Proyecto de Innovación Tecnológica 2016 · 2016-02-28 · conjunto han demostrado potenciar el...

Faltan parámetros necesarios o son incorrectos. 1

Proyecto de Innovación Tecnológica 2016

DATOS DEL PROYECTO

Título del Proyecto:

Preservación efectiva mediante liofilización de cepas del inoculante multi-especies EMMIM-1 (Parte II)

Disciplina: Agrobiotecnología

Tiene una solicitud de patente: No ( ) Si ( X) Número de solicitud: MX2013007978 Título de la invención: Formulación de un inoculante multiespecies para potenciar el crecimiento de plantas Nombre del Responsable: Jesús Muñoz Rojas Si colaboran más integrantes mencionarlos: Nota: preferentemente se apoyará a equipos multidiciplinarios Dr. Luis Ernesto Fuentes Ramírez Dr. José Antonio Munive Hernández Dra. Yolanda Elizabeth Morales García Dra. María del Rocío Bustillos-Cristales Dra. Dolores Castañeda-Antonio

Indique el Área de aplicación

( ) Salud ( ) Energía y Medio

Ambiente ( ) Electrónica, Computación y

Comunicaciones

(X) Agroalimentación ( ) Biotecnología

( ) Materiales

(X) Otro _Agrobiotecnología__


Nombre del estudiante becario: Ana Laura Hernández-Tenorio Matricula: 214470781 Programa Académico: Maestría en Ciencias (Microbiología) Nombre del estudiante becario: Dalia Molina Romero Matricula: 212570880 Programa Académico: Doctorado en Ciencias (Microbiología) Nombre: Raúl Vivanco Calixto Matricula:213570739 Programa Académico: Doctorado en Ciencias (Microbiología) Nombre: Osvaldo Rodríguez Andrade Matrícula: 212570881 Programa Académico: Doctorado en Ciencias (Microbiología)

INFORMACIÓN DEL PROYECTO

Resumen: La formulación multiespecies EMMIM-1 contiene seis especies de bacterias benéficas que en conjunto han demostrado potenciar el crecimiento de plantas. Son bacterias compatibles entre sí a pesar de producir sustancias inhibitorias, son promotoras del crecimiento de plantas por diversos mecanismos, son resistentes a la desecación y 4 de ellas son biorremediadoras por lo que el potencial de la formulación multiespecies podría ampliarse para realizar biorremediación en zonas áridas o de escasez de agua. La formulación multiespecies a la fecha se produce de forma líquida y su vida de anaquel ha sido determinada en 6 meses a 4 grados centígrados, lo que genera inconvenientes de transporte y estabilidad del producto. Por esta razón y con el propósito de obtener una formulación multiespecies con amplia estabilidad sin necesidad del uso de refrigeradores y cuya formulación sea práctica para su transporte, en el presente trabajo se propone obtener un liofilizado de células de la formulación EMMIM-1 con un protector económico. El grupo que dirijo tiene amplia experiencia en estudios relacionados con la tolerancia a la desecación de células bacterianas y su preservación bajo condiciones de liofilización. En el trabajo presente se evaluó en una primera etapa la supervivencia de las bacterias que conforman a la formulación después de su desecación por liofilización usando protectores económicos y efectivos. Se exploró el uso de sacarosa 100 mM, leche 20% diluida, myo-inositol 100 mM y extracto de levadura 10%. En una segunda etapa, se propone evaluar la efectividad biológica de las células almacenadas bajo las mejores condiciones y demostrar que aún tienen la capacidad de adherirse a semillas, colonizar la rizósfera de maíz y de promover el crecimiento de plantas a pesar de haber sido almacenadas varios meses. El proyecto se propone a dos años para conocer el alcance de protección de células desecadas y almacenadas por largos periodos. En este segundo año proponemos liofilizar las células del inoculante multiespecies en sacarosa (un protector con buenos resultados en el primer año; donde las células dejan de ser cultivables pero mantienen su viabilidad). Con esas células desecadas se propone corroborar su regreso del estado “viable no cultivable” al estado “viable cultivable”, su capacidad de colonización en plantas de maíz, así como evaluar si se conservan sus efectos promotores de crecimiento de plantas de maíz, a pesar del almacenaje en polvo. Este último objetivo es un reto de alto impacto y el recurso y tiempo requerido para desarrollar esta parte, de mayor envergadura respecto al de los objetivos anteriores, está acorde con el monto y periodo de apoyo otorgado (9 meses), razón por la que a pesar que se plantea aparentemente resolver un objetivo se debe considerar que es el de mayor trascendencia del proyecto. Palabras Claves: Liofilización bacteriana, supervivencia a la desecación, adhesión y colonización bacteriana, Promoción del crecimiento de plantas.


Describir el problema tecnológico a resolver: La formulación multiespecies EMMIM-1 es efectiva para potenciar el crecimiento de plantas diversas. Sin embargo el tiempo de anaquel es relativamente corto (6 meses), requiere gasto de energía costoso (refrigeración a 4 grados centígrados) y su transporte podría resultar problemático. Por esta razón, el presente proyecto tiene como propósito principal incrementar el tiempo de anaquel de la formulación multiespecies EMMIM-1 usando tecnologías de ahidrobiosis de células, manteniéndolas en dormancia en su condición desecada y permitiendo su resurrección bajo condiciones adecuadas de rehidratación. La obtención de una formulación en polvo de EMMIM-1 con un protector económico, permitirá una mejor supervivencia celular, una forma práctica de transporte a temperatura ambiente y se espera se mantengan las características de una adecuada efectividad biológica. Antecedentes del Proyecto a desarrollar:

En el planeta existe una gran diversidad de especies bacterianas las cuales se encuentran en los diferentes ecosistemas realizando funciones e interacciones con otros organismos. Las bacterias pueden tener propiedades benéficas desde una perspectiva biotecnológica, agrícola, ecológica, en biorremediación y biomedicina (Lucy et al., 2004). Un ejemplo de interés agrícola son las bacterias que colonizan la rizósfera; que es el suelo que se encuentra bajo la influencia de los exudados de las raíces de las plantas (Kennedy, 2005). Las bacterias que rizosféricas que tienen un efecto positivo sobre el crecimiento de las plantas se llaman rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR por sus siglas en inglés). Los mecanismos que las bacterias tienen para promover el crecimiento de plantas se clasifican en directos e indirectos: 1.- Mecanismos directos.

Cuando ocurre un mecanismo directo hay una mejora del estado de los nutrientes de la planta (Antoun y Prévost, 2005), ya sea por su valor nutrimental o su efecto hormonal. Los ejemplos incluyen la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfatos minerales, producción de sustancias o moléculas volátiles (tipo fitohormona) y fitohormonas en rizósfera; como ácido Indol acético (AIA), giberelinas, auxinas y citoquinas. 2.- Mecanismos indirectos.

En el cual las bacterias benéficas producen metabolitos que pueden inducir respuesta de defensa en plantas contra los posibles patógenos presentes en el entorno o bien producir algunas sustancias inhibitorias contra esos patógenos; lo cual conduce a plantas más sanas y con menos posibilidad a ser atacadas por un patógeno. Adicionalmente, la inducción de mecanismos de degradación de xenobióticos presentes en suelos contaminados podría significar un mecanismo de efecto benéfico indirecto, sobre todo si los contaminantes presentes afectan el crecimiento de las plantas (Jiménez Delgadillo et al., 2001).

Rizobacterias promotoras de crecimiento de las plantas (PGPR)

Las PGPR son importantes por poseer diversos mecanismos en la promoción del crecimiento de las plantas, por esta razón, en las últimas décadas se ha realizado una búsqueda intensiva de bacterias que sean benéficas para la agricultura y a continuación se describen algunos ejemplos de bacterias que actúan como PGPR. El género Azospirillum (del francés Azote-nitrógeno y del grupo Spirillum-espiral) comprende bacterias Gram negativas, de vida libre, fijadoras de nitrógeno y asociadas a la rizósfera de la planta, se encuentran en zonas templadas, tropicales y subtropicales, son bacterias mótiles (Parra et al., 2001). La especie más estudiada de este género es Azospirillum brasilense, debido a que es una bacteria con la capacidad de fijar de nitrógeno; lo cual es común en el género. Las colonias de A. brasilense son rojo escarlata crecidas en medio “Rojo Congo”, produce fitohormonas como auxinas, citoquininas, giberelinas y la auxina más estudiada es el ácido 3-indol-acético (AIA), se encuentra en ambientes tropicales a temperaturas de 30ºC-40ºC (Cassán et al., 2008). Pseudomonas putida es una bacteria saprófita del suelo, Gram negativa, aerobia, móvil, posee una dioxigenasa inicial, una toluenodioxigenasa, se caracteriza por poseer la capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos (de tipo xileno o etilbenceno) y otros xenobióticos; los cuales usa como fuente de carbono en condiciones aeróbicas evitando de esta manera la contaminación medioambiental producida por dichos compuestos (Ramos et al., 2005), P. putida es capaz de producir auxinas, giberelinas, citoquininas y ácido 3-indol-acético (AIA); coloniza efectivamente la


rizósfera de plantas y es antagonista de patógenos asociados a las raíces. Gluconacetobacter diazotrophicus se aisló por primera vez por Cavalcante y Döbereiner en raíz y tallos de caña de azúcar en diversas regiones de Brasil (Cavalcante y Döbereiner, 1988), es una bacteria endófita y se encuentra en los tejidos vasculares como Xilema y en los espacios intracelulares. En condiciones de laboratorio tiene la capacidad de fijar nitrógeno en presencia de nitratos, resulta más abundante en medios de cultivo que contienen 10 % de sacarosa y pH de 5.5 (Muñoz- Rojas y Caballero-Mellado, 2001). La bacteria también se ha descrito asociada a la rizósfera de plantas y promueve su crecimiento vía independiente a la fijación biológica de nitrógeno; quizás por la producción de AIA (Muñoz-Rojas y Caballero-Mellado, 2003). Burkholderia unamae es una bacteria Gram negativa que ha sido aislada de la rizósfera de maíz, caña de azúcar y café (Caballero-Mellado et al., 2004). Estas cepas tienen la capacidad de fijar nitrógeno con diferentes fuentes de carbono, solubilizan fosfatos insolubles, producen sideróforos; lo cual la hacen una bacteria con capacidad de antagonizar fitopatógenos protegiendo a la planta y usa compuestos aromáticos de tipo fenol como fuente de carbono. Bradyrhizobium sp. Son bacterias Gram negativas, producen alcalinidad y son fijadoras de nitrógeno se caracterizan por hacer simbiosis con la familia de las leguminosas formando nódulos, son de vida libre, produce sideróforos, solubilizan fosfatos inorgánicos, es productor de ácido indolacético (AIA) y promueve el crecimiento de las plantas (Cuadrado et al., 2009). Sphingomonas sp. Comprende bacterias Gram negativas, en forma de bacilo, aerobias y quimioheterótrofas (tanto la energía como el carbono pueden obtenerse del metabolismo de un mismo sustrato orgánico). Estas bacterias se encuentran distribuidas en varios ambientes tanto acuáticos como terrestres. Diversos organismos del género tiene la capacidad de degradar diferentes compuestos xenobióticos y algunos componentes de tipo herbicida y plaguicida utilizados en campo, también se sabe que el género es capaz de producir sustancias que antagonizan tanto a hongos como bacterias fitopatógenas por esto es considerada una bacteria de interés biotecnológico (Basta et al., 2004; Böltner et al., 2008). Inoculantes Microbianos Los “inoculantes microbianos” se definen como formulaciones que contienen uno o más microorganismos dentro de un soporte; cuya función es la de transportar de forma viable a los microorganismos desde donde son producidos hasta el campo donde son utilizados (Bashan, 1998). Estos pueden subclasificarse de forma general en función de la actividad que tienen las bacterias y algunos ejemplos se dan a continuación: 1) Biofertilizantes, cuando los microorganismos que contienen aportan algún nutriente esencial para la planta a partir del medio que lo rodea. 2) Bioestimulantes, cuando los microorganismos que contiene la formulación interaccionan con las plantas aportando alguna molécula de tipo hormonal que acelera el crecimiento celular de raíces y por consiguiente la mejor absorción de nutrientes. 3) Bioremediante, cuando los microorganismos tienen vías metabólicas de degradación de contaminantes o sustancias xenobióticos. 4) Biocontrolante, cuando los microorganismos que contiene realizan antagonismo contra patógenos, lo que conduce a plantas más sanas. Para que un inoculante tenga una amplia aplicación es necesario que la inoculación sea práctica, económica y fácil de manejar para el agricultor, debe proveer un inóculo suficiente para la planta; debe ser competitivo con las normas comerciales vigentes, así mismo tener una larga viabilidad en las condiciones de almacenamiento (Bashan et al., 1997). Inoculante multiespecies EMMIM-1

Morales García y colaboradores (2009) llevaron a cabo estudios de antagonismo entre diferentes cepas bacterianas de los géneros Pseudomonas, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphingomonas, Burkholderia y Bradyrhizobium, Enterobacter, Azotobacter y Klebsiellla, notando que individualmente producen sustancias inhibitorias y que algunas especies a pesar de esa producción son capaces de coexistir en conjunto. Con los datos anteriores se formuló un inoculante con seis especies bacterianas capaces de coexistir a pesar de producir sustancias inhibitorias (Morales-García, 2013). Las bacterias que conforman al inoculante multi-especies son: G. diazotrophicus PAl 5, Bradyrhizobium sp. MS22, B. unamae MTl-641, Sphingomonas sp. OF178, A. brasilense Sp7 y P. putida KT2440; todas las cepas son parte de una formulación líquida denominada EMMIM-1 cuyo soporte es agua (Muñoz-Rojas et al., 2013). Con el uso de medios selectivos para cada especie, realizaron estudios de inoculación de semillas de maíz con estas cepas individualmente como en mezcla; mostrando que pueden colonizar y coexistir en la rizósfera.


Morales García y colaboradores (2011) evaluaron la promoción de crecimiento del inoculante multi-especies y lo compararon con un inoculante comercial (Azospirillum brasilense y Micorriza) en plantas de maíz de diferentes variedades (criollas) en campos de temporal, observando que el porcentaje de nacencia fue mayor para plantas inoculadas con el multi-inoculante en referencia a las plantas no inoculadas y plantas inoculadas con inoculante comercial. Con el multi-inoculante las plantas de maíz alcanzaron una mayor altura y grosor del tallo que las plantas (Morales-García, 2013). Otras formulaciones multiespecies también han resultados efectivas para promover el crecimiento de caña de azúcar (Oliveira et al., 2008) y de Echinocactus plathyacanthus (Alatorre-Cruz, 2013).

La formulación mutiespecies además ha sido probada para estimular el crecimiento de frijol (Juárez-Hernández, 2013), papa (Santiago-Saenz et al., 2014) y se recientemente se exploró su potencial para estimular el crecimiento de otras plantas de interés agrícola, como jitomate, lechuga y plantas de cafeto (Apoyo DiTCo2014-09).

El potencial de la formulación multiespecies EMMIM-1 es muy grande para la agricultura, por lo que en el grupo de Ecología Molecular Microbiana se evaluó la estabilidad de la formulación líquida (Hernández-Tenorio, 2014), encontrando que la viabilidad y cultivabilidad de las bacterias que conforman el inoculante multiespecies es mejor cuando la formulación se almacena a 4 grados centígrados. No obstante el tiempo de anaquel fue óptimo solo durante 6 meses y adicionalmente bajo condiciones líquidas existen problemas de transporte desde el laboratorio al campo. En el presente protocolo se propone realizar estudios de estabilidad de la formulación multiespecies para su almacenamiento efectivo por mayor tiempo y en forma de polvo. Se evaluará la supervivencia a la liofilización, de las bacterias que conforman la formulación multiespecies y se ensayará su efectividad después de dicho proceso. Fundamentación Técnica del Proyecto: Conservación de bacterias a largo plazo.

La preservación de bacterias es un paso muy importante, debido a que las bacterias representan un potencial muy importante por diversos beneficios antes mencionados, así que si guardamos a estos microorganismos, de cierta forma estamos resguardando su potencial biotecnológico (Morales-García et al., 2010) Existen métodos de conservación los cuales pueden ser de tres formas generales: 1.- Preservación a corto plazo; el cual consiste en realizar la resiembra continua de la cepa. 2.- Preservación a mediano plazo, consiste en el resguardo de células en ultra congeladores que las mantienen a -80°C. 3.- Preservación a largo plazo, mediante el proceso de liofilización; que consiste fundamentalmente en extraer por sublimación, bajo condiciones de alto vacío, el agua de las células congeladas, el agua pasa directamente a un estado de vapor debido a que no hay presión molecular que lo impida. Una vez que las bacterias se liofilizan, estas pueden permanecer en un lugar fresco a una temperatura que oscile entre los 15 a los 25°C, esto significa guardar a las muestras liofilizadas a temperatura ambiente. El punto limitante del método es que aún hay poco conocimiento en la forma adecuada para preservar a la mayoría de las bacterias por este método y de acuerdo con los datos con que se cuenta no existe un lio-protector universal para todas las cepas bacterianas y se debe explorar la supervivencia a la liofilización para cada caso particular (Morgan et al., 2006). Sin embargo, Muñoz-Rojas et al., 2006 evaluaron las condiciones para la conservación óptima de la cepa P. putida KT2440 la cual fue sometida a congelación (-80°C) y liofilización. Observando que las tasas de supervivencia más altas se obtuvieron con células que habían alcanzado la fase estacionaria y que había sido sometidos a liofilización en presencia de disacáridos (trehalosa, sacarosa maltosa y lactosa) como lio-protectores. Los azúcares ofrecen buena capacidad protectora en diversas bacterias (Leslie et al., 1995; Morales-García et al., 2010, Rojas-Tapias et al., 2013), pero los lioprotectores explorados han sido diferentes y se poco se conoce sobre la supervivencia de bacterias en mezclas. Recientemente en nuestro grupo de investigación se exploró la capacidad de sacarosa y otros protectores para proteger a las bacterias benéficas del proceso de desecación por liofilización (Morales-García et al., 2010) y desecación natura (Resultados no publicados), observando que es un excelente protector, quizás manteniendo la estructura de las membranas celulares como ha sido propuesto en la teoría de resustitución de moléculas de agua (Leslie et al., 1995). En el presente trabajo se explorará la capacidad de distintos protectores para mantener la viabilidad de las bacterias que conforman a la formulación multiespecies (tanto de forma individual como en mezcla) después de la liofilización. El mejor protector será usado para evaluar a largo plazo su capacidad para mantener de forma viable a las


células de la formulación multiespecies, así como de mantener sus capacidades biológicas de forma efectiva (como son adherencia, colonización y promoción de crecimiento de plantas), aun después de su almacenamiento a largo plazo. Objetivo: Evaluar la viabilidad y efectividad PGPR de las cepas que conforman al inoculante multiespecies EMMIM-1 antes y después de la liofilización, con la finalidad de obtener un proceso efectivo de resguardo en anaquel de la formulación a largo plazo. Objetivos específicos:

1) Evaluar la supervivencia a la liofilización, en presencia de distintos protectores, de las cepas bacterianas que conforman al inoculante multi-especies EMMIM-1 de manera individual como en mezcla, para seleccionar el protector más adecuado. (100%)

2) Evaluar la supervivencia, a largo plazo, de las cepas que conforman al inoculante

multiespecies EMMIM-1 usando el protector más efectivo. (70%)

3) Evaluar la capacidad del inoculante multi-especies EMMIM-1 para adherirse a semillas y colonizar plantas de maíz, antes y después de la liofilización, usando el protector más efectivo. (100%)

4) Evaluar la capacidad de la formulación multiespecies para promover el crecimiento

en plantas de maíz utilizando el inoculante multi-especies EMMIM-1 antes y después de la liofilización; con el protector más efectivo. (20%)

Metodología: Evaluación de distintos protectores para las cepas que conforman al inoculante multiespecies EMMIM-1. Las formulaciones tanto individuales (6) como en mezcla (1) se prepararan de manera líquida de acuerdo con Morales-García 2013. Las células se crecerán en medio sólido de selección en placas de 40 X 40 cm con aproximadamente 125 ml de medio de cultivo gelificado. La cosecha se llevará a cabo agregando 100 ml de agua destilada estéril a cada placa. Para desprender las cepas se utilizarán seis espátulas estériles, de cada 100 ml obtenidos se colocarán 20 ml en frascos estériles de 400 ml de capacidad y se aforarán a 300 ml obteniendo seis frascos con las seis baterías independientes. Para realizar la mezcla se tomarán 20 ml de cada cepa en un frasco estéril de capacidad de 400 ml, haciendo un total de 120 ml que se aforarán a 300 ml (en total seis frascos con cepas individuales y un frasco con el inoculante multi-especies). De cada frasco se tomarán alícuotas de 1ml de las suspensiones bacterianas. Estos serán lavados por centrifugación dos veces. Los pellet obtenidos serán resuspendidos en dos condiciones: agua o lioprotector (Se explorará el uso de sacarosa 100 mM, leche 20% diluida, myo-inositol 100 mM y extracto de levadura 10%). Cada suspensión bacteriana se colocará en 20 tubos Ependorf los cuales se someterán a congelación antes de ser liofilizados. Después de la liofilización las cepas se conservaran en condiciones ambientales, la temperatura y humedad relativa del sitio de almacenaje serán registrados tres veces al día. Antes de la liofilización, así como cada 5 días y hasta el día 20 después de la liofilización se realizará el recuento de bacterias viables, usando 5 muestras, mediante el método de goteo por sellado masivo (Corral-Lugo et al., 2012). Se seleccionará el protector que permita la mejor supervivencia de bacterias. Evaluación de la supervivencia de las bacterias que componen inoculante multi-especies EMMIM-1, sometido a liofilización, durante un año con el protector más efectivo. Las formulaciones tanto individuales como en mezcla se prepararan de manera como se mencionó anteriormente. Estas serán lavadas por centrifugación dos veces. Los pellet obtenidos serán resuspendidos en dos condiciones: agua o protector efectivo. Cada suspensión bacteriana se colocará en 120 tubos Ependorf los cuales se someterán a congelación antes de ser liofilizados. Después de la liofilización las cepas se conservaran en condiciones ambientales, la temperatura y humedad relativa del sitio de almacenaje serán registrados tres veces al día. Cada 15 días se


realizará el recuento de bacterias de 5 muestras mediante el método de Goteo por Sellado en Placa Masivo (GSPM) (Corral Lugo et al., 2010) las placas se incubarán a 30ºC, posteriormente se contarán las colonias y se obtendrá la tasa de supervivencia bacteriana (BSR) la cual es la relación del registro del número de células bacterianas presentes en una suspensión después de algún estrés en referencia con el número observado antes del estrés (Muñoz-Rojas et al., 2006). Efectividad biológica del inoculante multi-especies EMMIM-1 antes y después de la liofilización en semillas de maíz. Para determinar si el inoculante multi-especies conserva su actividad biológica después de la liofilización, se comparará la capacidad de las bacterias de adherirse a semillas, colonizar rhizósfera y promover el crecimiento de maíz, antes y después de la liofilización. Se obtendrán las suspensiones de bacterias de cada tratamiento (8 totales; incluyendo control agua) como se describió anteriormente. Cuatro tubos Falcon con 25 ml de cada suspensión serán obtenidos; un tubo será destinado para evaluar la actividad biológica antes de la liofilización y los otros tres serán sometidos a liofilización y se evaluará su actividad biológica a los 4, 8 y 12 meses posteriores a la liofilización. Para realizar los estudios de actividad biológica se inocularán 25 semillas en cada suspensión-tratamiento. Las semillas inoculadas serán colocadas en Frascos de vidrio con vermiculita estéril, de los tratamientos se tomarán los siguientes datos: la capacidad que tienen las bacterias del inoculante EMMIM-1 para adherirse (12 a 24 horas después de la inoculación) así como para colonizar a la rizósfera (20 días posteriores a la inoculación) de las plantas de maíz; también se evaluará la capacidad de promoción de crecimiento de las plantas a los 30 días, midiendo la altura la planta como la raíz y se tomará el peso fresco como peso seco de la planta. Se incluirán controles no inoculados. Las plantas serán mantenidas en condiciones de invernadero y serán regadas periódicamente con aguas y nutrientes. Algunas cepas aisladas en los medios selectivos para cada especie implicada serán corroboradas mediante metodologías moleculares, en particular mediante la amplificación del gen que codifica para la subunidad ribosomal 16S RNA y su restricción con la enzima HhaI (en acuerdo con resultados del primer año) y mediante secuenciación del mismo amplificado. Desglose de presupuesto:

Descripción Cantidad

Componentes para compra de medios de cultivo (Agar, sales minerales, fuentes de carbono, colorantes, ácidos orgánicos entre otros).

12,000 pesos

Materiales de plástico como tubos eppendorf, tubos falcon, placas para cultivo, placas multipozos para recuento de microorganismos, frascos de vidrio, entre otros.

18,000 pesos

Sacarosa como protectores para liofilización.

3000 pesos

Nutrientes del medio MS para el crecimiento de plantas como nitrato de amonio, nitrato de potasio, sales menores, entre otros.

10,000 pesos

Vermiculita como soporte inerte para plantas

15,000 pesos

Aceite para liofilizador, debido a la liofilización constante de muestras se requiere cambio de aceite.

10,000 pesos

Reactivos de biología Molecular para la corroboración de las cepas implicadas (Reactivos de PCR y enzimas de restricción).

15,000 pesos

Gastos de secuenciación de cepas para 15,000 pesos


corroborar que las cepas aisladas en experimentos de colonización son las cepas que inicialmente fueron presevadas e inoculadas en plantas

Becas para dos estudiantes de posgrado en fase de terminación de tesis relacionada con la supervivencia de microorganismos.

20,000 pesos

Asistencia de participantes a congresos, puede cubrir gastos de inscripción, transporte, hospedaje y alimentos.

20,000 pesos

Compra de dos vortex, para el recuento bacteriano.

12,000 pesos

Total: $ 150,000.00 M. N.

Bibliografía:

Alatorre-Cruz Julia María. Diseño de inoculante multiespecies para cactus con

bacterias resistentes a la desecación. Tesis de Maestría, Posgrado en Ciencias

(Microbiología), Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Sustentada el 12 de

agosto de 2013. Becaria CONACYT.

Antoun H. and Prévost D. Ecology of plant growth promoting rhizobacteria. Z. A.

Siddiqui (ed.), en: PGPR: Biocontrol and Biofertilization, Springer. Printed in the

Netherlands. 2005: 1–38.

Basta T, Keck A, Klein J and Stolz A. Detection and Characterization of Conjugative Degradative Plasmids in Xenobiotic-Degrading Sphingomonas Strains. J. Bacteriol. 2004; 186: 3862-3872. Bashan Y. y Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances can. UJ.Microbiol.1997; 43: 103-121. Bashan Y. “Inoculants of plant growth-promoting bacteria for use in agriculture”. Biotechnology Advances. 1998; 16: 729-770. Böltner D., Godoy P., Muñoz-Rojas J., Duque E., Moreno-Morillas S., Sánchez L. y Ramos J. L. Rhizoremediation of lindane by root-colonizing Sphingomonas. Microbial Biotechnology.2008; 1: 87–93. Casaca Á. D. Guías tecnológicas de frutas y verduras. DICTA. 2005: 1-14. Caballero-Mellado J., Martinez-Aguilar L., Paredes-Valdez G y Estrada-de los Santos P. Burkholderia unamae sp. nov., an N2-fixing rhizospheric and endophytic species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2004; 54: 1165–1172.


Cavalcante V. A. and Döbereiner, J. A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant Soil. 1988; 108: 23–31.

Corral-Lugo A., Morales-García Y. E., Pazos-Rojas L. A., Ramírez-Valverde A.,

Martínez-Contreras R. D. y Muñoz-Rojas J. Cuantificación de bacterias cultivables

mediante el método de “Goteo en Placa por Sellado (o estampado) Masivo”. Rev.

Colomb. Biotecnol.2012; 14: 147-156.

Cuadrado B., Rubio G. y Santos W. Caracterización de cepas de Rhizobium y Bradyrhizobium (con habilidad de nodulación) seleccionados de los cultivos de fríjol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioinóculos. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. 2009; 38: 78-104. Kennedy A. C. Rhizosphere, in: Principles and Applications of Soil Microbiology, D.M., Sylvia, J.J., Fuhrmann, P.G., Hartel, and D.A., Zuberer, eds., 2nd ed. Pearson, Prentice Hall, New Jersey.2005: 242-262. Hernández-Tenorio Ana Laura. Viabilidad de bacterias de un inoculante multi-especies y su efecto, a corto plazo, en el crecimiento de Solanum tuberosum cv. Atlantic. Tesis de Licenciatura, Escuela de Biología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Jiménez D. R., Virgen C. G., Tabares F. S. y Olalde P. V. Bacterias promotoras del crecimiento de plantas: agro-biotecnología. Avance y Perspectiva. 2001; 20: 395-400. Juárez-Hernández Dalia. Evaluación de la capacidad de un inoculante

multiespecies para estimular el crecimiento de frijol. Tesis de Licenciatura, Escuela

de Biología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Sustentada el 22 de

febrero de 2013. Becaria VIEP-BUAP. Tutor principal.

Lucy M., Reed E. y Glick B. R. Applications of free living plant growth promoting

rhizobacteria. Antonie Van Leeuwenhoek .2004; 86: 1-25.

Morales-García Y. E., Duque E., Rodríguez-Andrade O., De la Torre J., Martínez-Contreras R.D., col. Bacterias Preservadas, una Fuente Importante de Recursos Biotecnológicos Bio Tecnología, 2010; 14:2: 11-29. Morales-García Y. E., Aguilera-Méndez N., Huerta-Gómez A. del C., Fuentes-Ramírez L. E. y Muñoz-Rojas J. 2009. “Evaluación del antagonismo entre bacterias de interés agrícola y formulación de un inoculante multiespecies”. Memoria VI encuentro Participación de la mujer en la Ciencia. In extenso. Biotecnología y Ciencias Agropecuarias. ISBN: 978-607-95228-0-3. León, Guanajuato, México. Morales-García Y. E, Juárez-Hernández D., Muñoz-Gracía A., Hernández-Tenorio A. L. y Muñoz-Rojas J. 2011. “Efecto de un multi-inoculante con especies


compatibles sobre maíz (Zea mays)”. Memoria VIII encuentro Participación de la mujer en la Ciencia. In extenso. Biotecnología y Ciencias Agropecuarias. ISBN: 978-607-95228-2-7. León, Guanajuato, México. Morales-García Yolanda Elizabeth. Tesis de doctorado: Antagonismo entre bacterias de interés agrícola y evaluación de inoculantes.2013: 1-108. Morgan CA, Herman N, White PA & Vesey G (2006) Preservation of micro-organisms by drying; a review. J. Microbiol. Methods 66: 183-193. Muñoz-Rojas J. y Caballero Mellado, J., Gluconacetobacter diazotrophicus, modelo de bacteria endófita, en Martínez Romero, E. y Martínez Romero, J. (editores), Microbios en línea http://biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/, UNAM, México, 2001; 157-176. Muñoz-Rojas J. y Caballero-Mellado J. Population Dynamics of Gluconacetobacter diazotrophicus in Sugarcane Cultivars and Its Effect on Plant Growth. Microb Ecol.2003; 46:454–464. Muñoz-Rojas J, Bernal P, Duque E, Godoy P, Segura A & Ramos JL Involvement of cyclopropane fatty acids in the response of Pseudomonas putida KT2440 to freeze drying. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72: 472-477.

Muñoz-Rojas J. Inoculante multiespecies potencia el crecimiento de plantas. Reportaje por milenio digital. 2013. http://www.milenio.com/tendencias/Inoculante_multiespecies-ICUAP-plantas FINNOVA-UAP_14_205319468.html. Oliveira A. L. M., M. Stoffels, M. Schimid, V. M. Reis, J. I. Baldani and A. Hartmann.

2008. Colonization of sugarcane plantlets by mixed inoculations whit diazotrophic

bacteria. European Journal of Soil Biology. 45(1):106-113.

Parra. Y y Cuevas F. potencial de Azospirillum como inoculante para la agricultura. Cultivo tropicales. 2001; 23: 31-41. Rojas-Tapias D, Ortiz-Vera M, Rivera D, Kloepper J, Bonilla R (2013) Evaluation of three methods for preservation of Azotobacter chroococcum and Azotobacter vinelandii. Universitas Scientiarum 18(2): 129-139 doi: 10.11144/Javeriana. SC18-2.etmp. Ramos M. J. L., HaÏdour A. y Duque M. O. E. Consejo Superior de Investigaciones Científicas Serrano 117 28006 Madrid, ES. Microorganismos (Pseudomonas putida) y procedimiento para la degradación microbiológica de hidrocarburos aromáticos del tipo tolueno, xilenos o etilbenceno. Oficina española de patentes y marcas. Santillana-Villanueva N. Producción de biofertilizantes utilizando Pseudomonas sp. Ecol. apl. 2006; 5: 87-91.

http://www.milenio.com/tendencias/Inoculante_multiespecies-ICUAP-plantas%20FINNOVA-UAP_14_205319468.html

http://www.milenio.com/tendencias/Inoculante_multiespecies-ICUAP-plantas%20FINNOVA-UAP_14_205319468.html


Santiago-Saenz Y. O., Hernández-Tenorio A. L., Alatorre-Cruz J. M., Molina-Romero D., Morales-García Y. E., Elías-Domínguez A., Munive-Hernández J. A. y Muñoz-Rojas J.2014. Efecto de un inoculante multiespecies (EMMIM-1) en papa Solanum tuberosum, CV. Atlantic, propagada en laboratorio y crecida en invernadero. Memoria XI Encuentro “Participación de la Mujer en la León, Guanajuato, México.Ciencia”. In extenso.Biotecnología y Ciencias Agropecuarias S1-BCA01. ISBN: 978-607-95228-5-8. Otros:

METAS COMPROMISO A LA CONCLUSIÓN DEL PROYECTO

Los compromisos del presente proyecto son:

1) El compromiso principal de este proyecto obtener un método efectivo para desecar células bacterianas de la formulación multiespecies EMMIM-1. El método permitirá mantener de forma viable y con una adecuada actividad biológica a las cepas de la formulación multiespecies. Se persigue que la formulación en polvo sea más estable, no requiera energía para su almacenamiento y que conserven sus propiedades de promoción de crecimiento. Este conocimiento podría incorporarse como una patente adicional a la previamente sometida de la formulación multiespecies MX2013007978.

2) El proyecto permitirá la continuación de proyectos de una estudiante de maestría y

tres de doctorado. Se pretende terminar una tesis de maestría y una de doctorado con temas relacionados a la formulación de inoculantes (una sobre el almacenamiento de las células de la formulación EMMIM-1 y otra sobre una formulación multiespecies alternativa). Se avanzará en resultados de dos tesis más de doctorado (una relacionada con la entrada a la fase viable no cultivable de las cepas de la formulación EMMIM-1 que ocurre en la liofilización y otra en relación con la supervivencia de microorganismos en estrés por desecación y congelación; donde se reduce la biodisponibilidad de agua). Todas las tesis contribuirán al conocimiento requerido para entender cómo se puede potenciar la supervivencia de microorganismos durante su vida de anaquel.

3) Se redactará una patente con el material obtenido con el apoyo de proyecto para someterla a su consideración de ser enviada al IMPI.


INFORMACIÓN DE POTENCIAL COMERCIAL

VENTAJAS COMERCIALES POTENCIALES

El conocimiento generado en el presente proyecto ofrecerá un método para conservar estable y en forma de polvo a las bacterias de la formulación multiespecies EMMIM-1. Las cepas se mantendrán en dormancia, pero una vez hidratadas recuperarán sus funciones biológicas, específicamente aquellas de adhesión, colonización y promoción de crecimiento. La formulación en polvo no requiere de refrigeración, por lo que no se requiere de un gasto energético alto para su vida de anaquel, además el transporte es mucho más fácil, sin mucho peso (al no contener agua) y sin requerir refrigeración. En esta forma la formulación multiespecies podría producirse a mayor escala, almacenar por periodos largos, sin presión a que se tenga que comercializar inmediatamente, reduciendo los riesgos de inversión.

EN SU CASO, DISTINCIÓN CON OTROS DESARROLLOS TECNOLÓGICOS YA COMERCIALIZADOS

En el mercado hay algunas bacterias que se comercializan liofilizadas, especialmente bacterias que se usan como células iniciales para un proceso de fermentación, pero no existe un protector universal para el resguardo de las células y cada caso se ha estabilizado de forma diferente (Morales-García et al., 2010). Este trabajo será el primero que intente el resguardo de una mezcla de bacterias, no obstante el grupo tiene mucha experiencia en experimentos de supervivencia a desecación y liofilización, incluso de cepas de la formulación multiespecies y tenemos resultados del primer año que facilitarán la la continuación del proyecto. Además tenemos métodos de crecimiento efectivos en medios de cultivo selectivos y la contamos con metodologías moleculares de comprobación de las cepas implicadas. Además también tenemos un método de contabilización rápida, económica y eficiente de bacterias, lo que facilitará las mediciones de supervivencia bacteriana para el desarrollo exitoso del proyecto.

NECESIDADES DEL MERCADO QUE CUBRE LA TECNOLOGÍA

La tecnología que se desarrollará en el presente proyecto incrementará el tiempo de vida de anaquel y facilitará el transporte de la formulación multiespecies EMMIM-1, la cual potencia el crecimiento de plantas de interés agrícola. El mercado es el sector de la agricultura de campo e invernaderos, en especial de la agricultura libre de tóxicos orgánicos. No obstante también puede aplicarse a jardines, agricultura urbana y huertos

ANÁLISIS DE COMPETENCIA (Información sobre competidores, así como de productos y/o tecnologías competitivas)

La formulación mutiespecies es pionera en el campo de la agrobiotecnología y en el presente proyecto se pretende dar estabilidad a la formulación mediante la desecación controlada (liofilización), usando un protector económico. Por lo que la formulación será

METAS COMPROMISO DE TIPO DE DESARROLLO

(X) Proceso o metodología

( ) Equipo o dispositivo ( ) Servicio

( ) Otro (especificar)

INDIQUE EL GRADO A ACANZAR DEL ENTREGABLE AL FINALIZAR

(X) Metodología ( ) Diseño ( ) Prototipo de laboratorio

( ) Diseño industrial o para escalamiento

( ) Modelo escala real ( ) pruebas de concepto en campo

( ) Otro ______________


aún más novedosa y aun no tiene equivalente en el mercado con estudios científicos que sustenten la efectividad como se propone en el trabajo presente. Lo mas cercano son las formulaciones mono-especie que se comercializan en turba.

USUARIOS Y/O CLIENTES POTENCIALES (Empresas, Público)

Nacional:

Nuestra propuesta es realizar una Spin off para la creación de una empresa agrobiotecnológica en la BUAP. Hay muchos usuarios nacionales interesados para la utilización del producto, por ejemplo la Asociación Nacional ANEC A. C. y diversas organizaciones de ejidatarios donde se ha comprobado la capacidad de la formulación multiespecies. Por ejemplo en la ANEC en el año pasado se exploraron 500 ha de diversos cultivos con resultados exitosos. Se está estableciendo un convenio de colaboración con esta organización que está en evaluación con la abogada general.

En el extranjero:

Proyecto de Innovación Tecnológica 2016 · 2016-02-28 · conjunto han demostrado potenciar el...

Documents

Transcript of Proyecto de Innovación Tecnológica 2016 · 2016-02-28 · conjunto han demostrado potenciar el...