7/30/2019 Rapid Identification ..

1/4

J O U R N A L O F C L I N I C A L M I C R O B I O L O G Y , F e b . 1 9 9 3 , p . 1 7 5 - 1 7 80 0 9 5 - 1 1 3 7 / 9 3 / 0 2 0 1 7 5 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t X 1 9 9 3 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

R a p i d I d e n t i f i c a t i o n o f M y c o b a c t e r i a t o t h e S p e c i e s L e v e l byP o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n a n d R e s t r i c t i o n Enzyme A n a l y s i sAMALIO T E L E N T I , 1 * FRANCINE MARCHESI,1 MARIANNE B A L Z , 1 FRANK B A L L Y , 'ERIK C . BOTrGER,2 AND THOMAS BODMER1

I n s t i t u t f i i r M e d i z i n i s c h e M i k r o b i o l o g i e , U n i v e r s i t a t B e r n , F r i e d b u h l s t r a s s e 5 1 , 3 0 1 0 B e r n , S w i t z e r l a n d , 1 a n dI n s t i t u t f i r M e d i z i n i s c h e M i k r o b i o l o g i e , M e d i z i n i s c h e H o c h s c h u l e H a n n o v e r , 3 0 0 0 H a n n o v e r , G e r m a n y 2R e c e i v e d 2 9 J u l y 1 9 9 2 / A c c e p t e d 2 6 O c t o b e r 1 9 9 2

A m e t h o d f o r t h e r a p i d i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a t o t h e s p e c i e s l e v e l was d e v e l o p e d on t h e b a s i s o fe v a l u a t i o n b y t h e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) o f t h e g e n e e n c o d i n g f o r t h e 6 5 - k D a p r o t e i n . T h e m e t h o di n v o l v e s r e s t r i c t i o n enzyme a n a l y s i s o f PCR p r o d u c t s o b t a i n e d w i t h p r i m e r s common t o a l l m y c o b a c t e r i a .U s i n g t w o r e s t r i c t i o n enzymes, B s t E I I a n d H a e I l l , m e d i c a l l y r e l e v a n t a n d o t h e r f r e q u e n t l a b o r a t o r y i s o l a t e swere d i f f e r e n t i a t e d t o t h e s p e c i e s or s u b s p e c i e s l e v e l b y P C R - r e s t r i c t i o n enzyme p a t t e r n a n a l y s i s . P C R -r e s t r i c t i o n e n z y m e p a t t e r n a n a l y s i s was p e r f o r m e d on i s o l a t e s ( n = 3 3 0 ) f r o m s o l i d a n d f l u i d c u l t u r e m e d i a ,i n c l u d i n g BACTEC, or f r o m f r o z e n a n d l y o p h i l i z e d s t o c k s . T h e p r o c e d u r e d o e s n o t i n v o l v e h y b r i d i z a t i o n s t e p sor t h e use o f r a d i o a c t i v i t y a n d ca n b e c o m p l e t e d w i t h i n 1 w o r k i n g d a y .

D i f f e r e n t i a t i o n o f m y c o b a c t e r i a t o t h e s p e c i e s l e v e l i sc u r r e n t l y d o n e b y t i m e - c o n s u m i n g e v a l u a t i o n o f p h e n o t y p i ca n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . A d d i t i o n a l m e t h o d s s u c h ash i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) or t h i n -l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ar e l i m i t e d b y t h e n e e d f o r s t a n d a r d -i z e d g r o w t h c o n d i t i o n s ( 4 , 1 3 , 1 8 ) . G e n - P r o b e ( G e n - P r o b e ,I n c . , S a n D i e g o , C a l i f . ) i s a r a p i d m e t h o d , b u t i t r e q u i r e ss e v e r a l p r o b e s a n d covers o n l y a l i m i t e d range o f m y c o b a c -t e r i a l s p e c i e s ( 1 4 ) . S e q u e n c i n g o f t h e 1 6 S rRNA gene i s ap o w e r f u l t e c h n i q u e o f d i f f e r e n t i a t i n g s p e c i e s ; h o w e v e r , i t i sl a b o r - i n t e n s i v e a n d d i f f i c u l t t o i m p l e m e n t f o r r o u t i n e use i nmany c l i n i c a l l a b o r a t o r i e s ( 1 6 ) .We d e v e l o p e d a r a p i d method b a s e d on t h e e v a l u a t i o n o ft h e gene e n c o d i n g f o r t h e 6 5 - k D a h e a t s h o c k p r o t e i n b y t h ep o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) . A s i m i l a r a p p r o a c h t o t h ed i f f e r e n t i a t i o n o f m y c o b a c t e r i a h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e db y P l i k a y t i s e t a l . ( 1 5 ) . Th e 6 5 - k D a p r o t e i n c o n t a i n s e p i t o p e st h a t ar e u n i q u e as w e l l as e p i t o p e s t h a t ar e common t ov a r i o u s s p e c i e s o f m y c o b a c t e r i a ( 1 7 ) . The c o n s e r v e d n a t u r eo f t h i s gene a l l o w e d d i f f e r e n t i a t i o n o f m y c o b a c t e r i a w i t h i n 1d a y b y r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n o f PCR p r o d u c t s o b -t a i n e d b y u s i n g p r i m e r s common t o a l l m y c o b a c t e r i a .

MATERIALS ANDMETHODSS a m p l e s . F o r t y r e f e r e n c e s t r a i n s ( T a b l e 1 ) were i n v e s t i -g a t e d t o e s t a b l i s h t h e d i a g n o s t i c a l g o r i t h m . T h e r e a f t e r , t h e

assay was u s e d t o d e t e r m i n e t h e s p e c i e s o f 2 9 0 c l i n i c a li s o l a t e s .S a m p l e p r e p a r a t i o n . A l o o p o f m y c o b a c t e r i a grown ons o l i d medium ( L o w e n s t e i n - J e n s e n or M i d d l e b r o o k 7H10a g a r ) was s u s p e n d e d i n 1 m l o f T E ( 1 0 mM T r i s , 1 mM EDTA[ p H 8 ] ) a n d was h e a t i n a c t i v a t e d f o r 1 0 m i n a t 8 0 C . Whenw o r k i n g w i t h l i q u i d medium ( M i d d l e b r o o k 7 H 9 , BACTEC1 2 B , or BACTEC 1 3 A ) or f r o z e n or r e h y d r a t e d l y o p h i l i z e ds t o c k s , 2 5 0 , u l was c e n t r i f u g e d a n d t h e p e l l e t was resus-p e n d e d i n TE as d e s c r i b e d a b o v e . A f t e r i n a c t i v a t i o n , t h eb a c t e r i a were c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n , t h e p e l l e t was resus-p e n d e d i n 1 0 0 , u l o f T E , a n d 1 0 0 , u l o f g l a s s b e a d s ( S i g m a )was a d d e d ; t h e s u s p e n d e d c e l l s were m e c h a n i c a l l y d i s i n t e -

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .1 7 5

g r a t e d f o r 2 m i n i n a M i c k l e a p p a r a t u s ( M i l l W o r k s , Gom-s h a l l , U n i t e d K i n g d o m ) . A f t e r a 1 0 - m i n c e n t r i f u g a t i o n s t e p ,t h e s u p e r n a t a n t was t r a n s f e r r e d t o a new t u b e . A l l c e n t r i f u -g a t i o n s t e p s were d o n e a t 1 3 , 0 0 0 rpm i n an E p p e n d o r fm i c r o c e n t r i f u g e .A m p l i f i c a t i o n . F i v e m i c r o l i t e r s o f l y s a t e was a d d e d t o e a c hr e a c t i o n t u b e . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e PCR m i x t u r e ( 5 0 , u )was 5 0 mM K C l , 1 0 mM T r i s - H C l ( p H 8 . 3 ) , 1 . 5 mM M g C l 2 ,10% g l y c e r o l , 2 0 0 , u M ( e a c h ) d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e ,0 . 5 , u M ( e a c h ) p r i m e r , a n d 1 . 2 5 U o f T a q p o l y m e r a s e ( C e t u sor B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) . T h e r e a c t i o n was s u b j e c t e d t o 4 5c y c l e s o f a m p l i f i c a t i o n ( 1 m i n a t 9 4 C , 1 m i n a t 6 0 C , 1 m i n a t7 2 C ) ; t h i s was f o l l o w e d b y 1 0 m i n o f e x t e n s i o n a t 7 2 C .P r i m e r s T b l l (5'-ACCAACGATGGTGTGTCCAT) a n d T b 1 2(5'-CTTGTCGAACCGCATACCCT) a m p l i f i e d a 4 3 9 - b p f r a g -ment b e t w e e n p o s i t i o n s 3 9 8 a n d 8 3 6 o f t h e p u b l i s h e d g e n esequence ( 1 7 ) .C o n t a m i n a t i o n p r e c a u t i o n s . A m p l i f i c a t i o n t u b e s f o r PCR-r e s t r i c t i o n enzyme p a t t e r n a n a l y s i s ( P R A ) were p r e p a r e d i na " P C R - c l e a n " room, w h i l e t h e m y c o b a c t e r i a l i s o l a t e s werei n a c t i v a t e d a n d l y s e d b y s t a f f f r o m t h e m y c o b a c t e r i o l o g yl a b o r a t o r y . T h e r e a f t e r , s a m p l e s were a d d e d t o t h e PCRm i x t u r e i n a h o o d f r o m an i n t e r m e d i a t e s a m p l e - l o a d i n g area,a n d PCR a n d r e s t r i c t i o n a n a l y s i s was p e r f o r m e d i n t h e" P C R - d i r t y " area. O t h e r recommended p r e c a u t i o n s werer e s p e c t e d ( 1 2 ) .R e s t r i c t i o n a n a l y s i s . F o r B s t E I I d i g e s t i o n , 1 0 R I o f PCRp r o d u c t was a d d e d d i r e c t l y t o a m i x t u r e c o n t a i n i n g 0 . 5 p l( = 5 U ) o f e n z y m e , 2 . 5 , u l o f r e s t r i c t i o n b u f f e r ( 5 x b u f f e r B ) ,a n d 1 1 . 5 , l o f w a t e r , a n d t h e m i x t u r e was i n c u b a t e d f o r 6 0m i n a t 6 0 C . S i m i l a r l y , 1 0 , u l o f p r o d u c t was d i g e s t e d a t 3 7 Ci n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g H a e I I I e n z y m e , t h e c o r r e s p o n d i n gb u f f e r ( 5 x b u f f e r M ) , a n d w a t e r . Enzymes a n d b u f f e r s werep u r c h a s e d f r o m B o e h r i n g e r M a n n h e i m .E v a l u a t i o n o f r e s t r i c t i o n p a t t e r n s . A f t e r d i g e s t i o n , 4 , u l o fg e l l o a d i n g b u f f e r ( 0 . 2 5 % b r o m o p h e n o l b l u e , 40% sucrose i nw a t e r ) was a d d e d , a n d 1 0 , l o f t h e m i x t u r e was l o a d e d o n t oa N u S i e v e 3 : 1 agarose g e l (FMC B i o p r o d u c t s ) . F r a g m e n t swere v i s u a l i z e d b y e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n i n g a n d UV l i g h t .F o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e PRA p a t t e r n s we d e s i g n e d ac o m p u t e r i z e d work s h e e t ( E x c e l ; M i c r o s o f t ) t o c o n v e r t t h er u n n i n g d i s t a n c e on e l e c t r o p h o r e s i s ( i n m i l l i m e t e r s ) t o ap -

V o l . 3 1 , N o . 2

7/30/2019 Rapid Identification ..

2/4

1 7 6 TELENTI E T AL.TABLE 1 . R e f e r e n c e s t r a i n s u s e d f o r t h e d e v e l o p m e n to f t h e d i a g n o s t i c a l g o r i t h m

I s o l a t e S t r a i nM . t u b e r c u l o s i s H37Rv . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 0 1 . O l 0 aM . b o v i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 0 2 . 0 0 0 1 aM . a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r es e r o t y p e 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l bM. a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r es e r o t y p e 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l bM . a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r es e r o t y p e 1 5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l bM. a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r es e r o t y p e 1 8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 3 5 7 7 0 cM . k a n s a s i i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NCTC 1 0 2 6 8 , d 1 4 0 1 1 . 0 0 0 1 , aDSM 4 3 2 2 4M . g a s t i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 3 4 . 0 0 0 1 , a B o r s t e l bM . g o r d o n a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 2 1 . 0 0 0 1 , a ATCC 1 4 4 7 0 cM . s h i m o i d e i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 0 7 . 0 0 0 1 aM . m a l m o e n s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NCTC 1 1 2 9 8 , d B o r s t e l bM . h a e m o p h i l u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 2 9 5 4 8 CM . t e r r a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DSM 1 0 1 1 1 . 6 8 eM . n o n c h r o m o g e n i c u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 1 9 5 3 0 CM . s c r o f u l a c e u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l bM . t n i v i a l e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 2 3 2 9 2 , c 1 4 0 3 3 . 0 0 0 1 aM . m a r i n u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 1 2 . 0 0 0 1 aM . f l a v e s c e n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 2 3 . 0 0 0 1 , a ATCC 1 4 4 7 4 cM . s i m i a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l bM . s z u l g a i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B o r s t e l , b 1 4 0 2 4 . 0 0 0 1 aM . x e n o p i . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NCTC 1 0 0 4 2 dM . s m e g m a t i s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 3 3 . 0 0 0 1 aM . a s i a t i c u m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 0 8 . 0 0 0 1 aM. aurum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 2 1 . 0 0 0 5 aM . v a c c a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 1 2 0 . 0 0 0 6 a"M g e n a v e n s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . H a n n o v e r fM . f o r t u i t u m s u b s p . f o r t u i t u m . . . . . . . . .ATCC 6 8 4 1 CM . f o r t u i t u m s u b s p . p e r e g r z n u m . . . . . . ATCC 1 4 4 6 7 CM . f o r t u i t u m t h i r d v a r i a n t . . . . . . . . . . . . . . .ATCC 4 9 4 0 3 , c ATCC 4 9 4 0 4 cM . c h e l o n a e s u b s p . c h e l o n a e . . . . . . . . . .ATCC 3 5 7 5 2 CM . c h e l o n a e s u b s p . a b s c e s s u s . . . . . . . . . ATCC 1 9 9 7 7 c

a I n s t i t u t P a s t e u r , P a r i s , F r a n c e .b N a t i o n a l R e s e a r c h I n s t i t u t e f o r M y c o b a c t e r i a , B o r s t e l , G e r m a n y .c ATCC, A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M d .d N a t i o n a l C o l l e c t i o n o f T y p e C u l t u r e , L o n d o n , E n g l a n d .D e u t s c h e S t a m m s a m m l u n g f i r M i k r o o r g a n i s m e n , B r a u n s c h w e i g , G e r -

ma n y .f I n s t i t u t f f i r M e d i z i n i s c h e M i k r o b i o l o g i e , H a n n o v e r , G e r m a n y .

p a r e n t m o l e c u l a r s i z e ( i n b a s e p a i r s ) . The s o f t w a r e b u i l d s as t a n d a r d curve f r o m t h e m i g r a t i o n d i s t a n c e o f a m o l e c u l a rs i z e s t a n d a r d ( H a e I I I - d i g e s t e d 4 ) X 1 7 4 DNA). T h e r e a f t e r , t h ed i s t a n c e v a l u e s f o r e a c h s a m p l e were a u t o m a t i c a l l y r e f e r r e dt o t h e s t a n d a r d curve a n d e x p r e s s e d as t h e c a l c u l a t e dm o l e c u l a r s i z e . R e s u l t s f r o m s e q u e n t i a l r e a d i n g o f B s t E I Ia n d H a e I I I d i g e s t i o n p a t t e r n s were e v a l u a t e d w i t h t h e h e l po f an a l g o r i t h m ( F i g . 1 ) . To a v o i d c o n f u s i o n w i t h p r i m e r a n dp r i m e r - d i m e r b a n d s , r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s s h o r t e r t h a n 6 0 b pwere d i s r e g a r d e d .

RESULTST e s t e d m y c o b a c t e r i a were d i f f e r e n t i a t e d by u s i n g t wor e s t r i c t i o n enzymes ( F i g . 1 t o 3 ) . Th e m em be rs o f t h eM y c o b a c t e r i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x were n o t d i f f e r e n t i -a t e d b y PRA. T he M. a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r e c o m p l e x wasd i s c r i m i n a t e d t o M. a v i u m a n d M. i n t r a c e l l u l a r e s p e c i e s( F i g . 2 ) . M. a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r e ATCC 3 5 7 7 0 s e r o t y p e1 8 d i s p l a y e d an M. i n t r a c e l l u l a r e PRA p a t t e r n . T h e M.f o r t u i t u m c o m p l e x was s e p a r a t e d t o t h e s u b s p e c i e s l e v e l

B s t E I I H a e I I I1 8 0 / 1 4 0 b p M . t r i v i a l e

- N o D i g e s t i o - 1 7 5 / 8 0 b p M . v a c c a e- 1 4 0 / 1 0 5 b p-. s z u l g a i1 4 0 b p M . f l a v e s c e n s I1 4 0 b p 2 1 0 b p M . c h e l o n a e s s . c h e l o n a eL 17 5 /1 2 5 b p-. h a e m o p h i l u m- 3 2 5 b p F 1 9 0 / 1 4 0 b p M . t e r r a e- 1 2 5 b p 1 4 0 / 1 1 5 / 7 O b p -M. g o r d o n a e I VL 1 4 0 / 1 0 5 b p - " M . g e n a v e n s e "

- 2 4 5 b p

2 0 0 / 1 3 5 b p -M.s i m i a e- 1 6 0 / 1 1 5 / 8 0 bp- M . m a r i n u m- 1 6 0 / 6 0 b p M . c h e l o n a e s s . a b s c e s s u s- 1 5 5 / 1 5 0 / 1 0 0 bp- M . f o r t u i t u m s s . p e r e g r i n u m- 1 5 5 / 1 3 5 / 9 5 b p-M . s c r o f u l a c e u m- 2 2 0 b p - - 1 5 0 / 1 0 0 b p M . f l a v e s c e n s I I- 1 4 0 / 1 1 5 b p M . g o r d o n a e V- 1 4 0 / 1 0 5 / 7 O b p - M . k a n s a s i i1 4 0 / 1 0 5 b p M aviu m1 1 5 / 1 1 0 b p M . a s i a t i c u m- 1 7 5 / 8 0 b p M . a u r u m

- 1 4 0 / 8 5 b p - 1 6 0 / 1 3 0 b p-. s m e g m a t i s- 1 5 0 / 1 1 0 / 7 0 n b p-. s h i m o i d e i1 4 0 / 1 0 5 / 7 O b p -M. g a s t r i / M . k a n s a s i i1 5 5 / 1 4 0 / 6 0 b p -M. i n t r a c e l l u l a r e / l A I S t . 1 8- 1 2 5 / 1 0 0 b p 1 5 5 / 1 1 0 7 O b p -M. m a l m o e n s e1 4 0 / 1 2 0 b p -M. g o r d o n a e I I I- 2 3 5 / 1 1 5 b p -M.g o r d o n a e I I- 1 7 0 / 1 1 5 b p-. g o r d o n a e I- 1 7 0 / 1 0 5 b p -M.x e n o p i

- 1 2 5 / 8 0 b p - 1 6 0 / 1 4 0 / 7 O b p - M . t u b e r c u l o s i s c o m p l e x1 6 0 b p M . n o n c h r o m o g e n i c u m1 5 5 / 1 3 5 b p -M.f o r t u i t u m s s . f o r t u i t u m1 5 0 / 1 3 5 b p -M.f o r t u i t u m s s . 3 r d v a r i a n tF I G . 1 . A l g o r i t h m f o r t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f s i g n i f i c a n t m e d i c a la n d l a b o r a t o r y m y c o b a c t e r i a l i s o l a t e s t o t h e s p e c i e s l e v e l . A p p a r e n tm o l e c u l a r s i z e s c a n v a r y w i t h i n a 5 b p r a n g e , b u t t h i s r a r e l yr e p r e s e n t s a p r o b l e m f o r a c o r r e c t i d e n t i f i c a t i o n .

( F i g . 3 ) . R e f e r e n c e s t r a i n s o f M. k a n s a s i i a n d M. g a s t r ie x h i b i t e d d i s t i n c t PRA p a t t e r n s ; h o w e v e r , t w o c l i n i c a l i s o -l a t e s h a d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f M . k a n s a s i i , b u tt h e y w e r e G e n - P r o b e n e g a t i v e a n d e x h i b i t e d a n M . g a s t r iPRA p a t t e r n . Two M . g o r d o n a e r e f e r e n c e s t r a i n s e v a l u a t e da n d 3 8 % o f t h e c l i n i c a l M. g o r d o n a e i s o l a t e s e x h i b i t e d t h ep a t t e r n d e s c r i b e d i n F i g . 1 a s M. g o r d o n a e I . H o w e v e r ,o t h e r M . g o r d o n a e c l i n i c a l i s o l a t e s g e n e r a t e d t h e f o l l o w i n ga d d i t i o n a l p a t t e r n s : I I ( 1 7 % ) , I I I ( 1 2 % ) , IV ( 2 1 % ) , a n d V( 1 2 % ) ( F i g . 1 ) . Two r e f e r e n c e s t r a i n s o f M. f l a v e s c e n s , o n ef r o m t h e I n s t i t u t P a s t e u r a n d o n e f r o m t h e A m e r i c a n T y p eC u l t u r e C o l l e c t i o n , p r e s e n t e d d i f f e r e n t PRA p a t t e r n s ( M .f l a v e s c e n s I a n d I I , r e s p e c t i v e l y ) ; two c l i n i c a l s t r a i n s e x h i b -i t e d p a t t e r n I .M o s t PRA p a t t e r n s c o u l d b e r e c o g n i z e d v i s u a l l y . P a t t e r n sw i t h t h e g r e a t e s t d e g r e e o f s i m i l a r i t y were t h o s e f r o m M .f o r t u i t u m s u b s p . f o r t u i t u m a n d M . f o r t u i t u m s u b s p . t h i r dv a r i a n t ( F i g . 3 , l a n e s 3 a n d 4 , r e s p e c t i v e l y ) , M. f o r t u i t u ms u b s p . p e r e g r i n u m a n d M . f l a v e s c e n s I I ( F i g . 1 ) , a n d M.x e n o p i a n d M . g o r d o n a e I ( F i g . 1 ) . M . t u b e r c u l o s i s a n d M .f o r t u i t u m s u b s p . f o r t u i t u m d i s p l a y e d s i m i l a r p a t t e r n s onB s t E I I d i g e s t i o n ; h o w e v e r , t h e y were d i s c r i m i n a t e d a t t h eH a e I I I l e v e l b y t h e p r e s e n c e o f a c h a r a c t e r i s t i c - 7 0 b p M .t u b e r c u l o s i s r e s t r i c t i o n b a n d ( F i g . 2 , l a n e 1 ) , o r a t r i p l e tp a t t e r n ( = 3 l o w - m o l e c u l a r - m a s s b a n d s ) common t o M. f o r -t u i t u m s u b s p . f o r t u i t u m a n d M. c h e l o n a e ( F i g . 3 , l a n e 3 ) .

J . C L I N . M I C R O B I O L .

7/30/2019 Rapid Identification ..

3/4

RAPID IDENTIFICATION OF MYCOBACTERIA 1 7 7M 1 2 3 4 5 6 7 8 M

H a e l l i

M 1 2 3 4 5 6 M M 1 2 3 4 5 6 M

4-603 bp

3 1 0 bp-251 bp

23 4 bp-I 9A bp

4--1 18 bp7 0 bp

B S t E I I B s t E I l H a e l l iF I G . 2 . PRA o f t h e f o l l o w i n g s e l e c t e d s l o w - g r o w i n g m y c o b a c t e -r i a : M . t u b e r c u l o s i s c o m p l e x ( l a n e 1 ) , M . g o r d o n a e ( l a n e 2 ) , M.i n t r a c e l l u l a r e ( l a n e 3 ) , M. m a l m o e n s e ( l a n e 4 ) , M. a v i u m ( l a n e 5 ) , M.k a n s a s i i ( l a n e 6 ) , a n d M . s z u l g a i ( l a n e 8 ; n o t d i g e s t e d w i t h B s t E I I ) .L a n e M, m o l e c u l a r mass m a r k e r s . F a s t i d i o u s l y g r o w i n g m y c o b a c -t e r i a s u c h as t h e r e c e n t l y d e s c r i b e d "M. g e n a v e n s e " ( l a n e 7 ) cana l s o b e i d e n t i f i e d b y PRA.

A g a r o s e g e l a r t i f a c t s ( i . e . , d i s t o r t e d or u n e q u a l m i g r a t i o np a t t e r n s ) a n d g e l - t o - g e l d i f f e r e n c e s may r e s u l t i n v a r i a t i o n si n t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r s i z e o f 5 b p .Th e f o l l o w i n g c l i n i c a l i s o l a t e s were e v a l u a t e d b y PRA: M.t u b e r c u l o s i s c o m p l e x ( n = 1 0 9 , i n c l u d i n g 5 M. b o v i s a n d 1M. a f r i c a n u m ) , M. a v i u m ( n = 5 0 ) , M. i n t r a c e l l u l a r e ( n =1 2 ) , M. g o r d o n a e ( n = 2 4 ) , M. x e n o p i ( n = 9 ) , M. k a n s a s i i orM. g a s t r i ( n = 8 ) , M. malmoense ( n = 5 ) , d i f f e r e n t s u b s p e -c i e s o f t h e M. f o r t u i t u m c o m p l e x ( n = 3 0 ) , 2 i s o l a t e s e a c h o fM. m a r i n u m , M. s z u l g a i , M. s m e g m a t i s , M. f l a v e s c e n s , a n dM. s h i m o i d e i , a n d 1 i s o l a t e e a c h o f M. t e r r a e a n d M. s i m i a e .DNA p r e p a r e d f r o m s i x c l i n i c a l i s o l a t e s c o n t a i n i n g t h e n e w l yd e s c r i b e d f a s t i d i o u s l y g r o w i n g "M. g e n a v e n s e " ( 2 ) wass u c c e s s f u l l y a m p l i f i e d a n d i n v e s t i g a t e d b y PRA ( F i g . 2 , l a n e7 ) . PRA r e s u l t s were c o n f i r m e d b y s t a n d a r d b i o c h e m i c a lp a t t e r n s , G e n - P r o b e , or 1 6 S rRNA gene s e q u e n c i n g . T h e r ewere 2 5 i s o l a t e s w i t h p a t t e r n s n o t r e p r e s e n t e d i n t h e r e f e r -ence a l g o r i t h m .

DISCUSSIONThe t wo m a i n p r o b l e m s i n t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f m y c o b a c -t e r i a t o t h e s p e c i e s l e v e l ar e t h e d i v e r s i t y o f t e c h n i q u e s and

t e s t s t h a t ar e necessary a n d t h e t i m e r e q u i r e d f o r a f u l li d e n t i f i c a t i o n . The method d e s c r i b e d h e r e c o n t r i b u t e s t o t h es o l u t i o n o f t h e s e two p r o b l e m s : i t can b e c o m p l e t e d i n 1 d a y ,i t r e p r e s e n t s a u n i v e r s a l s y s t e m o f i d e n t i f y i n g m y c o b a c t e r i at o t h e s p e c i e s l e v e l , a n d i t d o e s n o t r e q u i r e h y b r i d i z a t i o n t oa p a n e l o f s p e c i e s - s p e c i f i c p r o b e s , w h i c h i s a l i m i t a t i o n o fo t h e r P C R - b a s e d a n d h y b r i d i z a t i o n methods f o r d i f f e r e n t i a t -i n g m y c o b a c t e r i a l s p e c i e s ( 1 , 5 , 7 , 9 , 1 1 , 1 4 ) .P r e p a r a t i o n o f s a m p l e s was a c c o m p l i s h e d b y s i m p l e me-c h a n i c a l d i s i n t e g r a t i o n o f t h e b a c t e r i a . A l t e r n a t i v e p r o t o -c o l s , s u c h as t h e e n z y m a t i c d i g e s t i o n w i t h lysozyme a n dp r o t e i n a s e K , h a v e n o t b e e n as e f f e c t i v e i n p r o d u c i n g ac o n s i s t e n t y i e l d o f a m p l i f i e d p r o d u c t a n d ar e more t i m e -c o n s u m i n g . O t h e r t e c h n i q u e s f o r t h e m e c h a n i c a l d i s r u p t i o no f t h e m y c o b a c t e r i a l c e l l w a l l , s u c h as s o n i c a t i o n , ar e l i k e l yt o b e e q u a l l y e f f e c t i v e ( 3 , 1 5 ) . The i s o l a t e s were o b t a i n e df r o m s o l i d or l i q u i d m e d i u m , i n c l u d i n g BACTEC, a n d f r o mf r o z e n or l y o p h i l i z e d m y c o b a c t e r i a l s t o c k s w i t h o u t t h e n e e df o r s t a n d a r d i z a t i o n o f g r o w t h c o n d i t i o n s t h a t l i m i t o t h e r

F I G . 3 . PRA a l l o w s d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e f o l l o w i n g M. f o r t u i t u mc o m p l e x s t r a i n s t o t h e s u b s p e c i e s l e v e l : M. c h e l o n a e s u b s p . c h e l o -nae ( l a n e 1 ) , M. c h e l o n a e s u b s p . a b s c e s s u s ( l a n e 2 ) , M. f o r t u i t u ms u b s p . f o r t u t u m ( l a n e 3 ) , M. f o r t u i t u m s u b s p . t h i r d v a r i a n t ATCC4 9 4 0 3 a n d ATCC 4 9 4 0 4 ( l a n e s 4 a n d 5 , r e s p e c t i v e l y ; i d e n t i c a lp a t t e r n s ) , a n d M. f o r t u i t u m s u b s p . p e r e g r i n u m ( l a n e 6 ) . L a n e M,m o l e c u l a r mass m a r k e r s .

r a p i d m e t h o d s o f d i f f e r e n t i a t i n g m y c o b a c t e r i a l s p e c i e s ( 4 , 6 ) .The a d d i t i o n o f 10% g l y c e r o l t o t h e a m p l i f i c a t i o n m i x t u r ewas e s s e n t i a l f o r c o n s i s t e n t PCR r e s u l t s . I n t h e a b s e n c e o fg l y c e r o l , PCR y i e l d s were r e d u c e d , i n p a r t i c u l a r f o r s p e c i e ss u c h as M. a v i u m , M. k a n s a s i i , a n d M. f l a v e s c e n s .Th e s p e c i e s o f most o f t h e c l i n i c a l i s o l a t e s i n v e s t i g a t e dwere d e t e r m i n e d b y PRA. T h e s e i n c l u d e d t h e n e w l y d e -s c r i b e d f a s t i d i o u s l y g r o w i n g " M . g e n a v e n s e " ( 2 ) a n d t h el e s s common i s o l a t e s M. m a l m o e n s e , M. m a r i n u m , M.s h i m o i d e i , a n d M. s i m i a e . T h e M. t u b e r c u l o s i s i s o l a t e sc o n s i s t e n t l y d i s p l a y e d t h e same PRA p a t t e r n s . H o w e v e r ,members o f t h e M. t u b e r c u l o s i s c o m p l e x , w h i c h ar e d i f f i c u l tt o s e p a r a t e b y means o f o t h e r m e t h o d s s u c h as 1 6 S rRNAg e n e s e q u e n c i n g or HPLC a n a l y s i s o f m y c o l i c a c i d s ( 4 , 6 ,1 6 ) , c o u l d n o t b e d i s c r i m i n a t e d b y PRA. I n c o n t r a s t , t h e M.f o r t u i t u m c o m p l e x was s e p a r a t e d t o t h e s u b s p e c i e s l e v e l ,a n d t h e M. a v i u m - M . i n t r a c e l l u l a r e c o m p l e x was d i s c r i m i -n a t e d t o M. a v i u m a n d M. i n t r a c e l l u l a r e s p e c i e s i n a mannert h a t c o r r e l a t e d w i t h t h e G e n - P r o b e r e s u l t s . R e f e r e n c e s t r a i n so f M. k a n s a s i i a n d M. g a s t r i , w h i c h cannot b e d i f f e r e n t i a t e db y 1 6 S rRNA g e n e s e q u e n c i n g , e x h i b i t e d d i s t i n c t PRAp a t t e r n s ; h o w e v e r , t wo c l i n i c a l i s o l a t e s h a d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s o f M. k a n s a s i i b u t were G e n - P r o b e n e g a t i v ea n d h a d an M. g a s t r i PRA p a t t e r n . T h e s e o b s e r v a t i o n su n d e r s c o r e t h e c u r r e n t p r o b l e m i n t h e taxonomy o f t h e s em y c o b a c t e r i a ( 1 9 ) . I n c o n t r a s t t o o t h e r m y c o b a c t e r i a , M.g o r d o n a e i s o l a t e s g e n e r a t e d m u l t i p l e p a t t e r n s . T h i s f i n d i n g i sc o n s i s t e n t w i t h t h e M. g o r d o n a e p a t t e r n " c l u s t e r i n g " d e -s c r i b e d b y P l i k a y t i s e t a l . ( 1 5 ) a n d t h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n ap r i o r r e p o r t on m i c r o h e t e r o g e n e i t y w i t h i n t h e r R N A - e n c o d -i n g r e g i o n o f M. g o r d o n a e ( 1 0 ) .Many i s o l a t e s whose p a t t e r n s were n o t p r e s e n t i n t h er e f e r e n c e a l g o r i t h m were e n v i r o n m e n t a l m y c o b a c t e r i a pre-v i o u s l y i d e n t i f i e d b y c o n v e n t i o n a l means as "M. t e r r a ec o m p l e x " or " M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s . " I n v e s t i g a t i o n b y1 6 S rRNA gene s e q u e n c i n g was n o t c o n c l u s i v e . Te n o f t h e mwere i d e n t i c a l i s o l a t e s f r o m a b r o n c h o s c o p y c o n t a m i n a t i o no u t b r e a k a n d ar e b e i n g e v a l u a t e d b y 1 6 S rRNA g e n e se -q u e n c i n g a n d b i o c h e m i c a l m e a n s . I n f a c t , PRA w o u l d b e ane f f i c i e n t method f o r e s t a b l i s h i n g t h e n a t u r e o f s u c h pseu-d o e p i d e m i c s ( 8 ) .

4- 60 3 b p

3 in up25 1 b p

4 - 2 34 b p- 19 4 b p

4- 1 ;e b p4- 70 b p

V O L . 3 1 , 1 9 9 3

I

7/30/2019 Rapid Identification ..

4/4

1 7 8 TELENTI ET AL.M o s t PRA p a t t e r n s c a n b e r e c o g n i z e d v i s u a l l y . A l t e r n a -t i v e l y , c o m p u t e r i z e d g e l r e a d e r s w i t h a n i n t e r n a l s t a n d a r da n d b a s e l i n e c o r r e c t i o n c a n b e u s e d ( 1 5 ) ; h o w e v e r , t r a i n e dp e r s o nn e l c a n i n t e r p r e t t h e g e l s w i t h m i n i m a l d i f f i c u l t y , a n di f n e c e s s a r y , p r o b l e m s a m p l e s c a n b e r u n i n p a r a l l e l w i t hs t o r e d d i g e s t e d r e f e r e n c e s t r a i n DNA. T h e u s e o f o t h e rp r i m e r s o r r e s t r i c t i o n e n z y m e s w o u l d n e c e s s a r i l y r e q u i r e t h e

c o n s t r u c t i o n o f a new r e f e r e n ce a l g o r i t h m ( 1 5 ) .C o n t a m i n a t i o n ( c a r r y o v e r ) p r e c a u t i o n s s h o u l d b e c a r e -f u l l y r e s p e c t e d ( 1 2 ) . H o w e v e r , c o n t a m i n a t i o n i s u n l i k e l y t or e p r e se n t a p r o b l e m b e c a u s e a l i m i t e d n u m b e r o f c a r r y o v e rm o l e c u l e s w i l l b e o v e r w h e l m e d b y t h e m a i n t a r g e t , a n d i fv i s i b l e o n t h e g e l , c o n t a m i n a t i o n c a n b e r e c o g n i z e d b y t h ea p p e a r a n c e o f s u p e r i m p o s e d d i g e s t i o n p a t t e r n s . I f t h e l a b o -r a t o r y i s p e r f o r m i n g PCR f o r d i r e c t d e t e c t i o n o f m y c o b a c t e -r i a i n c l i n i c a l s a m p l e s ( d i a g n o s t i c P C R ) , we w o u l d r e c o m -mend t h e u s e o f p r i m e r s d i r e c t e d t o a c o m p l e t e l y u n r e l a t e dg e n o m i c r e g i o n t o t h e o n e t a r g e t e d f o r P R A . T h i s i s i m p o r -t a n t b e c a u s e t h e v e r y h i g h c o p y n u m b e r o f PCR p r o d u c t sg e n e r a t e d d u r i n g PRA c o u l d r e p r e s e n t a s o u r c e o f c o n t a m i -n a t i o n f o r a s e n s i t i v e d i a g n o s t i c P C R .We a r e e v a l u a t i n g t h e u s e o f PRA f o r r o u t i n e i d e n t i f i c a t i o no f m y c o b a c t e r i a f r o m p o s i t i v e BACTEC ( g r o w t h i n d e x ,. 1 0 0 ) o r s o l i d m e d i u m c u l t u r e s . I n t h e f u t u r e we w i l l a p p l yPRA t o t h e d i r e c t i n v e s t i g a t i o n o f s m e a r - p o s i t i ve c l i n i c a ls a m p l e s . H o w e v e r , many o f t h e s e r e n d e r i n s u f f i c i e n t q u a n -t i t i e s o f a m p l i f i e d p r o d u c t t o a l l o w a s a t i s f a c t o r y v i s u a l i z a -t i o n o f d i g e s t i o n f r a g m e n t s o n t h e a g a r o s e g e l , a n d a na d d i t i o n a l s t e p , s u c h a s c h e m o l u m i n e s c e n c e d e t e c t i o n o fr e s t r i c t i o n f r a g m e n t s , may b e n e c e s s a r y . I n a d d i t i o n , o u rp r e l i m i n a r y e x p e r i e n c e w i t h d i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f m y c o -b a c t e r i a l s p e c i e s f r o m s m e a r - p o s i t i v e s p u t a s u g g e s t s t h ep r e s e n c e o f i n h i b i t o r s o f t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s , a n d af u r t h e r s t e p o f PCR p r o d u c t p u r i f i c a t i o n c o u l d b e n e c e s s a r y .PRA w i l l a l s o p r o v e t o b e u s e f u l f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o ff a s t i d i o u s l y o r n o n g r o w i n g m y c o b a c t e r i a , s u c h a s " M .g e n a v e n s e , " t h a t a r e c u r r e n t l y d i f f e r e n t i a t e d t o t h e s p e c i e sl e v e l b y 1 6 S rRNA g e n e s e q u e n ci n g ( 2 ) .I n s u m m a r y , PRA a p p e a r s t o b e a v e r y r a p i d m e t h o d o fd i f f e r e n t i a t i n g m y c o b a c t e r i a t o t h e s p e c i e s l e v e l . O t h e r a d -v a n t a g e s a r e t h e s i m p l i c i t y o f s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d i t si n d e p e n d e n c e f r o m h y b r i d i z a t i o n s t e p s , m u l t i p l e p r o b e s , o rr a d i o a c t i v i t y . I n a d d i t i o n , i t c a n b e u p g r a d e d t o a l l o w f o ra u t o m a t i o n , s u c h a s t h e u s e o f f l u o r e s c e n t p r i m e r s a n da u t o m a t e d g e l r e a d e r s .

ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k C l a u d i a B e r n a s c o n i , A n d r e a G u r t n e r , a n d N i c o l eP a t t i s e l a n n o f o r t e c h n i c a l h e l p .T h e s t u d y was s u p p o r t e d i n p a r t b y g r a n t 3 2 - 3 2 4 0 6 . 9 1 f r o m t h eS w i s s N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n .

REFERENCES1 . B o d d i n g h a u s , B . , T . R o g a l l , T . F l o h r , H . B l o c k e r , a n d E .B o t t g e r . 1 9 9 0 . D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a b ya m p l i f i c a t i o n o f rRNA. J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 8 : 1 7 5 1 - 1 7 5 9 .2 . B o t t g e r , E . , A . T e s k e , P . K i r s c h n e r , S . B o s t , H . C h a n g , V . B e e r ,a n d B . H i r s c h e l . 1 9 9 2 . D i s s e m i n a t e d " M . g e n a v e n s e " i n f e c t i o n

i n p a t i e n t s w i t h A I D S . L a n c e t 3 4 0 : 7 6 - 8 0 .3 . B u c k , G . , L . O ' H a r a , a n d J . S u m m e r s g i l l . 1 9 9 2 . R ap i d , s i m p l em e t h o d f o r t r e a t i n g c l i n i c a l s p e c i m e n s c o n t a i n i n g M y c o b a c t e -r i u m t u b e r c u l o s i s t o r e m o v e DNA f o r p o l y m e r a s e c h a i n r e a c -t i o n . J . C l i n . M i c r o b i o l . 3 0 : 1 3 3 1 - 1 3 3 4 .4 . B u t l e r , W . , K . J o s t , a n d J . K i l b u r n . 1 9 9 1 . I d e n t i f i c a t i o n o fm y c o b a c t e r i a b y h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J .C l i n . M i c r o b i o l . 2 9 : 2 4 6 8 - 2 4 7 2 .5 . F i s s , E . , F . C h e h a b , a n d G . B r o o k s . 1 9 9 2 . DNA a m p l i f i c a t i o na n d r e v e r s e d o t b l o t h y b r i d i z a t i o n f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a -t i o n o f m y c o b a c t e r i a t o t h e s p e c i e s l e v e l i n t h e c l i n i c a l l a b o r a -t o r y . J . C l i n . M i c r o b i o l . 3 0 : 1 2 2 0 - 1 2 2 4 .6 . F l o y d , M . , V . S i l c o x , W. J o n e s , W. B u t l e r , a n d J . K i l b u r n . 1 9 9 2 .S e p a r a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m b o v i s BCG f r o m M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s a n d M y c o b a c t e r i u m b o v i s b y u s i n g h i g h - p e r f o r -m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f m y c o l i c a c i d s . J . C l i n . M i c r o -b i o l . 3 0 : 1 3 2 7 - 1 3 3 0 .7 . F r i e s , J . , R . P a t e l , W. P i e s s e n s , a n d D . W i r t h . 1 9 9 0 . G e n u s - a n ds p e c i e s - s p e c i f i c DNA p r o b e s t o i d e n t i f y m y c o b a c t e r i a u s i n g t h ep o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n . M o l . C e l l . P r o b e s . 4 : 8 7 - 1 0 5 .8 . G u b l e r , J . , M. S a l f i n g e r , a n d A . v o n G r a e v e n i t z . 1 9 9 2 . P s e u -d o e p i d e m i c o f n o n t u b e r c u l o u s m y c o b a c t e r i a d u e t o a c o n t a m i -n a t e d b r o n c h o s c o p e c l e a n i n g m a c h i n e . C h e s t 1 0 1 : 1 2 4 5 - 1 2 4 9 .9 . H a n c e , A . , B . G r a n d c h a m p , V . L e v y - F r e b a u l t , D . L e c o s s i e r , J .R a u z i e r , D . B o c a r t , a n d B . G i c q u e l . 1 9 8 9 . D e t e c t i o n a n d i d e n t i -f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a b y a m p l i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a lDNA. M o l . M i c r o b i o l . 3 : 8 4 3 - 8 4 9 .1 0 . K i r s c h n e r , P . , a n d E . B o t t g e r . 1 9 9 2 . M i c r o h e t e r o g e n e i t y w i t h i nrRNA o f M y c o b a c t e n i u m g o r d o n a e . J . C l i n . M i c r o b i o l . 3 0 : 1 0 4 9 -1 0 5 0 . ( L e t t e r . )1 1 . K u s u n o k i , S . , T . E z a k i , M. T a m e s a da , Y . H a t a n a k a , K . A s a n o ,Y . H a s h i m o t o , a n d E . Y a b u u c h i . 1 9 9 1 . A p p l i c a t i o n o f c o l o r i m e t -r i c m i c r o d i l u t i o n p l a t e h y b r i d i z a t i o n f o r r a p i d g e n e t i c i d e n t i f i c a -t i o n o f 2 2 M y c o b a c t e r i u m s p e c i e s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 9 : 1 5 9 6 -1 6 0 3 .1 2 . K w o k , S . , a n d R . H i g u s h i . 1 9 8 9 . A v o i d i n g f a l s e p o s i t i v e s w i t hP C R . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 9 : 2 3 7 - 2 3 8 .1 3 . M a r k s , J . , a n d T . S z u l g a . 1 9 6 5 . T h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o fm y c o b a c t e r i a l l i p i d s a s a n a i d t o c l a s s i f i c a t i o n ; t e c h n i c a l p r o c e -d u r e s ; M y c o b a c t e r i u m f o r t u i t u m . T u b e r c l e 4 6 : 4 0 0 - 4 1 1 .1 4 . M u s i a l , C . , L . T i c e , L . S t o c k m a n , a n d G . R o b e r t s . 1 9 8 8 . I d e n -t i f i c a t i o n o f m y c o b a c t e r i a f r o m c u l t u r e b y u s i n g t h e G e n - P r o b er a p i d d i a g n o s t i c s y s t e m f o r M y c o b a c t e n i u m a v i u m c o m p l e x a n dM y c o b a c t e n i u m t u b e r c u l o s i s c o m p l e x . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 6 :2 1 2 0 - 2 1 2 3 .1 5 . P l i k a y t i s , B . , B . P l i k a y t i s , M. Y a k r u s , W. B u t l e r , C . W o o d l e y , V .S i l c o x , a n d T . S h i n n i c L 1 9 9 2 . D i f f e r e n t i a t i o n o f s l o w l y g r o w i n gM y c o b a c t e n i u m s p e c i e s , i n c l u d i n g M y c o b a c t e n i u m t u b e r c u l o -s i s , b y g e n e a m p l i f i c a t i o n a n d r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y -m o r p h i s m a n a l y s i s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 3 0 : 1 8 1 5 - 1 8 2 2 .1 6 . R o g a l l , T . , T . F l o h r , a n d E . B o t t g e r . 1 9 9 0 . D i f f e r e n t i a t i o n o fm y c o b a c t e r i a l s p e c i e s b y d i r e c t s e q u e n c i n g o f a m p l i f i e dDNA. J . G e n . M i cr o b i o l . 1 3 6 : 1 91 5 - 1 9 2 0.1 7 . S c h i n n i c k , T . 1 9 8 7 . T h e 6 5 - k i l o d a l t o n a n t i g e n o f M y c o b a c t e n i u mt u b e r c u l o s i s . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 1 0 8 0 - 1 0 8 8 .1 8 . T s a n g , A . , I . D r u p a , M. G o l d b e r g , J . M c C l a t c h y , a n d P .B r e n n a n . 1 9 8 3 . U s e o f s e r o l o g y a n d t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h yf o r t h e a s s e m b l y o f a n a u t h e n t i c a t e d c o l l e c t i o n o f s e r o v a r sw i t h i n t h e M y c o b a c t e i i u m a v i u m - M y c o b a c t e n i u m i n t r a c e l l u -l a r e - M y c o b a c t e n u m s c r o f u l a c e u m c o m p l e x . I n t . J . S y s t . B a c -t e r i o l . 3 3 : 2 8 5 - 2 9 2 .1 9 . W a y n e , L . , a n d H . S r a m e k . 1 9 9 2 . A g e n t s o f n e w l y r e c o g n i z e d o ri n f r e q u e n t l y e n c o u n t e r e d m y c o b a c t e r i a l d i s e a s e s . C l i n . M i c r o -b i o l . R e v . 5 : 1 - 2 5 .

J . C L I N . M I C R O B I O L .