PRT-712.00-105 V2 Evaluación Medios Cultivo ISO 11133

PROCEDIMIENTO EVALUACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Fecha emisión: 28-10-2008 Revisión: 2 Fecha revisión: 10-01-2012

Sección Microbiología Alimentos PRT-712.00-105

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1. OBJETIVO

Asegurar la calidad de los medios de cultivos preparados en la Sección Microbiología de Alimentos utilizados en los análisis microbiológicos de alimentos y agua. 2. CAMPO DE APLICACION Y ALCANCE

Aplicable a medios preparados en el laboratorio y a medios comerciales listos para su uso. 3. FUNDAMENTO

Para realizar análisis microbiológicos de alimentos de manera confiable, es imprescindible utilizar medios de cultivo de calidad probada. Los criterios de rendimiento mínimos de aceptación evaluados mediante los métodos definidos y que además se puede aplicar por todos los laboratorios de microbiología para evaluar las propiedades productivas, selectivas y/ o específicas de un medio de cultivo. 4. REFERENCIAS

4.1 ISO 11133-2/ 2002: “Practical guidelines on performance testing of culture media”. 5. TERMINOLOGIA 5.1 Medio de Cultivo: Formulación de sustancias, en forma líquida, semi-sólida o sólida, las

cuales contienen constituyentes naturales y/o sintéticos que tiene como propósito permitir la multiplicación, o preservar la viabilidad de microorganismos.

5.2 Lote de Medio de cultivo: Unidad completamente trazable de un medio, referido a una

cantidad de granel, producto semi-terminado o producto final, el cual es consistente en tipo y calidad, y el cual ha pasado los requerimientos de producción (controles en proceso) y test que aseguren la calidad, y los cuales han sido producidos en un periodo de producción definido y se les ha asignado el mismo lote de producción.

5.3 Productividad: Evaluación de la capacidad de un medio de cultivo de favorecer o permitir el

desarrollo de un microorganismo que tenga una reacción “positiva” en dicho medio. 5.4 Selectividad: Evaluación de la capacidad de un medio de cultivo de inhibir el crecimiento o

desarrollo de un microorganismo que NO tenga una reacción “positiva” en dicho medio.




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5.5 Microorganismo objetivo: Corresponde a un microorganismo conocido al nivel de género y

especie, catalogado y descrito acorde a sus características. Es aquel microorganismo que se desarrolla o debería desarrollar en el medio de cultivo analizado.

5.6 Microorganismo no objetivo: Corresponde a un microorganismo conocido al nivel de género

y especie, catalogado y descrito acorde a sus características. Es aquel microorganismo que no se desarrolla o no debería desarrollar en el medio de cultivo analizado.

6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1. Materiales

6.1.1 Placas estériles de Petri

6.1.2 Tubos 16 x 160 mm

6.1.3 Asas calibradas 1µL

6.1.4 Asas calibradas de 10µL

6.1.5 Pipetas estériles1 mL y de 5 mL

6.1.6 Cepas ATCC

6.2 Medios de Cultivo y Reactivos

6.2.1 Agar no selectivo: Plate Count o Soya tripticase

6.2.2 Caldo de cultivo no selectivo: caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón

6.2.3 Agares selectivos a controlar

6.2.4 Caldos selectivos a controlar

6.3 Equipos

6.3.1 Baño de agua 47 ± 2 °C

6.3.2 Incubadora regulada a 35°C ± 1°C

6.3.3 Incubadora regulada a 30°C± 1°C

7 DESARROLLO DEL PROCESO

7.1 Preparación del cultivo de trabajo: Fase estacionaria

7.1.1 Utilizar un caldo no selectivo como: caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón.




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7.1.2 Dispensar en tubos una cantidad aproximada de 5 a 10 mL de caldo.

7.1.3 Inocular el caldo con la cepa objetivo de control (cepa deseada) para estudio de productividad y cepa no objetivo de control (no deseadas) para estudio de selectividad del medio a evaluar.

7.1.4 Incubar a 35°C por 24 horas.

7.1.5 Estimar la fase estacionaria para cada microorganismo de control a utilizar, realizando diluciones seriadas y consectivas suficientes ( Ejemplo: 10-9, 10-10 , 10-11 ).

7.1.6 Sembrar 1 mL u otra alícuota adecuada en duplicado de las diluciones elegidas e incubar 24- 48 horas a 35°C.

7.1.7 Efectuar recuento eligiendo las placas más cercanas a 250 ufc las que son equivalentes a la dilución 100 correspondiente a la fase estacionaria.

7.1.8 Estimar los valores de recuentos en forma descendente para las diluciones siguientes hasta llegar al valor 100 (Ejemplo: Fase estacionaria correspondiente a 100 = 8,6 x 109; 10-1 = 8,6 x 108 etc).

7.1.9 Esta fase estacionaria es útil para control de medios de cultivo para métodos cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos de productividad y selectividad.

7.1.10 Estandarizar para comparar.

7.1.11 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-22.

7.2 Concentraciones o densidad microbiana de trabajo del Microorganismo Objetivo (Deseado):

7.2.1 Para ensayos cuantitativos de productividad se requiere de una concentración de 102

ufc por placa que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa objetivo.

7.2.2 Para ensayos semicuantitativos y cualitativos de productividad, se requiere de una

concentración entre 103 a 10

4 ufc por placa que es estimada conforme al valor de la fase

estacionaria de la cepa objetivo.

7.2.3 Para ensayos de productividad en medios líquidos se requiere una concentración de 10

a 102 ufc que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa objetivo.

7.2.4 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022.




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7.3 Concentraciones o densidad microbiana de trabajo del Microorganismo No Objetivo

( No Deseado):

7.3.1 Para ensayos de selectividad en placa o tubos se requiere de una concentración de cepa

no objetivo entre 104 a 10

6 ufc por placa o tubo que es estimada conforme al valor de la

fase estacionaria de la cepa No objetivo.

7.4 Método de Productividad y Selectividad para medios de cultivo Sólidos

7.4.1 Método en placa: Cuantitativo:

7.4.1.1 Preparar tubo de caldo no selectivo (caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón) con cepa objetivo para el cálculo de Productividad y un tubo con caldo no selectivo con cepa no objetivo para cálculo de Selectividad respectivamente.

7.4.1.2 Estos cultivos corresponden a la fase estacionaria.

7.4.1.3 Realizar diluciones seriadas y consecutivas necesarias para obtener la alícuota con la concentración requerida, 102 ufc para la cepa objetivo y realizar diluciones necesarias para obtener la alícuota con la concentración requerida, 104 a 106 ufc para la cepa no objetivo.

7.4.1.4 Sembrar en duplicado en superficie o profundidad en el medio de cultivo a evaluar y en el medio de cultivo de referencia (Agar soya tripticase), una alícuota de 1mL; 0,1 mL u otro volumen que contenga la concentración requerida para la cepa objetivo (102 ufc) y para la cepa no objetivo (104 a 106 ufc).

7.4.1.5 Asegurarse que las superficies de las placas estén bien secas.

7.4.1.6 Incubar adecuadamente por 24 a 48 h a 35°C o según las condiciones establecidas en los métodos normalizados.

7.4.1.7 Contar las colonias.

7.4.1.8 Calcular la Productividad (PR) según fórmula: PR = Ns / N0 . Donde, Ns es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo sometido al ensayo (obtenido de una o más placas). N0 es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido, obtenido de una o más placas y, debe ser ≥ 100 ufc.

7.4.1.9 Calcular la Selectividad (SF) según fórmula: SF = D0 - DS. Donde D0 es la dilución más alta que muestra un crecimiento de al menos 10 colonias en el medio de referencia. DS es la dilución más alta que muestra un crecimiento comparable en el medio que está evaluando. Tanto SF, D0 y DS se expresan en logaritmos decimales.

7.4.1.10 Las características de especificidad están definidas en el Anexo N° 1.




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7.4.1.11 Interpretación :

7.4.1.11.1 La relación de productividad de un medio no selectivo es al menos 0,7 para los microorganismos que puedan crecer fácilmente en el medio. El PR del microorganismo objetivo en un medio selectivo debería ser al menos 0,1. Estos valores son generalmente alcanzables, sin embargo se pueden aceptar criterios menos rigurosos.

7.4.1.11.2 El SF de los microorganismos no objetivos en un medio selectivo debería ser al menos 2.

7.4.1.11.3 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022.

7.4.2 Método en placa: Semicuantitativo basado en ecométrico para medios de cultivo Sólidos:

7.4.2.1 Se requieren placas con 15 mL agar Soya Tripticase o Plate Count y placas con agar selectivo a evaluar.

7.4.2.2 Medios que se utilizan habitualmente para recuentos en profundidad, se pueden evaluar en superficie.

7.4.2.3 Preparar diluciones respectivas hasta obtener las concentraciones de trabajo a partir de la fase estacionaria de cepa objetivo cuya concentración requerida es de 103 a 104 ufc

y de la cepa no objetivo cuya concentración requerida es de 104 a 106 ufc.

7.4.2.4 Sembrar en estría con asa de 1µL, realizando cuatro líneas paralelas a intervalos de aproximadamente 0,5 cm en el sector A. La siembra en estría se repite en los sectores B y C y se acaba en el sector D con una sola línea. Se puede utilizar una plantilla bajo la placa para facilitar la siembra en estría. Ver figura N° 1.

7.4.2.5 Se emplea la misma asa para sembrar en estría todos los sectores y sin flamear entre las estrías.

7.4.2.6 Incubar por 24 a 48 h a 35° C o según las condiciones establecidas en los métodos normalizados.

7.4.2.7 Interpretación de las líneas de crecimiento y cálculo índice de crecimiento GI obtenido por una cepa objetivo en donde cada línea tiene un valor = 1 con un mínimo de 6 para que se pueda concluir que el medio es aceptable. Para medios no selectivos el GI es generalmente más elevado.

7.4.2.8 Estrías sin crecimiento o desarrollo escaso se marca como 0.

7.4.2.9 El crecimiento de cepas objetivo debe ser típico y el crecimiento de las cepas no objetivo debe ser parcial o completamente inhibido.

usuario

Resaltado




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7.4.2.10 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022.

7.4.3 Método en placa: cualitativo de siembra en estría (Para medios sólidos)

7.4.3.1 Preparar placas con 15 mL de Agar Plate Count o agar Soya tripticasa (TSA) y placas con agar selectivo a evaluar.

7.4.3.2 Los medios que habitualmente se siembran en profundidad se pueden ensayar en superficie.

7.4.3.3 Caldo de cultivo no selectivo con cepa objetivo y caldo de cultivo con cepa no objetivo respectivamente y provenientes de fase estacionaria.

7.4.3.4 Realizar diluciones correspondientes para obtener las concentraciones adecuadas y

estimar que en 1µL se obtendrá 102

ufc para cepa objetivo y 104 a 10

6 ufc para cepa

no objetivo.

usuario

Resaltado




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7.4.3.5 Con asa de 1 µL sembrar una línea recta en superficie.

7.4.3.6 Incubar por tiempo y temperatura de incubación establecidos en los métodos normalizados.

7.4.3.7 Interpretación resultados: rangos: 0 - 1 - 2 (sin desarrollo - lento o escaso - buen desarrollo).

7.4.3.8 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022

7.5 Método para medios de cultivo líquidos:

7.5.1 Siembra en placa: Método cuantitativo de dilución para cepa objetivo y no objetivo

7.5.1.1 Aplicable a medios de cultivo nuevos o soluciones de dilución.

7.5.1.2 Preparar tubos con 10 mL de caldo seleccionado para evaluar (seleccionar un apropiado N° de tubos).

7.5.1.3 Preparar tubos con 10 mL del caldo de referencia (caldo soya tripticase).

7.5.1.4 Inocular con la cepa objetivo ambos caldos por separado con una concentración del microorganismo de 10 a 100 ufc / tubo. Mezclar.

7.5.1.5 Inocular con microorganismo no objetivo ambos caldos por separado con Concentración > 1.000 ufc/tubo. Mezclar.

7.5.1.6 Inocular con cepa objetivo y con cepa no objetivo, cultivo mixto, ambos caldos por separado con una concentración del microorganismo objetivo de 10 a 100 ufc/tubo + una concentración del microorganismo no objetivo de >1.000 ufc/tubo. Mezclar.

7.5.1.7 Incubar a temperatura y tiempo establecidos en los métodos normalizados.

7.5.1.8 Sembrar un volumen apropiado en superficie en placas agar no selectivo.

7.5.1.9 Después de la incubación contar colonias de cada medio y provenientes de cada tubo respectivo.

7.5.1.10 En el caso de los tubos con el pool de microorganismos contar diferenciadas.

7.5.1.11 Lectura, cálculo de PR y SF según el procedimiento descrito en el numeral 7.4.1.1.8 y 7.4.1.1.9.

7.5.1.12 Interpretación:

7.5.1.12.1 Productividad satisfactoria o aceptable: Microorganismo objetivo PR ≥ 0,1 o

recuentos entre 106 a 10

8 ufc/mL.




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7.5.1.12.2 Selectividad satisfactoria o aceptable: Microorganismo no deseado SF. ≥ 2 o

recuentos ≤104 ufc/ mL.

7.5.1.12.3 En los cultivos mixtos o pool el crecimiento de los microorganismos objetivo no debe ser inhibido por los microorganismos no objetivo, es decir los microorganismos objetivos debe ser siempre la población dominante.


7.5.1.13 Control a los diluyentes:

7.5.1.13.1 Se inoculan los líquidos de dilución con los microorganismos de control (por ejemplo, de 100 ufc a 1.000 ufc por cada tubo). Mezclar.

7.5.1.13.2 Líquido de dilución incubar 45 minutos a temperatura ambiente y después sembrar en placa.

7.5.1.13.3 Para los medios de transporte incubar a tiempo y temperatura apropiados a su uso habitual.

7.5.1.13.4 Sembrar una alícuota o si es necesario una dilución después de la etapa de incubación y se vuelve a aislar sobre superficie en placas agar no selectivo para obtener recuentos dentro de los límites establecidos.

7.5.1.13.5 Después de la incubación el N° de microorganismos debe estar entre ± 50 % del recuento inicial. No se requieren ni un número reducido ni superior de organismos objetivo y/ o no objetivo.

7.5.1.13.6 Realizar el control de esterilidad agregando un volumen no menor a 10 mL del diluyente, por cada lote de producción, a un volumen de caldo soya tripticasa, manteniendo una relación de volumen de 1/10.

7.5.1.13.7 Incubar la mezcla por 24 horas a 35 ºC y verificar el desarrollo de microorganismos.

7.5.1.13.8 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022

7.5.2 Método Semicuantitativo del tubo único para microorganismos objetivo, no objetivo y mixtos

7.5.2.1 Seleccionar el caldo dispensado en 10 mL para evaluar.

7.5.2.2 Inocular con microorganismo objetivo y no objetivo, haciendo pool: inocular 1 tubo del caldo a evaluar con 10 a 100 ufc del microorganismo objetivo y en el mismo tubo inocular con microorganismo no objetivo una concentración >1.000 ufc /tubo. Mezclar.




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7.5.2.3 Inocular con microorganismo no deseado una concentración >1.000 ufc a un tubo de

medio a prueba.

7.5.2.4 Incubar a tiempo y temperatura establecidos en los métodos normalizados.

7.5.2.5 Remover con asa 10 µL (3mm) desde el tubo con cultivo mixto y sembrar en estría para aislar sobre placa de agar selectivo específico para microorganismo objetivo.

7.5.2.6 Remover con asa 10 µL desde cultivo con microorganismo no objetivo y sembrar por estría de aislamiento en medio no selectivo (TSA).

7.5.2.7 Incubar ambas placas en condiciones apropiadas durante un tiempo adecuado, como se indica en las normas individuales.

7.5.2.8 Interpretación resultados:

7.5.2.8.1 Productividad aceptable en medio cultivo líquido a evaluar es al menos con 10 colonias de microorganismo objetivo en agar selectivo.

7.5.2.8.2 Selectividad aceptable en medio de cultivo líquido a evaluar es si no hay desarrollo o el crecimiento es < 10 col del microorganismo no objetivo en agar no selectivo.


7.5.3 Método Cualitativo para tubo único

7.5.3.1 Apropiado para ensayos de rendimiento de medios de cultivo líquidos y las puntuaciones son sólo indicativas.

7.5.3.2 Los medios que por naturaleza son turbios, como el caldo tetrationato, no se pueden evaluar por este método.

7.5.3.3 Para probar el rendimiento de los medios de cultivo líquidos se siembran directamente empleando un asa de 1µL los cultivos de trabajo en el medio que se está probando.

7.5.3.4 Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubación establecidos en los métodos normalizados individuales.

7.5.3.5 No hay siembra en agar.

7.5.3.6 Interpretación resultados: rango 0- 1- 2 para turbiedad (turbidez nula, turbidez ligera, turbidez elevada).

7.5.3.7 Registrar los valores en hoja de registro RG-712.00-022.

usuario

Resaltado




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8 REGISTROS

8.1 Registro de preparación y evaluación de medios de cultivo y reactivos

9 ANEXOS

Anexo N° 1: Tabla microorganismos recomendados para control.




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ANEXO N° 1 MICROORGANISMOS RECOMENDADOS PARA CONTRO L

Tabla 1 - Medios selectivos para recuento de microo rganismos

Medio Tipo Micro-organismos Norma Función Incubación Cepas control Medio de

referencia Método de

control Criterios Reacciones características

Baird -

Parker

Sa) Estafilococos coagulasa positivos

EN ISO 6888-1

Productividad 24 h -48 h/ 37ºC

S. aureus ATCC 6538

S. aureus ATCC 25923b)

TSA Cuantitativo PR≥0,5 Colonias negro/gris con halo claro (reacción de aclaramiento de la yema de huevo)

Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 ó 8739b) - Cualitativo Inhibición total

-

Especificidad 24 h -48 h/ 37ºC

S. epidermidis ATCC 12228b) - Cualitativo - Colonias negro/gris sin reacción de aclaramiento de la yema de huevo

RPFA S Estafilococos coagulasa positivos

EN ISO 6888-2

Productividad 24 h -48 h/ 37ºC

S.aureus ATCC 6538 ó 6538 P

S. aureus ATCC 25923b)

TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias negro/gris con halo de opacidad

RPFA

Estafilococos coagulasa

EN ISO Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 ó 8739b) - Cualitativo Inhibición total

-




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S positivos 6888-2 Especificidad 24 h -48 h/

37ºC S.epidermidis ATCC 12228b) - Cualitativo - Colonias negro/gris sin halo

de opacidad

Tabla 1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuación)

Medio Tipo Micro-

organismos

Norma Función Incubación Cepas control Medio de referencia

Método de control Criterios

Reacciones características

Cloran-fenicol u

OGA (OGY)

S Levaduras/ Mohos

ISO 7954 Productividad 3-5 días/ 25ºC

C. albicans ATCC 10231

A. niger ATCC 16404b)

P. cyclopium ATCC 16025

S. cerevisiae ATCC 9763b)

Lote de medio SDA

(Sabouraud Dextrosa

Agar) u OGA o Agar

cloranfenicol

Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias características según cada especie

Selectividad 3-5 días/ 25ºC

E. coli ATCC 25922 ó 8739b)

B. subtilis ATCC 6633

- Cualitativo Inhibición total

-

MRS S Bacterias ácido láctica

ISO 15214 Productividad 72 h/ 30ºC L. sake ATCC 15521b)

Ped. damnosus ATCC 29358

Lc. lactis ATCC 19435b)

Lote de medio MRS ya validado

Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias características según cada especie




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Medio Tipo Micro-

organismos

Norma Función Incubación Cepas control Medio de referencia

Método de control Criterios

Reacciones características

Selectividad 72 h/ 30ºC E.coli ATCC 25922 u 8739b)

B. cereus ATCC 11778


-

MYP S Bacillus cereus

EN ISO 7932

(NCh3116) Productividad 24 h - 48 h/

30ºC B. cereus ATCC 11778b) TSA Cuantitativo PR≥ 0,7 Colonias rosa con

halo de precipitación

Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Cualitativo Inhibición total

-

Especificidad 48 h/ 37ºC B. subtilis ATCC 6633b) - - Colonias amarillas sin halo de precipitación

Oxford S Listeria mono-

cytogenes

EN ISO 11290

(NCh2657/2) Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC 19111

L. monocyt. 4b ATCC 13932b)

TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias de gris a negro con halo negro

Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b)

E. faecalis ATCC 29212 u 19433

C. albicans ATCC 10231


-




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Tabla 1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (continuación)




PALCAM S Listeria mono-cytogenes

EN ISO 11290

(NCh2657/2) Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC 19111

L. monocyt. 4b ATCC 13932b)

TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias gris-verdosas a negro con halo negro

Selectividad 72 h/ 30ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b)

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433


-

TS(C) S Clostridium perfringens

EN ISO 7937

(NCh3061) Productividad 20 h/ 37ºC

atmósfera anaerobia

Cl. perfringens ATCC 13124

Cl. perfringens ATCC 12916

Lote de medio TS(C) ya validado

Cuantitativo PR≥ 0,7 Colonias negras

Selectividad TSC 20 h/ 37ºC atmósfera anaerobia

E. coli ATCC 25922 u 8739 - Cualitativo Inhibición total

-

Especificidad TS - Cualitativo - Colonias blancas

VRBG S Enterobac-terias

ISO 7402 ISO 8523

Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b)

S. typhimurium ATCC 14028

TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación

Selectividad 24 h/ 37ºC E.faecalis ATCC 29212 ó 19433b) - Cualitativo Inhibición total

-

VRBL S Coliformes ISO 4832 Productividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b) TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias púrpura con o sin halo de precipitación

Selectividad 24 h/ 30ºC E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b) - Cualitativo Inhibición total

-




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Especificidad 24 h/ 30ºC Ps. aeruginosa ATCC 27853 - Cualitativo - Colonias de incoloras a beige

CT-SMAC S Escherichia coli O157

ISO 16654 Productividad 24 h/ 37ºC E. coli O 157:H7 ATCC 43894 ó 43895b)

(no tóxicas)

TSA Cuantitativo PR≥ 0,5 Colonias transparentes con un aspecto amarillento pálido -marrón y un diámetro de aproximadamente 1 mm

Selectividad 24 h/ 37ºC S.aureus ATCC 6538 ó 25923b) - Cualitativo Inhibición total

-

Especificidad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC 11775 ó 25922b) - Cualitativo - Colonias rosadas

Tabla 1 - Medios selectivos para recuento de microorganismos (conclusión)




BGBLB Lc) Coliformes ISO 4831 Productividad 24 h - 48 h/ 30ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

C. freundii ATCC 43864

- Semi- cuantitativo

Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana

Durham

Producción de gas y turbidez

Selectividad 24 h - 48 h/ 30ºC

E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b)

- Cualitativo Ausencia de crecimiento

-




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LST L Coliformes ISO 4831 Productividad 24 h - 48 h/ 30ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b)

C. freundii ATCC 43864

- Semi- cuantitativo


Durham


Selectividad - E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b)

- Cualitativo Ausencia de crecimiento

-

EC L Escherichia coli

ISO 7251 Productividad 24 h - 48 h/ 44ºC

E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Semi- cuantitativo


Durham



Ps. aeruginosa ATCC 27853b) - Cualitativo Ausencia de crecimiento

-

a) S = medio sólido.

b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo).

c) L = medio líquido.

NOTA - Para los medios de cultivo sólidos es posible también utilizar un método en placa semicuantitativo.




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Tabla 2 - Medios no selectivos para recuento de microorganismos




PCA Sa) Flora total ISO 4833 Productividad 72 h/ 30ºC E. coli ATCC 25922 ó 8739b)

S. aureus ATCC 6538 ó 6538P

B. subtilis ATCC 6633b)

TSA Cuantitativo PR≥ 0,7 -



Tabla 3 - Medios de enriquecimiento selectivos

Medio Ver

Anexo E Tipo Micro-

organismos Norma Función Incubación Cepas control Medio de referencia

Método de control Criterios Reacciones

características

EE La) Enterobacte-rias

ISO 7402

ISO 8523

Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b)

o S. typhimurium ATCC 14028

- Semi-cuantitativo

>10 col. en VRBG Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación

Selectividad 24 h/ 37ºC + E. faecalis ATCC 29212 ó 19433b)

- Semi-cuantitativo

Inhibición total -




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Medio Ver

Anexo E Tipo Micro-

organismos Norma Función Incubación Cepas control Medio de referencia

Método de control Criterios Reacciones

características

Half-Fraser

L Listeria mono-

cytogenes

EN ISO 11290-1

Productividad 24 h/ 30ºC L. monocyt. 1/2a ATCC 19111

o L. Monocyt.. 4b ATCC 13932b)

+ E.coli ATCC 25922 u 8739b) + E. faecalis ATCC 29212 ó

19433b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en Oxford o PALCAM

Colonias de gris a negro con halo negro

Selectividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC 25922 ó 8739b) - Semi-cuantitativo

Inhibición total en TSA

- E. faecalis ATCC 29212 ó

19433 <100 colonias en

TSA




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Tabla 3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuación)




Fraser L Listeria mono-

cytogenes

EN ISO 11290-1

Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC 19111

o L. Monocyt. 4b ATCC 13932b) + E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +E.faecalis ATCC 29212

ó 19433b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en Oxford o PALCAM

Colonias de gris a negro con halo negro


E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Semi-cuantitativo


-


<100 colonias en TSA

ITC L Yersinia enterocolitica

ISO 10273 Productividad 48 h/ 25ºC Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b)

+ E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en CIN o SSDC

Colonias características según cada medio (ver norma)

Selectividad 48 h/ 25ºC Ps. aeruginosa ATCC 27853b) P. mirabilis ATCC 29906

- Semi-cuantitativo


-

Park & Sanders

L Campylo-bacter

ISO 10272 Productividad Ver norma C. coli ATCC 43478*

o C.jejuni ATCC 33291 ó 29428*

+E. coli ATCC 25922 u 8739b)

+P. mirabilis ATCC 29906b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en medio Karmali u otro medio elegido





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Selectividad Ver norma E. coli ATCC 25922 u 8739b)

P. mirabilis ATCC 29906

- Semi-cuantitativo


-

Preston L Campylo-bacter

ISO 10272 Productividad 18 h/ 42ºC C. coli ATCC 43478b)

o C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b)

+ E. coli ATCC 25922 u 8739b) +P. mirabilis ATCC 29906b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en medio Karmali u otro medio elegido


Selectividad 18 h/ 42ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b) P.mirabilis ATCC 29906

- Semi-cuantitativo


-

Tabla 3 - Medios de enriquecimiento selectivos (continuación)




PSB L Yersinia enterocolitica

ISO 10273 Productividad 3-5 días/ 25ºC

Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b)

+ E. coli ATCC 25922 ó 8739b) +Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en CIN o SSDC


Selectividad 3-5 días/ 25ºC

Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

P.mirabilis ATCC 29906

- Semi-cuantitativo


-




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MKTTn L Salmonella ISO 6579 Productividad 24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC 14028b)

o S. enteritidis ATCC 13076b)

+E.coli ATCC 25922 u 8739b)

+Ps. aeruginosa ATCC 27853b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en XLD u otro medio de

elección


Selectividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Semi-cuantitativo


-

E.faecalis ATCC 29212 ó 19433

<10 col. en TSA

Rappaport Vassiliadis

L Salmonella EN 12824 Productividad 24 h/ 41,5ºC S. typhimurium ATCC 14028b)


+E. coli ATCC 25922 u 8739

+Ps.aeruginosa ATCC 27853

- Semi-cuantitativo

>10 col. en BGA u otro medio de

elección


Selectividad 24 h/ 41,5ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b)

- Semi-cuantitativo


-


<10 col. en TSA

RVS L Salmonella ISO 6579 Productividad 24 h/ 41,5ºC S. typhimurium ATCC 14028


+E.coli ATCC 25922 ó 8739b)

+Ps.aeruginosa ATCC 27853*

- Semi-cuantitativo

>10 col. en XLD u otro medio de

elección





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Selectividad 24 h/ 41,5ºC E.coli ATCC 25922 u 8739b) - Semi-cuantitativo


-


<10 col. en TSA

Selenito-cistina

L Salmonella EN 12824 Productividad 24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC 14028b)


+E.coli ATCC 25922 u 8739b)

+Ps.aeruginosa ATCC 27853b)

- Semi-cuantitativo

>10 col. en BGA u otro medio de

elección


Selectividad 24 h/ 37ºC E.coli ATCC 25922 u 8739b) - Semi-cuantitativo

<100 colonias en TSA

-


a) L = medio líquido.


Tabla 4 - Medios de enriquecimiento no selectivos




BHI La) Staphylococcus ISO 6888 Productividad 24 h/ 37ºC S. aureus ATCC 25923b) - Cualitativo Turbidez de 1 a 2 -

Brucella L Campylobacter ISO 10272 Productividad 2-5 días/ 25ºC

C. coli ATCC 43478 - Cualitativo Turbidez de 1 a 2 -




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C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b)

Peptona salina

L Líquidos de dilución

ISO 6887 Diluyente 45 min/ 20ºC-25ºC

E. coli ATCC 25922 ó 8739b)

S. aureus ATCC 25923

TSA Cuantitativo ± 50% col./T0 (±50% del

recuento original

-

Thioglicolato

L Clostridium perfringens

ISO 7937

(NCh3061) Productividad 24 h/ 37ºC Cl. perfringens ATCC 13124b) - Cualitativo Turbidez de 1 a 2 -

TSYEB L Listeria monocytogenes

ISO 11290 Productividad 24 h/ 25ºC L. monocyt. ½ a ATCC 19111

L. monocyt. 4b ATCC 13932

b)

- Cualitativo Turbidez de 1 a 2 -

a) = L medio líquido.


Tabla 5 - Medios de aislamiento selectivos

Medio Tipo Microorganismos Norma Función Incubación Cepas control Medio de referencia

Método de

control Criterios Reacciones

características

Butzler modificado

Sa) Campylobacter ISO 10272 Productividad 24 h - 72 h/ 42ºC

C. coli ATCC 43478 - Cualitativo Buen crecimiento (2)

Colonias características

según cada medio (ver norma)

CCDA Karmali

Preston

C. jejuni ATCC 33291 ó 29428b)




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Método de


características

Skirrow


E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Cualitativo Inhibición total o parcial (0-1)

Colonias no características

S. aureus ATCC 25923 Inhibición total (0) -

CIN S Yersinia enterocolitica

ISO 10273 Productividad 24 h/ 30ºC Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610b)

- Cualitativo Buen crecimiento (2)

Colonias caracteristicas

según cada medio (ver norma)

SSDC Selectividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Cualitativo Inhibición total o parcial (0-1)


S. aureus ATCC 25923 Inhibición total (0)

-

Agar verde brillante (BGA)

XLD

S Salmonella EN 12824/ ISO 6579

Productividad 24 h - 48 h/ 37ºC

S. typhimurium ATCC 14028b)

S. enteritidis ATCC 13076

- Cualitativo Buen crecimiento (2)

Colonias características

según cada medio

(ver norma)


E. coli ATCC 25922 u 8739b) - Cualitativo Inhibición total o parcial (0-1)



Inhibición total (0)

-





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Método de


características


Tabla 6 - Medios de aislamiento no selectivos


Método de


características

Agar nutritivo

Sa) Enterobacteriaceae ISO 7402 ISO 8523

Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC 25922 u 8739c) - Cualitativo

Buen crecimiento (2)

-

Salmonella EN 12824 ISO 6579

24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC 14028c)

Yersinia enterocolitica

ISO 10273 24 h/ 30ºC Y. enterocolitica ATCC 23715 ó 9610c)

Agar TSYEA

S Listeria monocytogenes

EN ISO 11290

Productividad 24 h/ 37ºC L. monocyt. ½a ATCC 1911 ó L. Monocyt. 4b ATCC 13932b)

- Cualitativo

Buen crecimiento (2)

-

a) S = Medio sólido.

b) Cepas a emplear por el laboratorio (mínimo).

c) Cepas de libre elección según el método utilizado.

PRT-712.00-105 V2 Evaluación Medios Cultivo ISO 11133

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