Pruebas Bioquimicas Editado Contabla

8/13/2019 Pruebas Bioquimicas Editado Contabla

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Pruebas

bioqumicasDiego SilvaRoco Silva

Nathalie CruzAndrea BeltrnShanath Snchez


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El estudio de los microorganismos basndose en sudescripcin colonial y microscpica no es suficientepara hacer una identificacin satisfactoria.

Es por esto que se tiene que recurrir al estudio de sucomportamiento fisiolgico por medio de pruebasque determinan cmo utilizan los nutrimentos y qu

sustancias producen.


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En las pruebas bioqumicas se determina la actividad deuna va metablica a partir de un sustrato que se

incorpora en un medio de cultivo y que la bacteriapuede o no transformar al crecer.

En general el microorganismo se cultiva en medios que

contienen una sustancia nutritiva especfica o sustrato y,despus de la incubacin del cultivo, se examina paraver los cambios qumicos que han ocurrido.


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Entonces qu observamos en las

pruebas bioqumicas?

O Relacin entre caractersticasfisiolgicas y funcin celular.

O Relacin entre funciones que llevanacabo en su ambiente natural.

O Relacin de los trayectosmetablicos microbianos.


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O TSI (Tiple Sugar Iron)

Identifica microorganismos que fermentan:

*glucosa (superficie roja)

*lactosa y/o sacarosa (tubo amarillo)Tambin identifica a los microorganismos queproducen H2S.

Principales pruebas bioqumicas


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Contiene*glucosa al 0.1% (Por eso solo se fermentala parte superior del tubo)

*Sacarosa y Lactosa al 1% (por eso cambiatodo el color del tubo)

*Rojo fenolIndicador de pH: amarillodebajo de 6,8 y rojo por encima de 8,2

FeSO4Algunas bacterias pueden reducirSO4 a H2S. El hierro se combina con elH2S y forma FeS, un compuesto negro.


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LIA (Lysine Iron Agar)Permite diferenciar los microorganismos que producendescarboxilacin o desanimacin de la lisina y siproducen H2S

Prueba ReaccinPositiva

ReaccinNegativa

Prueba de H2S Formacin de un

precipitado

No hay formacin

de un precipitadonegro

Decarboxilacinde la lisina

Fondo ysuperficie colorprpura

Fondo amarillo ysuperficie prpura

Desaminacindela lisina

Superficie roja Superficieprpura


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Medio SIM (Sulfure Indol Motility)O La prueba del Indol estudia la capacidad de degradar

el triptfano con produccin de Indol y metabolitosindlicos.Esto es indicado por el reactivo de

Kovac, el cual reacciona con el indol formando uncolor rosa. La presencia de indol indica que labacteria produce

O La prueba de sulfuro nos indica si elmicroorganismo produce H2S a partir de sulfatos.

O La prueba de Motilidad nos dice si la bacteria se

mueve a cierta temperatura. Esto lo observamos siel medio se ve turbio o si unicamente se ve lalnea donde se incub la bacteria.


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O cidos y gases

Estudia la capacidad de utilizar un hidrato de carbonocon la produccin de cidos y la formacin de gas.

O Hidrolisis Gelatina

Estudia la capacidad proteoltica del microorganismo

por degradacin de la gelatina.O xido - Fermentativa o de Hugh-Leifson

Estudia si el microorganismo es capaz de metabolizarun hidrato de carbono por va oxidativa o por va

fermentativa


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Rojo de metilo y Voges-Proskauer

O Permiten la diferenciacin dentro de las

enterobacterias del grupo coliy aergenes. Lasenterobacterias son anaerobios facultativos queutilizarn la glucosa en dos fases: 1. La metabolizarn aerobiamente (respiracin

oxibintica) consumiendo rpidamente el oxgeno delmedio

2. Continuar metabolizndola por va anaerobia(fermentacin). sta puede ser de dos tipos:


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O Fermentacin cido mixta:La realizan las bacterias del grupode E.coliy los productos finales son cidos orgnicos (cidosfrmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte

descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por elviraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillopor encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

O Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias delgrupo Klebsiella-Enterobacter(antiguo aergenes). Losproductos finales son compuestos neutros como el butanodiol yel etanol, producindose acetona como intermediario quepodr ser detectada aadiendo al medio el reactivo de Voges-

Proskauer que reaccionarn con este compuesto produciendoun color rojo caracterstico.


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O OxidasaEstudia la presencia de la enzima citocromo c oxidasa queacta en la cadena respiratoria del organismo.O CatalasaEstudia si el microorganismo posee la enzima catalasa que

acta descomponiendo el perxido de hidrgeno.O CoagulasaForma cogulos formados por la reaccin de la coagulasa enun tubo de ensayo. Estudia la produccin delenzima coagulasa capaz de coagular el plasma. Ayuda a

diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies.O UreasaLa prueba de ureasa estudia si el microorganismo posee laenzima ureasa que cataliza la hidrlisis de la urea.

Pruebas enzimticas


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Prueba Fundamento ResultadoUTILIZACIN DE AZCARES La determinacin de la capacidad de un

microorganismo para utilizar un hidrato decarbono especfico incorporado en un mediode cultivo bsico, originando un pH cido. Seutiliza un indicador rojo fenol

+: color amarillo del medio, que indicaacidez.

-: color rosa-rojizo del medio, que indicaalcalinidad.

PRUEBA DE LACATALASA

El perxido de hidrgeno se forma como unproducto terminal oxidativo de ladescomposicin aerbica de los azcares.

Si se deja acumular, el perxido de hidro-geno es txico para las bacterias, por lo quedeben tener el enzima catalasa, que lodescompone a agua y oxgeno.

+: Inmediata formacin de burbujas por laliberacin de gas.

-: No hayformacin de burbujas.

CITRATO Determina si un microorganismo es capaz deutilizar citrato como nica fuente de carbonopara el metabolismo.

El medio utilizado incluye citrato como nicafuente de carbono y fosfato amnico comofuente de nitrgeno. Las bacterias que

metabolicen el citrato, tambin utilizarn elfosfato amnico, con la consiguientealcalinizacin del medio.

+: Crecimiento con un color azul intenso enel pico de flauta.

-: No se observa crecimiento ni cambio decolor, apareciendo verde.

COAGULASA ENPORTA ("CLUMPINGFACTOR")

Investigar la capacidad de produccin delenzima coagulasa. Actua de alguna formasobre el mecanismo de coagulacin delsuero provocando la transformacin defibringeno en fibrina, y formacin delcogulo.

+: Se observa la inmediata formacin de unprecipitado macroscpico en forma deaglutinados blancos (grumos).-: Se considera negativo si no se produce laaglutinacin en 3-4 minutos.


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DNAsa Se emplea un medio de cultivocuya caracterstica principal es lade poseer cidodesoxirribonucleico, con objetode investigar si es hidrolizado porel microorganismo problema, encaso de que posea la enzimadesoxirribonucleasa.

+: Al aadir el ClH, hace que el ADNexistente precipite, produciendo conello un enturbiamiento del medio. Esevidente que donde ya no quedabaADN por la accin de la DNAsamicrobiana, el medio apareceratransparente. Esto sucedera en lazona contigua al crecimiento,indicando con ello que elmicroorganismo ha hidrolizado el cidonucleico.

-: El ADN no ha sido despolimerizado,con lo que precipita por el ClH en toda

la placa, y no va a haber zonatransparente.

HIDROLISIS DE LAESCULINA La esculina, un glicsido, eshidrolizada por algunas

bacterias, dando como productosde degradacin glucosa yesculetina. La esculetina al

reaccionar con el hierro forma uncomplejo de color castaooscuro o negro.

+: presencia de colornegro/castao oscuro alrededorde las colonias.

-: ausencia de color negro.

PRUEBA DE LAHIDRLISIS DE LAARGININA

Se trata de detectar la hidrlisisde la arginina mediante laenzima que transforma esteaminocido en citrulina, conliberacin de amoniaco.

+: Color anaranjado-marrn.-: Color amarillo plido o

ausencia de color.


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PRUEBA DE LA HIDRLISISDE LA ARGININA

Se trata de detectar la hidrlisis de laarginina mediante la enzima que transformaeste aminocido en citrulina, con liberacinde amoniaco.

+: Color anaranjado-marrn.

-: Color amarillo plido o ausencia de color.

GALACTOSIDASA(ONPG) Fermentadores tardos de la lactosa sonaquellos que degradar la lactosa en 3-4 das.En este grupo de microorganismos podemos

predecir la facultad de fermentar la lactosademostrando la presencia o ausencia deactividad Galactosidasa mediante el empleodel compuesto Orto- nitrofenil--D-Galactopiransido (ONPG),Si se encuentran clulas positivas para lametabolizacin activa de la lactosa, elreactivo ONPG incoloro es hidrolizadoliberando un compuesto amarillo, el Orto-Nitrofenol.

+: se produce el cambio de color a amarillo.

-: continua incoloro.

HIDROLISIS DEL HIPURATO La hipuricasa es una enzima que produce lahidrlisis del hipurato de sodio, con laformacin de benzoato de sodio y glicina.

+: Presencia de un precipitado en el fondodel tubo.-: Ausencia de precipitado.

INDOL Por la degradacin del triptfano se liberaindol, cido pirvico, amoniaco y energa.Ese indol puede ser detectado por el empleode determinados reactivos que dan unareaccin de color.

+: Anillo de color rojo en la superficie delmedio.

-: Anillo del color del Reactivo de Kovacs(ocre oscuro).

LECITINASA Determinar la presencia del enzimalecitinasa. Para ello empleamos un mediorico en lecitina, como pueda ser un medionutritivo enriquecido con yema de huevo.

+: Seformarun halo ms claro alrededor dela zona de crecimiento microbiano debido ala degradacin de la lecitina por el

microorganismo.-: No existe halo opaco alrededor de la zonade crecimiento microbiano.


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MOTILIDAD Investigar si un microorganismo es mvil ono. Para ello se emplea un mediosemislido (con Agar al 0'2%), en el que labacteria mvil difunda lo ms rpidamenteposible.

+: Aparece una turbidez que se difunde portodo el tubo.-: Se produce una lnea de crecimientolimitada a seguir la lnea de siembra,mientras que el medio que la rodea semantiene claro.

OXIDASA La prueba de la oxidasaestbasada en lapresencia en la bacteria del enzimacitocromo oxidasa.

+: Las colonias que producen citocromooxidasa hacen que el reactivo pase a uncolor prpura oscuro.-: No se produce cambio de color delreactivo.

ROJO DE METILO Se trata de una prueba para detectar laproduccin de cidos fuertes (lctico,frmico y actico) a partir de lafermentacin Se consideran rojo de metilo positivos sloaquellos microorganismos que puedanmantener un pH cido

Se basa simplemente en el empleo de unindicador de pH (Rojo de Metilo) para de-terminar la concentracin de ionesHidrgeno (pH) presentes cuando unorganismo degrada la glucosa.

+: color rojo del medio.

-: color amarillo o cobrizo en la superficiedel medio.


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UREA La ureasa es una importante enzimamicrobiana vinculada con ladescomposicinde los compuestosorgnicos. Por suaccindesdobla la urea, liberando 2 molculas deamoniaco.Empleamos un indicador de pH, el rojo fenol,con color amarillo en medio cido y rosadoen medio alcalino.

+: color rojo rosado del medio, que indicaalcalinizacin por el amoniaco tras eldesdoblamiento de la urea.-: color amarillo anaranjado del medio.

VOGES PROSKAUER(Prueba de la Acetoina)

Esta prueba bioqumica permite determinarla presencia de acetil-metil-carbinol en loscultivos. Este compuesto es un productofinal neutro derivado del metabolismo de la

glucosa, concretamente de unafermentacinparticular, denominada butileno-gliclica, lacual predomina en ciertas bacterias.

+: color rojo-rosado en la superficie delmedio (presencia de acetoina).

-: no existe cambio de color.

HIDRLISIS DE LAGELATINA

Esta prueba se utiliza para determinar lacapacidad de un microorganismo paraproducir enzimasproteolticas que lican lagelatina (gelatinasas).

Cubra la placa con el reactivo precipitante deprotenas (Cloruro mercrico cido). Unprecipitado blanco indica presencia degelatina no hidrolizada; la ausencia delprecipitado en la regin de crecimientobacteriano indica hidrlisis de la gelatina.


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INFLUENCIA DE LATEMPERATURA EN ELCRECIMIENTO

Esta prueba permite determinar latemperatura ptima y el rango detemperatura de crecimiento de unmicroorganismo.

Anotar el crecimiento y la abundanciarelativa del mismo. Seleccione lastemperaturas mnima y mxima a la cualhubo crecimiento para determinar el rangode temperatura de crecimiento. Seleccionela temperatura a la cual hubo mayorcrecimiento, sta representa la temperaturaptima.

UTILIZACIN DE CITRATOCOMO NICA FUENTE DEENERGA

Esta prueba permite diferenciar a lasenterobacterias basndose en lautilizacin del citrato. Entre lasenterobacterias citrato negativas estnEsche- richia y Shigella y entre las citratopositivas Arizona, Citrobacter, Klebsiella,Salmonella y Serratia.

El desarrollo de crecimiento en este medio yel viraje del indicador de verde a azul,indican que el microorganismo es capaz deutilizar el citrato como nica fuente decarbono.

PRODUCCIN DE

NUCLEASATERMOESTABLE(TERMONUCLEASA)

Esta prueba se realiza para detectar laproduccin de nucleasa termoestable. Un resultado positivo para la termonucleasaestardado por un halo rosado alrededor de

los reservorios de cultivo, tanto el calentadocomo el no calentado.

REDUCCIN DE NITRATOSYDENITRIFICACIN

Esta prueba se realiza para determinar lacapacidad de un microorganismo parareducir los nitratos a nitritos o gasnitrgeno libre, una caracterstica que amenudo tiene valor diferencial.

Para determinar si el nitrato ha sido reducidoa nitrito, despus de laincubacin,adaleal medio de cultivo,2gotas desolucin A, yluego 2 gotas de la solucin B del reactivode Griess y mezcle. La aparicin de unacolo- racin rosada o roja indica que los

nitratos han sido reducidos a nitritos.. Resultado positivo Resultado negativoSi la reaccin es negativa, aada una muypequea cantidad de polvo de Zinc. Laaparicin de una coloracin rosada o rojaconfirma la negatividad de la reaccin; encaso de que esto no suceda, significa quelos nitratos han sido reducidos a N2gaseoso, es decir se ha producido una

desnitrificacin.

SOLUBILIDAD EN Si la suspensin se vuelve clara la pruebaes positiva.


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REACCIONES EN EL AGARHIERRO-TRIPLE AZUCAR(Agar TSI)

Esta prueba se recomienda para laidentificacin de patgenos entricos gramnegativos. Se emplea para detectar lafermentacin de lactosa, sacarosa yglucosa, con formacin de cido y gas, ytambin para detectar produccin de cidosulfhdrico.

Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.Bisel cido (amarillo): Lactosa y/o sacarosafermentada.Taco cido (amarillo): Glucosa fermentada.Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosano fermentada.Taco alcalino (rojo) y bisel alcalino (rojo):

Ninguno de los tres glcidos es fermentadoLa aparicin de burbujas en el taco indicaque la fermentacin se ha efectuado conproduccin de gas.Un ennegrecimiento en el medio indica laproduccin de cido sulfhdrico.

DECARBOXILACIN DEAMINOCIDOS(ARGININA, LISINA YORNITINADECARBOXILASAS)

Algunas bacterias poseen unas enzimasdecarboxilasas especficas que son capacesde atacar el grupo carboxilo de determinadosaminocidos, produciendo anhdridocarbnico y una amina, o diamina, con laconsiguiente alcalinizacin del medio. Asi: - La lisina decarboxilasa (LDC)

produce, a partir de la L-lisina,cadaverina.

- La ornitina decarboxilasa (ODC)produce putrescina.

- El aminocido L-arginina posee un

sistema especial de transformacin:primero poraccin de una descarboxilasa setransforma en un producto intermedio,la agmatina, la cual, por una Argininadehidrolasa (ADH) pasa a putrescinay urea. Si el microorganismo esproductor de ureasa transformar asu vez la urea en amoniaco yanhdrido carbnico.

+: color prpura turbio a prpura apagado.-: color amarillo claro y brillante.

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