Prueba de ELISA Fundamentos
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7/23/2019 Prueba de ELISA Fundamentos
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADORFACULTAD DE CIENCIASMEDICAS
ESCUELA DE MEDICINA
CATEDRA DE BIOLOGIA MOLECULAR
TEMA: ELISA
PERIODO 2015
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7/23/2019 Prueba de ELISA Fundamentos
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ELISA
La palabre proviene del
acrnimo en ingls Enzyme-
Linked ImmunoSorbent
Assay, Ensayo porIn!noa"sor#$%n L$&a'o aEn($as)
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EN 1960 Rosaln !alo" ! #alomon $erson, desarrollaron
el R%&%' (Radioinmnoensao) *e+eccin de 'gs o 'cs marcados con radioisopos La radioac+ividad proporciona na seal -e indica si
n 'g o 'c espec./ico es+ presen+e en la mes+ra% #e bscaron o+ras al+erna+ivas segras para el medio
ambien+e, -e no perdicarn la sald, de menor
cos+o, sencilla prc+ica
E%&%' En2ima inmnoensao se desarrollo
independien+emen+e por #+ra+is 'vrameas 3ierce% 4sa la nin de 'cs a los 'gs para iden+i/icar medir
ss+ancias, por colorime+r.a%
An)*#*'*n)*s
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Los an+.genos son, por de/inicin,
generadores de an+icerpos%
&nclen pro+e.nas, polisacridos
varias molclas pe-eas, -e
es+imlan la prodccin dean+icerpos%
Los an+.genos son, a mendo,
molclas -e se de/inen como (no
propias) o e5+raas, para elorganismo%
a (an+.genos propios) -e ac+7an
como e+i-e+as de iden+i/icacin
An)+&*nos
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#on la respes+a del organismo an+e lapresencia de n agen+e in/eccioso%
Los an+icerpos son molclas pro+eicas
secre+adas por los plasmoci+os, +ienen
na al+.sima a/inidad por ss an+.genos
correspondien+es% 'n+icerpos se carac+eri2an por8 #er *e/ensa na+ral :ener 4+ilidad +erap+ica :ener 4+ilidad *iagns+ica ;arcador de &n/eccin o
E5posicin% *e+eccin de an+.genos
Los an+icerpos +ili2ados en el m+odo
EL' son de origen monoclonal o
policlonal%
An)$#!*rpos
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ELISA Es na +cnica de inmnoensao en cal n 'g o 'c
inmovili2ado se de+ec+a median+e n an+icerpo enla2ado a
na en2ima capa2 de generar n prodc+o de+ec+able al
cambiar de color
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ELISA
#e sa para de+erminar si n an+icerpo
o an+.geno en par+iclar es+ presen+e
en na mes+ra de es+dio%
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ELISA
La in+eraccin an+.geno=
an+icerpo en el labora+orio
pede ser +ili2ada para
de+erminar si n pacien+e +ienena in/eccin o na en/ermedad
a+oinmne%
3ero como preba diagns+ica,
posee diversas limi+aciones -e
conviene conocer8
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LIMITACIONES
1% Resl+ado posi+ivo para an+icerpos no signi/ica -e
necesariamen+e el pacien+e es+a en/ermo
>% &nmnospresin pede dar n /also nega+ivo o pede
es+ar en na vena+ana inmnolgica dar /also
nega+ivo
?% &nespeci/icidad en+re an+.geno = an+icerpo
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VENTANA INMUNOL,GICA
El +iempo -e +ranscrre en+re el momen+o de
la con+aminacin por n virs la prodccin
de an+icerpos s/icien+es para ser de+ec+ados
en la serolog.a es llamado de -*n)ana$n!no.%&$#a% 3or lo +an+o, cando decimos-e n e5amen +iene na ven+ana inmnolgica
de ? meses, eso signi/ica -e el e5amen slo
dar posi+ivo ? meses desps de -e elpacien+e @aa en+rado en con+ac+o con el
de+erminado virs o bac+eria%
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EL'
:ambin, debemos +ener en cen+a -e cando
se +ra+a de diagnos+icar na en/ermedad -e
posee n valor predic+ivo posi+ivo bao en nade+erminada poblacin, es necesario volver a
con/irmar el resl+ado posi+ivo median+e o+ro
m+odo de diagns+ico independien+e%
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ELISA
Normalmen+e, se lleva a cabo n western blotdonde sede+ec+a la presencia de varios an+icerpos
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ELISA
El resl+ado del "es+ern se considera posi+ivo candoaparecen al menos A bandas, -e indica -e A an+icerpos
di/eren+es es+n presen+es en el se+o /ren+e a esa in/eccin%
Es en+onces
cando se
diagnos+ica comoposi+ivo a dic@o
pacien+e%
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EL' *isposi+ivos empleados en EL'
L*#)or*s ELISA%
#e san desde +bos decris+al desde los masan+igos @as+a las
ac+ales microplacas de 96pocillos de pls+ico +ra+ado
para amen+ar scapacidad de adsorcin
(en s sper/icie) demolclas, con /ondos depocillo p+icamen+e claros-e permi+an reali2ar las
medidas de densidadp+ica en ins+rmen+os
espec./icos
'c+almen+e disposi+ivos
de maor capacidad B
con ?CD 1A?6 pocillos
B para los
screeningmasivo de los
sis+emas robo+i2ados
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EL'
*isposi+ivos empleados en EL'
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EL' *isposi+ivos empleados en EL'
Los lec+ores EL' sonespec+ro/o+me+ros capaces de
reali2ar lec+ras seriadas de cada node los pocillos de la placa EL'%
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EL' *isposi+ivos empleados en EL'
' di/erencia de n
espec+ro/o+me+roconvencional, con capacidadde leer +odas las longi+desde onda del l+raviole+a elvisible de manera con+ina,
los lec+ores de EL'disponen de sis+emas de/il+ros -e solo permi+en la
lec+ra de na o pocaslongi+des de onda
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Con)ro.*s
#e +ili2an para asegrar -e la preba es+a /ncionando
correc+amen+e
Control POSITIVO
&nclen na ss+ancia -e se sabe -e reaccionara
posi+ivamen+e, proporcionando as., n pa+rn sobre el cal
basar los resl+ados%
Control NEGATIVO
&nclen ss+ancias -e no deben reaccionar%
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T$pos '* ELISA
Los /)o'os '* ELISA '*p*n'$*n'o '* .aa#)$-$'a' *n($)$#a s* '$-$'*n *n 'os )$pos:
1 Cop*)$)$-os
2 No #op*)$)$-os
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ELISA COMPETITIVO:
El an+icerpo de la mes+ra va
a compe+ir con el congado
por n n7mero limi+ado desi+ios de nin del an+.geno%
abr asencia de color en
na mes+ra posi+iva debido a
-e el ss+ra+o no encon+rar a
la en2ima por-e el congado
@a sido despla2ado por el
an+icerpo presen+e en la
mes+ra
T$pos '* ELISA
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T$pos '* ELISA
ELISA O COMPETITIVO:
#i na mes+ra es posi+iva se /ormar
el compleo an+.geno=an+icerpo al
agregar el congado reaccionar con
el respec+ivo ss+ra+o dando color
*en+ro de los no compe+i+ivos
+enemos8
Los direc+os -e de+ec+an an+.genos
Los indirec+os -e de+ec+an
an+icerpos
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Fas*s '*. ELISA In'$r*#)o F$a#$%nal sopor+e insolble de an+.genos espec./icos para
los an+icerpos obe+o de es+dio% La-a'opara eliminar losan+.genos /iados de/icien+emen+e o no /iados% A'$#$%n del sero problema, de +al /orma -e ss
an+icerpos reaccionarn espec./icamen+e con los an+.genos
/iados al sopor+e% La-a'o para eliminar los an+icerpos
marcados -e no @aan reaccionado%
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Fas*s '*. ELISA In'$r*#)o A'$#$%nde an+i=an+icerpos congados con na en2ima, los cales
reaccionan con los an+icerpos espec./icos aadidos en el pasoan+erior -e se encen+ran /iados a los an+.genos% La-a'o paraeliminar los an+i=an+icerpos marcados -e no @aan reaccionado%
A'$#$%n de n sbs+ra+o sobre el -e sea capa2 de ac+ar laen2ima marcadora% #e pede parar la reaccin si se desea%
L*#)!ravisal o colorim+rica del prodc+o /inal coloreado
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Leenda
'n+.geno
'n+icerpo
3rimario
'n+icerpoLigado a En2ima
#s+ra+o
Pr!*"a ELISA In'$r*#)a
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:ipos de ensaos
(EL' #'N*&F)
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Ap.$#a#$on*s '*. ELISA
D*)*##$%n '* an)+&*nos o an)$#!*rpos:
Girs
ongos3arsi+os
$ac+erias%
D*)*##$%n '* a!)oan)$#!*rpos:
&g< (Hac+or rema+oideo)
*N'
3ro+e.na del n7cleo
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Ap.$#a#$on*s '*. ELISA
M*'$#$%n '* 3oronas:
Pro&*s)*rona4 *s)r%&*nos4 #or)$so.4
$ns!.$na4 )*s)os)*rona4 &ona'o)rop$na#or$%n$#a !ana4 TS3
D*)*##$%n '* an)+&*nos )!ora.*s:
An)+&*no pros))$#oA.6a76*)opro)*+naAn)+&*no '*. o-ar$o
An)+&*no #ar#$no*"r$onar$o
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Ipor)an#$a
En es+dios serolgicos, @ema+olgicos,
endocrinolgicos, oncolgicos, en los
+ransplan+es, la medicina /orense la
an+ropolog.a%
Los resl+ados apor+an elemen+os
diagns+icos, in/ormacin de na en/ermedad coadvan en la plani/icacin del +ra+amien+o
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Fonsideraciones
Fora#$%n '* !na o s #apas '*$n!no#op.*os
Es el ensao de compe+icin del an+.geno% En es+a e+apa es mimpor+an+e con+rolar los /ac+ores +iempo +empera+ra deincbacin para evi+ar la aparicin de /alsos nega+ivos%
En el caso del +iempo, si es in/erior a 1A min+os, no ocrrir lain+eraccin an+.geno=an+icerpo el color no ser eviden+e al /inal del
ensao, dando n /also nega+ivo%
3or s par+e, si la +empera+ra de incbacin es m baa, la /ormacin
del compleo an+.geno=an+icerpo +ampoco se comple+ar en el +iempoes+ablecido,
;ien+ras -e si la +empera+ra es m al+a, las pro+e.nas (an+.geno an+icerpo) se desna+rali2an , por +an+o, disminen s capacidad
para in+eraccionar, dando igalmen+e /alsos nega+ivos%
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Fonsideraciones
R*-*.a'o '* .a r*a##$%n *n($)$#a
*esps de n lavado paraeliminar +odas las molclasmarcadas no /iadas en /orma deinmnocompleos, se aade elss+ra+o en2im+ico en solcin% #edea reaccionar se lee ladensidad p+ica median+eespec+ro/o+ome+r.a%
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L*#)or ELISA
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Con!&a'o: En($aLa en2ima escogida como marcador debe8
4nirse /cilmen+e a an+.genos an+icerpos,
Encon+rarse en es+ado pro a n precio ra2onable
:ener n sbs+ra+o cromognico o /lorognico convenien+e de /cil
preparacin%
Las en2imas ms
+ili2adas son /os/a+asalcalina, pero5idasa de
rbano I=galac+osidas
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ELISA DE CUARTA GENERACI,N
&den+i/icar an+icerpos con+ra el G& mspreco2men+e, sino +ambin inves+iga el an+.geno
3>D, na pro+e.na e5is+en+e en el virs G&%
El EL' DJ generacin es, por lo +an+o, n e5amen
doble -e bsca an+icerpos al propio virs%
Gen+ana inmnolgica de D semanas (en algnos
casos en @as+a > semanas)%