de fusin se hace automticamente en el producto

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amplificado (amplicon) inmediatamente despus del termociclado y de la medicin de lafluorescencia.Aunque cualquiera de las qumicas fluorescentes descritas en el numeral 3.3 de estedocumento se puede utilizar para la deteccin de mutaciones, las sondas de hibridacinson de uso frecuente. Despus de que se completa la reaccin de PCR, las sondas dehibridacin se unen al amplicn en tndem, permitiendo que la energa fluorescente setransfiera del donante al aceptor, el cual emite una seal. Como la temperatura de reaccindel recipiente aumenta durante el anlisis de la curva de fusin, la sonda donadora sedisociar, dando como resultado una disminucin en la fluorescencia. Si hay algunamutacin en el amplicn (en la regin de hibridacin), la sonda donadora se unir menosfuertemente y disociar a una temperatura ms baja. As las mutaciones pueden serdetectadas fcilmente observando un cambio en el punto de fusin del producto de PCR.Este tipo de anlisis puede tambin ser utilizado para genotipificar organismosindividuales o experimentales (Por ej: discriminacin allica).

4.4 Organismos genticamente modificados (GMO) (Bustin, 2005)La aprobacin mundial de una gran cantidad de organismos genticamente modificados(GMOs), y los requisitos de etiquetado asociados, han dado lugar al desarrollo de mtodosbasados en RT PCR para la deteccin de la presencia de GMOs en alimentos o en aditivospara los mismos. La deteccin de organismos genticamente modificados por RT PCR sebasa en la amplificacin paralela del transgen y de un gen endgeno de referencia queproporciona un control tanto para la prdida de inhibicin como para la capacidad deamplificar el DNA blanco en la muestra. Adems, para los anlisis cuantitativos, laamplificacin del gen de referencia proporciona una estimacin de la cantidad total deDNA blanco presente en la muestra. Ubicar el DNA blanco es particularmente apropiado,debido a la alta estabilidad de esta molcula bajo las condiciones extremas usadas duranteel procesamiento de algunos productos alimenticios.

4.5 Aplicaciones futuras y perspectivas (Valasek et al., 2005)Cualquier necesidad de medir rpida y exactamente pequeas de cantidades de cidosnucleicos representa un nicho potencial a futuro para las innovaciones basadas en RTPCR. Ya que las mquinas se vuelven ms rpidas, baratas, pequeas, y ms fciles de

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usar, el desarrollo de ensayos estandarizados, y los avances en microfluidos, la ptica, ylos termocicladores, se podrn cubrir ms campos de aplicacin. En el sector alimenticio yla agricultura, la tcnica de RT PCR puede probablemente ampliar el uso para deteccin eidentificacin de microorganismos, parsitos u organismos genticamente modificados.Las ciencias forenses se pueden beneficiar de la sensibilidad, especificidad, y velocidadde las tcnicas de RT PCR, especialmente porque el tiempo es crucial para muchasinvestigaciones criminales y el tamao de la muestra puede ser limitado. La reduccin enel costo y la disminucin en los tamaos de los equipos abren una puerta para eldiagnostico de enfermedades en reas alejadas junto con los estudios epidemiolgicos insitu y pueden facilitar la transferencia de tecnologas cientficas a los pases en vas dedesarrollo. Ya que la demanda para medir la expresin gentica es poco probable quedisminuya, nuevas generaciones de mquinas para RT PCR deben ser desarrolladas.Como las computadoras, las primeras generaciones de mquinas debern serrelativamente ms baratas y por lo tanto se incrementar el acceso global y el aumento dela tecnologa. La enseanza del RT PCR podr ser usada como una plataforma paraintroducir conceptos claves en biologa molecular, as como tambin una oportunidad paradar a los estudiantes habilidades cientficas relevantes. El RT PCR generar un foco deatencin hacia el transcriptoma, permitiendo a los investigadores entender mejor losprogramas transcripcionales que son la base de la fisiologa, la patofisiologa, ydesarrollo.La evolucin de la ciencia y de la tecnologa de la biologa molecular puede ser vistacronolgicamente por pocas que estn marcadas por la maduracin del estudio debiomolculas particulares. Bsicamente, el anlisis del DNA (genmica) fue primerorealizado en el proyecto del genoma humano. Ahora, el anlisis de los perfiles deexpresin del RNA (transcriptmica) est alcanzando madurez. El futuro inminentepromete grandes saltos en anlisis de las protenas (protemica), y en lpidos biolgicos ointermediarios metablicos (lipmica o metabolmica, respectivamente). Se espera quelos pedazos del rompecabezas biomolecular puedan ser juntados, conduciendo a unacomprensin ms holstica de la biologa. Para formar una figura coherente, sin embargo,sern necesarios avances paralelos en la adquisicin, la compilacin, y el anlisis dedatos.

Trampas del RT-PCR en tiempo real


CAPITULO 5

TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL

La cuantificacin de ADN genera datos robustos que son informativos y reproducibles,

esto se debe a que la informacin contenida dentro del genoma es independiente del

contexto. De forma general, cada clula normal dentro de un organismo contiene la misma

secuencia de ADN, las mismas mutaciones y los mismos polimorfismos. El transcriptoma,

por otra parte, depende altamente del contexto celular y temporal, por lo que la

informacin que nos brinda es muy variable. Si esto lo combinamos con las limitaciones

tcnicas inherentes a cualquier ensayo de RT-PCR en tiempo real, puede ser difcil

obtener resultados que puedan ser interpretados de una manera correcta. La calidad del

templado, la variacin entre operadores y la subjetividad en el anlisis de los datos son

slo algunos de los aspectos tcnicos que convierten al RT-PCR en tiempo real en una

tcnica frgil que puede hacer difcil la correcta interpretacin de los datos. Un ejemplo de

ello es la cuantificacin de ARNm que proviene de biopsias como las derivadas de

colonoscopas, clulas aisladas o muestras obtenidas mediante la microdiseccin por lser,

donde la cantidad de templado es muy baja. Desgraciadamente bajo estas circunstancias la

cuantificacin de ARNm por RT-PCR en tiempo real puede ser utilizada de manera

inapropiada para llegar a conclusiones nada comprometidas con la realidad. Por todo esto

existen dudas de que en el futuro, los anlisis basados en el transcriptoma se vuelvan

tcnicas de rutina (Bustin y Nolan, 2004b).

5.1. Calidad del ARNAnteriormente hemos destacado que la calidad del ARN templado es el factor ms

importante para obtener resultados de relevancia biolgica. Muchas muestras, en especial

las biopsias de tejido humano, son nicas, y por ende deben ser tratadas con extremo

cuidado, desde su coleccin, transporte y almacenamiento. Debe existir alta rigurosidad



en los protocolos de extraccin de ARN, el cual es extremadamente delicado. Un

templado adecuado para una reaccin de RT-PCR en tiempo real debe cumplir con los

siguientes criterios:

1-Debe estar libre de ADN, especialmente si el templado es un gen sin intrones

2-No deben copurificar inhibidores de la reversotranscripcin

3- La preparacin debe estar libre de nucleasas para un almacenamiento adecuado

Existen muchos componentes dentro de la sangre y los tejidos que inhiben los ensayos de

RT-PCR. La sangre de los mamferos en cantidades tan pequeas como al 1% v/v inhibe a

la Taq polimerasa (Panaccio y Lew, 1991). El cido hmico, polmero componente de las

muestras extradas de suelo, inhibe las reacciones de PCR (Zhou et al., 1996), as como el

calcio proveniente de los alimentos (Rossen et al., 1992). Las drogas terminadoras de

cadena como el Aciclovir son tambin inhibidores de la Taq polimerasa, lo que lleva a

obtener resultados que son falsos negativos en determinados pacientes (Yedidag et al.,

1996). Algunos componentes de los medios de cultivo y de los agentes de extraccin de

cidos nucleicos, e incluso los palillos de madera utilizados para picar colonias

bacterianas, son algunos de los inhibidores ms comunes de las reacciones de PCR (Lee et

al., 1995). Otros inhibidores son altamente especficos, como los provenientes del

msculo esqueltico, los cuales frenan a la Taq polimerasa pero no a la polimerasa aislada

de Thermus thermophilus (Belec et al., 1998).

5.2. Deteccin no especficaEn estos mtodos se utilizan agentes intercalantes del ADN de doble cadena como el

SYBR Green (Ishiguro et al., 1995), el cual se adiciona a la mezcla de reaccin y, aunque

no es especfico, es muy utilizado para cuantificar ADN si el PCR se combina con curvas

de disociacin que permitan evaluar la calidad del producto de reaccin (Ririe et al.,

1997). Los ensayos que utilizan intercalantes del ADN que fluorescen tienen dos ventajas

respecto a los que se basan en sondas especficas:

1- Pueden incorporarse a protocolos optimizados que utilizan los mismos primers y

las mismas condiciones experimentales.

2- Son mucho ms baratos.

Estas caractersticas convierten a los agentes intercalantes del ADN en herramientas tilespara los primeros pasos en la optimizacin de las tcnicas de PCR en tiempo real, por



ejemplo, para determinar si existe alguna interaccin entre los primers mediante elanlisis de curvas de disociacin o para explorar de forma preliminar la tcnica dedeteccin de mltiples amplicones antes de utilizar un ensayo basado en sondasfluorescentes especficas.Entre las desventajas de la deteccin no especfica se encuentra la unin indiscriminada

hacia cualquier estructura de doble cadena, lo que produce fluorescencia en el control sin

templado debido a su unin a los dmeros de primers. Un segundo problema es que las

curvas de disociacin para analizar la calidad del producto obtenido son absolutamente

necesarias, lo cual incrementa la complejidad de los anlisis. Un tercer problema es que

muchas de estas molculas son capaces de unirse a una sola molcula de amplicn, por lo

que la intensidad de la seal fluorescente luego de la radiacin depender del tamao del

ADN de doble cadena. Si asumimos similares eficiencias de amplificacin, el PCR en

tiempo real de un templado ms largo generar una mayor seal fluorescente.

5.3. Deteccin especficaEl anlisis especfico de los templados requiere el diseo y la sntesis de una o varias

sondas fluorescentes. Algunas sondas pueden ser utilizadas adems para realizar curvas de

disociacin, lo cual provee otro nivel de control para el producto de la reaccin. La mayor

ventaja de estas sondas es que aseguran un segundo paso de especificidad, la cual ya no

slo radica en los primers utilizados. Los artefactos de la amplificacin que pueden

ocurrir debido a un mal funcionamiento de los primers o a la formacin de dmeros entre

ellos no genera seal fluorescente, lo cual obvia la necesidad de realizar un Southern Blot,

curvas de disociacin o la secuenciacin del producto luego del ensayo de PCR para

confirmar la identidad del amplicn. Las sondas adems pueden ser marcadas con

diferentes fluorforos, lo cual permite la deteccin simultnea de varios productos de

amplificacin en una misma reaccin de PCR (multiplexing). Dentro de las desventajas

del uso de sondas especficas se encuentra paradjicamente la no deteccin de los

artefactos que ocurren, los cuales siempre disminuyen la eficiencia del ensayo. Debido a

esto se hace necesario utilizar los fluorforos intercalantes del ADN de doble cadena para

optimizar el tipo de primers a utilizar y las condiciones de la reaccin, y de esta forma,

asegurarnos de que no ocurran apareamientos anmalos. El uso de las sondas especficas

es adems costoso, cada templado requiere de su sonda particular, incrementando mucho

el costo en los ensayos de multiplexing.



5.4 Linearidad del paso de reversotranscripcinLa primera etapa de las reacciones de RT-PCR puede llevarse a cabo utilizando tres tiposde primers ADNc diferentes: al azar, oligo-dT o primers especficos por el templado, loscuales difieren significativamente entre s respecto a la cantidad de ADNc que se obtiene.Es necesario puntualizar adems que la temperatura de desnaturalizacin de los primers alazar y de los oligo-dT est muy por debajo de la temperatura ptima de funcionamiento delas reversotranscriptasas termoestables, por lo que al ser utilizados deben preincubarsepreviamente con el ARN a bajas temperaturas o deben ser modificados qumicamente. Lacompaa Ambion demostr que la reversotranscripcin a partir de muestras biolgicaspuede ocurrir an sin la adicin exgena de primers, dado que en los tejidos existenprimers internos. Esto por supuesto conlleva a una alteracin de los resultados en el pasode PCR posterior. El uso de primers al azar produce varios ADNc a partir de un templadode ARN, por lo que este mtodo es, por definicin, no especfico. Sin embargo rinde lamayor cantidad de ADNc, lo cual es decisivo en la identificacin de transcriptos que seencuentran en bajas cantidades. Se ha demostrado que los hexmeros al azar puedensobreestimar la cantidad de templado hasta en 19 veces respecto a los primers secuencia-especficos (Zhang and Byrne, 1999), adems de que la mayora del ADNc sintetizadoproviene del ARN ribosomal. La sntesis de ADNc utilizando oligo-dT es ms especficapara el ARNm y es capaz de amplificar ARNm con estructuras secundarias significativas.Debido a que el uso de los oligo-dT requiere de ARN de alta calidad, no se utilizan en loscasos en que el ARN se fragmenta, como el obtenido por microdiseccin con lser.Los primers especficos por el templado de ARN constituyen la opcin ms sensible de

cuantificacin (Lekanne et al., 2002). La relacin lineal Ct vs cantidad de templado en una

reaccin de RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucletidos especficos es ms

amplia que para los ensayos donde se utilizan primers al azar, lo cual se ilustra muy bien

en la figura 5.1.



El poder analtico del RT-PCR tambin depende de la eficiencia de conversin de ARN a

ADNc, lo cual recae sobre la enzima utilizada. Por otro lado, debe considerarse otro factor

importante conocido como el efecto Monte Carlo, una limitacin inherente a toda

tcnica de PCR donde se quiera amplificar un templado que se encuentran en pequeas

cantidades formando parte de una mezcla compleja (Karrer et al., 1995). La eficiencia de

la amplificacin entre templados individuales dentro de una poblacin de ADNc depende

de su concentracin: cada uno tiene una cierta probabilidad de ser amplificado o ignorado

una vez que sobrepasa cierto rango de dilucin. Una explicacin a este fenmeno puede

ser el considerar que la hibridacin de los primers con cada molcula de templado en cada

ciclo de PCR es un evento azaroso. Bajo condiciones de exceso de primers, la

probabilidad de hibridacin depende de la temperatura de hibridacin, el tiempo y el

nmero de templados disponibles. Si la cantidad de templado es limitante y se encuentra

dentro de una mezcla compleja, disminuir la eficiencia de su amplificacin debido a que

Fig. 5.1.



la probabilidad de hibridacin con el primer ser menor. Si estas diferencias ocurren

durante la fase exponencial de la amplificacin, el reporte de la concentracin final de ese

templado en particular ser completamente errnea.

5.5 Anlisis de los datosEl parmetro Ct se ha convertido en el ms utilizado para realizar cuantificaciones

utilizando la tcnica de RT-PCR en tiempo real. Anteriormente explicamos que el ciclo

umbral (Ct) se define como el ciclo donde la fluorescencia excede un valor umbral

escogido por encima del ruido de fondo. Aqu la palabra crtica es escogido, dado que

el ruido de fondo no es un valor absoluto y tambin se ve influenciado por las condiciones

de la reaccin. Muchas veces, los valores de Ct no son indicativos de una amplificacin

genuina, y en otros casos, una verdadera amplificacin no provee un valor de Ct

significativo. Este ltimo caso se da cuando el nmero de ciclos que determinan el ruido

de fondo se escogen de forma incorrecta, a partir de los cuales se establece la lnea

umbral de fluorescencia. Normalmente, estos ciclos son los primeros antes de que el

producto de PCR se acumule de forma significativa al inicio de la

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