RAPORT ŞTIINłIFIC ŞI TEHNIC Etapa V 2009 de cercetare - Etapa V.pdf · Descrierea stiintifica si...
Transcript of RAPORT ŞTIINłIFIC ŞI TEHNIC Etapa V 2009 de cercetare - Etapa V.pdf · Descrierea stiintifica si...
1
RRAAPPOORRTT ŞŞTTIIIINNłłIIFFIICC ŞŞII TTEEHHNNIICC
EEttaappaa VV
22000099
CUPRINS
1. Obiective generale
2. Obiectivele fazei de executie
3. Rezumatul fazei
4. Descrierea stiintifica si tehnica
5. Concluzii
2
1. Obiective generale
Obiectivul general al proiectului de platforma (PYRAMID) propune crearea
infrastructurii necesare dezvoltarii cercetarilor in diagnosticarea precoce in patologia
maligna digestiva. Proiectul isi propune folosirea tehnicilor imagistice de ultima
generatie (autofluorescenta endoscopica, tomografie cu coerenta optica,
endomicroscopie confocala laser, etc.), generind crearea unui curent unificator, cu
integrarea cercetatorilor tineri in obiectivele si aria de cercetare FP7.
2. Obiectivele fazei de executie
In cadrul fazei de executie nr 5, derulata in intervalul 31/07/2009-27/09/2009,
s-a urmarit integrarea aparaturii de laborator achizitionate anterior precum si
efectuarea de masuratori comparative:
• A V.1. Integrarea laboratoarelor in cadrul platformei si interconectarea
aparaturii in circuitul retelei de calculatoare
• A V.2. Testare si masuratori comparative a dispozitivelor de tehnica medicala
3. Rezumatul fazei
Rezultatele obtinute folosind aparatura achizitionata în etapele anterioare au
fost selectate si comparate. Laboratoarele au fost integrate intr-un ciclu complet de
analiza.
4. Descrierea stiintifica si tehnica
Metodele folosite sunt proceduri de ultima generaŃie, ele completându-se
reciproc. O investigare completă asigura o şanse sporite de detecŃie precoce si
implicit reduce costurile afectate tratamentelor. Metodele folosite de catre platformă
3
îmbina tehnici standard noi precum autofluorescenta si microscopia confocala
laser cu tehnici aflate în fază incipientă de dezvoltare precum tomografia optic ă
coerenta şi cu analize genetice necesare cunoaşterii mecanismelor intrinseci ale
afecŃiunilor investigate.
Integrarea diferitelor laboratoare în cadrul platformei are ca rezultat o circulaŃie
optimă a rezultatelor şi imaginilor obŃinute cu ajutorul diferitelor metode în scopul
unei analize complete.
Caracteristicile si performantele sistemelor au fost descrise amanunŃit in
rapoartele anterioare, la momentul achiziŃiei. Integrarea lor se face prin intermediul
retelei IT achiziŃionate
Principiul autofluorescentei este bazat pe interactiunea dintre lumina cu o
anumita lungime de unda si fluoroforii din tesuturi. Sursele de lumina folosite includ
surse incoerente (ex. xenon) sau lumina laser monocromatica. Caracterul fluorescent
(profilul spectral) al fiecarui tesut este dependent de compozitia biochimica si
arhitectura morfologica. Cand un tesut este iluminat cu lumina ultravioleta sau cu
lungime de unda joasa din spectrul vizibil obtinute dintr-o sursa laser sau lampa cu
filtru, este emisa de moleculele endogene (fluorofori) tisulare o lumina fluorescenta
4
cu o lungime de unda mai mare. Aceasta autofluorescenta provine din componentele
tesutului conjunctiv (colagen, elastina), din enzimele metabolismului celular (NADH,
etc.), din produsii biosintezei hemului (porfirine) si din lipopigmenti (lipofuscina,
ceride).
Endoscopie cu autofluorescenŃă – esofagită non-erozivă cu leziuni minime vizualizate în autofluorescenŃă sub formă de leziuni liniare de culoare roz.
Endoscopie în mod NBI – esofagită non-erozivă cu leziuni minime. În mod NBI se vizualizează pattern-ul vascular dezorganizat datorită inflamaŃiei.
5
Endoscopie cu autofluorescenŃă – esofagită erozivă grd. A
Endoscopie cu autofluorescenŃă – cancer gastric precoce
Diferite lungimi de unda activeaza diferiti fluorofori, fiecare emitand intr-o alta
lungime de unda. Detectia leziunilor prin autofluorescenta depinde de schimbarile in
concentratia diferitilor fluorofori, modificarile arhitecturale tisulare sau ambele,
incluzand alterarea grosimii mucoasei sau circulatiei sangvine care pot afecta
intensitatea fluorescentei.
6
Principiul endomicroscopiei confocale laser este bazat pe integrarea unui
microscop confocal laser in virful unui endoscop conventional. In timpul endoscopiei
se foloseste apoi o raza laser care genereaza o unda de excitatie de 488 nm,
permitind obtinerea de sectiuni optice tisulare de 7 µm cu o rezolutie laterala de 0,7
µm si o penetratie intre 0 si 250 µm.
Avantajul major consta in obtinerea unor imagini histologice in vivo cu
posibilitatea de a obtine biopsii ghidate. Desi microvascularizatia, celulele individuale
si tesutul conjunctiv au vizibilitate buna, diferentierea dintre displazia joasa si inalta
nu sunt inca posibile cu agenti de contrast topici de tipul fluoresceinei, deoarece
contrastul nu penetreaza nucleii celulelor. Alti agenti de contrast de tipul acriflavinei
sunt folositi cu grija deoarece au risc potential de activitate mutagenic.
Endomicroscopia confocala laser are aplicatii multiple: screening-ul carcinomului
colorectal, in special postpolipectomie si in colita ulcerativa, permitind diagnosticul
unor neoplazii intraepiteliale cu acuratete mai buna decit endoscopia conventionala.
Supravegherea esofagului Barrett si a leziunilor preneoplazice gastrice este de
asemenea mai usoara cu microendoscopie confocala laser. Desi confirmarea
diagnosticului necesita inca examene anatomopatologice conventionale, este
posibila folosirea tehnicilor de telemedicina care permit transmisia in timp real a
datelor imagistice catre specialistii anatomopatologi, in timpul examinarilor
endoscopice de catre gastroenterologi.
7
Endomicroscopie confocală laser – aspect normal al mucoasei gastrice cu vizualizarea celulelor columnare, glandelor gastrice şi lumenului acestora în secŃiune transversală
Endomicroscopie confocală laser – aspect normal al mucoasei colonului superficial (a) şi profund (b)
8
Endomicroscopie confocală laser – cancer de colon - arhitectură tisulară complet dezorganizată cu pierderea criptelor şi celulelor caliciforme (a) şi invadarea vaselor cu ieşirea substanŃei de contrast în spaŃiul intercelular (b)
Endomicroscopie confocală laser – colită ulcerativă - alterarea arhitecturii tisulare cu infiltrat inflamator cronic şi creşterea distanŃei dintre cripte (a) şi vascularizaŃie abundentă (b)
9
Metoda tomografiei optice coerente (OCT) este o metoda nou intrata in
domeniul medical. Metoda se bazeaza pe folosirea unei surse partial coerente intr-
un montaj de tip interferential cele mai des intalnite find cele de tip Michelson sau
Mach –Zender si isi are originea in masuratorile din domeniul transmiterii informatiei
(determinari ale defectelor aparute in fibre optice si/sau in microchipuri). Este o
metoda neinvaziva care, pe baza analizei semnalului interferential permite scanarea
tesuturilor biologice pe o adancime de cativa mm avand o rezolutie de ordinal
micronilor.
Sistemul OCT THORLABS OCS1300SS
Imagine OCT a mucoasei gastrice normale
10
Imagine OCT a mucoasei colonice normale
Imagine OCT a mucoasei de acoperire a unui polip colonic
Imagine 3D-OCT a mucoasei gastrice normale
11
Sistemul automat de secven Ńiere Beckman Coulter CEQ 8000 permite
detecŃia mutaŃiilor, deleŃiilor şi ambiguităŃilor, detecŃia automată a heterozigoŃilor,
identificarea automată a alelelor cu scor SNP, instabilitatea microsateliŃilor, pierderea
heterozigoŃilor.
Specificitatea sistemul de secvenŃiere a fost evaluată prin analizarea secvenŃei
nucleotidice a unui fragment de ADN plasmidic cu secvenŃă cunoscută.
De asemenea au fost evaluate mutaŃiile de la nivelul codonului 12 al genei K-
ras la pacienŃii cu cancer colorectal. ADN-ul a fost izolat şi purificat atât din probe de
Ńesut tumoral provenind de la pacienŃii cu cancer colorectal, cât şi din materiile fecale
12
ale acestor pacienŃi. Un fragment de 82 de perechi de baze de la nivelul exonului 1,
care conŃine codonul 12, a fost apoi amplificat prin PCR. SecvenŃa fragmentelor
amplificate a fost apoi analizată cu ajutorul sistemului automat Coulter CEQ 8000.
O a doua componentă a sistemului achiziŃionat, luminometrul Glomax 20/20
(Promega), a fost utilizat pentru evaluarea calitativă a acizilor nucleici, în paralel cu
evaluarea prin spectrofotometrie (biofotometrul Eppendorf), real-time PCR (în
13
prezent dispunem de un sistem RotorGene 6200 + HRM de la compania Corbett) şi
cu ajutorul sistemului de fotodocumentare cu camera CCD (Syngene G:Box HR).
Mikro-Dismembratorul U (Sartorius), cu o viteză de agitare de 2000 min-1,
este utilizat în etapa iniŃială de omogenizare a izolării acizilor nucleici. Acest aparat
permite omogenizarea rapidă a probei în condiŃiile reducerii riscului degradării ADN,
ARN şi proteinelor, evitându-se utilizarea enzimelor şi reducând riscul degradării
probelor.
In cadrul laboratorului, aparatul a fost utilizat pentru omogenizarea probelor de
Ńesuturi recoltate de la pacienŃii cu cancer colorectal şi cancer gastric, în vederea
izolării şi purificării ARN-ului.
Pentru extracŃia şi purificarea acizilor nucleici, a fost achiziŃionat extractorul
automat Maxwell® 16 (Promega). Cu ajutorul extractorului automat, a fost izolat
ADN din 32 de probe de sânge şi ARN dintr-o probă de Ńesut malign colorectal.
ConcentraŃiile şi purităŃile acizilor nucleici, măsurate spectrofotometric, sunt redate în
tabelul de mai jos.
NR. crt. Proba ADN µg/ml ADN
260/280 ADN
260/230
1 SP110 48,06 1,72 1,15 2 SP111 35,90 1,81 1,22 3 SP112 44,18 1,88 1,29 4 SP113 44,76 1,80 0,98 5 SP114 27,17 1,75 1,00 6 SP115 36,37 1,65 1,13 7 SP116 43,38 1,77 1,26
8 25Reu 56,92 1,76 1,22
9 FB6 51,46 1,62 1,01 10 FB7 13,97 1,44 0,53 11 71 26,22 1,49 0,83 12 72 26,68 1,83 1,13 13 73 95,28 1,63 1,37 14 73 20,09 1,57 0,99 15 29 36,02 1,74 0,87 16 29 30,24 1,77 1,20 17 SP158 27,99 1,86 0,41 18 SP159 44,82 1,69 1,13 19 SP160 100,33 1,76 1,14 20 SP161 58,32 1,80 1,12 21 SP162 55,65 1,78 1,22 22 SP163 50,19 1,79 1,03 23 SP169 52,04 1,79 1,32 24 SP170 42,73 1,82 1,04
14
25 SP171 67,26 1,48 1,10 26 SP172 29,05 1,83 0,90 27 SP174 23,83 1,84 0,78 28 SP175 44,30 1,78 1,16 29 SP176 10,18 1,90 0,53 30 SP177 40,66 1,81 1,05 31 SP178 60,99 1,80 1,46
32 SP179 58,48 1,84 1,46
ARN µg/ml ARN
260/280 ARN
260/230 33 CRC5 15,2 1,09 0,23
5. Concluzii
Proiectul PYRAMID completează si dezvoltă infrastructura de cercetare a
UMF Craiova determinind valorificarea potentialului si a resurselor CDI in plan
regional si national, respectiv participarea Centrului de Cercetare in
Gastroenterologie in colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie Moleculara,
la programe nationale si internationale de cercetare.
In cadrul acestei faze s-au realizat măsurători cu echipamentele de cercetare
achiziŃionate şi totodată au fost examinaŃi pacienŃi utilizând aparatura medicală de
înaltă performanŃă.
Infrastructura IT a fost armonizată şi astfel concepută pentru a putea prelua
toate imaginile şi datele medicale obŃinute în scopul revederii şi prelucrării ulterioare.
Director contract,
Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu