R FOR CLINICAL BREAST CANCER RESEARCH

R in Genomics, 20150323 Daniel Klevebring, Ph D daniel.klevebring@ki.se

1

D ATA F L O W A N D B I O I N F O R M AT I C SI N C L I N I C A L C A N C E R R E S E A R C H… A N D S O M E R S T U F F.  

2  

C L I N I C A L S E Q U E N C I N G O F C A N C E R

Most overused slide in genomics

3  

4

ClinSeq overall objectives and short term goals

Perform disease subtyping at primary diagnosis with the goal to replace and improve standard diagnostics Ensure rapid adoptions of new research findings Ensure rapid inclusion of patients in clinical trials Include first prospective cases in breast cancer and AML by Q1 2015 Develop a clinical pipeline for cancer genomics with capacity to handle 5000+ cancers yearly

Overall objectives Short term goals

ClinSeq pipeline

5

Patient value

Research opportunities !

6

ClinSeq clinical collaborations and funding

AML Breast cancer Ovarian cancer

Colorectal cancer Pancreatic cancer

–  Sören Lehmann, hematologist –  Christer Nilsson, hematologist –  Jonas Bergh, oncologist –  Johan Hartman, pathologist –  Kamila Czene, epidemiologist –  Lorand Kis, pathologist –  Jan Frisell, surgeon –  Irma Fredriksson, Surgeon

–  Henrik Falconer, surgeon –  Hanna Dahlstrand, oncologist –  Joseph Carlson, pathologist –  Anna Martling, surgeon –  Maria Gustavsson Liljefors, oncologist –  Sam Ghazi, pathologist –  Matthias Löhr, professor –  Caroline Verbeke, pathologist –  Marco Del Chiaro, surgeon

Clinical collaborations Funding

This  can  happen  within  one  pa0ent  

Tumor  Frozen  piece  (/RNALater/FFPE)  

Normal  Tissue  

Examples  •  Mul0focal  tumor  •  Contralateral  BC  •  Primary  tumor  and  local  met  (node)  •  Primary  tumor  and  recurrence  •  Primary  tumor  and  metastasis  

54  

1   2  

3  

Blood  

-Deltagarens personnummer

Å Å M M DD NNNN

- -

Fylls i av provtagare och patolog. Avläses maskinellt. Skriv tydligt.

T T M M

Å Å Å Å M M D D

L

Provtagningsdatum

KI Biobank, Institutionen för Medicinsk Epidemiologi och Biostatistik, Karolinska Institutet, Box 281, 171 77 Stockholm Tel: 08-524 823 77, ki.se/kibiobank, biobank@ki.se

tissue1 tissue2

Ref

1 2

Kontrollera identiteten, fyll i uppgifterna på remissen. Glöm ej att fylla i datum och tid för operation och för patolog-arbete.Märk 1-4 rör med streckkodsetikett. OBS! Tag rätt rör till rätt tumör.Fyll i fältet provbit med antal provbitar som tas (1-4).

Tumörpreparat:1. Tag ett skrap från tumören och skrapa av på kantens insida av ett RNAlater-rör.2. Skruva på locket och vänd röret försiktigt ca 10 ggr.3. Placera i kyl (+4 grader)

:

ClinSeq Bröst

Tissue 1 tissue1 Tag rätt etikett till rätt prov

tissue3

tissue2Tissue 2

Klockslag för provhantering påpatologen

Kommentar

Tissue 3

ClinSeq Bröst - Tumörpreparat

RemissID

Provtagares signatur

Studieinformation: Kombikakod:

Mottagande biobank: KI Biobank (reg.nr.222),Karolinska Institutet.

+

tissue4

4

ClinSeq Bröst

Tissue 4 tissue4

L

L

ClinSeq Bröst

Instruktion för provtagning:

KI BiobankRemiss för provtagning

Prov 1

Vänster Höger

00021001710

Ver: 2015-03-03, ClinSeq-Bröst_tumör

Γ

Kontaktperson:

Carin Cavalli- Björkman

tel: 08-524 867 97

Antal provbitar:

Prov 4

Prov 3

Prov 2

tissue3

3

ClinSeq Bröst

rid

Kön:Kvinna Man

Godkänt av Etikprövningsnämnden, dnr:2011/1020-32 och 2013/1833-31/2.

-Deltagarens personnummer

Å Å M M DD NNNN

- -

Fylls i av provtagaren. Avläses maskinellt. Skriv tydligt.

T T M MÅ Å Å Å M M D D

+

Provtagningsdatum

KI Biobank, Institutionen för Medicinsk Epidemiologi och Biostatistik, Karolinska Institutet, Box 281, 171 77 Stockholm Tel: 08-524 823 77, ki.se/kibiobank, biobank@ki.se

blood

1

Ref

4 mL EDTA

Instruktion för blodprovtagning Karolinska Universitetssjukhuset Solna: 1. Kontrollera identiten, fyll i uppgifterna på remissen. Glöm ej att fylla i datum och tid.

2. Märk ett rör med streckkodsetikett.

1 st. 4 mL EDTA rör, lila propp

4. Tag provet som vid vanlig venpunktion.

5. Vänd röret försiktigt ca 10 ggr.

6. Skicka provet till KI Biobank enligt vanliga rutiner.

Vid frågor kontakta Carin Cavalli- Björkman tel: 08-524 867 97

Provtagares telefonnummer

:

Clin

Seq

Brö

st

Blod blood1Placera etiketten rakt på röret.

Provtagningstid (24-timmarsklocka)

Kommentar

ClinSeq Bröst - Blodprov

Remiss för provtagningKI Biobank

RemissID

Provtagares signatur

Kombikakod:

Mottagande biobank: KI Biobank (reg.nr.222), Karolinska Institutet.

+

+

+

+

rid

Ver. 2015-03-03, ClinSeq-Bröst_blod_Karolinska Solna

Godkänt av Etikprövningsnämnden dnr:

2011/1020-32 och 2013/1833-31/2.

00021001710

Kön:Kvinna Man

Referrals  ClinSeq  Breast  

KI Biobank

Local MSSQL db

BloodRefTbl TissueRefTbl

ResultsTbl

SciLifeLab

Seq + bioinfo

MEB Firewall

Push from KI Biobank

Nightly  

cFTP  

Path Referral

Surgeon Referral Blood Referral

cFTP  

10  

Bioinformatics preprocessing

•  ≈1000 patients analyzed to date

•  15 Gb raw data / TN pair •  Analysis ≈ 100 CPUh / TN pair •  Uses accepted best practices for each data type •  Open source tools •  Based on GATK Queue •  Generation of reference files and tool-spec indices

GRCh37  aka  1000kg  aka  GATK  bundle  ref  

•  Included  chromosomes  –  GRCh37  1-­‐22  –  X  –  Y  

•  Masked  pseudoautosomal  regions  (PARs)  –  PAR1  chrY:10001-­‐2649520    ßà  chrX:60001-­‐2699520    –  PAR2  chrY:59034050-­‐59363566  ßà  chrX:154931044-­‐155260560  

•  X-­‐PARs  will  look  diploid  for  men  –  MT  -­‐  NC_012920.1    –  GL000191-­‐249  (unplaced  con0gs)  –  Decoy  sequences  (d5,  incl  NC_007605  (EBV)  )  from  

•  _p://_p.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/_p/technical/reference/phase2_reference_assembly_sequence/  

–  Source  file  that  we  use:  _p://gsapub_p-­‐anonymous@_p.broadins0tute.org/bundle/2.8/b37/human_g1k_v37_decoy.fasta.gz  

track  name='PARs'  description='PARs'  chrX  60001  2699520    chrX  154931044  155260560  chrY  10001  2649520  chrY  59034050  59363566  

Parsing  varia0on  resource  files  •  dbSNP,  Cosmic,  ClinVar,  ExAC  are  all  great  resources  •  None  of  them  follow  the  VCF4.1  spec,  which  they  all  claim  

to  do  •  The  problem:  

12  

dbSNP  VCF  

ClinVar  VCF  

Cosmic  VCF  

ExAC  VCF  

Use  these  files   to  annotate  this  file  

Sample  VCF  

"How  hard  could  this  possibly  be?"  

Issues  with  annota0ng  variants  •  Mul0alleleic  variats  

–  Mul0ple  ALT  alleles  on  a  single  VCF  line  ("T,A")  •  (1)  Some  tools  check  the  whole  ALT  string  for  iden0ty  

–  Does  "A"  equal  "A,T"  à  no  à  move  on  –  WRONG  

•  (2)  Some  tools  ignore  mul0alleleic  variants  –  Some  GATK  tools    

•  (3)  Some  tools  only  check  chr/pos  for  iden0ty,  without  regarding  REF  and  ALT  alleles  

–  Some  GATK  tools  here  as  well  

•  Solu0on:  Split  mul0allelic  variants  into  mul0ple  lines  and  avoid  tools  in  category  (2)  

–  Must  learn  how  each  tool  operates  

•  Måns  Magnusson's  vcf_parser  correctly  handles  FORMAT,  INFO  and  genotypes  when  splilng  mutliallelic  variants  

–  hmps://github.com/moonso/vcf_parser  

13  

Le_  alignment  of  indels  •  Indels  can  have  mul0ple  correct  representa0ons  •  Consensus  strategy  is  to  "le_  align"  •  GATK  Le_AlignAndTrimVariants  

–  When  splitMultiallelics  is  set  to  true,  the  INFO  field  is  not  correctly  split,  and  genotypes  are  dropped  (set  to  ./.)  

–  Breaks  if  any  indel  >  200  bps  is  found  –  Doesn't  check  that  REF  allele  matches  the  reference  

sequence  (by  default)  –  (tested  with  GATK  3.3-­‐0  –  bugs  reported,  so  can  change)  

•  bc_ools  norm  –  Requires  that  REF  matches  the  reference  sequence  –  Cosmic  has  some  variants  that  map  to  the  Y-­‐PARs,  which  has  

reference  sequence  NNNN  in  the  build  we  use  •  (Related  hmps://github.com/arq5x/gemini/issues/346  )  

14  

External  VCF  prep  pipeline  

vcfsorter.pl   vcf_parser  

sort  in  dict  order   split  mul0allelics   le_  align  

bc_ools  norm  

vcfsorter.pl  by  German  Leparc  from  hmps://code.google.com/p/vcfsorter/  

bedtools  intersect  

filter  Y-­‐PAR  variants  

Adrian  Tan  et  al,  Bioinforma0cs  (2015)  doi:  10.1093/bioinforma0cs/btv112  

Panel  

Low-­‐pass  WGS  

RNAseq  

Sharing is caring –  [Ongoing work] – We want our data to be accessible to others –  Two tiers required

•  Open access for non-personal data –  Tumor-specific alterations, gene expression levels, some

phenotypes •  Controlled access

–  Genetic data (considered personal data by Swedish law) –  Certain sensitive phenotypes

–  Let’s not reinvent the wheel - Others to this well •  ICGC

– Can we submit our data to EGA? –  Legal &| consent issues?

17

R  in  ClinSeq  

•  BioConductor  – CNANorm,  QDNAseq  for  CNV  analyses  – Rmarkdown  and  Sweave  for  report  genera0on  

•  Rstudio  – Rmarkdown/knitr  +  git  to  version  control  project  spec  analyses  

•  Hadleyverse  – ggplot2/devtools/dplyr/reshape/0dyr/data.table  

18  

Hadleyverse  

•  Use  cases:  – data.table  reduces  reading  0me  of  RNAseq  data  from  30  min  to  <2  min  

•  400  files,  each  a  matrix  of  2  x  50000  

– tidyr  and  reshape  enable  rapid    – ggplot2  makes  beau0ful  plots  with  powerful  syntax  

– magrittr  enables  piping  in  R  

19  

Bioconductor  

•  Repo  for  HT-­‐biology-­‐related  R  packages  –  Sta0s0cal  and  graphical  methods  – Genome  Annota0on  

•  bioconductor.org  •  Updated  twice  per  year  •  Focus  on  packages  with  vignemes  •  In  a  pipeline  stucture,  runnable  scripts  are  needed  –  Wouldn't  it  be  nice  if  packages  ship  with  a  #!Rscript  included?  

20  

Time  to  befriend  getopt  library(getopt)    #  set  variables  #  format  is  c(long,  short,  argmask,  datatype,  desk)  #  argmask  0=no  arg,  1=req,  2=optional  args  <-­‐  rbind(      c("bam",  "b",  1,  "character",  "Input  bam  file"),      c("output",  "o",  1,  "character",  "Output  tsv"),        c("background",  "x",  1,  "character",  "Background  set  to  use,  as  a  RData  file"))    opts  <-­‐  getopt(args)    #  opts$bam  #  opts$output  #  opts$background  

21  

getopt,  check  parameters    #check  cli  parameters  if(is.null(opts$bam)){      stop("Must  specify  input  bam  file  -­‐-­‐bam/-­‐b.")  }  if(is.null(opts$output)){      stop("Must  specify  output  tsv  file  name  -­‐-­‐segments/-­‐s.")  }  if(is.null(opts$background)){      stop("Must  specify  background  file  -­‐-­‐background/-­‐x.")  }      

22  

Write  to  file,  sense  .gz  suffix      ##  Write  to  outfile,  gzip  if  outfile  end  with  gz.  cat("Writing  outfile...\n")    ofile  <-­‐  opts$output  if(  grepl("gz$",  opts$output)  ){      ofile  <-­‐  gzfile(  opts$output,  'w'  )  }    write.table(dat,  ofile,  col.names=TRUE,  dec=".",  quote=FALSE,  sep="\t",  row.names=FALSE)    if(  grepl("gz$",  opts$output)  ){      close(ofile)  }      

23  

oncoprints  in  R  

24  

Premy  print  matricies  of  genomics  data  As  seen  on  cbioportal.org  hmps://github.com/dakl/oncoprint  

oncoprints  in  R  library(devtools)  install_github("dakl/oncoprint")  library(oncoprint)    data(tcga_brca)    #  load  example  data    #  vertical  x-­‐labels  vert_x  <-­‐  theme(axis.text.x  =  element_text(angle  =  90,  hjust  =  1,  vjust=.5))    oncoprint(tcga_brca)  +  coord_fixed()  +  vert_x  

25  

Questions?

26  

daniel.klevebring@ki.se