Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas Lucas...

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Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas ucas Brandão FRPE
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  • Q-TOF Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqenciamento de Protenas Lucas Brando UFRPE
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  • Espectrmetro de Massa
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  • Existem diversas plataformas para anlise em espectrometria de massa Vrias configuraes possveis. A primeira pergunta Qual a diferena principal nos resultados entre os q-TOF para outras plataformas?
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  • Concluso Q-TOF muito mais sensvel e com um poder de resoluo muito maior MAIOR Sensibilidade Resoluo acurcia
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  • Quadropole-Time of Flight Devido as vantagens do espectro de TOF ele utilizado como analisador Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o on parente (precursores) de interesse Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, so gravados com um TDC (time-to-digital converter) Q-TOF pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS
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  • Segunda pergunta: O que pode influenciar no resultado final de um q- TOF? Ionizao positiva Ionizao negativa TCD (time-to-digital converter)
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  • Perguntas que se deve fazer Amostra: como ser processada? Qual a procedncia? Ionizao: Positiva ou negativa? ESI ou MALDI? MAIOR Sensibilidade Resoluo acurcia
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  • Tipos de dados O principal tipo de dado que um espectrmetro de massas produz um Espectro de massa Espectro de massa Cromatograma de massa selected ion monitoring (SIM), total ion current (TIC), selected reaction monitoring chromatogram (SRM)
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  • Espectro de Massa MS m/z Intensidade
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  • Resoluo de Massa Definio: como a separao de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurcia M1 = 2,0157 M2 = 1,9793
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  • Resoluo de Massa Quanto mais estreito o pico, maior a resoluo e maior a preciso em determinar m/z Full width at half maximum Definio: como a separao de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurcia
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  • M1 = 2,0157 M2 = 1,9793 M1-M2 = 0.0364 Resoluo = (286/0.0364) = 7857 Resoluo de Massa
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  • Comparao entre alta e baixa resoluo Baixa resoluo: Um nico pico BAIXA RESOLUO: Amostra com contaminantes mas apenas um nico pico ALTA RESOLUO: Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos
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  • Seqenciamento de Protenas
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  • Overview
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  • Q-TOF Duas possibilidades Modo MSModo MS/MS
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  • Resultados em MS mode Produz um mapa peptdico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint) A protena foi tripsinizada e depois analisada pela MS, sem a necessidade de ocorrer a separao (filtro) de ons Se a protena j existe ele ser encontrada no banco de dados.
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  • Resultados em MS/MS mode Caso da caracterizao pelo peptide map, no seja suficiente para determinar a protena, Pode ser realizada a separao, fragmentao dos ons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.
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  • Modo MS/MS Para fazer esta analise necessrio realizar a seleo do on precursor Visto que o volume de dados impossibilita a aquisio de todos os ons num nico espectro de massa Tomar a deciso de qual on precursor deve ser selecionado
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  • Critrios Intensidade Status da carga m/z Depois que ocorre a seleo do on precursor, o modo MS/MS automaticamente ligado Aps um determinado perodo ou at que que um certo critrio seja preenchido o sistema retorna ao modo MS E permanece nesse modo (MS) at que outro on precursor seja novamente selecionado
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  • Seleo e fragmentao
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  • Ou seja... Uma corrida Dura 70mim 350 espectros de massa (TOF) Muitos picos: solventes, contaminantes e ons de peptdeos.
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  • De novo seqenciamento O Papel da cmera de coliso
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  • Seqenciamento de Protenas Para seqenciar peptdeos necessrio realizar a sua fragmentao Podem existir 3 tipos de quebras de ligaes diferentes NH-CH, CH-CO, e a ligao CO-NH Cada fragmentao da origem a duas espcies Uma neutra E outra carregada
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  • A fragmentao acontece de maneira randmica e no seqencial Alm disso, algumas fragmentaes so preferidas em relao a outras Por isso se encontra sinais de intensidades diferentes
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  • Fragmentao peptdica e nomenclatura ons b = no amino terminal y = no carboxil terminal A questo que a fragmentao peptidica no acontece de forma sequencial
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  • ons b ons y
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  • Os ons b e y so utilizados para fazer o seqenciamentos de um peptdeo.
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  • OUTRO EXEMPLO
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  • O Que fazer? 1- Olhar para os imunoons menores: Provaveis a.a. Presentes no peptdeo. 2 olhar para o on precursor:
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  • OBRIGADO PELA ATENO [email protected]