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Juan Carlos Rodríguez DíazS. Microbiología
Hospital General Universitario de [email protected]
PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS EMPLEADAS
EN LA PRACTICA CLINICA II
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Métodos diagnósticos
SerologíaSe basa en al detección de anticuerpos del paciente mediante ensayos in vitro
Métodos:Aglutinación
IFI: Inmunofluorescencia indirecta
EIA: Enzimoinmunoensayo
Western Blot
Tipos de inmunoglobulinasIg G: Se mantiene positiva toda la vida del paciente (puede cuantificarse)
IgM. Sólo se mantiene positiva en la fase aguda de la enfermedad (semanas o meses)
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Métodos diagnósticos
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Métodos diagnósticos
Detección por reacción en cadena de la polimerasaSirve para detectar la presencia de los virus
1.- Separación de las cadenas
2.- Unión de los cebadores y la diana
3.- La Taq polimerasa genera de una nueva cadena
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HerpesvirusVirus herpes 1, 2, 6 y 8– Detección del virus por PCRVirus Epstein Barr– Mononucleosis infecciosa:
• Paul Bunnell: Antígenos no específicos• Detección de IgM frente al VCA (Virus capside antigen)
– Reactivaciones en inmunodeprimidos• Detección del virus por PCR
Varicella-zoster– Varicella: IgM– Zoster: PCR de las lesiones
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HerpesvirusCitomegalovirus
– Infección en inmunodeprimidos: • Cuantificación del los virus en sangre
• Detección de antígenos en leucocitos del paciente: Técnica en desuso; sustituida por PCR en sangre
– Enfermedad en inmunodeprimidos: • Detección de virus por PCR en diferentes muestras
– Mononucleosis infecciosa en inmunocompetentes: Ig M
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Papilomavirus
Genotipos
– Hay más de 100 diferentes. Se asocian a:• Genotipos de bajo riesgo: Patologías benignas: verrugas genitales o no genitales
• Genotipos de alto riesgo: Contribuyen a la generación de procesos cancerígenos: cuello de útero, faringe, etc.
Clasificación• Alto riesgo: 16, 18, 31, etc
• Bajo riesgo: 6, 8, etc
Diagnóstico– Detección y genotipado del virus por PCR
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Hepatitis AMarcadores serológicos
� Ig M: Aparece en la infección aguda y se mantiene 3-6 meses, por lo que es el que se emplea en el diagnóstico. Se detecta mediante ELISA
� Ig G: Indica contacto previo con el virus. Sólo útil en estudios de prevacunación y seroprevalencia. Se detecta mediante ELISA
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Marcadores serológicos. Hepatitis A
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Hepatitis B. Marcadores serológicos
HBsAg HBeAg AntiHBc (IgM)
AntiHBc AntiHBs AntiHBe
H. Aguda
+ + + + - -
H. Curada
- - - + + +
H. Crónica
+ + -/+ + - -
Portador + - - + - +
Pre-core + - - + - +
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Hepatitis B. Marcadores serológicos
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Hepatitis B. Marcadores serológicos
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Hepatitis C. Diagnóstico
� Técnica de cribado: Detección de anticuerpos totales mediante ELISA
� Los anticuerpos aparecen 4-6 semanas postinfección, pero en algunos casos pueden retrasarse meses.
� Todos los resultados positivos deben ser confirmados
� Pruebas confirmatorias: Inmunoblot o PCR
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Hepatitis C. Genotipado
� El genotipo del virus influye en la respuesta al tratamiento (1b es el que peor responde)
� Se realiza mediante una amplificación por PCR del fragmento variable y por hibridación posterior con sondas fijadas en un papel de celulosa (LIPA)
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Hepatitis C. Genotipado
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Hepatitis D. Marcadores serológicos
� Solo se debe buscar este agente si existe presencia de HBsAg en suero del paciente (hepatitis B aguda, portador o hepatitis crónica)
� Se detecta mediante la busqueda de anticuerpos totales mediante ELISA
� Mediante PCR se detecta la presencia de virus en suero
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Pruebas diagnósticas de cribado
� Detecta conjuntamente Ac y Ag frente al HIV-1, HIV-2 y subgrupo 0
� Generalmente mediante detección de anticuerpos en suero mediante ELISA
� Pruebas de EIA (enzimo-inmunoensayo) de membrana: Pruebas rápidas
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Pruebas diagnósticas de confirmación
� Todos los sueros positivos deben ser confirmadas por Western Blot
� Las proteínas del virus se separan en una tira de nitrocelulosa (incluye proteinas del HIV_1 y HIV-2).
Se considera un suero positivo si hay anticuerpos frente a dos de las tres proteínas más importantes del virus (gp160, gp120, gp41)
� Si no cumplen los criterios, se llama WB indeterminado
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Western Blot
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Otros virus RNA
� Rubéola
� Detección de IgM
� PCR del virus en líquido amniotico en infecciones congénitas
� Sarampion:
� Detección de IgM
� PCR del virus en orina o exudado nasofaringeo
� Parotiditis
� Detección de IgM
� PCR del virus en saliva
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Virus respiratorio sincitial (VRS) y metaneumovirus
� Clínica� Infección de vía respiratorias inferiores y superiores
� Bronquiolitis en neonatos
� Diagnóstico� Detección de antígenos en muestras respiratorias
� PCR en muestras respiratorias
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Virus de la gripe
� Caracteristicas principales� Producida por los virus influenza A y B
� Infección viral estacional
� Las pandemias son producidas por influenza A
� Subtipos antigénicos� Pueden tener diferentes tipos de hemaglutinina (H1, H2, H3, …) y de neuraminidasa (N1, N2, N3, …)
� Se nombran indicando las dos proteinas: H1N1, H3N2.
� Diagnóstico� Detección de antígeno específico de A ó B (poco sensible)
� PCR múltiple en muestras respiratorias para detectar:� Gen común a todas las cepas de gripe
� Gen común a todas las cepas de gripe A
� Gen específico de cada subtipo
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Enterovirus
� Virus incluidos� Coxsackie
� Echovirus
� Enterovirus
� Clínica� Manifestaciones neurológicas
� Meningitis (la mayor parte de las meningitis de la infancia)
� Encefalitis y mielitis (poliomielitis like)
� Manifestaciones cutáneas
� Miopericarditis
� Conjuntivitis aguda hemorrágica
� Manifestaciones gastrointestinales
• DiagnósticoPCR y cultivo viral
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Virus productores de gastroenteritis
� Virus� Rotavirus
� Adenovirus
� Calicivirus: norovirus y sapovirus
� Astrovirus
� Torovirus
� Virus Aichi (kobuvirus)
� Diagnóstico� Detección de antígenos de rotavirus, adenovirus y astrovirus
� PCR y microscopia electrónica
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JUAN CARLOS RODRÍGUEZS. MICROBIOLOGÍAHOSPITAL GENERAL
UNIVERSITARIO DE ELCHE
Diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por
micobacterias
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Mycobacterium
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Características de los microorganismos del género Mycobacterium
�Bacilos aerobios curvados�No se tiñen por la coloración de Gram�Tienen ácidos micólicos en la pared, por lo que son ácido-alcohol resistentes
�Crecimiento lento (tiempo de generación entre 2 y 20 horas) y medios especiales
�El género incluye más de 60 especies, algunas patógenas y otras saprófitas
�Necesitan tratamientos especiales y no responden a los antibióticos habituales
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Características de los microorganismos del género Mycobacterium
�No crecen en los medios de cultivo habitualmente utilizados en los laboratorios de Microbiología. ¡¡Hay que solicitar expresamente su aislamiento!!
�Mediante la tinción de Gram no se visualizan, ¡hay que hacer tinciones especiales!
� Los cultivos tardan semanas
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Mycobacterium tuberculosis
�Hay que diferenciar entre:�Infección tuberculosa o tuberculosis latente: Nuestro sistema inmune ha estado en contacto con el microorganismo pero el paciente no ha sufrido ninguna alteración clínica
�Enfermedad tuberculosa: El paciente presenta signos y síntomas de tuberculosis
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Infección tuberculosa
El Mantoux presenta reacciones cruzadas con:
�Vacunación�Otras micobacterias no tuberculosas
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Alternativas al Mantoux
� IGRAs (Interferon gamma release assay):Quantiferon y T-spot.
�Se basa en que dos proteínas de M. tuberculosis(ESAT-6 y CFP-10) estimulan al sistema inmune e inducen una fuerte producción de IFN-gamma por las células CD4
�Estos antígenos están ausentes en la cepa vacunal y en la mauoria de las micobacterias no tuberculosas
�Excepto M. kansasii, M. marinum y M. szulgai
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Muestras a procesar en función de la localización de la infección
� Pulmonar: 3 muestras de esputo de calidad o muestras invasivas
� Linfática: Punción del ganglio � Pleural: Líquido o biopsia pleural� Genitourinaria: 3 muestras de orina de tres días (más de 25 ml)
� Ósea: Material quirúrgico� TB Miliar: Muestras respiratorias, orina, sangre, LCR y otras muestras
� Meningea: LCR� Infección diseminada por M. avium: Muestras respiratorias, sangre, heces y médula ósea
� Muestras de piel y tejidos blandos:Biopsia o punción, con incubación de los cultivos a 30ºC (M. marinum)
� Sospecha de M. genavense: Incluir medios líquidos
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Muestras pulmonares invasivas
� También pueden utilizarse muestras invasivas:�Aspirado bronquial (BAS)�Lavado broncoalveolar (BAL)�Cepillado bronquial�Biopsia transbronquial�Aspirado transtraqueal�Biopsia pulmonar, obtenida quirúrgicamente
� Los esputos obtenidos en los días siguientes a estos procedimientos son muy rentables
� Los aspirados gástricos deben procesarse o neutralizarse rápidamente con carbonato cálcico para neutralizar el ácido clorhídrido estomacal
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Tinción
�Se basa en demostrar la existencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en la muestra
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Tinción
� La tinción de Ziehl Neelsen utiliza fuschina y azul de metileno y se observa a 1000 aumentos en microscopio óptico
� La tinción de auramina se observa a 200 aumentos en microscopio de fluorescencia
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Tinción
� La sensibilidad en muestras respiratorias es de 50-75% dependiendo de:�Calidad de la muestra�Tipo de lesión del paciente
� La sensibilidad en muestras extrarespiratorias es mucho más baja, dependiendo del tipo de muestra
� Las dos tinciones tienen rentabilidad semejante
�No diferencia las especies del género
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Cultivo
� Puede hacerse en medios sólidos o líquidos
� Se incuban 2 meses, aunque suelen ser positivos entre 2 y 4 semanas. El rango de crecimiento está entre 2 días y 8 semanas.
� Se incuban a 37ºC salvo algunas excepciones (biopsias cutáneas con sospecha de infección por M. marinum)
� Los medios sólidos se leen cada semana, mientras que los líquidos tienen lectura diaria automatizada
Siempre hay que hacer cultivo porque mejora� Sensibilidad: Detecta casos con tinción negativa� Especificidad: Permite identificar las micobacterias no tuberculosas� Permite estudiar la sensibilidad de la cepa mediante el antibiograma
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Colonias de Mycobacterium
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Nuevos métodos diagnósticos
� Basados en la reacción en la cadena de la polimerasa (PCR)
Más útiles en:�Muestras con pocas bacterias, como las extrapulmonares�Muestras pulmonares con tinción negativa �Aumentar la rapidez diagnóstica�Complemento de los medios líquidos�Permite detectar simultaneamente algunas resistencias antibióticas
� Un resultado negativo no descarta la infecciónaunque tienen buena sensibilidad
� No sustituye a los métodos tradicionales