Radioimunoensaio
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Médica Veterinária MSc Maria Tereza Barreto Guedes sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e
Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
RADIOIMUNOENSAIOS (RIA)
CARACTERÍSTICAS GERAIS
• 1959 Berson e Yalow – primeiro RIA para quantificação de insulina.
• O RIA foi a primeira técnica imunológica padronizada capaz de detectar e quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas.
• Torna-se então possível determinar qualquer tipo de molécula biológica, desde que haja um receptor específico e que a molécula biológica possa ser marcada.
CARACTERÍSTICAS GERAIS
o DEFINIÇÃO
• O termo radioimunoensaio (RIA) é mais empregado em ensaios com antígenos marcados.
• O termo imunorradiométrico (IRMA) é utilizado em ensaios com anticorpos marcados.
CARACTERÍSTICAS GERAIS
• Apresenta alta sensibilidade que é conferida pela detecção radioativa.
• O RIA também apresenta elevada especificidade.
• Graças à sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no líquido biológico.
• Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor.
CARACTERÍSTICAS GERAIS
o Vantagens • Método muito sensível,
específico e de alta afinidade.
• Baixo custo.
• Requer pouca amostra.
• Rápido.
CARACTERÍSTICAS GERAISo Desvantagens• Instabilidade dos radioisótopos.
• Risco operacional.
• Necessidades de medidas
especiais.
• Elevado custo de biossegurança
e problemas com o descarte de
material.
o Alta sensibilidade → permite dosagem de substâncias não encontradas em concentrações suficientes para serem percebidas por outras técnicas.
• polipeptídios, catecolaminas, esteróides, antibióticos, hormônios tireoidianos, proteínas, vitaminas, drogas e outras.
• vírus da hepatite B.• marcador tumoral.
APLICAÇÕES
PRINCÍPIOS
Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.
PRINCÍPIO GERAL
Componentes• Anticorpo radioativo• Antígeno radioativo• Amostra a ser
testada• Leitor radiométrico
Leitor radiométrico
o 125 I • É o radioisótopo mais comumente empregado.• Meia vida de 57,5 dias.• Liga-se facilmente aos resíduos de tirosina das proteínas.• Produz radiação Υ.• Estabilidade menor que 3H.• Dosagem de hormônios protéicos.
o Trítio (3H) •Produz radiação β .• Dosagem de esteróides.
o Carbono 14
CARACTERÍSTICAS DOS MARCADORES
TIPOS DE RIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE Ag
o De competição com Ag marcado.
o De competição com Ac marcado.
o Sanduíche ou captura de Ag.
o Para detecção de IgE:
• Paper Radioimmunosorbent Test (PRIST).
• Radioallergosorbent Test (RAST).
TIPOS DE RIA
Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida.
YEm seguida, adiciona-se o antígeno marcado com 125 I.
Uma amostra de soro de um paciente suspeito é então acrescentada.
O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos.
A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade.
DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO
Y
Y
Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo específico
Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.
A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.
Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.
Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o Ag do soro.
Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade.
DE COMPETIÇÃO COM Ac MARCADO
Antígeno marcado Antígeno do soro Y Anticorpo marcado
Y
YY
Teste realizado em duas etapas:
Primeira etapa:1) Fixação de Acs não marcados na fase
sólida.
4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem para eliminação de componentes não específicos.
Segunda etapa:1) Acrescenta-se um segundo anticorpo
específico e marcado, que formará o “sanduíche”.
2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo.
SANDUÍCHE OU CAPTURA DE Ag
2) Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos).
3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra.
Antígeno do soro Y Ac marcado Y Ac não marcado Componentes não específicos
Y
YY
Y
TIPOS DE RIA PARA DETECÇÃO DE IgE
Anticorpos anti-IgE e não marcados são fixados na fase sólida.
Acrescenta-se o soro a ser pesquisado para a presença de IgE. Em caso positivo, haverá a união do anticorpo IgE + anticorpo anti-IgE.
Após lavagem para retirada do excesso de Ac não ligado, acrescenta-se anticorpos anti-IgE marcados com isótopo para que haja a revelação da amostra.Após lavagem, procede-se com a leitura. A determinação da concentração de IgE total presente na amostra ocorrerá através de cálculo que relacionará os valores obtidos com uma determinada curva padrão.
PAPER RADIOIMMUNOSORBENT TEST (PRIST)
Y Ag IgE da amostra Y Ac anti-IgE marcado Y Ac anti-IgE não marcado
YY YYY YY
YY
O alérgeno específico para o Ac IgE pesquisado é previamente fixado ao fundo do tubo na fase sólida.
Acrescenta-se soro do paciente. Havendo presença de IgE específica ao alérgeno em questão, haverá a formação do complexo Ag/Ac.
Acrescenta-se o anticorpo anti-IgE marcado, e este se liga ao Ac IgE pesquisado.
A reação então será revelada através do segundo anticorpo.
RADIOALLERGOSORBENT TEST (RAST)
YY
Alérgeno Y IgE do soro do paciente Y Ac anti-IgE marcado
YY