Reakce mikroorganismů na změny

v prostředí

• Co je adaptace?

• →odpověď na stres

• Co je stres?

• Změna teploty (teplo nebo chlad)

• Výživa (nedostatek nebo toxicita)

• Světlo (množství/ kvalita

• Tlak (obvykle vodní)

• O2 (přítomnost/nepřítomnost)

Typy extremofilů

• Acidofilní pod pH 3

• Alkalifiní nad pH 9

• Endolitní v pórech hornin

• Halofilní min. 0,2M NaCl

• Hypertermofilní 80-122 oC

• Piezofilní – odolávají zvýšenému

hydrostatickému tlaku

Typy extremofilů

• Polyextremofilní – více kategorií najednou

• Psychrofilní –kryofilní rostou až do -15 oC

• Radiorezistentní

• Termofilní 60-80 oC

• Xerofilní – odolávají suchu

• Termoacidofilní 70-80 oC a pH 2-3

Klasifikace je založena na 16/18S rRNA sekvencích

• Hypertermofily náleží buď do řádu Bacteria nebo Archea.

• Jsou adaptované k aciditě, kyslíku, nizké salinitě, vysoké

salinitě, nízkému redox potenciálu, podle naleziště.

• Extrémní acidofilové- aerobní, fakultativně anaerobní a

anaerobní kokovité. Rostou mezi pH 1 až 5, s optimem

3. Sulfolobus, Metallosphaera, Acidianus, Stygiolobus

• Mírní acidofilové a neutrofilové – většinou podmořské,

nízká salinita. Většina jsou striktní anaerobové:Thermo-

proteus, Pyrobaculum,

Energetika extremofilních bakterií

Hypertermofilní bakterie nejsou schopné

růstu při teplotě pod 60 C, nejvíce adaptované

Pyrolobus fumarii, neroste pod 90 C.

Typickým prostředí jsou podvodní vulkány,

mořské nebo pozemní.

Sirné prameny – dvě vrstvy: horní silně

kyselá, kyslík je přítomen, rovněž Fe. Je

oranžově zabarvená. Rody: Sulfolobus,

Acidianus. Spodní vrstva – černomodrá – Fe.

Rody: Thermoproteales, Methanothermus.

Podmořské systémy: mělčiny a

hlubokomořské. Vysoká koncentrace soli, pH

závisí na typu vulkanické činnosti.

Izolace – aerobní i anaerobní vzorky horkých sedimentů,

bahna, hornin, půdy a vod.

• Většina horkých biotopů je anaerobních vzhledem k

přítomnosti sulfanu.

• Během vzorkování je nutné chránit vzorky před

kyslíkem.

• Šokové chlazení nebo okamžitá redukce kyslíku je nutná

pro zabránění inaktivace buněk.

• Kultura Pyrobaculum islandicum 108 CFU/ml odumřela

po 40 min vzdušnění.

• Nárůst 1 den až 1 týden po inokulaci

• Vzhledem k teplotě, agarové půdy nejsou vhodné,

polysilikáty, nebo vyředění pro zisk čisté kultury.

Optická mikroskopie

Složení prostředí pro hypertermofily

• Typ

• pozemní mořský

• Lokality: solfatarová pole, parou podmořské horké

• prohřívaná půda, bahna prameny a fumaroly

• hlubinné horké prameny „black smokers“

• geothermální elektrárny hlubinné zdroje

• ropy, oplachované

• mořskou vodou

• Teploty: povrchové do 100, až do 400 C „bs“

• hlubinné nad 100

• Salinita: obvykle nízká 0,1 -0,5% okolo 3%

• pH: 0,5 – 9 5 - 8,5 , vzácně 3

• Plyny a CO2, CO, CH4,H2 CO2, CO, CH4,H2, H2S,S0.

• Sirné látky H2S S0 S2O3 2-, SO4

Proteiny hypertermofilů

• enzymy hypertermofilů a mesofilů jsou si

podobné na 40 až 85%

• jejich 3rozměrné struktury jsou

srovnatelné

• mají tytéž katalytické mechanismy

Methanothermus fervidus

klonování a exprese genů z hypertermofilů v

mesofilech

• více než 100 genů z hypertermofilů bylo

exprimováno v mesofilech

• transkripční systém Archaei je více podobný

eukaryotnímu, pro expresi v E.coli jsou nutné

silné promotory

• většina hypertermofilních enzymů se správně

skládá při 60oC a zachovává si termostabilitu

• ornitinkarbamoyl transferasa z P.furiosus

exprese v S.cerevisiae stabilnější než v E.coli

Pyrodictium abyssi

volná energie stabilizace ΔGstab

• ΔGstab= ΔHstab - TΔSstab

• volná energie stabilizace proteinu je rozdíl mezi

volnými energiemi složeného a rozvinutého

proteinu

• ΔHstab stabilizační enthalpie

• ΔSstab stabilizační entropie

termodynamické studie hypertermofilních enzymů

• odehrávají se mimo teplotní rozsah většiny

kalorimetrů

• provádějí se v přítomnosti guanidin hydro-

chloridu nebo v pH mimo fysiologický rozsah

• teplota denaturací se tak stává fyzikálně

měřitelná

• rozdíl v ΔGstab je obvykle 5 - 20 kcal/mol

• někdy jen 3 -6,5 kcal/mol

mechanismy inaktivace proteinů

• „unfolding“ proteinů lze měřit diferenciální

skenovací kalorimetrií, cirkulárním

dichroismem,viskositou

• mezofilní enzymy - irreversibilní rozpad

• hypertermofilní proteiny rovněž nevratná

denaturace,ale jsou k tomu nutné vyšší množství

energie -100kcal/mol

• chemické modifikace probíhají jen na

denaturovaném proteinu

složení aminokyselin a vnitřní vlastnosti

• první statické porovnání mezi meso- a thermo-

ukázalo trend k výměně Gly za Ala, a Lys za

Arg. Dnes je jasné, že to není jen primární

sekvence,

• poněkud více hydrofobních a aromatických AK

• nejvíce vlivu má distribuce zbytků a jejich

interakce v proteinu

• Arg je lépe adaptován k vysokým teplotám než

Lys

• cystein - nižší obsah (citlivost k oxidaci)

disulfidové můstky

• disulfidové můstky, stabilizují protein?

• vzhledem k citlivosti cysteinu a disulfidových

můstků k vysoké T, 100oC - horní limit pro

stabilitu proteinu

• serinová proteasa Aquifex pyrophilus obsahuje 8

cysteinů, jsou však chráněné před destrukcí

• t1/2 při 105oC - 6 h, pH 9,0

• t1/2 při pH 8 -1 h „unfolded“ struktura

Typy acidofilních mikroorganismů

Alkalofilní mikroorganismy

Aquifex pyrophilus – dělící se buňka s bičíky. Pokoveno

Pt, transmisní elektronmikrografie. Úsečka - 1μm

Typy halofilních organismů

hydrofobní interakce

• hydrofobní interakce - stabilizační mechanismus

hypertermofilních enzymů

• zvýšení stability o 1.3(+/- 0,5)kcal/mol vyvolá

každá přidaná methylová skupina

aromatické interakce

• aromatické páry jsou definovány vzdáleností

menší než 7.0 Ǻ mezi středy fenylových kruhů

• α-amylasa z P.furiosus o 5% více aromatických

residuí než homolog z B.licheniformis

• Thermitasa - Thernoactinomyces vulgaris 16

aro. mesofilní homolog B.amyloliquefaciens

pouze 6

Posttranslační modifikace

• glykosylace - zvyšuje termostabilitu

• posttranslační methylace lysinu

• (A-ε-monomethyllysin) nalezen u Sulfolobus

• stabilizace solemi - nejlépe působí K+ a NH4+

• stabilizace substrátem - T.maritima dihydrofolát reduktasa je kineticky stabilizovaná substráty, NADPH 6tinásobné zvýšení t1/2 při 80oC

Thermoproteus tenax - 1

• hyperthermofilní Crenarcheum Thermoproteus tenax roste chemolithoautotrofně na H2, CO2, a So

• nebo chemoorganoheterotrofně v přítomnosti So a různých organických substrátů

• pro metabolismus glukosy užívá variantu Embden-Meyerhof-Parnasovy dráhy, právě tak jako dráhu Entner-Doudoroff

• varianty EMP - hexokinasa bez regulačních vlastností

- fosfofruktokinasa závislá na Ppi

- dvě glyceraldehyd 3-fosfát dehydro-

genasy (GAPDH)

Thermoproteus tenax- 2

2 glyceraldehyd 3 – fosfát dehydrogenasa (GADPH)

-Klasická fosforylační GADPH

-Allosterická nefosforylační GADPH

-Pyruvát kinasa PH bez allosterického

potenciálu

-Kontrolní bod EMP pro T.tenax je na úrovni

rovnováhy mezi glyceraldehyd 3 – fosfát /

3- fosfoglycerát

Thermoproteus tenax-3

Enzymy T.tenax podobně jako ostatní archeální

pyruvát kinasy se liší od bakteriálního typu

omezenou regulovatelností.

Přeměna pyruvátu na PEP - PEP karboxykinasa

Fosfoenolpyruvát syntasa PEPS

Pyruvát + ATP + H2O ↔ PEP + AMP + Pi

Nalezena u P.furiosus cca 2.25MDa

Thermoproteus tenax - 3

• přeměna fosfoenolpyruvátu a pyruvátu - významný

klíčový bod EMP dráhy u všech bakterií a eukaryot

• situace u Archae méně jasná

• koexistence fosfoenolpyruvát syntetasy (PEPS) a

pyruvát fosfát dikinasy (PPDK), které se kromě pyruvát

kinasy (PK) účastní této reakce u hyperthermofilní

crenarcheoty T.tenax

• geny pocházející z T.tenax naklonovány v E.coli

• enzymové a regulační vlastnosti rekombinantního

produktu se testovaly

Thermoproteus tenax - 4

• PEPS katalyzuje jednosměrnou přeměnu pyruvátu na fosfoenolpyruvát

• PPDK (pyruvát fosfát dikinasa) má dvousměrnou aktivitu s preferencí pro katabolickou reakci

• na rozdíl od pyruvát kinasy T.tenax, která je regulovaná na úrovni transkripce, ale vykazuje jen omezený regulační potenciál na úrovni proteinu, aktivity PEPS a PPDK jsou modulovány ATP a intermediáty metabolismu cukrů

• exprese PEPS je regulovaná na úrovni transkripce jako odpověď na nabízený zdroj uhlíku (Northern blot analysa)

Pyrrococcus horikoshii

• Hyperthermofilní β-1,4 endoglukanasa (EGPh) z hyperthermofilního archaeonu Pyrococcus horikoshii vykazuje silnou hydrolytickou aktivitu ke krystalické celulose.

• Charakteristické rysy EGPh jsou: (1) zdá se, že má disulfidické vazby, které jsou vzácné u proteinů anaerobních hypertermofilních archeonů, a

• (2) postrádají vazebnou doménu pro cukr, která je nezbytná pro účinnou hydrolyzu celulosy.

Pyrrococcus horikoshii 2

• Nejprve studovali vztah mezi disulfidickými vazbami

a katalytickou aktivitou pomocí různých mutant pro

cystein. Aktivita mutovaných enzymů ke

karboxymethyl celulose (CMC) se zvyšovala bez

ztráty thermostability.

• Dále byly připraveny fuse tak, že thermostabilní

doména k chitinu pro chitinasu z P. furiosus byla

připojena C-konci EGPh a jeho variant. Tyto fuse

enzymů vykázaly vyšší aktivity než divoký typ

EGPh jak ke CMC a krystalické celulose (Avicel).

Získávání energie u hyperthermofilních

chemolithoautotrofů

• 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O Methanothermus

• H2 + S0 → H2S Pyrodictium

• 2 H2 + H2SO4 → H2S + 4H2O Archaeoglobus

• H2 + HNO3 → HNO2 + H2O Pyrobaculum

• H2 + ½ O2 → H2O Pyrobaculum

• 2 S0 + 3 O2 + 2H2O → 2 H2SO4 Aquifex

• 2 FeS2 + 7 O2 + 2H2O → 2 FeSO4+ 2 H2SO4 • Acidianus

Typy fermentací - reakce poskytující energii u

heterotrofních hyperthermofilů

• Pyruvát → L(+)-laktát + acetát + H2 + CO2

• Thermotoga, Thermosipho

• peptidy → isovalerát, isobutyrát, butanol, CO2 , H2

• Pyrodictium, Hyperthermus, Thermococcus

• Pyruvát → acetát + H2 + CO2

• Pyrococcus

Reakce poskytující energii u heterotrofních

hyperthermofilů

• respirace S0 2 [H] + S0 H2S Thermofilum

•

Desulfurococcus

SO42- (S2O3

2-,SO32-) +2H+ H2S + 4 H2O

• Sulfolobus, Metallosphaera

• O2 2 [H] + 1/2O2 H2O

Populace žijící v permafrostu

Psychrofilní mikroorganismy a proteinové

inženýrství

• Adaptace na extrémní teploty?

• Specifické strukturní vlastnosti

• Chladově aktivní β-galaktosidasa (BgaS) izolovaná z

Arthrobacter sp.

• Vykazuje 50% aktivity při 0oC

• Podobně jako u E.coli- tetramer, monomery neaktivní

• BgaS je termolabilní nad 25oC a po 10 min při 37oC

zcela ztrácí aktivitu

• Využitím znalostí β-galaktosidasy z E.coli – specifické

mutace

• BgaS7 2,5x vyšší aktivita při 15oC, hydrolyzoval 80%

laktosy v mléce za polovinu času než BgaS při 2,5oC