QCM

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  • FACULTE DE MEDECINEFACULTE DE MEDECINE

    PIERRE & MARIE CURIEPIERRE & MARIE CURIE

    PCEM1

    1. Protines

    CAHIER D'EXERCICESde BIOCHIMIE

    2005-2006EDITE PAR LES ENSEIGNANTS DE BIOCHIMIE

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 2

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    CAHIER D'EXERCICES POUR PCEM1

    BIOCHIMIE

    I . P R O T E I N E S

    S O M M A I R E

    Page

    1. Techniques d'tude des protines . . . . . . . . 3

    2. Fonctions des protines. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    3. Structure des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

    4. Enzymologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

    4.1 Gnralits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134.2 Enzyme Michalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144.3 Enzyme Allostrique . . . . . . . . . . . . . . . . 164.4 Problme de rvision . . . . . . . . . . . . . 17

    5. QCM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

    6. Annales du concours . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

    Image de couverture :Structure d'un cristal de BRCA2, une protine dficiente dans des formes hrditaires decancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org)

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 3

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    1. TECHNIQUES DETUDE DES PROTEINES

    1.1 Le volume ncessaire llution (Vel) dune protine sur une colonne de gel filtration estfonction inverse du poids molculaire(Mr). La courbe dtalonnage ci-dessous est trace partir des rsultats reports dans le tableau:

    Protine Mr Vel (ml))

    bleu de dextran* 106 85

    lysosyme 14 000 200

    chymotrypsinogne 25 000 190

    ovalbumine 45 000 170

    srum albumine 65 000 150

    aldolase 150 000 125

    urase 500 000 90

    X ? 130

    * le bleu dextran est un polymre de haut PM

    a. Expliquer lordre dlution des protines.b. Evaluer le PM de la protine inconnue X.

    1.2 Une protine tudie par gel filtration dans un tampon aqueux pH7 prsente un poidsmolculaire apparent de 160.000 daltons. Si cette protine est soumise unelectrophorse sur gel en prsence de SDS la rvlation montre 2 bandescorrespondant des poids molculaires apparents de 50000 et 30000. Expliquer ces rsultats.

    1.3 Expliquer et commenter ces affirmations.a. Les protines sont trs peu solubles leur point isolectrique (pHi).b. Pour une valeur de pH suprieure son pHi une protine est charge ngativement etpour une valeur de pH infrieure son pHi une protine est charge positivement.

    1.4 Une solution contenant de lalbumine (pHi= 4,6), de la -lactoglobuline (pHi = 5,2) et duchymotrypsinogne (pHi= 9,5) est charge sur une colonne de DEAE cellulose pH 5,4.(Le DEAE est une molcule charge positivement)

    La colonne est lue par un gradient de NaCl de concentration croissante. Proposer un ordre dlution de la colonne pour ces protines.

    1.5 Soit une protine oligomrique dun poids molculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sastructure quaternaire est tudie par la dtermination des poids molculaires lissue dedivers traitements :a. Traitement par le mercaptothanol 0,1M : donne uniquement des structuresprotiques dun PM de 120 000 D.b. Traitement par lure 4M : donne uniquement des structures protiques dun PM de 80000 D.c. Traitement par le mercaptothanol 0,1M et lure 4M : donne uniquement desstructures protiques dun PM de 40 000 D.

    Quels sont les effets des diffrents traitements ? Quelle est la structure quaternaire de cette protine ?

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 4

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    1.6 On se propose de purifier, partir de srum humain, une protine liant avec une forteaffinit une hormone strode, la testostrone: la TEBG ou testosterone estradiol bindingglobulin. Comme elle lie galement lestradiol, hormone strode oestrognique, cetteprotine est appele aussi SBP (sex steroid binding protein).Ces proprits sont utilises pour suivre les diffrentes tapes de la purification de laprotine. Aprs incubation du srum avec de la testostrone radioactive qui joue le rle detraceur, on suit le complexe protine srique-testostrone radioactive.Ces tapes sont rsumes ci-dessous:

    a. Prcipitation au sulfate dammonium 50% de saturation.

    b. Solubilisation du prcipit suivie de dialyse contre un tampon phosphate 20 mM, pH 6,NaCl 50 mM.

    c. Chromatographie sur rsine changeuse danions; diverses protines, dont le complexeTEBG-testostrone radioactive, sont lues par diminution progressive du pH jusqu 5.

    d. La fraction radioactive est dpose sur une colonne de chromatographie par filtration surgel de Sephadex G100 et lue par un tampon phosphate 20 mM, pH 7, NaCl 150 mM.Nous rapportons le profil dlution sur le schma ci-dessous (D.O = densit optique 280nm; R.A. = radioactivit; dps = dsintgration par seconde ou becquerel). La colonne deSephadex G100 a t pralablement calibre avec 4 protines de masses molculairesconnues dont les volumes dlution respectifs sont indiqus par les flches.

    e. La puret de la fraction radioactiveest vrifie par une lectrophorse en gelde polyacrylamide aprs coloration par lebleu de Coomassie(figure A); le gel estensuite dcoup afin de pouvoir quantifierla radioactivit correspondant la bandecolore (figure B).

    1.6.1- Donner le principe de chaque tape de purification.

    1.6.2- Daprs les rsultats obtenus au cours des tapes c et d, que pouvez-vousdduire sur le pHi et la masse molculaire de la protine(utiliser la feuille semi-logarithmique ci-aprs)?

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 5

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    1.6.3- Interprtez les rsultats obtenus en e.

    1.6.4- Citer une technique de purification de la TEBG, en tenant compte de sesproprits biologiques de liaison.

    f. La protine purifie est ensuitecaractrise par filtration sur gel selonle protocole suivant et aprstalonnage par des protines demasse molculaire connue:1- dpt simple (fig.4A)2- traitement par lure 8M (fig.4B)3- traitement par lure 8M et

    mercaptothanol (fig.4B)

    1.6.5- Que pouvez-vous dduire sur lastructure quaternaire de cetteprotine?

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 6

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    1.7 Electrophorse bidimensionnelleOn veut sparer 5 protines de 390 acides amins (Wt, A, B, C, D) :soit une protine sauvage (Wt) et 4 protines mutantes qui diffrent entre elles par unepermutation d'un aa pour les 4 premires et la perte des 50 aa C-terminaux pour ladernire. Les modifications sont les suivantes :

    Potine Wt Mutation

    Mutant A aa charg ngativement

    (rsidu acide)

    aa apolaire

    (rsidu sans charge)

    Mutant B aa charg ngativement

    (rsidu acide)

    aa charg positivement

    (rsidu basique)

    Mutant C aa apolaire

    (rsidu sans charge)

    aa apolaire avec deux rsidus CH3 de plus

    Mutant D suppression des 50aa C-terminaux

    Expliquer les modifications (ou non) de migration de ces protines sur unelectrophorse bidimensionnelle.

    Montrer sur un schma les positions respectives des protines A, B, C, D et Wt. Si une ou plusieurs protines ne sont pas spares par cette technique, comment

    peut-on les sparer?

    2. FONCTIONS DES PROTEINES

    2.1 Transport d'O2Lorsque vous courrez, votre organisme ragit pour bien oxygner vos muscles.a. Quelles protines sont mises en jeu et dans quel compartiment de lorganisme?b. Comment expliquez le transfert dO2 des poumons vers les muscles?c. Selon les diffrentes classifications des protines, comment ces protines seront-elles

    dfinies?d. Les acides amins de ces protines sont-ils mis directement en jeu pour fixer lO2?Justifiere. Du CO dgag par un pole mal rgl peut vous asphyxier en privant toutes vos cellules de

    lapport dO2Pourquoi?

    2.2 Mcanisme de fixation de O2a. A saturation, la myoglobine fixe 1 molcule dO2 alors que lhmoglobine (Hb) fixe 4

    molcules dO2.En quoi ces 2 protines ont-elles une structure diffrente? Dcrivez-les.

    b. La constante daffinit de lHb pour la 1re molcule d'O2 est plus faible que la constantedaffinit pour la seconde molcule dO2, elle mme plus faible pour la 3

    me etc.... Comment nomme-t-on ce phnomne? Comment lexplique-t-on au niveau molculaire?

    c. En altitude il y a adaptation de lorganisme par diminution de laffinit de Hb pour ledioxygne en quelques joursPourquoi?

  • Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protine / 7

    Facult de Mdecine Pierre & Marie Curie

    2.3 Hmoglobinea. Pourquoi les chanes et de lhmoglobine sont-elles capables de sassocier alors que les

    chanes de myoglobine ne le font pas?b. A haute altitude, la concentration en DPG (2,3-diphospho glycerate) augmente de 50%

    (aprs 2 jours 4000 m). Pourquoi?c. Par quel mcanisme loxyhmoglobine est elle capable de librer plus de dioxygne dans les

    tissus mtabolisme rapide?

    2.4 Comparaison de lhmoglobine ftale etmaternelle.

    a. Soient les courbes ci-contre de saturation en O2 delhmoglobine ftale et maternelle.Dans les conditions physiologiques, quelle estlhmoglobine qui a la plus forte affinit pour O2?

    b. Quelle est la signification physiologique de cesdiffrences daffinit pour lO2?

    c . Quand on supprime tout le 2,3diphosphoglycrate (DPG) li, les courbes sedplacent vers la gauche, supprimant la diffrenceentre les 2 hmoglobines. Quel est leffet du DPG sur laffinit des Hbpour lO2 ?

    Comment expliquer leffet plus important sur lHbA ?

    2.5 La migration d'un anticorps monoclonal (issu du mme clone de plasmocytes) enlectrophorse sur gel de polyacrylamide conduit une seule bande. Aprs tratement parle -mercapto-thanol, 2 bandes apparaissent Quelle caractristique structurale de ces a