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PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN Y EL ANÁLISIS DE CLOROFILA-A POR ESPECTROFOTOMETRÍA

Luis Aubriot y Sylvia Bonilla

Sección Limnología, Facultad de Ciencias, UdelaR setiembre 2013

La clorofila a es el pigmento común a todos los organismos que realizan fotosíntesis con liberación de oxígeno. Su concentración se usa como indicador de la biomasa del fitoplancton. Los métodos de extracción se basan en la transferencia del pigmento a un solvente orgánico sin provocar cambios químicos en la molécula y la concentración de la clorofila se cuantifica por absorbancia en un espectrofotómetro. El pigmento es muy sensible a la degradación fotoquímica por lo que todas las manipulaciones deben hacerse en condiciones de luz tenue. 1- Materiales y equipos Usar reactivos de grado analítico (PPA, puro para análisis). Las soluciones deben ser preparadas con agua bidestilada o ultrapurificada (ej. Milli-Q): Ácido clorhídrico HCl 0,12N Etanol (C2H5OH) ABSOLUTO PURO PARA ANÁLISIS para preparar solución al 90%. Filtros de fibra de vidrio tipo GF/C o GF/F de 25 o 47 mm de diámetro. Tubos de centrífuga tipo Falcon, de plástico con tapa de rosca, capacidad 15 ml (1 o 2 por cada muestra a analizar) Erlenmeyer, matraz o vaso de Bohemia Probetas graduadas Pipetas automáticas (capacidad 10 ml y 200 microlitros) o pipetas de vidrio graduadas Tips de plástico para pipetas Pinzas, papel de aluminio para recubrir los tubos de centrífuga, papel tissue Cubetas para espectrofotómetro con tapa (se pueden tapar con parafilm). Rotuladores, planillas Equipos 1. Espectrofotómetro con rango de longitud de onda visible hasta 750 nm, resolución de 1 nm, ancho de banda de 2 nm o menos, definición igual o mayor a 0,001 unidades de absorbancia y capacidad para celdas con un trayecto óptico de 1 a 5 cm. 2. Sistema de filtración por vacío con portafiltro (para filtros de 25 mm o 47 mm de diámetro). 3. Baño térmico de agua con termostato apropiado para 75 ºC ± 1 ºC con porta tubos. 2- Procedimiento (Modificado de Nusch 1980 e ISO 1992)

1) Filtrar entre 0.25 y 2 litros de muestra dependiendo de la concentración de algas a través de filtros de fibra de vidrio (GF/C)

2) Doblar los filtros con las algas hacia adentro y guardarlos inmediatamente en los tubos de centrífuga recubiertos con papel de aluminio

3) Realizar el resto del procedimiento inmediatamente. Si no es posible, los filtros con el tubo se deben congelar de inmediato (–20 °C por algunos días, ultrafreezers: semanas a meses).

4) Agregar X ml de la solución de etanol 90% a cada muestra y tapar. El volumen de etanol puede variar, en general se usan 8 a 10 ml.

5) Colocar el tubo tapado a baño maría y calentar a 75 1 °C durante 5 min. Si se deja más tiempo se puede degradar la clorofila. Enfriar con agua corriente inmediatamente al finalizar el tiempo de calentamiento.

6) Dejar en extracción las muestras durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.

7) Clarificar el extracto mediante centrifugación (4000 rpm, 5 minutos: en general es suficiente). Otra opción de clarificación puede ser filtrar el extracto por un filtro GF/C en portafiltro a través de una jeringa. En este caso se debe filtrar la muestra a otro tubo. Luego, el extracto puede ser mantenido en refrigerador y oscuridad hasta un máximo de 3 días pero se recomienda que el tiempo entre la extracción y la medición en el espectrofotómetro sea mínimo.

8) Medir en el espectrofotómetro la absorbancia a 665 nm y 750 nm utilizando cubetas de borosilicato. Se deben llenar la cubeta hasta ¾ de su capacidad. El blanco de etanol 90% debe hacerse con la misma solución que se usó para las muestras. Es importante que la cubeta del blanco quede bien tapada durante todo el análisis para evitar que se evapore el alcohol.

9) Acidificar la muestra directamente en la cubeta con 50 a 100 µl de HCl 0.12 N. Esperar 5 minutos y repetir las lecturas a 665 y 750 nm. Durante los 5 minutos se completa la acidificación y se estabiliza la lectura.

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La molécula de clorofila se degrada naturalmente (por senescencia o muerte celular) en feopigmentos (feofitina, clorofilida, etc.), que se encuentran normalmente en la muestra. Estos pigmentos presentan máximos de absorbancia a similares longitudes de onda que la clorofila a, por lo que la absorbancia a 665 nm incluye la clorofila y los feopigmentos. La clorofila a es susceptible de ser transformada en feopigmentos acidificando con HCl (0.12 N). La diferencia entre la absorbancia de la muestra sin acidificar y la acidificada permitirá conocer el aporte de la clorofila a sin productos de degradación. Relación ácida: para un extracto puro de clorofila a, la relación entre la absorbancia a 665 nm antes y después de la acidificación es 1.7. Los cocientes ácidos normales de muestras naturales van de 1.4 a 1.6 en general Por lo tanto en una muestra natural esta relación debe ser menor o igual a 1.7. Este índice se utiliza además como indicador de que la extracción ha sido llevada a cabo correctamente. Relación ácida: (Abs665 – Abs 750)/(Abs665ácida – Abs 750 ácida) donde: A665 y A750 las absorbancias del extracto (sin acidificar) Aa665 y Aa750 las absorbancias luego de la acidificación 3- Cálculos

Calcular la concentración de clorofila a (Clo a) en µg l

-1:

A665 y A750 las absorbancias del extracto (sin acidificar) Aa665 y Aa750 las absorbancias luego de la acidificación v: volumen del extracto (ml), V: volumen de la muestra filtrada (l) L: largo de la cubeta (cm). El factor 29,6 incluye el coeficiente de absorción específico de la clorofila a pura en etanol (en l/µg cm).

Bibliografía

ISO (1992). Water quality measurement of biochemical parameters spectrophotometric determination of chlorophyll-a concentration. Ginebra, International Organization for Standarization: 1-6

Nusch, E. A. (1980). Comparison of different methods for chlorophyll and phaeopigments determination. Archiv für Hydrobiologie Beiheft Ergebnisse der Limnologie 14: 14-36

Bonilla S (2009). Cianobacterias planctónicas del Uruguay. Manual para la identificación y medidas de gestión. PHI 17, UNESCO, Montevideo

Clo = 29.6a A A Aa Aa v V L