QUALITA ’ E SICUREZZA DEGLI ALIMENTI · la crescita dei lieviti incrementando la velocitàdi...
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QUALITAQUALITA’’ E SICUREZZA E SICUREZZA DEGLI ALIMENTIDEGLI ALIMENTI
Prof. DANILA MOSCONEProf. DANILA MOSCONEChimica Chimica AnaliticaAnaliticaDip. Dip. didi ScienzeScienze e e TecnologieTecnologie ChimicheChimiche
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ALIMENTIALIMENTI
Si definiscono alimenti i prodotti commestibili che l’uomo deve assumere per assicurare, insieme con la respirazione, il normale svolgimento delle funzioni fisiologiche dell’organismo.L’assunzione di alimenti risponde ad uno dei bisogni elementari di ogni essere vivente, compreso l’uomo.
Ai consumatori devono essere offerti alimenti di
ALTA QUALITA’ e SICURI.
Ai consumatori devono essere offerti alimenti di
ALTA QUALITA’ e SICURI.
La catena di produzione alimentare diviene sempre piùcomplessa ed ogni singolo anello della catena deve essere
altrettanto forte per salvaguardare la salute dei consumatori. Ciò indipendentemente se l’alimento è prodotto
in loco oppure importato da paesi terzi.
“from field to fork”
Il principio guida deve essere:
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Lo studio degli alimenti può essere condotto tenendo presenti quattro aspetti fondamentali:
� chimico generale (chimica dei principi alimentari: proteine, carboidrati, lipidi, vitamine)
� analitico (chimica analitica applicata all’esame degli alimenti)
� tecnologico (descrizione dei processi di preparazione, trattamento e conservazione dei prodotti alimentari)
� chimico-igienico (contaminazione chimica degli alimenti)
ALIMENTIALIMENTI
Aspetto
Odore SaporeNon si può contare solo su questi parametri per sapere se un alimento è sicuro e di qualità!
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Cosa significa“Alta Qualità dell’Alimento?”
Qualità
Nutrizi
onali
Sicurezza Chimica
PesticidiMetalli pesanti Micotossineetc
Sicurezza
Sicurezza Microbiologica
+
Stima di malattie di origine alimentare Stima di malattie di origine alimentare negli Stati Uniti ogni annonegli Stati Uniti ogni anno
76 milioni di personesi ammalano
76 milioni di personesi ammalano
5,000 personemuoiono!
5,000 personemuoiono!
Sono stati identificati più di 250 tipi diversi di malattie a trasmissione alimentare.
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Anche un piccolo assaggio non ci mette al sicuro….
Solo 10 batteri possono causare alcune malattie di origine alimentare!
Mal di stomaco Diarrea
Febbre
Disidratazione(a volte severa)OOPS!
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Condizioni gravi meno comuni, Condizioni gravi meno comuni, ma possibilima possibili
ParalisiMorte
Meningite
Persone con un elevato rischio per Persone con un elevato rischio per malattie a trasmissione alimentaremalattie a trasmissione alimentare
Donne in attesaDonne in attesa Bambini ed anziani
persone con sistema immunitario indebolito e persone con alcune malattie croniche
persone con sistema immunitario indebolito e persone con alcune malattie croniche
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CostoCosto delledelle malattiemalattie a a trasmissione alimentaretrasmissione alimentare
• 10 - 83 miliardi di $ ciascun anno
• Costi specifici:Spese mediche Azioni legaliAffari persi
Cosa proponiamo noi?
Nuovi metodi di analisi della qualità e salubrità degli alimenti tramite l’utilizzo
di biosensoribiosensori
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CHE COSCHE COS’’EE’’ UN BIOSENSORE?UN BIOSENSORE?
Un biosensorebiosensore è un strumento analitico in cui èpresente un elemento biologico strettamente connessoo integrato con un trasduttore di segnale.
Quali sono glielementielementi biologicibiologici?
I I pipiùù diversidiversi…………
•Enzimi•Anticorpi•DNA•Batteri•Fettine di tessutoanimale o vegetale•……
Che cos’è un trasduttore di segnale?
Sensore: : un un dispositivodispositivo cheche converteconverte unaunaforma forma didi energiaenergia in in unun’’altraaltra, cioè chetrasforma una grandezza fisica che sivuole misurare in un segnale di naturadiversa (tipicamente elettrico) piùfacilmente misurabile o memorizzabile.
•sensori di luce (o sensori ottici): fotocellule, tubi fotoelettrici •sensori di calore: calorimetri.•sensori di radiazione: contatori Geiger.•sensori di corrente elettrica: galvanometri, amperometri.
AnalitaAnalitaComponente Componente biologicobiologico
TrasduttoreTrasduttoredi segnaledi segnale Registratore Registratore
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Cosa hanno in comune?
Analita/biorecettore/trasduttore/processore di segnale
Biosensore
Piccole molecole/membrana olfattiva/cellule nervose/cervello
Luce Visibile /bastoncelli e coni/ cellule nervose/cervello
Naso
Occhi
AnalitiAnaliti
• piccole molecoleglucosio, alcool, CO, CO2, agenti nervini, urea, pesticidi, aspirina, paracetamolo, penicillina, TNT,colesterolo, amminoacidi
• bio-macromolecoleDNA, RNA, enzimi, proteine, ormoni, virus
• batteriantrace, E. coli, Salmonella
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Interazioni Biologiche
• Interazioni deboli, non-covalenti• Spontanee (self-assembly)• Altamente specifiche (differenze anchedi un singolo atomo)• Complementare (chiave/serratura)
RecettoriRecettori BiologiciBiologici
Enzima Anticorpo Acido Nucleico
Cristalli PiezoelettriciCristalli PiezoelettriciGenerano correnti elettriche grazie alla vibrazione diquarzi quando piccole quantità di analiti si legano a recettori biologici immobilizzati.
Promettenti per interazioni anticorpo/antigene, DNA
Trasduttore di segnale
••Fibre OtticheFibre OtticheSempre più usate grazie allo sviluppo di fibre che possono trasportare fotoni a siti remoti.
Assorbimento, reflettanza, fluorescenza, scattering, chemiluminescenza, etc.
Quantum dots (cristalli semiconduttori di dimensioni nanometriche).
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Trasduttore di segnale
• SensoriSensori elettrochimicielettrochimici ((elettrodielettrodi))Amperometrico: Il più comunemente usato in reazioni enzimatiche cheimplicano ossidasi e riduttasi. Glucosio ossidasi, Colesterolo ossidasi, etc.
Potenziometrico: reazioni che implicano variazioni significative di pH Es. penicillinasi, ureasi.
• MisuratoreMisuratore TermicoTermicoFormazione/rottura di legami chimici in reazioni enzimatiche che provocano variazionidi entalpia.
Inoltre, variazioni di calore di soluzionespecialmente con formazione di specie cariche(p. es. protoni).
Tipicamente possono essere misurate ≈≈≈≈millesimi di °K di variazione di temperatura.
Esempi di biosensoriEsempi di biosensori
Strumento per la misura del Glucosio nel sangue
(per pazienti diabetici)
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Il Padre dei Biosensori
Professor Leland C Clark Jnr1918–2005
Enzima Glucosio Ossidasi….+
Trasduttoreelettrochimico…
STRUMENTO
ELETTRODO +ENZIMA = biosensore
CAMPIONE
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Acido Gluconico
Ossigeno
GlucosioOssidasi
Glucosio
AcquaAcqua ossigenataossigenata
ElettrodiElettrodi StampatiStampati
1 cm
Produzione di massa
Basso costo
Monouso
Piccoli volumi di campione
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Esempi di biosensoriEsempi di biosensori
ANTRACEANTRACE
’Biosensore’ per CO dei vecchi minatori di
carbone
test di gravidanzaMisura l’ormone hCG nelle urine.
BIACOREBIACORE
Applicazioni in analisi degli alimentiApplicazioni in analisi degli alimenti:
ComposizioneComposizione
Analisi Sensoriale
Determinazione dei Patogeni
Carboidrati, vitamine, acidi organici,
Pesticidi, antibiotici, tossine, Pesticidi, antibiotici, tossine, ormoniormoni
Freschezza dei pesciMaturazione del formaggioControllo del confezionamentoControllo della cottura
Salmonella spp. Clostridium botulinum E. coli
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ANALIZZATORE BIOCHIMICO YSI 2700 SELECTANALIZZATORE BIOCHIMICO YSI 2700 SELECT
CARATTERISTICHE TECNICHE : Ammontare di campione : da 5 a 65 microlitri. Tempo di Risposta: circa 90 secondi
APPLICAZIONIDestrosio SaccarosioDestrosio in patate Destrosio e Saccarosio in latte concentrato Lattate nella carne Etanolo in birra e vini Lattosio in formaggi Glutammati in brodi Colina in mangimi Destrosio e Saccarosio in gelati
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SENZYTEC 1 è un analizzatore in gradodi determinare diversianaliti negli alimenti, come zuccheri, acidi, etanolo; è sufficientescegliere l’appropriatosensore usa e getta, inserirlo nella sondaed aggiungere pochegocce di campione per una rapida misura
ANALISI DEL VINOANALISI DEL VINO
• Glucosio• Zuccheri (glucosio + fruttosio) • Etanolo• L-Malico• L-Lattico• D-Lattico• Fruttosio• Saccarosio• Polifenoli
•Glucosio•Zuccheri (Glucosio + Fruttosio) •Etanolo
ANALISI DELLA FRUTTAANALISI DELLA FRUTTA
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Valutazione dello stato di Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescafreschezza dei prodotti della pesca
dove ATP, ADP, AMP = dove ATP, ADP, AMP = adenosinaadenosina trifosfatotrifosfato, , adenosinaadenosina difosfatodifosfato, , adenosinaadenosina monofosfatomonofosfato
IMP, HXR = inosina IMP, HXR = inosina monofosfatomonofosfato, inosina, inosina
HX, X, U = ipoxantina, xantina, acido uricoHX, X, U = ipoxantina, xantina, acido urico
Indicatore di freschezzaIndicatore di freschezza: : la degradazione dei nucleotidi, nel muscolo di pesce la degradazione dei nucleotidi, nel muscolo di pesce
Dopo la morte del pesce:Dopo la morte del pesce:
ATP ATP �������� ADP ADP �������� AMPAMP �������� IMP IMP �������� HXR HXR �������� HX HX �������� X X �������� U U
DEGRADAZIONE
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PoichPoichéé l'ATP, ADP ed AMP scompaiono circa 24 ore l'ATP, ADP ed AMP scompaiono circa 24 ore dopo la morte, per potere valutare la freschezza del dopo la morte, per potere valutare la freschezza del pesce, pesce, èè stato introdotto un parametro Kstato introdotto un parametro K11 basato sulla basato sulla degradazione dei rimanenti composti, che può essere degradazione dei rimanenti composti, che può essere
definito come segue:definito come segue:
KK11 = (HXR + HX) / (IMP + HXR + HX) * 100= (HXR + HX) / (IMP + HXR + HX) * 100
AllAll’’aumentare del Kaumentare del K1 1 diminuisce il grado di diminuisce il grado di freschezza del pesce:freschezza del pesce:
KK11 <<<<<<<< 2020 èè molto fresco, molto fresco,
20 20 <<<<<<<< KK11 <<<<<<<< 4040 deve essere cucinato,deve essere cucinato,
KK1 1 >>>>>>>> 4040 non non èè consigliabile per consigliabile per ll’’alimentazione umana.alimentazione umana.
E' quindi possibile stimare la freschezza del pesce E' quindi possibile stimare la freschezza del pesce misurando soltanto misurando soltanto tre tre dei sei metaboliti.dei sei metaboliti.
Le reazioni enzimatiche coinvolte nella degradazione Le reazioni enzimatiche coinvolte nella degradazione dell'IMP ad acido urico sono le seguenti:dell'IMP ad acido urico sono le seguenti:
IMP IMP ---- NTNT------>> HXR + PiHXR + Pi
HXR + Pi HXR + Pi ---- NPNP ------> HX + ribosio> HX + ribosio--11--fosfatofosfato
HX + 2OHX + 2O22---- XOXO ------> UA + 2H> UA + 2H22OO22
Dove Dove NT, NP, XONT, NP, XO e Pi rappresentano rispettivamente la e Pi rappresentano rispettivamente la 55’’--nucleotidasinucleotidasi, , lala nucleoside fosforilasi, nucleoside fosforilasi, lala xantina xantina ossidasiossidasi ed il fosfato.ed il fosfato.
Valutazione dello stato di freschezza Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescadei prodotti della pesca
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Valutazione dello stato di freschezza dei Valutazione dello stato di freschezza dei prodotti della pescaprodotti della pesca
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8
giorni
K%
18°C 4° C
4°C con ghiaccio Scong. dopo 30d a -20°C
Scong. dopo 90d a -80°C
0
2
4
6
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10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Punti
Trote iridee conservate in differenti condizioni di temperaturaTrote iridee conservate in differenti condizioni di temperatura ::
T = ambiente, 4oC, 4 oC con ghiaccio
-20 oC per 1 mese, poi scongelate e mantenute a 4oC
-80 oC per 3 mesi, poi scongelate e mantenute a 4oC
A A T ambienteT ambiente la conducibilitla conducibilitààelettrica elettrica scende al di sotto di scende al di sotto di 1010 gigiàà alal primo primo giornogiorno
A A 4 4 ooCC la conducibilitla conducibilitààelettrica elettrica scende al di sotto di scende al di sotto di 1010 dopo dopo il terzoil terzo giornogiorno
A A 4 4 ooCC con ghiacciocon ghiaccio la la conducibilitconducibilitàà elettricaelettrica scende scende al di sotto di 10al di sotto di 10 dopo il dopo il 5 5 giornogiorno
Per i pesci Per i pesci congelati non si congelati non si èèosservata conducibilitosservata conducibilitààelettrica elettrica
Monitoraggio della fermentazione alcolica in relazione a diverse tecniche
di vinificazione in rosso
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Torrevento (BA)140 Q di uve“Montepulciano” e “Troia”in botti d’acciaio rotanti
•volume����300 e 150 Hl•SO2���� 5 g/Hl•yeast S.cerevisiae����25g/Hl•T ����17-30°C
Di Majo Norante (CB)400 Q di “Montepulciano d’Abruzzo” in fermentoreverticale termocondizionato
volume ���� 270 Hl •SO2 ���� 4 g/Hl•yeast S.cerevisiae ���� 20 g/Hl•T���� 21 - 28 °C
Solopaca (BN)650 Q di “Aglianico”fermentato in un fermentoreverticale
•volume���� 800 Hl •SO2 ���� 5 g/Hl•yeast S.cerevisiae����20 g/Hl•T ���� 26-38 °C
MONITORAGGIO DI METABOLITI MONITORAGGIO DI METABOLITI DETERMINANTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICADETERMINANTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA
Applicazione in enopolio di biosensori elettrochimici (FIA) per il dosaggio di glucosio, fruttosio, glicerolo ed etanolo durante la fermentazione alcolica al fine di controllarne il decorso ed eventuali anomalie.
�Glucosio+ O2 GOD→ acido gluconico +H2O2
�Fruttosio + 2 PMS+FDH→ chetofruttosio + 2 PMSHPMSH----->2 PMS+ + 2e
�Etanolo + O2 AO→ acetaldeide +H2O2
�Glicerolo + ATP (Mg2+) GK→ glicerolo-3-p + ADP
Glicerolo-3-p +O2 + H2O GPO→ glicerone-3-p+H2O2
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Azienda viti-vinicola Di Majo Norante(CB)
capacità���� 270 Hl cicli di innaffiatura a pioggia del cappello ���� 3’/4hSO2 ���� 4 g/Hllieviti S.cerevisiae ���� 20 g/Hltemperatura ���� 21 - 28 °C
400 Q.li di uve “Montepulciano d’Abruzzo” divise in due partite da 200 Q.li e vinificate in fermentatori verticali termocondizionati:
La fermentazione alcolica termina prima nella tesi “triplice delestage” (65 ore)rispetto alla tesi “duplice delestage”(75 ore) e presenta una fase “lag” minore
�
Il delestageaggiuntivo a 20 ore dall’inizio ha favorito la crescita dei lieviti incrementando la velocità di fermentazione
�
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
g/L
0
2
4
6
8
10
12
14
% v
ol
glucosiofruttosioetanolo
Delestage
Delestage
Svinatura
Tempo (ore)
Tesi “duplice delestage”
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
g/L
0
2
4
6
8
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14
% v
ol
glucosiofruttosioetanoloDelestage
Delestage
Delestage
Svinatura
Tesi “triplice delestage”
25
0
20
40
60
80
100
120
140
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
Tempo (ore)
g/L
0
2
4
6
8
10
12
14
% v
olglucosio
fruttosioetanoloSvinatura
Tesi “rimontaggi” (ogni 2 ore)
���� Fase “lag” breve (rapido adattamento dei lieviti al mezzo) e difficoltà a consumare completamente il fruttosio
���� L’elevata temperatura raggiunta (38°C), in sinergia con l’effetto tossico dell’etanolo, può aver modificato, nei lieviti, la funzionalità dei sistemi di trasporto di membrana degli zuccheri
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
g/L
0
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% v
ol
Delastage
Delastage
Etanolo
Glicerolo
Di Majo N.-Tesi “duplice delestage”
0
1
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3
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5
6
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (ore)
g/L
0
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%vo
l
Delestage
Svinatura
Glicerolo
Etanolo
Torrevento-Tesi “unico delestage”
Rapido incremento della concentrazione di gliceroloed etanolo e della velocità di fermentazione subito dopo l’operazione di svuotamento
�
Il fenomeno è attribuito all’accumulo dei due alcoli nella cellula durante la fase di stress anaerobico ed al loro rilascio nel mezzo in seguito alla ripresa della funzionalitàdella membrana dovuta alla ossigenazione spinta
�
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Cosa significa“Alta Qualità dell’Alimento?”
Qualità
Nutrizi
onali
Sicurezza Chimica
PesticidiMetalli pesanti Micotossineetc
Sicurezza
Sicurezza Microbiologica
+
acqua
Pesticidi derrate alimentari
Concentrazioni ammissibili in (µµµµg/L) delle sostanze tossiche nelle acque di uso potabile
Parametro Concentrazione massima ammissibile
Antiparassitari 0.1
per componenti totali 0.5
Idrocarburi policiclici aromatici 0.2
Cianuri 50
Arsenico 10
Cadmio 5
Mercurio 1
Piombo 50
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BIOSENSORE PER LA MISURA DI PESTICIDI
Biosensore:
--enzima Acetilcolinesterasienzima Acetilcolinesterasi
AcetiltiocolinaAcetiltiocolina + H+ H22OO Tiocolina + acido aceticoTiocolina + acido aceticoAChEAChE
elettroattivaelettroattiva
SPE
MISURAMISURA
Tampone + substratoStep 1Step 1
misura dell’attività enzimaticaprima dell’esposizione alpesticida (i0)
3 Steps � Step 1: misura dell’attivitàenzimatica iniziale (i0)
� Step 2: inibizione
�Step 3: misura dell’attivitàenzimatica residua (ii)
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tempo diincubazione lavaggio
Step 2Step 2
Soluzione con Pesticida
Step 3Step 3Tampone + substrato
misura dell’attività enzimaticadopo dell’esposizione al
pesticida (ii)
I%=[( iI%=[( i00--iiii)/i)/i00]]••100100
STUDIO DEL DESTINO DEI PESTICIDI DURANTE LA FERMENTAZIONE ALCOLICA
Paraoxon
Aldicarb
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DeterminazioneDeterminazione del del PiomboPiombonelnel lattelatte
• Acqua potabile 10 µg/l
• Aria 0.5 µg/m3
• Alimenti 0,02-1 mg/Kg
Latte = 0.02 mg/kgLatte = 0.02 mg/kg
Massimo Massimo livellolivello ammissibileammissibile
(Dir. 92/46/CEE)(Dir. 92/46/CEE)
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ICP-MSASSORBIMENTO ATOMICO
Il Il PiomboPiombo sisi misuramisura ……....
Strumento ElettrochimicoStrumento Elettrochimico
SPE Sensor
32
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4
10
20
30
40
Potential (V)
Cu
rren
t
1 – STEP di PRE-CONCENTRAZIONE
Il Pb2+ è ridotto a Pb° e accumulato sulla superficie del sensore su cui èstato depositato un film di bismuto
2 – STEP di STRIPPING
Il Pb viene ridisciolto riossidandolo e si osserva un picco la cui altezza èproporzionale alla concentrazione del Pb nel latte
Analisi Analisi didi StrippingStripping
METODO UFFICIALE AOAC DI METODO UFFICIALE AOAC DI TRATTAMENTO DEL LATTETRATTAMENTO DEL LATTE
PROBLEMI: METODO LUNGO E TEMPERATURE MOLTO ALTEPROBLEMI: METODO LUNGO E TEMPERATURE MOLTO ALTE
���� Seccare i campioni per tutta la notte a 120 120 °°CC
���� Collocare il campione in forno a 250 250 °°CC ed aumentare lentamente la temperatura a 350 350 °°CC fino a quando cessano i fumi prodotti
���� Aumentare la temperatura lentamente a 500500°°CCLasciar incenerire per tutta la notte a 500500°°CC
Se la cenere è grigia invece che bianca: HNO3 + 3 h di forno
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Precipitazione delle ProteinePrecipitazione delle Proteine
Trattamento del LATTETrattamento del LATTE
latte
Acidi
1. Addizione di H2O2 e Sonicazioneper 30 min
2. Addizione di HClO4 e Sonicazioneper 15 min
3. Addizione di HCl e Centrifugazionea 48000g per 10 min
4. Filtrazione del supernatante
5. Diluzione 1:4
6. Filtrato a pH 2
TEMPO TOTALE = 1 h
Sviluppo di un programma Sviluppo di un programma ad hocad hoc
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10 ppb
20 ppb
10 ppb
20 ppb
milk
milk
Procedura di misuraProcedura di misura
REAZIONE ENZIMATICAS
P
SEGNALE ELETTROCHIMICO
Y Y Y
Y Y Y
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TRICOTECENI TIPO-A ED AFLATOSSINA B1
Fusarium
Tricotecene di tipo-A
TT--2 HT2 HT--22
TDI*:0.06 µg/kg: T-2 + HT-2
Livello MassimoCirca 200 ppb
25-50 ppb (baby food)* t-TDI: Temporary-Tolerable Daily Intake
Aspergillus
Aflatossina B1
O
O
O
OO
OMe
AFBAFB11
Livello Massimo
2 ppb – Maize, cereal, etc.
5 ppb – Unprocessed food
MISURA AFLATOSSINA B1
Trattamento del campione
Misura elettrochimica
500 µl di AFB1 o PBS
25.0 g di grano macinato + 2.5 g di NaCl
Estrazione per 3 min ad alta velocitàdi agitazione con 50 ml dimetanolo/acqua (80/20)
Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min
Diluzione 1:5 v/v in PBS
Centrifugazione a 6000 rpm per 10 min
AFB1 (ng mL-1)
0.1 1 10 100
Cur
rent
(µA
)
0
1
2
3
4
curva standard in PBS
MisuraMisura AFBAFB11 nelnel solventesolvente didi estrazioneestrazione
AFB1 in estratti di grano
EC50 = 1.2 ng/mlLOD = 0.2 ng/mlWR = 0.2 - 5 ng/ml
TEMPO TOTALE DI ANALISITEMPO TOTALE DI ANALISI(incluso trattamento)(incluso trattamento)MENO di 25 min!!!MENO di 25 min!!!
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Analisi di BATTERI PATOGENI Analisi di BATTERI PATOGENI neglineglialimentialimenti
Salmonella, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus and E. coli sono considerati la maggiorcausa di tossinfezioni alimentari nei paesiindustrializzati.
I metodi colturali standard richiedono fino a 5-6 giorniper dare un risultato.
Metodo colturale standard per la Metodo colturale standard per la SalmonellaSalmonella
(ISO 6579:2002)(ISO 6579:2002)
•••• Pre-arricchimento per permettere la riattivazione e la multiplicazione delle cellule danneggiate;
•••• Arricchimento Selettivo per aumentare il rapporto tra il batterio in esame e i microrganismi competitori;
•••• Isolamento su agar selettivo delle colonie caratteristiche;
•Conferma tramite tests biochimici e sierologici.
Tempo: fino a 5 giorniTempo: fino a 5 giorni
Il nostro obiettivo è stato lo sviluppo di immunosistemi elettrochimici semplici e rapidi per la misura specifica della Salmonella.
Secondo la legislazione Europea, la Salmonella deve essere assentein 25g di prodotto alimentare.
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MISURA
magneteElettrodoElettrodo
Screen Printed Screen Printed
Immunosensore Elettrochemico
Principio di misura
HRP
-
salmonella
IMB
anti-mouse IgG
MAb
PAB
S . E n te r itid is
1 .e + 3 1 .e + 4 1 .e + 5 1 .e + 6 1 .e + 7 1 .e + 8 1 .e + 9
Cor
rent
e (µ
A)
4
8
1 2
1 6
2 0
Salmonella
LOD = 3 x 10LOD = 3 x 1033 CFU/mlCFU/ml
CURVA DI CALIBRAZIONE USANDO LE MBsCURVA DI CALIBRAZIONE USANDO LE MBs
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Pre-enrichment Time (h)0 2 4 6 8 10 12
Cur
rent
(µµ µµA
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18PORK
TURKEY
0 2 4 6 8 10 120
5
10
15
20
25
Pre-enrichment Time (h)
Cur
rent
(µµ µµA
)
BEEF
Pre-enrichment Time (h)0 2 4 6 8 10 12
Cur
rent
(µµ µµA
)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
CHICKEN
0 2 4 6 8 10 120
5
10
15
20
Pre-enrichment Time (h)
Cur
rent
(µµ µµA
)
Il tempo minimo di pre-arricchimento è risultato variabile, probabilmente a causa della presenza di microrganismi competitori naturalmente contenuti nei campioni di carne. Tuttavia un massimo di 6h di pre-arricchimento è stato sufficiente per rivelare la presenza di salmonella in tutti i casi.
▲ Campioni sperimentalmente contaminati (1-10 cell/25g)
● Campioni non-contaminati (negativi al test microbiologico)
CAMPIONI SPERIMENTALMENTE CONTAMINATICAMPIONI SPERIMENTALMENTE CONTAMINATI
Samples ELIME PCRCultural Method Agglutination
method
pork - - -
pork - - -
pork + + + S. infantis
turkey - - -
chicken - - -
chicken + + + S. Enteritidis
chicken - - -
beef - - -
beef - - -
beef + + +S. Anatum
Analisi dei campioni di carne non sperimentalmente contaminati con metodo elettrochimico, PCR e metodo colturale classico
10 campioni di carne non sperimentalmente contaminati sono stati analizzati e solo tre di questi campioni sono risultati positivi per Salmonella con il metodo classico culturale, la PCR (dopo 5 ore di pre-arricchimento) ed il metodo elettrochimico
(dopo 6 ore di pre-arricchimento).
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Il gruppo:Prof. G. PalleschiProf. D. MosconeDr G. VolpeDr L. MicheliDr F. RicciDr F. Arduini Dr F. ValentiniDr S. Piermarini Visiting Prof. A.Amine
B.E.A.T. B.E.A.T. BioElettroAnaliticaBioElettroAnalitica ““Tor VergataTor Vergata””
www.uniroma2.it/dipartim/BEATwww.uniroma2.it/dipartim/BEAT
Dr J. Calvo QuintanaDr D. NeaguDr V. BiagiottiDr D. RomanazzoDr G. AdornettoDr F. CaprioDr F. Dell’UntoDr A. De StefanoDr D. MigliorelliDr A. PorchettaDr U. Sozzo
…gli studenti in tesi…