PRUEBAS DE PRUEBAS DE LABORATORIO LABORATORIO

PARA PROTEINAS, PARA PROTEINAS, CARBOHIDRATOSCARBOHIDRATOS

REACCIONES DE PROTEINAS Y REACCIONES DE PROTEINAS Y AMINOACIDOSAMINOACIDOS

Aunque todas las proteínas están compuestas de aminoácidos Aunque todas las proteínas están compuestas de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico, estas moléculas muestran unidos mediante enlace peptídico, estas moléculas muestran entre ellas variaciones muy marcadas en sus propiedades entre ellas variaciones muy marcadas en sus propiedades biológicas, físicas y químicas. biológicas, físicas y químicas.

Esto se debe en última instancia a que cada proteína guarda Esto se debe en última instancia a que cada proteína guarda una composición y secuencia de aminoácidos específica y una composición y secuencia de aminoácidos específica y precisa, que es lo que se c conoce como estructura primaria.precisa, que es lo que se c conoce como estructura primaria.

La estructura primaria de una proteína se refiere al tipo, La estructura primaria de una proteína se refiere al tipo, cantidad y secuencia de los aminoácidos que la conforman.cantidad y secuencia de los aminoácidos que la conforman.

De este modo la proteína refleja las propiedades De este modo la proteína refleja las propiedades de los aminoácidos que la componen, pero de los aminoácidos que la componen, pero muestra nuevas propiedades características. En muestra nuevas propiedades características. En la naturaleza existen 200 tipos de aminoácidos, la naturaleza existen 200 tipos de aminoácidos, de los cuales sólo 21 forman parte de las de los cuales sólo 21 forman parte de las proteínas en general. De ellos, 10 son los proteínas en general. De ellos, 10 son los llamados esenciales y que deben ingerirse en llamados esenciales y que deben ingerirse en la dieta humana y son: la dieta humana y son:

Fenilalanina, Triptófano, Lisina, Valina, Fenilalanina, Triptófano, Lisina, Valina, Treonina, Metionina, Leucina, Isoleucina, Treonina, Metionina, Leucina, Isoleucina, Arginina e Histidina, Arginina e Histidina,

los dos últimos esenciales solo en infantes.los dos últimos esenciales solo en infantes.

TÉCNICAS COLORIDAS DE TÉCNICAS COLORIDAS DE IDENTIFICACIÓN DE IDENTIFICACIÓN DE

AMINOÁCIDOSAMINOÁCIDOS

Las reacciones coloridas de identificación de Las reacciones coloridas de identificación de aminoácidos resultan útiles para ensayos a la aminoácidos resultan útiles para ensayos a la gota y determinación cualitativa, pero para gota y determinación cualitativa, pero para determinaciones mas precisas y cuantitativas determinaciones mas precisas y cuantitativas se utilizan métodos cromatográficos.se utilizan métodos cromatográficos.

Reacción de Biuret (Reacción de Reacción de Biuret (Reacción de Piotrowsky).Piotrowsky).

El ión cobre puede formar enlaces covalentes El ión cobre puede formar enlaces covalentes coordinados con los grupos amino de las proteínas, coordinados con los grupos amino de las proteínas, formando un complejo de color violeta. Para formar formando un complejo de color violeta. Para formar el complejo se requieren al menos 2 grupos amino, el complejo se requieren al menos 2 grupos amino, unidos mediante enlace peptídico, por lo que la unidos mediante enlace peptídico, por lo que la reacción sólo es positiva para péptidos o proteínas y reacción sólo es positiva para péptidos o proteínas y no para aminoácidos solos. La sustancia más simple no para aminoácidos solos. La sustancia más simple que posee la estructura referida es el Biuret: NHque posee la estructura referida es el Biuret: NH22 – –

CO – NH – CO – NHCO – NH – CO – NH22 y de ahí el nombre de la y de ahí el nombre de la

reacción.reacción.

El complejo formado de color violeta El complejo formado de color violeta se ilustra a continuación:se ilustra a continuación:

Reacción de Lowry..Reacción de Lowry..

Es un método muy usado para la cuantificación de Es un método muy usado para la cuantificación de proteínas. La reacción se lleva a cabo en dos pasos:proteínas. La reacción se lleva a cabo en dos pasos:

el cobre reacciona con las proteínas en medio el cobre reacciona con las proteínas en medio alcalino formando un complejo violeta.alcalino formando un complejo violeta.

El complejo es capaz de reducir el reactivo Folín-El complejo es capaz de reducir el reactivo Folín-Cicalteau (Ac. Fosfomolíbdico - Ac. Cicalteau (Ac. Fosfomolíbdico - Ac. Fosfotungstínico), formando otro complejo azul Fosfotungstínico), formando otro complejo azul cuya estructura se desconoce. Esta reacción es 100 cuya estructura se desconoce. Esta reacción es 100 veces más sensible que la de Biuret en la veces más sensible que la de Biuret en la cuantificación de proteínascuantificación de proteínas

Reacción de NinhidrinaReacción de Ninhidrina

Es una reacción general para compuestos con grupos Es una reacción general para compuestos con grupos amino, descubierta por Ruheman en 1910, por lo que amino, descubierta por Ruheman en 1910, por lo que se usa comúnmente para determinar la presencia de se usa comúnmente para determinar la presencia de aminoácidos y proteínas. Es una reacción con alta aminoácidos y proteínas. Es una reacción con alta sensibilidad; detecta una parte de alanita en 500,00 sensibilidad; detecta una parte de alanita en 500,00 partes de agua.partes de agua.

La ninhidrina (triceto hidrinina) reacciona con los α-La ninhidrina (triceto hidrinina) reacciona con los α-aminoácidos para descarboxilarlos y producir un aminoácidos para descarboxilarlos y producir un compuesto púrpura violeta, CO2, agua y el aldehído compuesto púrpura violeta, CO2, agua y el aldehído correspondiente.correspondiente.

DICETOHIDRINDILIDENDICETOHIDRINDAMINA O AZUL DE RUHEMANEl color varia de acuerdo al tipo de aminoácido. La reacción puede hacerse cuantitativa.

Reacción XantoprotéicaReacción Xantoprotéica

Salkowsky encontró en 1888 que los Salkowsky encontró en 1888 que los aminoácidos con anillo aromático pueden aminoácidos con anillo aromático pueden nitrarse con HNOnitrarse con HNO33 concentrado, dando como concentrado, dando como

resultado un compuesto amarillo que en resultado un compuesto amarillo que en solución alcalina se vuelve anaranjado. solución alcalina se vuelve anaranjado. Triptófano Y Tirosina reaccionan rápidamente, Triptófano Y Tirosina reaccionan rápidamente, pero Fenilalanina lo hace mas lento, por lo que pero Fenilalanina lo hace mas lento, por lo que es necesario adicionar Hes necesario adicionar H22SOSO44 concentrado al concentrado al

reactivo para activar el anillo.reactivo para activar el anillo.

Reacción de EhrlichReacción de Ehrlich

El ácido sulfianílico diazotizado se condensa El ácido sulfianílico diazotizado se condensa con los anillos fenólico de tirosina e imidazol con los anillos fenólico de tirosina e imidazol de histidina para dar complejos coloridos. Con de histidina para dar complejos coloridos. Con histidina se forma un compuesto rojo cereza, y histidina se forma un compuesto rojo cereza, y que permite detectar compuestos formados se que permite detectar compuestos formados se conocen como azo-compuestos.conocen como azo-compuestos.

Reacción de Hopkins-Cole.Reacción de Hopkins-Cole.

El anillo indol de dos moléculas triptófano en El anillo indol de dos moléculas triptófano en solución de Hsolución de H22SOSO44 concentrado, reaccionan concentrado, reaccionan

con varios aldehídos para dar compuestos con varios aldehídos para dar compuestos coloridos. Esta reacción emplea ácido coloridos. Esta reacción emplea ácido glioxílico como reactivo. El color púrpura que glioxílico como reactivo. El color púrpura que se produce se debe a la condensación del se produce se debe a la condensación del anillo indol con el aldehído. Se propone la anillo indol con el aldehído. Se propone la siguiente reacción:siguiente reacción:

Reacción para azufre de cisteína y Reacción para azufre de cisteína y cistina.cistina.

La cisteína y la cistina cuando se tratan de álcalis La cisteína y la cistina cuando se tratan de álcalis fuertes pueden formar Hfuertes pueden formar H22S que se detecta al S que se detecta al hacerlo reaccionar con Pb formando un hacerlo reaccionar con Pb formando un precipitado negro de PbS.precipitado negro de PbS.

Este es uno de los R de las cadenas de Este es uno de los R de las cadenas de proteínas más importantes de determinar, pues proteínas más importantes de determinar, pues el –SH cumple un papel determinante en la el –SH cumple un papel determinante en la conformación de las proteínas y en su conformación de las proteínas y en su actividad biológica.actividad biológica.

SALTING-OUT Y DESNATURALIZACION SALTING-OUT Y DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINASDE LAS PROTEINAS

Las proteínas son compuestos biológicos constituidos Las proteínas son compuestos biológicos constituidos en su mayoría por aminoácidos unidos en forma en su mayoría por aminoácidos unidos en forma lineal, por enlaces peptídicos.lineal, por enlaces peptídicos.

Su peso molecular puede variar desde 6000 hasta varios Su peso molecular puede variar desde 6000 hasta varios millones; pudiendo ser fibrosas como la fibroína de la millones; pudiendo ser fibrosas como la fibroína de la seda o globulares como la globulina.seda o globulares como la globulina.

Esta forma básica esta determinada por las uniones Esta forma básica esta determinada por las uniones peptídicas entre cada par de aminoácidos en una peptídicas entre cada par de aminoácidos en una secuencia específica.secuencia específica.

La ovoalbumina es el componente mayor de los huevos La ovoalbumina es el componente mayor de los huevos de las aves (64%). Es una proteína globular compacta de las aves (64%). Es una proteína globular compacta de PM 45000, y tiene amplias aplicaciones en el de PM 45000, y tiene amplias aplicaciones en el laboratorio y en la industria, de ahí la importancia de laboratorio y en la industria, de ahí la importancia de su purificación.su purificación.

Hay aproximadamente 20 aminoácidos estructurando a Hay aproximadamente 20 aminoácidos estructurando a las proteínas, siendo una de las características las proteínas, siendo una de las características primordiales de éstos, su carácter anfotérico, esto es, primordiales de éstos, su carácter anfotérico, esto es, que en soluciones acuosas pueden existir como iones que en soluciones acuosas pueden existir como iones polares llamados SWITTERIONES.polares llamados SWITTERIONES.

Los cuales en presencia de un ácido actúan como bases Los cuales en presencia de un ácido actúan como bases y en presencia de una base actúan como ácidos.y en presencia de una base actúan como ácidos.

En estas circunstancias, las moléculas tienden a agregarse y a En estas circunstancias, las moléculas tienden a agregarse y a ser menos solubles, esta característica debe ser utilizada para ser menos solubles, esta característica debe ser utilizada para le separación de algunas proteínas, con la caseína, la cual es le separación de algunas proteínas, con la caseína, la cual es muy soluble en su pI. A uno y otro lado del pI la molécula muy soluble en su pI. A uno y otro lado del pI la molécula tendrá una carga neta positiva o negativa, por lo que estas tendrá una carga neta positiva o negativa, por lo que estas moléculas se repelen unas a otras minimizando la tendencia a moléculas se repelen unas a otras minimizando la tendencia a la agregación y precipitación.la agregación y precipitación.

La carga neta de las proteínas se ve influenciada además por el La carga neta de las proteínas se ve influenciada además por el pH, por su interacción con el solvente, formando puentes de pH, por su interacción con el solvente, formando puentes de hidrógeno con otros iones en solución, ya que las cargas hidrógeno con otros iones en solución, ya que las cargas positivas o negativas de la proteína atraerán a iones de carga positivas o negativas de la proteína atraerán a iones de carga opuesta, formando una atmósfera iónica que produzca un opuesta, formando una atmósfera iónica que produzca un enmascaramiento de las cargas de la proteína; esto conduce a enmascaramiento de las cargas de la proteína; esto conduce a la repulsión de otras moléculas de proteínas a baja la repulsión de otras moléculas de proteínas a baja concentración de sales. concentración de sales.

Y el pI variará en valor dependiendo de la naturaleza de dichos Y el pI variará en valor dependiendo de la naturaleza de dichos iones en solución. Para muchas proteínas el efecto de otros iones en solución. Para muchas proteínas el efecto de otros iones puede no ser grande, sin embargo, para algunas, como la iones puede no ser grande, sin embargo, para algunas, como la albúmina, el pI variará fuertemente con cambios en la albúmina, el pI variará fuertemente con cambios en la composición iónica de la solución. composición iónica de la solución.

Por lo tanto el verdadero punto isoeléctrico de una proteína es Por lo tanto el verdadero punto isoeléctrico de una proteína es aquel pH en el que el efecto de todos los iones es mínimo cero. aquel pH en el que el efecto de todos los iones es mínimo cero. A este pH se le denomina como isoiónico.A este pH se le denomina como isoiónico.

Cuando los enlaces inter o intracadena se rompen, la Cuando los enlaces inter o intracadena se rompen, la proteína sufre una serie de modificaciones en su proteína sufre una serie de modificaciones en su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, dando estructura secundaria, terciaria y cuaternaria, dando lugar a una proteína desnaturalizada con propiedades lugar a una proteína desnaturalizada con propiedades diferentes a la proteína nativa.diferentes a la proteína nativa.

Desnaturalización: cualquier cambio en la estructura de Desnaturalización: cualquier cambio en la estructura de lala

Proteína nativa que no se rompe las uniones peptídicas.Proteína nativa que no se rompe las uniones peptídicas.

La desnaturalización puede ser producida por: calor, pH La desnaturalización puede ser producida por: calor, pH extremos, agitación, rayos X, agentes oxidantes o extremos, agitación, rayos X, agentes oxidantes o reductores, solventes orgánicos, metales pesados, reductores, solventes orgánicos, metales pesados, algunas sales iónicas y vibraciones ultrasónicasalgunas sales iónicas y vibraciones ultrasónicas

Los criterios experimentales utilizados para Los criterios experimentales utilizados para medir la extensión de la desnaturalización medir la extensión de la desnaturalización

son:son: Disminución de la solubilidadDisminución de la solubilidad Incremento en la reactividad de grupos residuales Incremento en la reactividad de grupos residuales

de la cadena peptídicade la cadena peptídica Perdida de la actividad biológicaPerdida de la actividad biológica Modificaciones en la forma o tamaño que producen Modificaciones en la forma o tamaño que producen

a cambios en la viscosidad y coeficiente de a cambios en la viscosidad y coeficiente de sedimentación.sedimentación.

Cambios en su espectro de absorción de Cambios en su espectro de absorción de fluorescencia.fluorescencia.

Cambios en la dispersión de la rotación óptica.Cambios en la dispersión de la rotación óptica.

Efecto salting-outEfecto salting-out

En general la solubilidad de una proteína se incrementa En general la solubilidad de una proteína se incrementa por la presencia de sales neutras de baja fuerza iónica, por la presencia de sales neutras de baja fuerza iónica, efecto conocido como “salting-in”. Mientras que las efecto conocido como “salting-in”. Mientras que las sales neutras con alta fuerza iónica disminuyen su sales neutras con alta fuerza iónica disminuyen su solubilidad, efecto denominado “salting-out”solubilidad, efecto denominado “salting-out”

Por la capacidad de precipitar proteínas, el salting-out es Por la capacidad de precipitar proteínas, el salting-out es un proceso utilizado en la obtención y purificación de un proceso utilizado en la obtención y purificación de proteínas como las albúminas.proteínas como las albúminas.

Solventes. Solventes.

La acción de algunos solventes orgánicos como La acción de algunos solventes orgánicos como etanol o acetona a una solución acuosa de etanol o acetona a una solución acuosa de proteía incrementa su tendencia a precipitar, proteía incrementa su tendencia a precipitar, ya que disminuyen la constante dieléctrica del ya que disminuyen la constante dieléctrica del agua, desfavoreciendo la interacción agua-agua, desfavoreciendo la interacción agua-proteína y favoreciendo la interacción proteína y favoreciendo la interacción proteína-proteína, ocurriendo precipitación.proteína-proteína, ocurriendo precipitación.

Metales:Metales:

Las proteínas forman sales insolubles con ciertos iones Las proteínas forman sales insolubles con ciertos iones metálicos, probablemente por la combinación del ión metálicos, probablemente por la combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína, así el metálico con la forma aniónica de la proteína, así el precipitado formado con el HgClprecipitado formado con el HgCl22 . .

En el caso de los metales pesados como Hg, Pb, Ag, En el caso de los metales pesados como Hg, Pb, Ag, estos pueden reaccionar con el grupo –SH y S-S- de estos pueden reaccionar con el grupo –SH y S-S- de los residuos de cisteína y cistina, produciendo los residuos de cisteína y cistina, produciendo mercáptidos.mercáptidos.

Estos procesos de precipitación son muy útiles en la Estos procesos de precipitación son muy útiles en la desproteinización de soluciones o bien en la desproteinización de soluciones o bien en la obtención y purificación de proteínas.obtención y purificación de proteínas.

OBTENCION, HIDRÓLISIS E OBTENCION, HIDRÓLISIS E INDENTIFICACION DE INDENTIFICACION DE

MONOSACARIDOSMONOSACARIDOSLos carbohidratos son polihidroxialdehidos o Los carbohidratos son polihidroxialdehidos o

polihidroxicetonas que se pueden clasificar en polihidroxicetonas que se pueden clasificar en 3 grupos:3 grupos:

MonosacáridosMonosacáridos OligosacaridosOligosacaridos PolisacáridosPolisacáridosLa mayor parte de los carbohidratos que se La mayor parte de los carbohidratos que se

encuentran en la naturaleza, aparecen como encuentran en la naturaleza, aparecen como polisacáridos de peso molecular elevado.polisacáridos de peso molecular elevado.

Los polisacaridos de reserva mas importantes en la Los polisacaridos de reserva mas importantes en la naturaleza son el ALMIDON (plantas) y naturaleza son el ALMIDON (plantas) y GLUCOGENO (animales). El almidon abunda en GLUCOGENO (animales). El almidon abunda en tuberculos como la papa y contiene dos tipos de tuberculos como la papa y contiene dos tipos de polimeros de glucosa: polimeros de glucosa:

Amilosa 20-28%Amilosa 20-28% Amilopectina 72-80%Amilopectina 72-80%

La union glucosidica La union glucosidica αα(1-4) es bastante flexible por lo (1-4) es bastante flexible por lo que la forma de las moleculas de amilosa en solucion que la forma de las moleculas de amilosa en solucion acuosa, es principalmente la de espirales al azar, acuosa, es principalmente la de espirales al azar, estructura que puede ser establilizada por varios estructura que puede ser establilizada por varios agentes como el yodo que es capaz de formar agentes como el yodo que es capaz de formar complejos de color azul.complejos de color azul.

Las cadenas cortas de amilosa obtenidas por Las cadenas cortas de amilosa obtenidas por hidrólisis parcial, absorben poco yodo, hidrólisis parcial, absorben poco yodo, formando un complejo rojizo. La amilopectina formando un complejo rojizo. La amilopectina se absorbe una pequeñan cantidad de yodo se absorbe una pequeñan cantidad de yodo produciendo un complejo de color rojizo.produciendo un complejo de color rojizo.

LA CAPACIDAD MEDIA DE RETENCION LA CAPACIDAD MEDIA DE RETENCION DE YODO POR UNA MUESTRA DE DE YODO POR UNA MUESTRA DE ALMIDON SIRVE COMO INDICE DE LA ALMIDON SIRVE COMO INDICE DE LA RELACION AMILOSA-AMILOPECTINA.RELACION AMILOSA-AMILOPECTINA.

PRUEBA DE MOLISCHPRUEBA DE MOLISCH

Se basa en la formación de derivados aldehidicos Se basa en la formación de derivados aldehidicos del furano que se condensan con el Alfa del furano que se condensan con el Alfa Naftol, dando un producto colorido violeta. Es Naftol, dando un producto colorido violeta. Es capaz de detectar 0.001% de glucosa y capaz de detectar 0.001% de glucosa y 0.0001% de sacarosa.0.0001% de sacarosa.

Una prueba negativa de Molisch indica ausencia Una prueba negativa de Molisch indica ausencia de carbohidratos.de carbohidratos.

PRUEBA DE BENEDICTPRUEBA DE BENEDICT

En soluciones ligeramente acidas o alcalinas las aldosas En soluciones ligeramente acidas o alcalinas las aldosas y las cetosas sufren enolizacion, epimerizacion, y las cetosas sufren enolizacion, epimerizacion, fragmentacion, oxido-reduccion, formando mezclas fragmentacion, oxido-reduccion, formando mezclas complejas con fuerte actividad reductora. Son capaces complejas con fuerte actividad reductora. Son capaces de reducir algunos iones metálicos.de reducir algunos iones metálicos.

Los que utilizan cobre, se han empleado durante mucho Los que utilizan cobre, se han empleado durante mucho tiempo para detectar azucares reductores.tiempo para detectar azucares reductores.

Esta prueba se utiliza para distinguir azucares Esta prueba se utiliza para distinguir azucares reductores de no reductores en base a la reduccion de reductores de no reductores en base a la reduccion de CuCu2+2+ a Cu a Cu1+1+ en medio ligeramente alcalino. en medio ligeramente alcalino.

PRUEBA DE ORCINOLPRUEBA DE ORCINOL

Los productos obtenidos del tratamiento de las Los productos obtenidos del tratamiento de las pentosas y acidos uronicos con acidos pentosas y acidos uronicos con acidos concentrados no oxidantes, se condensa con el concentrados no oxidantes, se condensa con el orcinol dando lugar a un precipitado azul orcinol dando lugar a un precipitado azul oscuro soluble en alcohol n-butilico.oscuro soluble en alcohol n-butilico.

LLAMADA TAMBIEN BIAL O TOLLEN LLAMADA TAMBIEN BIAL O TOLLEN PARA DISTINGUIR PENTOSASPARA DISTINGUIR PENTOSAS

PRUEBA DE SELIWANOFFPRUEBA DE SELIWANOFF

Las cetohexosas forman cerca de 20-25 veces Las cetohexosas forman cerca de 20-25 veces mas derivados del furfural que las mas derivados del furfural que las aldohexosas. El resorcinol reacciona solo con aldohexosas. El resorcinol reacciona solo con altas concentraciones de furfural formando a altas concentraciones de furfural formando a partir de cetohexosas, produciendo un color partir de cetohexosas, produciendo un color rojo fuego. Las pentosas reaccionan dando un rojo fuego. Las pentosas reaccionan dando un color azul.color azul.