Q-TOF

Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry

ResultadosSeqüenciamento de Proteínas

Lucas BrandãoUFRPE

Espectrômetro de Massa

• Existem diversas plataformas para análise em espectrometria de massa– Várias configurações possíveis.

• A primeira pergunta– Qual a diferença principal nos resultados entre os

q-TOF para outras plataformas?

Conclusão

• Q-TOF é muito mais sensível e com um poder de resolução muito maior

• MAIOR– Sensibilidade– Resolução– acurácia

Quadropole-Time of Flight

• Devido as vantagens do espectro de TOF ele é utilizado como analisador

• Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o íon parente (precursores) de interesse

Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, são gravados com um TDC (time-to-digital converter)

Q-TOF pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS

• Segunda pergunta:– O que pode influenciar no resultado final de um q-

TOF?

Ionização positivaIonização negativa TCD (time-to-digital converter)

Perguntas que se deve fazer

• Amostra:– como será processada?– Qual a procedência?

• Ionização:– Positiva ou negativa?– ESI ou MALDI? MAIOR

SensibilidadeResoluçãoacurácia

Tipos de dados

• O principal tipo de dado que um espectrômetro de massas produz é um– Espectro de massa

Espectro de massa

Cromatograma de massa

• selected ion monitoring (SIM),• total ion current (TIC), • selected reaction monitoring chromatogram (SRM)

Espectro de MassaMS

m/z

Intensidade

Resolução de MassaDefinição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa.

Sendo diretamente proporcional a acurácia

M1 = 2,0157 M2 = 1,9793

Resolução de Massa

Quanto mais estreito o pico, maior é a resolução e maior a precisão em determinar m/z

Full width at half maximum

Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia

M1 = 2,0157M2 = 1,9793M1-M2 = 0.0364

Resolução = (286/0.0364) = 7857

Resolução de Massa

Comparação entre alta e baixa resolução

Baixa resolução:Um único pico

BAIXA RESOLUÇÃO:Amostra com contaminantes mas apenas um único pico

ALTA RESOLUÇÃO:Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos

Seqüenciamento de Proteínas

Overview

Q-TOF

Duas possibilidades

Modo MS Modo MS/MS

Resultados em MS mode

• Produz um mapa peptídico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint)– A proteína foi tripsinizada e depois analisada pela MS,

sem a necessidade de ocorrer a separação (filtro) de íons

– Se a proteína já existe ele será encontrada no banco de dados.

Resultados em MS/MS mode

• Caso da caracterização pelo peptide map, não seja suficiente para determinar a proteína,

• Pode ser realizada a separação, fragmentação dos íons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.

Modo MS/MS

• Para fazer esta analise é necessário realizar a seleção do íon precursor– Visto que o volume de dados impossibilita a

aquisição de todos os íons num único espectro de massa

– Tomar a decisão de qual íon precursor deve ser selecionado

Critérios

• Intensidade• Status da carga• m/z

Depois que ocorre a seleção do íon precursor, o modo MS/MS é automaticamente ligado

Após um determinado período ou até que que um certo critério seja preenchido o sistema retorna ao modo MS

E permanece nesse modo (MS) até que outro íon precursor seja novamente selecionado

Seleção e fragmentação

Ou seja...

• Uma corrida– Dura 70mim– 350 espectros de massa (TOF)• Muitos picos: solventes, contaminantes e íons de

peptídeos.

“De novo” seqüenciamento

O Papel da câmera de colisão

Seqüenciamento de Proteínas

• Para seqüenciar peptídeos é necessário realizar a sua fragmentação– Podem existir 3 tipos de quebras de ligações

diferentes• NH-CH, CH-CO, e a ligação CO-NH

– Cada fragmentação da origem a duas espécies• Uma neutra• E outra carregada

• A fragmentação acontece de maneira randômica e não seqüencial

• Além disso, algumas fragmentações são “preferidas” em relação a outras– Por isso se encontra sinais de intensidades

diferentes

Fragmentação peptídica e nomenclatura

Íons• b = no amino terminal• y = no carboxil terminal A questão é que a fragmentação peptidica não

acontece de forma sequencial

Íons b Íons y

Os íons b e y são utilizados para fazer o seqüenciamentos de um peptídeo.

OUTRO EXEMPLO

O Que fazer?

1- Olhar para os imunoíons menores:Provaveis a.a. Presentes no peptídeo.

2 – olhar para o íon precursor:

OBRIGADO PELA ATENÇÃOlucabrand@gmail.com