PRUEBAS BIOQUMICAS

PRUEBAS BIOQUMICASDOCENTE: Q.F. PEDRO JACINTO HERVIASPRUEBAS BIOQUMICASLa identificacin definitiva de una especie requiere de pruebas bioqumicas. Permiten conocer las actividades metablicas y enzimticas de los microorganismos.

PRUEBAS BIOQUMICASIdentificar los productos finales de los procesos metablicos Se debe conocer:1.- Cambios que se producen2.- Reacciones qumicas que ocurren3.- Enzimas que intervienen4.- Productos intermedios5.- Secuencias de las reacciones bioqumicasPRUEBAS BIOQUMICASLos microorganismos se cultivan en medios S/D SS + SD PBLas pruebas bioqumicas disponibles para la identificacin de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae son:1.- Pruebas IMVIC 2.- Prueba de TSI 3.- Prueba de Ureasa 4.- MovilidadPRUEBAS IMVICIncluyen un grupo de cuatro pruebas usadas para diferenciar a los microorganismos entricos (Familia Enterobacteriaceae) Las pruebas son: INDOL ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER CITRATO. Fermentacin de hidratos de carbono:

Accin sobre los hidratos de carbono

Primer daInocula cada tubo de caldo lactosado con E.coli, S.aureus, P.vulgaris.Toma un cuarto tubo sin sembrar como control.Rotula los tubos e incuba todos los tubos a 37C por 24 horas.Segundo daDespus del perodo de incubacin, compara cada uno de los tubos inoculados, con el tubo control.Cuando la bacteria ha degradado el hidrato de carbono (lactosa), se detecta por la inclusin del indicador de Andrade.Si el microorganismo tiene la capacidad de desdoblar un subproducto metablico a CO2 e H+ se observar la presencia de gas, en forma de burbujas.

Hidrlisis del almidn:

Accin sobre los hidratos de carbonoPrimer daCon ayuda del lpiz de cera, divida por fuera la base de la placa Petri en 3 partes.En la seccin 1, siembra B. Subtilis, en la seccin 2 siembra E. Coli y en la seccin 3 siembra Ps. aeruginosaIncuba a 37C por 24 horasSegundo daAgrega a toda la superficie del medio la solucin de lugol.Observa la reaccin alrededor del crecimiento microbianoLos polisacaridos, como el almidn son demasiados largos para ser transportados al interior de la clula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polmeros hasta oligo o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrlisis de almidn es analizada en medios conteniendo almidn en placa. Despus de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidn intacto forma un complejo prpura.

PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUERProduccin de cidos y acetil-metil-carbinol (acetona):

Accin sobre los hidratos de carbonoPrueba de Voges Proskauer (VP)Primer daRotula los tubos con el nombre del microorganismo.Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.Incuba a 37C por 24 horas.Segundo daA cada tubo agrega 10 a 12 gotas de la solucin de alfa-naftol y 4 gotas de la solucin de KOH creatina.Agita despus de agregar las soluciones por 1 minuto.Deja en reposo durante 15 minutos.La reaccin es positiva, si aparece una coloracin rosada localizada en la mitad superior o en todo el tubo dentro de los primeros 15 minutos, lo que nos indica la presencia de acetil-metil-carbinol.Si la lectura se realiza despus de 1 hora, los cultivos pueden presentar una coloracin cobriza, siendo esta una respuesta falsa positiva.La reaccin es negativa, si el color inicial del medio de cultivo no cambia.PRUEBA DE VOGES PROSKAUERFUNDAMENTO:GLUCOSAFERMENTACIN BUTILENGLICLICAACETIL-METIL-CARBINOL(ACETONA)2-3 BUTANODIOL, ETANOL, H2 y CO2 REACTIVO DE BARRETTKOH 40%

NEGATIVOPOSITIVOPrueba de rojo de metilo:

Accin sobre los hidratos de carbono

Primer daRotula los tubos con el nombre del microorganismo.Por la tcnica de inoculacin, siembra cada cepa (E. coli y Enterobacter) en su tubo correspondiente.Incuba a 37C por 48 a 72 horas.Segundo daAgrega 4 5 gotas del indicador rojo de metilo a cada tubo, cuyo rango de viraje esta entre pH 4.4 (rojo) y 6.0 (amarillo).La prueba es negativa si da una coloracin amarillo naranja.La prueba es positiva si se mantiene un color rojo estable.PRUEBA DE ROJO DE METILOFUNDAMENTO:

GLUCOSAFERMENTACIN CIDO MIXTACIDOS LCTICO, ACTICO Y SUCCNICO+CO2, H2 y ETANOLpH CIDO 5 GOTAS ROJO DE METILOCOLOR ROJO

POSITIVONEGATIVOPRUEBA DE ROJO DE METILOPROTOCOLO: (caldo MRVP) 1.- Se Inocula el medio con un cultivo puro joven. 2.- Se incuba a 35 37C durante 48 horas. 3.- Luego de terminado el tiempo de incubacin se aaden 5 gotas del reactivo de Rojo de Metilo (no agitar).INTERPRETACIN:

SIN INOCULARNEGATIVOPOSITIVOPrincipios bioqumicos de las reacciones en TSI:

Accin sobre los hidratos de carbono

Primer daCon el asa de siembra, inocula una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estra la superficie del pico de flauta.Rotula e incuba a 37C por 24 horas.Segundo da Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.Fermentacin de la glucosa nicamente (rojo/amarillo): esto se debe a que la glucosa (que se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azucares) ha sido utilizada y la cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la utilizacin de las peptonas. Estos procesos que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo, por no estar en contacto con el oxgeno, solo hay fermentacin y el medio permanece cido.Fermentacin doble o triple de carbohidratos (amarillo/amarillo): la fermentacin de la glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cido, por lo que el tubo permanece amarillo.No fermentacin de carbohidratos (rojo/anaranjado): se presenta nicamente utilizacin oxidativa de peptonas, por lo que solo la superficie del tubo se alcaliniza.Produccin de gas: formacin de burbujas, grietas o desplazamiento del medio.PRUEBA TSI (TRIPLE SUGAR IRON)Medio S/D Permite evidenciar: Capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio.Permite la identificacin de la produccin de SH2. PRUEBA TSI Esta prueba tiene como objetivo diferenciar entre:PRUEBA TSIFUNDAMENTO:El extracto de carne y peptona aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los HC fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH.Por la fermentacin de los azcares, se producen cidos que se detectan por el indicador de pH.PRUEBA TSIPROTOCOLO:1.- Se inocula los tubos de TSI con punta. 2.- Se introduce la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. 3.- Luego de retirar el asa del fondo, se estra el pico con un movimiento en zigzag, de un lado al otro. 4.- Se incuba a 35 - 37C durante 24 horas.

ESTRIACION EN ZIGZAG

INOCULACION CON PUNTAPRUEBA TSIINTERPRETACIN:Se debe considerar los cambios de color en el pico y el fondo del tubo y la formacin de burbujas. Cuando el medio es cido (A) este se torna de color amarillo y cuando es alcalino (ALK) permanece de color rojo.

PRUEBA TSIEl medio contiene 0.1% de glucosa y 1% de lactosa y sacarosa respectivamente. Si el microorganismo slo fermenta la glucosa, el cido producido en el fondo acidifica el medio en esa zona y se torna de color amarillo.Cuando el microorganismo fermenta la lactosa y la sacarosa, el cido producido es suficiente como para virar el color del medio a amarillo. El medio permanece rojo cuando no se produce fermentacin de ninguno de los azcares. PRUEBA TSISi hay formacin de gas durante el proceso de fermentacin, en el fondo del medio se observan burbujas o la ruptura del agar. Si las bacteria son productoras de SH2 este se evidencia como un precipitado negro en el fondo del tubo.

TuboC12344A5Fermentacin de Glucosa--+++++Produccin de gas---++++Fermentacin de Lactosa y Sacarosa----+++Produccin de SH2------+Hidrlisis de la gelatina:

Accin sobre las protenasPrimer da Rotula cada tubo con el nombre de la cepa correspondiente: E. Coli y B. Subtilis.Inocula cada cepa en un tubo con gelatina, haciendo uso de un asa en punta, introduciendo de manera vertical hasta el fondo del tubo.Incuba a 37C por 24 horas.Segundo da Observa los resultados. Observa la hidrlisis de la gelatina

La mayora de los polmeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las clulas. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polmeros transportando al interior de la clula en monmeros que les sirven para crecer.

La produccin de proteasas es evaluada por incorporacin de una protena (gelatina o casena) en un medio slido en placa. La placa se inunda con cido que precipita la proteina no hidrolizada.

Produccin de indol:

Accin sobre las protenasPrimer daRotula sus tubos con el nombre del microorganismo: E. coli y B. subtilis.Inocula cada cepa en su tubo correspondiente.Incuba a 37C por 24 horasSegundo daAgrega 4 gotas del reactivo de Kovacs, dejando resbalar por la pared interna de cada tubo que presenta desarrollo bacteriano, luego agite suavemente.La reaccin es positiva, si se forma un anillo de color rojo fucsia brillante en la zona superior del tubo, pocos segundos despus de haber agregado el reactivo.Las bacterias que a pesar de desarrollar en el medio no producen indol, permanecern sin cambio alguno (reaccin negativa).

PRUEBA DE INDOLFUNDAMENTO: TRIPTOFANASAH2O + TRIPTOFANO INDOL + AC. PIRUVICO + NH3

PROTOCOLO: Se inocula en caldo triptosa e incuba a 35 - 37C durante 24 horas. Luego de este perodo, se aaden 5 gotas del reactivo de Kovacs.

INTERPRETACIN:

NEGATIVOPOSITIVOPOSITIVONEGATIVOProduccin de sulfuro de hidrgeno:

Accin sobre las protenasPrimer daPor la tcnica de puntura y estra, siembra separadamente en el medio TSA las cepas de E. coli y P. vulgaris.Coloca una tira de papel de filtro impregnada con acetato de plomo.Incuba a 37C por 24 horasSegundo daObserva el ennegrecimiento del papel de filtro, por la produccin del sulfuro de hidrgeno (reaccin positiva).Muchas bacterias producen sulfuro de hidrgeno a partir de aminocidos azufrados (cistena o metionina) o tiosulfato.

La fermentacin de sulfhdrico puede ser detectada incluyendo hierro reducido en el medio para formar un precipitado negro de FeS

Se inocula un medio de agar nutritivo conteniendo tiosulfato metionina y sulfato ferroso.

Utilizacin del citrato:

Pruebas bioqumicas diferencialesPrimer da Siembra por la tcnica de estra en cada tubo con las cepas de E.coli y Enterobacter aerogenes.Incuba a 37C por 24 horasSegundo da La prueba es positiva si observa crecimiento bacteriano y un color azul intenso del agar en 24 a 48 horas.Es negativa si no hay crecimiento ni cambio de color.

PRUEBA DE CITRATONa2CO3CITRATOPIRUVATOCO2 + Na + H2OPh ALCALINOAZUL DE BROMOTIMOLCOLOR AZULPRUEBA +Agar Citratado de Simmons

PRUEBA DE CITRATOPROTOCOLO1.- Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola estra en la superficie. 2.- Se incuba a 35 - 37C durante 24 horas y se realiza la lectura de la prueba.

PRUEBA DE CITRATOINTERPRETACIN:Es positiva cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, y este se acompaa o no de un viraje del indicador de verde a azul. El cambio de color del medio a azul indica una reaccin positiva.

POSITIVONEGATIVOHidrlisis de la rea:

Pruebas bioqumicas diferencialesPrimer da Por la tcnica de estra, siembra los tubos con medio de urea con E.coli y P.vulgaris. No inocular el fondo.Rotula e incuba a 37C por 24 horas.Segundo da La prueba es positiva si el medio presenta un color rosado en la superficie o en todo el tubo.La prueba es negativa, si el medio permanece del color original.

PRUEBA DE LA UREASAFUNDAMENTO:UREAUREASA2 MOLCULAS DE NH4pH ALCALINO ROJO DE FENOLCOLOR FUCSIA

RESULTADOS+-PRUEBA DE LA UREASAPROTOCOLO:1.- Se siembra el microorganismo en estudio en caldo urea o agar rea de Cristensen.2.- Se incuba a 35 - 37 C durante 24 horas.

INTERPRETACIN:

POSITIVONEGATIVOAgar rea de Cristensen

NEGATIVOPOSITIVOPrueba de la catalasa:

Pruebas bioqumicas diferenciales

Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de Staphylococcus aureus o Streptococcus viridans, y transferir el inculo a un portaobjetos limpio.Aade de 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%.Observa si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.Descarta la lmina en un recipiente con desinfectante.

La catalasa es una enzima que proteje a las clulas frente al perxido de hidrgeno producido en el metabolismo del oxgeno. Cataliza la formacin de agua y oxgeno a partir del perxido de hidrgeno.

Es util para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva)

La actividad catalasa se detecta aadiendo unas gotas de perxido de hidrgeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (dara falsos positivos). La produccin de burbujas indica la presencia del enzima.

Reaccin de la citocromo oxidasa:

Pruebas bioqumicas diferenciales

Con el asa de siembra en punta, picar el crecimiento de uno de los tubos con el cultivo de E.coli o Ps. aeruginosa, y transferir el inculo a una tira del reactivo de oxidasa.Considera la prueba positiva cuando los cultivos dan una coloracin azul violceo intensa en la tira, en un mximo de 5 segundosLa presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Este test se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)

Se impregnan discos de papel con parafenilandiamina y se coloca en un cultivo creciendo en placas de agar nutritivo.