Razlike-u-djelovanju-prirodnih-i-umjetnih-hormona-na ...

Istraživački rad za natjecanje iz biologije

ožujak, 2014.

3. razred

Hana Ahmetović Luka Mijalković

Mentor: Ines Alujević

III. gimnazija Split

Razlike u djelovanju

prirodnih i umjetnih

hormona na

zakorjenjivanje luka

SADRŽAJ

1. UVOD .................................................................................................................................. 1

2. OBRAZLOŽENJE TEME .................................................................................................. 3

3. MATERIJAL I METODE RADA...................................................................................... 5

3.1. Priprema otopina za klijanje …………………………………………...……..5

3.2. Analiza uljnog destilata vrbinih grančica………………………………….....5

3.3. Prebrojavanje korjenčića………………………………………………….......6

3.4. Mjerenje duljine korjenčića i duljine nadzemnog dijela izdanka…………..6

3.5. Fiksiranje preparata korjenčića………………………………………………6

3.6. Mikroskopiranje…………………………………………………………...…...6

3.7. Obrada rezultata………………………………………………………………..7

4. REZULTATI ....................................................................................................................... 8

4.1. Morfološke razlike ………………………………...…………………………..8

4.2. Broj korjenčića………………………………………………………….……..9

4.3. Duljina korjenčića……………………………………………………………..9

4.4. Duljina nadzemnog izdanka………………………………...……………….10

4.5. Mitotski indeks………………………………………………………………..11

4.6. Trajanje i zastupljenost faza diobe stanica………………..………………..12

5. RASPRAVA ..................................................................................................................... 14

6. ZAKLJUČCI ..................................................................................................................... 17

7. SAŽETAK ........................................................................................................................ 18

ZAHVALA .......................................................................................................................... 18

8. POPIS LITERATURE .................................................................................................... 19

9. PRILOZI .......................................................................................................................... 20

1

1. UVOD

Svako živo biće je tijekom svog života podložno raznim promjena. Rast živog

organizma su kvantitativne promjene koje se očituju u povećanju broja stanica,

povećanju mase i volumena tijela, procesom rasta dolazi do niza promjena koje

pridonose sve većoj složenosti organizma. U biljni su razvitak uključeni procesi rasta i

diferencijacije. Rast i diferencijacija se obično zbivaju istovremeno i ovise o različitim

uvjetima. Rast biljaka je ograničen na specijalizirane zone tj. meristeme, zbog toga

većina biljaka ima mogućnost neograničenog rasta. Meristemi su tvorna tkiva koja se

sastoje od stanica koje imaju sposobnost mitotske diobe. Mitoza se satoji od dva

uzastopna procesa, diobe jezgre i diobe citoplazme (citokineza). Dioba jezgre se dijeli na

četiri faze: profazu, metafazu, anafazu i telofazu (Bačić, 2003.). Primarna meristemska

tkiva se nalaze na vegetacijskom vršku korijena i vegetacijskom vršku pupoljka.

Sekundarni meristemi nastaju od stanica nekog trajnog tkiva. Kalusno tkivo je

sekundarni meristem koji nastaje na mjestu ozljede biljnog organa. Vegetativno

razmnožavanje je razmnožavanje uz pomoć vegetativnih dijelova biljaka (korijen,

stabljika, list). Na ovaj način proizvedene sadnice prenose u potpunosti svoje osobine na

potomstvo. Jedan od načina vegetativnog razmnožavanja je razmnožavanje

lukovicama. Lukovice su preobražena podzemna stabljika. Uz matičnu lukovicu,

tijekom godine formira se veći broj manjih lukovica koje se mogu lako odijeliti,

presaditi na drugo mjesto i obnoviti cijelu biljku. Lukovice imaju biljke iz porodice

ljiljana – Liliaceae u koju spada i luk (Allium cepa L.).

Luk (Allium cepa L.) je pogodan organizam za utvrđivanje genotoksičnosti

različitih tvari, tzv. Allium cepa test omogućuje praćenje promjena u mitozi i učestalost

kromosomskih aberacija.

Vrba (Salix alba) je drvenasta biljka s jednospolnim, dvodomnim cvjetovima koji

su skupljeni u „rese“ te se iz daljine raspoznaju po žutim prašnicima. Mnoge vrste vrba

su najvažnije drveće i grmlje vlažnih šuma i obalnih šikara jer podnose visoki nivo vode

(Dubravec, 1991.). Vrba je poznata kao izrazito ljekovita biljka, vrlo je ljekovita vrbina

kora, a u narodnoj medicini se koriste i listovi. U vrbi se nalazi salicilna kiselina

(C6H4(OH)COOH), organska kiselina koja ima ulogu u rastu i razvoju biljaka

(Kalođera, 2009.) (Slika 1. i Slika 2.). Ljudi su odavna spoznali da ako stave grančicu

vrbe u zemlju ili u vodu, vrba će se zakorijeniti nevjerojatnom brzinom. To svojstvo

2

vrba duguje bogatstvom biljnih hormona u svojoj kori i izdancima. Prvenstveno, vrba

sadrži puno auksina.

Slika 1. Molekula salicilne kiseline Slika 2. Vrba (Salix alba) Martinez A., (2013.)

Auksini su biljni hormoni čiji je glavni učinak stimulacija produžnoga rasta stanica

stabljike i koleoptila. Auksini djeluju tako da omogućuju rastezanje stanične stijenke.

Također, stimuliraju sintezu tvari potrebnih za rast stanične stijenke. Stanice korijena

osjetljivije su na auksin nego stanice stabljike: koncentracija auksina koja je preniska da bi

stimulirala rast stanica izdanka, može stimulirati rast stanica korijena, ali će zato

koncentracija auksina koja je dovoljno visoka da stimulira rast stanica zdanka inhibirati rast

stanica korijena. Osim djelovanja na produžni rast stanica, auksini imaju i brojne druge

učinke: djeluju na sekundarni rast potičući diobu stanica vaskularnoga kambija, potiču

stvaranje adventivnoga korijenja na reznoj plohi stabljike (taj učinak uspješno se

primjenjuje za zakorjenjivanje reznica), stimuliraju rast plodova u mnogih vrsta te

inhibiraju stanične diobe u bočnim pupovima. Najčešći prirodni auksin u biljkama je

indol-3-octena kiselina (IAA). IAA se većinom sintetizira u vršnim meristemima i

mladim listovima u razvoju odakle se prenosi u ostale dijelove biljke. Danas postoje

brojni sintetizirani spojevi koji pokazuju auksinsku djelatnost poput indol-3-butanske

kiseline (IBA) koja često služi za zakorjenjivanje reznica (Škvorc i sur., 2008.). IBA je

glavni sastojak prašaka za zakorjenjivanje Rhizopon I i Rhizopon III (Slika 3. i Slika

4.).

Slika 3. Molekula salicilne kiseline Slika 4. Rhizopon III i Rhizopon I

3

2. OBRAZLOŽENJE TEME

Moderna poljoprivreda nezamisliva je bez upotrebe sredstava koja stimuliraju

procese zakorjenjivanja i rasta kultiviranih biljaka. Najčešće se u tu svrhu koriste

umjetni hormoni, posebice indol-3-butanska kiselina (IBA).

Rezultati našeg prošlogodišnjeg istraživanja (Utjecaj meda i vrbine vode na

zakorjenjivanje luka Allium cepa L.) pokazali su pozitivno djelovanje vrbine vode na

zakorjenjivanje luka i otvorili prostor za nova istraživanja s obzirom na razlike

dobivene kod uzoraka koji su klijali u različitim otopinama na svjetlu i u tami.

Vrba sadrži brojne sastojke među kojima je indol-3-octena kiselina (IAA) -

najrasprostranjeniji i najvažniji prirodni auksin. Najveće koncentracije IAA

ustanovljene su u vrhovima stabljika i korijena (meristemi). IAA ovisno o koncentraciji

potiče produžni rast izdanaka ili njihovih dijelova, a rastenje korijena uglavnom inhibira

(Dubravec i Regula, 1995.).

Auksini su djelotvorni u niskim koncentracijama (10-6

-10-8

M). Stimuliraju rast

adventivnog korijenja na reznoj plohi stabljike. Učinci auksina ovise o brojnim

čimbenicima, koncentraciji, vrsti auksina (prirodni ili umjetni), uključenosti drugih

biljnih hormona i sl. (Pevalek-Kozlina, 2003.).

IAA je jako osjetljiva prema svjetlu, pa se koncentracija npr. od 10 ppm na direktnom

svjetlu razgradi za 15 minuta. Za razliku od toga IBA je stabilnija na svjetlo (Dubravec i

sur, 1995.).

Vrba sadrži salicilnu kiselinu koja biljci signalizira aktivaciju sistemski razvijene

otpornosti. Svaka biljka može proizvesti salicilnu kiselinu koja aktivira unutarnju

obranu od patogena i infekcije u drugim dijelovima biljke. Nadalje, smatra se da je

salicilna kiselina odgovorna i za induciranje abscizinske kiseline, koja je svojevrsni

stres-hormon koji ubrzava reakciju biljke na zatvaranje povreda i reakciju na sušu.

Cilj ovog rada je utvrditi sastav i zastupljenost organskih spojeva u grančicama

vrbe, usporediti utjecaj prirodnih biljnih hormona iz uljnog i vodenog destilata vrbinih

grančica i umjetnih hormona na zakorjenjivanje luka u ovisnosti o koncentraciji otopine

i izloženosti svjetlu, prebrojavanjem i mjerenjem duljine korjenčića, utvrđivanjem

mitotske aktivnosti stanica korijena luka i utvrđivanjem eventualnih pogrešaka u mitozi

(genotoksičnost). Kako bi se odredio sastav i zastupljenost organskih spojeva u

grančicama vrbe bit će napravljena analiza otopina dobivenih vodenom destilacijom

4

vrbinih grančica pomoću masene spektrometrije u suradnji s Prirodoslovno -

matematičkim Fakultetom u Splitu.

Naša pretpostavka je da će lukovice bolje klijati u uljnom destilatu vrbinih

grančica i vodenom destilatu u tami pri nižim koncentracijama, te da će u istoj

genotoksičnost biti manja. Zbog velike fotoosjetljivosti IAA ne očekujemo veliku

klijavost lukovica koje će klijati u ulju vrbinih grančica te vodenom destilatu na svjetlu.

Veća genotoksičnost očekuje se kod lukovica koje će klijati u otopini umjetnih hormona

pri višim koncentracijama.

Bolju klijavost očekujemo kod lukovica koje će klijati u uljnom destilatu vrbinih

grančica zbog antiseptičkih svojstava biljnih ulja čime se sprječava razvoj

mikroorganizama, a time pospješuje rast biljke.

Ovisno o uspješnosti ovog istraživanja moguće je unaprijediti ekološku

proizvodnju te uvesti jeftinija, alternativna rješenja koja bi povećala uspješnost

zakorjenjivanja poljoprivrednih kultura.

5

3. MATERIJAL I METODE RADA

Lukovice jednake starosti kojima su skalpelom odstranjeni stari korjenčići

uronjene su u pet različitih otopina: vodovodna voda (kontrolna otopina), uljni destilat

vrbinih grančica, vodeni destilat vrbinih grančica, otopine praška za zakorjenjivanje

Rhizopon I i Rhizopon III. Jedan dio lukovica klijao je u tami u svim navedenim

otopinama, a drugi na svjetlu u svim navedenim otopinama. Lukovice su klijale 5 dana

pri jednakim uvjetima.

3.1. Priprema otopina za klijanje

Iz biljnog materijala je izolirano ulje vodenom destilacijom (destilacija je trajala tri sata)

u aparaturi po Clevenger-u.

Aparatura se sastoji od: - tikvice od 1000 mL,

- graduirane cijevi,

- hladila i

- kalote.

Koristilo se oko 100g vrbinih grančica u 500 mL vode (Slika 1.). U tikvicu je dodano i

2 mL pentana (C5H12, M = 72,15g/mol) u unutarnji dio graduirane cijevi zbog

mogućnosti gubitaka otopljenih, hlapljivih spojeva. Nakon završetka destilacije, otopina

ulja u pentanu je odijeljena od vode.

Tijekom istraživanja korišten je prašak za zakorjenjivanje Rhizopon III koji sadrži 2%

indol-3-butanske kiseline (IBA) i Rhizopon I koji sadrži 0,5% indol-3-butanske kiseline

(IBA). Lukovice su na mjestu odstranjenih starih korijenčića su posute prahom (prateći

uputstva na ambalaži) i stavljene u vodu.

3.2. Analiza uljnog destilata vrbinih grančica

U suradnji s Prirodolovno-matematičkim Fakultetom u Splitu napravljena je

GC/MS analiza, rađena je na sistemu Varian Saturn 2100.

Identifikacija je provedena usporedbom masenih spektara nepoznatih tvari s masenim

spektrima iz komercijalne biblioteke masenih spektara.

Za analizirani uzorak dobili smo:

- udio pojedine komponente izražen u postocima, tj. udio površine pika u ukupnoj

površini,

- naziv spoja/spojeva čiji spektar je najsličniji spektru nepoznate komponente,

sličnosti spektara koji su uspoređivani izraženi su u postotcima.

6

3.3. Prebrojavanje korjenčića

Nakon što su lukovice proklijale, svakoj lukovici je izbrojen točan broj korjenčića

te je napravljena tablica s prosječnim brojem korjenčića lukovica na svjetlu i u tami,

prosječan broj korjenčića lukovica u vodovodnoj vodi, u vodenom i uljnom destilatu

vrbinih grančica te otopinama hormona kako bi se primijetile razlike u brzini rasta i

mitozi.

3.4. Mjerenje duljine korjenčića i duljine nadzemnog dijela izdanka

Na lukovicama je izmjerena duljina svih korjenčića i izračunata prosječna

vrijednost duljine korjenčića za svaku lukovicu. Također je izmjeren nadzemni dio

izdanka i izračunata prosječna vrijednost duljine izdanka za lukovice iz različitih

otopina.

3.5. Fiksiranje preparata korjenčića

Potrebne kemikalije:

− 6M klorovodična kiselina

− destilirana voda

− aceto-karmin

− 45% octena kiselina

Skalpelom se odstrani nekoliko svježih korjenčića koji se pincetom prebace u staklenu

posudu s destiliranom vodom i tamo ostave 1 minutu. Nakon toga slijedi premiještanje

korjenčića u staklenu posudu sa 6M klorovodičnom kiselinom gdje će biti još 10

minuta. Korjenčići se ponovo premještaju u destiliranu vodu u svrhu ispiranja na 1

minutu nakon čega se stavljaju u staklenu posudu s aceto-karminom gdje se bojaju

slijedećih 20 minuta.

3.6. Mikroskopiranje

Pripremljeni preparati se mikroskopiraju i fotografiraju kako bi se lakše moglo obraditi i

prebrojati cca. 200 stanica po uzorku.

7

3.7. Obrada rezultata

Izračunat će se srednja vrijednost duljine korjenčića za lukovice iz različitih otopina na

svjetlu i tami, kao i srednja vrijednost duljina nadzemnog dijela izdanaka za lukovice iz

različitih otopina prema izrazu: M ∑

M - srednja vrijednost

X - duljina korjenčića (izdanaka)

n - broj lukovica (izdanaka)

Izračunat će se srednja vrijednost broja korjenčića za lukovice iz različitih otopina na

svjetlu i tami prema izrazu: M ∑

M - srednja vrijednost

X - broj korjenčića

n - broj lukovica iz iste otopine

Za navedena mjerenja izračunat će se i standardna devijacija koja ukazuje na

raspršenost vrijednosti oko srednje vrijednosti prema izrazu:

√∑( )

Rezultat istraživanja prezentirat će se prema izrazu M .

Promatrajući mikroskopske preparate meristemskog tkiva korijena luka u svakom se

uzorku stanicama odrede faze mitoze. Mitotički indeks (MI) govori koliki je udio

stanica promatranog luka u mitozi u odnosu na ukupan broj stanica promatranog uzorka.

Moguće ga je izračunati prema izrazu:

Udio stanica za svaku fazu moguće je izračunati prema izrazu:

Iz tog podatka moguće je izračunati trajanje svake faze s obzirom da trajanje staničnog

ciklusa kod luka iznosi 16 sati.

8

4. REZULTATI

Lukovice su klijale u navedenim otopinama 5 dana nakon čega su dobiveni

rezultati pogodne za obradu. Uočene su očite morfološke razlike korjenčića kod

lukovica koje su klijale u različitim otopinama.

4.1. Morfološke razlike

Uočene su razlike u boji, debljini i črvstoći.

Korjenčići lukovica koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica su bili bijeli,

deblji i mekši u odnosu na kontrolnu otopinu te bijeli. (Slika 3.). Korjenčići lukovica

koje su klijale u vodenom destilatu vrbinih grančica su bili poput korjenčića iz kontolne

otopine tanki i sivkastobijeli. (Slika 4.) Korjenčići lukovica koje su klijale u otopinama

hormona Rhizopon I i Rhizopon III su bili deblji od onih iz uljnog destilata vrbinih

grančica te iznimno krhki i lomljivi. (Slika 5.)

Slika 3. Korjenčići iz uljnog destilata Slika 4. Korjenčići iz vodenog destilata

vrbinih grančica vrbinih grančica

Slika 5. Korjenčići iz hormona Rhizopon I.

9

4.2. Broj korjenčića

Broj korjenčića svake od lukovica i prosječan broj korjenčića triju lukovica koje su

klijale u istim uvjetima/otopinama prikazan je u Tablici 2. i Slici 6.

Tablica 1. Podaci o broju korjenčića lukovica

SVJETLO TAMA

vodovodna voda 26 16

uljni destilat vrbinih grančica 73 20

vodeni destilat vrbinih grančica 33 28

Rhizopon I 52 13

Rhizopon III 49 15

Slika 6. Prosječne vrijednosti broja korjenčića na svjetlu i u tami

Korjenčići su bili najbrojniji na lukovicama koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih

grančica na svjetlu, a najmanje brojni na lukovicama koje su klijale u Rhizoponu I u

tami.

4.3. Duljina korjenčića

Rezultati mjerenja prosječne duljine korjenčića svake od lukovica i prosječne

duljine korjenčića triju lukovica koje su klijale u istim uvjetima prikazani su u Tablici 2.

i na Slici 7.

Najdulje korjenčiće imale su lukovice koje su klijale u vodovodnoj vodi u tami

(4.2 cm) , a najkraće u korjenčiće u Rhizoponu III u tami (0.5 cm).

Tablica 2. Podaci o duljini korjenčića (u cm)

SVJETLO TAMA

vodovodna voda 3.7 0.25 4.2

uljni destilat vrbinih grančica 3.5 1.72 3.5

vodeni destilat vrbinih grančica 3.6 0.96 2.8

Rhizopon I 1.2 0.5 0.6

Rhizopon III 0.6 0.32 0.5

0

20

40

60

80

vodovodnavoda

uljni destilatvrbinihgrančica

vodenidestilatvrbinihgrančica

Rhizopon I Rhizopon III

Tama

Svjetlo

10

Slika 7. Prosječne vrijednosti duljine korjenčića

4.4. Duljina nadzemnog izdanka

Rezultati mjerenja duljine nadzemnog dijela izdanka prikazani su u u Tablici 3. i na

slikama (Slika 8., Slika 9., Slika 10. Slika 11.)

Tablica 3. Podaci o duljini nadzemnog izdanka (u cm)

SVJETLO TAMA

vodovodna voda 6.8 0.3 6

uljni destilat vrbinih grančica 6.7 0.35 8.5

vodeni destilat vrbinih grančica 2.7 1.63 2.6

Rhizopon I - 0.07

Rhizopon III 1 0 -

Slika 8. Prikaz prosječne duljine nadzemnog izdanka

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

vodovodnavoda




Tama

Svjetlo

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

vodovodnavoda




Tama

Svjetlo

11

Slika 9., 10. i 11. Usporedbe nadzemnih izdanaka svjetlo i tama

(slijeva-uljni destilat vrbinih grančica, vodeni destilat vrbinih grančica, Rhizopon I i III)

Najdulji nadzemni izdanak imale su lukovice koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih

grančica u tami (8.5 cm), a lukovice koje su klijale u Rhizoponu III u tami i Rhizoponu

I na svjetlu nisu razvile nadzemni dio izdanka.

4.5. Mitotski indeks

Prebrojavanjem stanica na mikroskopskom preparatu određen je ukupan broj

stanica u mitozi za lukovice iz svake otopine te je izračunat mitotski indeks. Dobiveni

podaci zapisani su Tablicu 4. i prikazani Slikom 12.

Tablica 4. Podaci o mitotskom indeksu (u %)

SVJETLO TAMA

vodovodna voda 43.18 51.85

uljni destilat vrbinih grančica 81.17 52.84

vodeni destilat vrbinih grančica 79.41 53.26

Rhizopon I 42.94 42.94

Rhizopon III 22.5 17.89

Slika 12. Prikaz vrijednosti mitotskog indeksa (MI) u postotcima

0

20

40

60

80

100

vodovodnavoda

uljnidestilatvrbinihgrančica


Rhizopon I RhizoponIII

Tama

Svjetlo

12

Najveći mitotski indeks imale su stanice korjenčića lukovica koje su klijale u uljnom

destilatu vrbinih grančica na svjetlu, dok su najmanji mitotski indeks imale stanice iz

Rhizopona III u tami.

4.6. Trajanje i zastupljenost faza diobe stanica

Tijekom prebrojavanja stanica zabilježena je posebno svaka faza razvoja stanice

kako bi se odredilo trajanje cjelokupnog ciklusa mitoze i udio pojedine faze u ukupnom

broju stanica Dobiveni rezultate zapisani su u tablicama (Prilog 1. i Prilog 2.).

Zastupljenost pojedinih faza prikazana je grafovima i tablicama (Slika 13. i Slika 14.,

Prilog 3., Prilog 4.).

Slika 13. Prikaz zastupljenosti faza mitoze u otopinama na svjetlu

Slika 14. Prikaz zastupljenosti faza mitoze u otopinama u tami

0102030405060708090

100

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

VODOVODNAVODA

ULJNI DESTILAT VODENI DESTILAT RHIZOPON I RHIZOPON III

020406080

100120140160

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

inte

rfaz

a

pro

faza

met

afaz

a

anaf

aza

telo

faza

VODOVODNAVODA

ULJNI DESTILAT VODENIDESTILAT

RHIZOPON I RHIZOPON III

13

Najmanja mitotska aktivnost zabilježena je u stanicama korjenčića lukovica koje su

klijale u vodovodnoj vodi i Rhizoponu I na svjetlu te Rhizoponu III na svjetlu i u tami.

Najveća mitotska aktivnost zabilježena je u stanicama lukovica koje su klijale u uljnom

destilatu vrbinih grančica i vodenom destilatu vrbinih grančica na svjetlu.

4.7. Analiza uljnog destilata vrbinih grančica

Masena spektometrija uljnog destilata vrbinih grančica napravljena je u suradnji s

Prirodoslovno-matematičkim Fakultetom u Splitu. Dobiveni rezultati prikazani su u

Tablici 5.

Tablica 5. Identifikacija spojeva

IME SPOJA UDIO (%)

salicilna kiselina 22.0

hexacosane 15.3

hydroxycitronellal 13.1

palmitinska kiselina 10.2

karvon 6.2

eugenol 1.8

UKUPNO IDENTIFICIRANO 68.6

U uljnom destilatu je od identificiranih spojeva najviše zastupljena salicilna kiselina (22

%), a najmanje eugenol (1.8%).

14

5. RASPRAVA

Cilj ovog rada bio je utvrditi sastav i zastupljenost organskih spojeva u

grančicama vrbe, usporediti utjecaj prirodnih biljnih hormona iz uljnog destilata vrbinih

grančica te vodene frakcije i umjetnih hormona na zakorjenjivanje luka u ovisnosti o

koncentraciji otopine i izloženosti svjetlu, prebrojavanjem i mjerenjem duljine

korjenčića, utvrđivanjem mitotske aktivnosti stanica korijena luka i utvrđivanjem

eventualnih pogrešaka u mitozi (genotoksičnost).

Istražen je utjecaj navedenih otopina na lukovice te utjecaj izloženosti lukovica

svjetlu ili tami na njihovu klijavost. Izmjerena je duljina korjenčića svake lukovice iz

otopina, duljina nadzemnog dijela izdanka, određen je mitotski indeks te izračunato

ukupno trajanje staničnog ciklusa. Genotoksičnost nije zabilježena.

Naša pretpostavka je bila da će lukovice bolje klijati u uljnom destilatu vrbinih grančica

i vodenom destilatu u tami pri nižim koncentracijama, te da će u istoj genotoksičnost

biti manja. Zbog velike fotoosjetljivosti IAA nije očekivana velika klijavost lukovica

koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica te vodenom destilatu na svjetlu. Bolja

klijavost očekivana je kod lukovica koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica

zbog antiseptičkih svojstava biljnih ulja čime se sprječava razvoj mikroorganizama, a

time pospješuje rast biljke. Lukovice su stavljene da klijaju u navedenim otopinama 5

dana nakon čega su provedena mjerenja.

Korjenčići lukovica koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica su bili

bijeli, deblji i tvrđi u odnosu na kontrolnu otopinu što upućuje na djelovanje auksina

(Pevalek-Kozlina, 2003.). (Slika 4.) Velik broj korjenčića na lukovicama koje su klijale

u uljnom destilatu vrbinih grančica na svjetlu (73 ) ukazuje na prisutnost male

koncentracije auksina koja stimulira rast adventivnog korijenja. (Škvorc i sur., 2008.).

Broj korjenčića na lukovicama iz iste otopine u tami je primjetno manji (20 ) jer

je koncentracija auksina bila veća i stimulirala je rast izdanka. Razlike u koncentraciji

auksina posljedica su fotoosjetljivosti indol-3-octene kiseline. Srednja devijacija broja

korjenčića lukovica koje su klijale u uljnom destilatu na svjetlu je najveća jer je indol-3-

octena kiselina (IAA) iznimno fotoosjetljiva (raspada se ako je izložena svjetlu), a

postoji mogućnost da su neke lukovice bile izloženije svjetlu od drugih lukovica koje su

klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica na svjetlu (Dubravec i sur, 1995.).

15

Velik broj korječića posljedica je i djelovanja salicilne kiseline (Tablica 5.) koja

ubrzava reakciju biljke na zatvaranje povreda. Na korištenim lukovicama povreda je

nastala odstranjivanjem starih korjenčića.

Duljina nadzemnog izdanka lukovica koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica

bio je najdulji u tami (8.5 ) što ukazuje na povišenu koncentraciju IAA koja u

većim koncentracijama stimulira rast izdanka. Duljina nadzemnog izdanaka lukovica

koje su klijale u uljnom destilatu na svjetlu ne pokazuje veće razlike od onih koje su

klijale u kontrolnoj otopini.

Mitotski indeks bio je najviši u stanicama iz uljnog destilata vrbinih grančica

(81.17), a u tami je bio manji (52.84%) što upućuje na intenzivnu mitotsku aktivnost što

prati makroskopske promjene na lukovicama iz iste otopine. Niži MI u tami može biti

posljedica duljeg nadzemnog izdanka, odnosno veće koncentracije auksina i veće

mitotske aktivnosti u izdanku. Stanice korijena osjetljivije su na auksin nego stanice

stabljike: koncentracija auksina koja je preniska da bi stimulirala rast stanica izdanka

može stimulirati rast stanica korijena, ali će zato koncentracija auksina koja je dovoljno

visoka da stimulira rast stanica izdanka inhibirati rast stanica korijena (Škvorc i sur.,

2008.).

Korjenčići lukovica koje su klijale u otopinama hormona Rhizopon I i Rhizopon

III su bili deblji od onih iz uljnog destilata vrbinih grančica te iznimno tvrdi, ali krhki i

lomljivi što ukazuje na jak utjecaj auksina na sintezu stanične stijenke. Stanična stijenka

je dio biljne stanice koji joj daje čvrstoću (Slika 6.) (Pevalek-Kozlina, 2003.).

Broj korjenčića lukovica koje su klijale u Rhizoponu I i Rhizoponu III je bio veći

od kontrolne otopine na svjetlu (Tablica 1.) što potvrđuje pretpostavku (IBA nije

fotoosjetljiva) (Dubravec i sur, 1995.).

U tami je zabilježen manji broj korjenčića te velika srednja devijacija, što se kosi s

pretpostavkom.

Lukovice iz Rhizopona I (0.5% IBA) imale su veći broj korjenčića koji su bili

dulji od onih iz Rhizopona III (2% IBA), dok izdanka nije ni bilo, a lukovice iz

Rhizopona III imale su manji broj kraćih korjenčića, ali su razvile nadzemni izdanak,

što potvrđuje djelotvornost auksina ovisno o njihovoj koncetraciji (Pevalek-Kozlina,

2003.).

Nizak MI, odnosno slaba mitotska aktivnost u obe otopine, prati makroskopske

promjene na lukovicama, tj. kratke korjenčiće (Tablica 4., Slika 7.).

16

Korjenčići lukovica koje su klijale u vodenom destilatu vrbinih grančica bili su

poput korjenčića iz kontrolne otopine, tanki i sivkastobijeli. (Slika 5.)

Broj korjenčića bio je veći nego u kontrolnoj otopini (Tablica 1.), na svjetlu

(33 ) i u tami (28 ).

Duljina korjenčića bila je manja nego u kontrolnoj otopini (Tablica 2.), na svjetlu (3.6

0.96) i u tami (2.8 ). Duljina nadzemnog izdanka bila je manja nego u kontrolnoj

otopini (Tablica 3.), na svjetlu (2.7 1.63) i u tami (2.6 ). Mitotski indeks u

stanicama na svjetlu bio je iznimno visok (79.41%) dok je u tami bio nizak (53.26%).

Navedeni rezultati nisu bili očekivani. Očekivani su bili isti rezultati kao i u

kontrolnim otopinama što ukazuje na postojanje nehlapljive tvari koja je topljiva u vodi

i nije fotoosjetljiva, a pozitivno utječe na zakorjenjivanje luka na svjetlu.

Provedena je masena spektometrija uljnog destilata vrbinih grančica. (Tablica 5.)

Dokazana je salicilna kiselina koja pozitivno djeluje na zarastanje povreda i eugenol te

fenoli koji pokazuju biološku aktivnost protiv raznih mikroorganizama, uključujući

bakterije, gljivice i viruse.

U svim preparatima zabilježen je velik broj stanica u interfazi i profazi, a mali

broj stanica u metafazi, anafazi i telofazi što upućuje na vrlo brz ciklus mitoze. Najveći

broj stanica u interfazi utvrđen je u kontrolnoj otopini i otopinama Rhizopona I i III što

upućuje na sporiji cjelokupni stanični ciklus.

17

6. ZAKLJUČCI

Korjenčići lukovica koji su klijali u uljnom destilatu vrbinih grančica,

Rhizoponu I i Rhizoponu III bili su čvršći i deblji u odnosu na kontrolnu

otopinu što ukazuje na djelovanje auksina koji stimuliranjem razvoja stanične

stijenke biljnoj stanici daju čvrstoću.

Uočava se znatnija razlika u broju korjenčića na svjetlu i u tami kod uljnog

destilata vrbinih grančica, što potvrđuje fotoosjetljivost IAA. Broj korjenčića je

veći na svjetlu.

Nadzemni izdanak bio je tamnije zelen kod lukovica koje su klijale na svjetlu.

Nadzemni izdanak lukovica koje su klijale u uljnom destilatu vrbinih grančica

u tami bio je najdulji, što potvrđuje djelovanje auksina koji, ukoliko su prisutni

u većoj koncetraciji, stimuliraju rast izdanka i inhibiraju rast korjena.

Mitotski indeks bio je najveći u uljnom destilatu vrbinih grančica na svjetlu.

U uljnom destilatu vrbinih grančica dokazano je postojanje salicilne kiseline u

većoj količini.

Prisutnost salicilne kiseline u uljnom destilatu vrbinih grančica ubrzava

reakciju biljke na zatvaranje povreda.

Uočava se razlika djelovanja vodenog destilata vrbinih grančica na mitotski

indeks, broj i duljinu korjenčića te duljinu nadzemnog izdanka, ali ne i na

morfološke karakteristike korjenčića u odnosu na kontrolnu otopinu.

Uljni destilat vrbinih grančica utječe na zakorjenjivanje luka te se može

koristiti u ekološkoj proizvodnji.

18

7. SAŽETAK

Cilj ovog rada je utvrditi sastav i zastupljenost organskih spojeva u grančicama

vrbe, usporediti utjecaj prirodnih biljnih hormona iz uljnog i vodenog destilata vrbinih

grančica i umjetnih hormona na zakorjenjivanje luka u ovisnosti o koncentraciji otopine

i izloženosti svjetlu, prebrojavanjem i mjerenjem duljine korjenčića, utvrđivanjem

mitotske aktivnosti stanica korijena luka i utvrđivanjem eventualnih pogrešaka u mitozi

(genotoksičnost).

Jedan dio lukovica bio je izložen svjetlu, drugi dio je klijao u tami. Istraživanjem su

određene morfološke razlike među lukovicama, broj korjenčića svake lukovice, izmjerena

duljina korjenčića, duljina nadzemnog dijela izdanka i određen mitotski indeks, udio i

trajanje pojedine faze mitoze u meristemskim stanicama korijena. Sakupljeni podaci

statistički su obrađeni te je izvršena usporedba rezultata dobivenih za različite otopine u

kojima su lukovice klijale na svjetlu i u tami.

Otopine djeluju različito na zakorjenjivanje ovisno nalaze li se na svjetlu ili u tami.

Auksini i salicilna kiselina iz uljnog destilata vrbinih grančica pozitivno utječu na

zakorjenjivanje luka. Ovaj, u potpunosti prirodan proizvod, može se koristiti za povećanje

uspješnost zakorjenjivanja poljoprivrednih kultura na jeftiniji i ekološki prihvatljiv način.

ZAHVALA

Zahvaljujemo se Prirodoslovno-matematičkom Fakultetu U Split u suradnji s

kojim je napravljena destilacija vrbinih grančica te GS/MS analiza uljnog destilata

vrbinih grančica.

19

8. POPIS LITERATURE

- Bačić T., 2003. Tkiva, Pintarić A. (ur.), Morfolofija i anatomija bilja, Sveučilište

Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku, Osijek, str. 194 – 200.

- Dubravec K. D., 1991., Dubravec K. D. (ur.), Botanika, Sveučilište u Zagrebu,

Fakultet poljoprivrednih znanosti, Zagreb, str. 409 -410.

- Dubravec K. D., Regula I., 1995. Fiziologija mijene oblika, Babić S. (ur.), Fiziologija

bilja, Školska knjiga, Zagreb, str. 130 – 137.

- Kalođera Z., (2009) Fitofarmacija/ Droge kod stanja prehlade/ Salicis cortex /Vrbina

kora, On-Line URL: www.pharma.unizg.hr , Farmaceutsko – biokemijski fakultet

Sveučilišta u Zagrebu. Pristupljeno 10.02.2014.

- Martinez A., (2013.) Usos medicinales del sauce dolor de espalda fiebre dolor de

cabeza http://naturistaalfonso.com/wpcontent/uploads/2013/12/salix_alba_nmk_151.jpg

pristupljeno 10.2.2014.

- Pevalek – Kozlina B., 2003., Pevalek - Kozlina B. (ur.), Fiziologija bilja, Profil

International, Zagreb, str. 279-288.

- Strasburger E., Noli F., Schneck H., Schimper A. F. W., Denfer D., Ziegler H., 1982.,

Devide Z., Udžbenik botanike za visoke škole. Morfologija i fiziologija, Školska

knjiga, Zagreb, str.112 - 114.

- Škvorc Ž., Franjić J. ,Sever K. 2008. Fiziologija bilja, Interna skripta, Sveučilište u

Zagrebu, Šumarski fakultet, Zagreb, str. 44.

http://www.pharma.unizg.hr/

http://naturistaalfonso.com/wp-content/uploads/2013/12/salix_alba_nmk_151.jpg

20

9. PRILOZI

Prilog 1. Podaci o trajanju i zastupljenosti pojedinih faza na svjetlu

SV

JE

TL

O

br. stanica u pojedinoj fazi

zastupljenost

pojedine faze (%)

trajanje faze V

OD

OV

OD

N

A V

OD

A

interfaza 100

17

6

56.68 9h 4min 9s

profaza 65 36.93 5h 54min 33 s

metafaza 4 2.27 21min 49s

anafaza 1 0.57 5min 27 s

telofaza 6 3.41 32min 44s

UL

JN

I

DE

ST

ILA

T interfaza 29

15

4

18.83 3h 0min 5s

profaza 89 57.79 9h 14 min 48s

metafaza 12 7.97 1h 14min 48s

anafaza 8 5.19 0h 49 min 52s

telofaza 16 10.39 1h 39 min 44s

VO

DE

NI

DE

ST

ILA

T interfaza 28

136

20.58 3h 17 min 39s

profaza 60 44.12 7h 3 min 31s

metafaza 14 10.29 1h 38 min 49s

anafaza 22 16.18 2h 35 min 18s

telofaza 12 8.82 1h 27 min 42s

RH

IZO

PO

N

I

interfaza 97

1

70

57.05 9h 7min 45s

profaza 51 30 4h 48min


anafaza 9 5.29 0h 50min 49s

telofaza 3 1.76 0h 16min 56s

RH

IZO

PO

N

III

interfaza 83

120

69.17 11h 4 min

profaza 16 13.33 2h 8 min

metafaza 7 5.83 0h 56 min

anafaza 7 5.83 0h 56 min

telofaza 7 5.83 0h 56 min

21

TA

MA

br. stanica u pojedinoj fazi zastupljenost

pojedine faze (%) trajanje faze

VO

DO

VO

DN

A V

OD

A

interfaza 104

21

6

48.15 7h 42min 13s

profaza 106 49.07 7h 51min 7 s

metafaza 4 1.85 17min 47s

anafaza 1 0.46 4min 27s

telofaza 1 0.46 4min 27s

UL

JN

I

DE

ST

ILA

T interfaza 91

19

3

47.15 7h 32min 38s

profaza 76 39.38 6h 26min 56s




VO

DE

NI

DE

ST

ILA

T interfaza 86

18

4

46.73 7h 28min 36s





RH

IZO

PO

N

I

interfaza 93

165

56.36 9h 1min 5s





RH

IZO

PO

N

III

interfaza 156

1

90

82.11 13h 8min 12s





Prilog 2. Podaci o trajanju i zastupljenosti pojedinih faza u tami

22

Prilog 3. Fotografija mikroskopskog preparata – uljni destilat vrbinih grančica na

svjetlu

Prilog 4. Fotografija mikroskopskog preparata – vodeni destilat vrbinih grančica na

svjetlu

Razlike-u-djelovanju-prirodnih-i-umjetnih-hormona-na ...

Documents

Transcript of Razlike-u-djelovanju-prirodnih-i-umjetnih-hormona-na ...