Tallinna Reaalkool

Proteiinkinaasi Aurora B jaoks biligandsete inhibiitorite arendamine ning biokeemilise mitte-radioaktiivse inhibeerimismeetodi väljatöötamine

Uurimistöö

Mirel Mesila 11.c

Juhendaja: PhD Darja Lavõgina (TÜ keemia instituut)

Kooli kontaktisik: õp Kersti Veskimets

Tallinn 2017

Sisukord

Kasutatud lühendid ..................................................................................................................... 4

Sissejuhatus ................................................................................................................................ 7

1. Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................... 9

1.1. Valkude fosforüülimine ................................................................................................... 9

1.2. Proteiinkinaasid ja nende talitlus ..................................................................................... 9

1.3. Proteiinkinaas Aurora B ................................................................................................ 11

1.3.1. Aurora B aktiveerimine .......................................................................................... 12

1.3.2. Aurora B roll mitoosis ning sellega seotud võimalikud häired .............................. 13

1.4. Aurora A versus Aurora B ............................................................................................. 13

1.5. Inhibiitorid ..................................................................................................................... 14

1.5.1. Mono- ja multisubstraatsed inhibiitorid ................................................................. 15

1.5.2. Biligandsed inhibiitorid .......................................................................................... 15

1.5.3. Aurora B inhibiitorid .............................................................................................. 16

2. Metoodika, aparatuuri ja reagentide kirjeldus ...................................................................... 18

2.1. Fmoc-tahkefaassüntees .................................................................................................. 18

2.2. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ......................................................... 20

2.3. TLC ehk õhukese kihi kromatograafia .......................................................................... 22

3. Eksperimentaalne osa ........................................................................................................... 24

3.1. Tahkefaassüntees ........................................................................................................... 24

3.2. Biokeemilised katsed ..................................................................................................... 27

4. Tulemuste analüüs ................................................................................................................ 31

4.1. Inhibiitorite disain .......................................................................................................... 31

4.2. Inhibiitorite süntees ning RP-HPLC ja MS ................................................................... 31

4.2.1. Tahkefaassüntees .................................................................................................... 31

3

4.2.2. RP-HPLC ja MS ..................................................................................................... 32

4.3. Biokeemilised katsed ..................................................................................................... 34

4.3.1. Inhibiitorite emalahuste ning vahelahjenduste valmistamine ................................. 34

4.3.2. Fosforüülimisvõime määramine ............................................................................. 34

4.3.3. Katsed inhibiitoritega ............................................................................................. 37

4.4. Võimalikud arengusuunad ............................................................................................. 39

Kokkuvõte ................................................................................................................................ 40

Kasutatud materjalid ................................................................................................................. 42

Lisa 1 Tellitud dervatiseeritud vaigu andmed .......................................................................... 47

Lisa 2 Sünteesitud peptiidi struktuur ........................................................................................ 48

Lisa 3 Kasutatud mõisted ja definitsioonid .............................................................................. 49

Lisa 4 RP-HPLC tulemused ja puhtusesüstid ........................................................................... 50

Lisa 5 Massi-laengu suhte väärtused massispektromeetrias ..................................................... 54

Lisa 6 Fosforüülimisreaktsiooni tulemused TLC plaadil ......................................................... 55

Resümee .................................................................................................................................... 57

Abstract ..................................................................................................................................... 59

Kinnitusleht .............................................................................................................................. 61

Kasutatud lühendid

Lühend Inglisekeelne nimetus Eestikeelne nimetus

ACN acetonitrile atsetoonitriil

ADP adenosine diphosphate adenosiin-5'-difosfaat

Ahx 6-aminohexanic acid 6-aminoheksaanhape

ATP adenosine-5'-triphosphate adenosiin-5'-trifosfaat

Aur Aurora protein kinase family Aurora perekonna proteiinkinaas

Chk1 checkpoint kinase 1 rakutsükli kontrollpunkti kinaas 1

CPC chromosomal passenger

complex

Kromosoomide tsentromeeridel paiknev

valguline kompleks

DCM dichloromethane diklorometaan

DIPEA N,N-diisopropylethylamine N,N-diisopropüületüülamiin

DMF N,N-dimethylformamide N,N-dimetüülformamiid

DMSO dimethylsulfoxide dimetüülsulfoksiid

DTT dithiothreitol ditiotreitool

EDTA ethylenediaminetetraacetic acid etüleendiamiintetraäädikhape

ESI-MS electrospray ionization mass

spectrometry

elektropihustusionisatsiooni

massispektromeetria

Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl 9-fluorenüülmetoksükarbonüülrühm

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-

ethanesulfonic acid

4-(2-hüdroksüetüül)piperasiin-1-

etüülsulfoonhape

HBTU N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-

benzotriazol-1-yl)uronium

hexafluorophosphate

N,N,N’,N’-tetrametüül-O-(1H-

bensotriaso-1-üül)uroonium

heksafluorofosfaat

HOBt 1-hydroksybenzotriazole 1-hüdroksübensotriasool

HPLC high performance liquid

chromatography

kõrgefektiivne vedelikkromatograafia

HSTU N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(N-

succinimidyl)uronium

hexafluorophosphate

N,N,N’,N’-tetrametüül-O-(N-

suktsiinimidüül)uroonium

heksafluorofosfaat

IC50 half maximal inhibitory

concentration

Inhibiitori kontsentratsioon, mille

juures väheneb inhibeeritava ensüümi

aktiivsus katses kasutatud oludes 50%

võrra

ivDde 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-

1-ylidene)-3-methylbutyl

1-(4,4-dimetüül-2,6-dioksotsükloheksa-

1-ülideen)-3-metüülbutüül

Lys lysine lüsiin

MLN8054 4-[[9-chloro-7-(2,6-

difluorophenyl)-5H-pyrimido[5,4-

d][2]benzazepin-2-

yl]amino]benzoic acid

4-[[9-kloro-7-(2,6-difluorofenüül)-5H-

pürimido[5,4-d][2]bensasepiin-2-

üül]amino]bensoehape

MS mass spectrometry massispektromeetria

MQ Milli-Q® deioniseeritud (ultrapuhas) vesi

NMM 4-methylmorpholine 4-metüülmorfoliin

PK protein kinase proteiinkinaas

PKAc catalytic subunit of cAMP-

dependent protein kinase

cAMP-sõltuva proteiinkinaasi

katalüütiline alaühik

RP-HPLC reversed-phase high performance

liquid chromatography

pöördfaasi kõrgefektiivne

vedelikkromatograafia

RNA ribonucleic acid

ribonukleeinhape

SAC spindle assembly checkpoint Käävi mitootiline kontrollpunkt

Ser serine seriin

TAMRA-

kemptiid

Kemptide (LRRASLG) labeled

with 5-

carboxyltetramethylrodamine via

N-terminus

Kemptiid (aminohappeline järjestus

LRRASLG), mille N-terminaal on

märgistatud 5-

karboksüültetrametüülrodamiiniga

TFA trifluoroacetic acid trifluoroetaanhape

Thr threonine treoniin

Tyr tyrosine türosiin

TIPS triisopropylsilane triisopropüülsilaan

TLC thin layer chromatography õhukese kihi kromatograafia

UV-Vis ultraviolet–visible spectroscopy ultravioletse ja nähtava ala

spektroskoopia

Sissejuhatus

Proteiinkinaasid (PK-d) on ensüümid, mis katalüüsivad reaktsioone, kus fosforüülrühm

kantakse üle valgule, muutes nii viimase aktiivsust. See on üks tähtsamaid rakusiseseid

valkude reguleerimise mehhanisme, mis võimaldab ensüümidel kontrollida seal toimuvaid

protsesse, reageerida väliskeskkonna muutustele ja tagada raku normaalne elutegevus.

Proteiinkinaasid teevad koostööd peaaaegu kõikide rakus toimuvate protsesside

koordineerimises: metabolismi ja rakujagunemise regulatsioonis, valkude transkriptsioonis ja

isegi apoptoosi vältel. Paraku on PK-de funktsioneerimishäired (üleekpsresseeritus,

kõrgendatud aktiivsus) või proteiinfosfataaside alatalitlus vahetult seotud mitmete kasvajate,

diabeetide, Alzheimeri tõve ja teiste haigustega. Sellega seoses on proteiinkinaaside uurimine

ja nende aktiivsust blokeerivate ühendite arendamine tõusnud viimase kahe aastakümne

jooksul kiirelt üheks kõige huvipakkuvamaks ravimiarendusobjektiks.

Farmakoloogiliselt potentsiaalse ravimiarendusena nähakse inhibiitoreid – ühendeid, mis

otseselt takistavad fosforüülülekannet. Selleks peaks inhibiitor seostuma PK ATP-, substraadi

ja/või mõne muu saidiga võimalikult selektiivselt ja kõrge efektiivsusega. Käesoleva töö

eesmärk oli leida selline ühend, mis sobib inhibeerima proteiinkinaasi Aurora B. Aurora B on

üks kolmest Aurora perekonda kuuluvast ensüümist, mis kindlustab raku jagunemisprotsessi

käigus erinevate osakomponentide korrapärase töö. Muu hulgas aitab ta kontrollida

kromosoomide kokkupakkimist enne raku jagunemist, parandab mitoosi käigus kääviniitide

kinnitumist tsentromeerile ja osaleb jagunemise viimases etapis tsütokineesis. Aurora B

valgukompleksi üks olulisemaid osafragmente on INCENP – regulaatorvalk, mis muude

ülesannete hulgas ka aktiveerib antud kinaasi. Potentsiaalselt sobivaim arendatav ühend peaks

seega seostuma nii PK ATP-saiti kui ka sellesse taskusse, kuhu muidu seostuks Aurora B

looduslik aktivaator INCENP.

Inhibiitori sünteesiks oli plaanis kasutada TÜ Keemia instituudi meditsiinilise keemia

uurimisrühmas pikaaegset rakendust leidnud tahkefaassünteesi strateegiat. Inhibiitori

biokeemilisi omadusi sooviti iseloomustada optimeerides eelnevalt muude PK-de

8

iseloomustamiseks arendatud mitte-radioaktiivset inhibeerimismeetodit, mis kasutab õhukese

kihi kromatograafia eeliseid.

Uurimistöö on jaotatud neljaks osaks. Teoreetilise aluspõhjana antakse ülevaade valkude

fosforüülimise olulisusest raku signaaliradade loomisel, proteiinkinaaside tööst ja eripäradest

ning inhibiitorite disainist ja tööpõhimõtetest. Ülevaates suunatakse fookus eelkõige antud

uurimistöös käsitletavale PK Aurora B-le: tema ülesannetele rakus,

aktivatsioonimehhanismile ja seni uuritud inhibiitoritele. Töö kirjutamisel ja metoodikate

iseloomustamisel on tuginetud uurimisrühma kogemustele, teemakohastele teaduslikele

publikatsioonidele ja varasematele diplomitöödele. Töö eksperimentaalne osa ja tulemuste

analüüs koosneb inhibiitorite sünteesist ja biokeemilistest katsetest, mis viidi läbi Tartu

Ülikooli Keemia instituudi bioorgaanilise keemia laboris.

Autor tänab eelkõige oma juhendaja PhD Darja Lavõginat, kelle tarvilikud näpunäited,

soovitused ja innustus olid suureks abiks ja motivatsiooniks terve protsessi vältel. Teisena

lähevad tänuavaldused õp Kersti Veskimetsale, kes toetas töö valmimist ja viimast viimistlust

heade nõuannetega ning ilma kelleta ei oleks tekkinud võimalust töötada sellise projekti

kallal. Suur tänu ka Tartu Ülikooli keemia instituudile labori kasutamise ja seal töötamise

kogemuse eest.

9

1. Kirjanduse ülevaade

1.1. Valkude fosforüülimine

Organismide elutegevuse aluseks on võimsad ja spetsiifilised katalüsaatorid: ensüümid.

Ensüümid katalüüsivad peaaegu kõiki biokeemilisi reaktsioone ja on valdavalt valgud

(eranditeks on mõned RNA-ensüümid). Kuni pooltes eukarüootse raku valkudes toimub

mingil ajahetkel fosforüülimisreaktsioon doonormolekulilt aktseptorile. (Lehninger et al.

2005: 191, 574) Fosforüülimiseks nimetatakse valkudele fosforüülrühma (PO32-) ülekandmist.

Reaktsiooni käigus kantakse fosforüülrühm sihtmärkvalgu ehk substraadi Ser, Thr või Tyr

aminohappejääkide külgrühma hüdroksüülrühmale, mis seejärel omandab negatiivse

osalaengu. Fosforüülrühma doonoriks on mõni nukleotiid, tüüpiliselt adenosiin-5’-trifosfaat

ehk ATP. Fosforüülülekanne on biokeemias üks olulisemaid reaktsioone, mille tagajärjel

negatiivse laengu saanud hüdroksüülrühm põhjustab valgu ruumilise struktuuri ehk

konformatsiooni muutust. Sellised ehituslikud muutused põhjustavad omakorda muutusi

valgu aktiivsuses ja võimes osaleda rakusisestes signaaliradades. (Lehninger et al. 2012: 228-

230)

1.2. Proteiinkinaasid ja nende talitlus

Suurt osa raku signaaliradadest reguleerivad erinevad ensüümid, nende hulgas ka 538 seni

kindlaks tehtud inimese PK-i (näiteks AGC-kinaasid, Haspin, Aurora ja NEK perekonnad)

(Manning et al. 2002: 1912-1934). Proteiinkinaasid on ensüümid, mis katalüüsivad

fosforüülekannet ATP-lt aktseptormolekulile. Sidudes oma "taskusse" järjest fosforüüli

doonori ja substraadi, loovad nad sobiva keskkonna fosforüülülekandeks (Wang, Cole 2014:

1-21). Ülekanne toimub 1011 korda kõrgema efektiivsusega kui ilma proteiinkinaasideta

(Adams 2001: 2271-2290). Proteiinkinaas seob esimesena ATP-d (kõrgema kontsentratsiooni

tõttu rakus) ja alles teisena toimub fosforüülülekanne ATP-lt substraadile. Lõpp-produktid –

ADP ja fosforüülitud valk – saavad seejärel PK sidumistaskutelt lahkuda (vt joonis 1).

10

Organismi seisukohalt on äärmiselt oluline, et protsessides valitseks teatav dünaamika – uue

impulsi läbitulekuks peab eelmise lõpetama. Selleks on ka fosforüülrühma eemaldamiseks

valkudelt (defosforüleerimiseks) omad ensüümid. Neid nimetatakse fosfataasideks ning nende

ülesanne on teostada valgu aminohappejäägi hüdroksüülrühmaga seotud fosforüüli hüdrolüüsi

ehk defosforüülimist. (Lehninger 2012: 228-229)

Joonis 1. Proteiinkinaasi katalüütiline tsükkel. Kinaas on joonisel tähistatud kollaste

ovaalidena, nukleosiid sinise kolmnurgana ning selle külge seotud fosforüülid valgete

ringidena.

Kinaaside ja fosfataaside erinevus seisneb ka selles, et fosfataasid püsivad rakus enamasti

püsivalt aktiivsetena ja tagavad sel viisil puhkeolekus rakus valkude madalat

fosforüülitustaset. Kinaaside aktiveerimiseks rakus on aga mitmeid võimalusi:

• väikeste molekulide (nn sekundaarsed virgatsained) või suuremate valkude (nt

tsükliinid) abi;

• fosforüülimine teiste valkude poolt;

• fosforüüli eemaldamine fosfataaside poolt;

• di- või oligomiseerumine;

• osaline proteolüüs jms.

(Lodish et al. 2007)

11

Proteiinkinaas Aurora B kasutab mainitutest enda aktivatsiooniks suuremate valkude abi (nt

INCENP ja Survivin) ning fosforüülimist teiste valkude poolt (nt Ser331 jäägile, mida

katalüüsib Chk1) (Petsalaki et al. 2011: 449-466). Proteiinkinaaside aktiivsust saab vähendada

eeltoodud aktivaatorite mahavõtmisega või inhibiitorite abil (vt peatükk 1.5.).

1.3. Proteiinkinaas Aurora B

Inimese genoom kodeerib kolme Aurora kinaaside perekonda kuuluva liikme järjestust:

Aurora A, Aurora B (vt joonis 2) ja Aurora C. Aurora kinaasid on perekond Ser-/Thr-kinaase,

mille ülesanne on reguleerida raku tööd mitoosi (Aurora A ja Aurora B) ja meioosi (Aurora

C) käigus. Mitoos on raku jagunemise protsess, mille käigus moodustuvad kaks tütarrakku,

mis on geneetiliselt identsed nende emarakuga. Häired mitoosimehhanismis, sh ka

proteiinkinaaside töös, on eelduseks vähirakkude tekkeks. (Goldenson, Crispino 2015: 537-

545)

Joonis 2. Proteiinkinaasi Aurora B kompleks. PK on näidatud rohelisena, INCENPi

fragment helesinisena ning MLN8054 värviliste sfääridena (oranžina tähistatud C, sinisena N,

punasena O, tumerohelisena Cl ning helerohelisena F aatomid).

Koordinaatide allikad: 4AF4 ja 2X81. Protein Data Bank

Aurora B on üks neljast osakomponendist kromosoomidega seostunud valkude kompleksist

(ingl chromosome passenger complex, CPC) (vt joonis 3). Aurora B ülesanne on kontrollida

kogu kompleksi katalüütilist aktiivsust ja tagada eri osade koostöö. Regulaator- ja

sihtmärkvalgud INCENP (ingl Inner Centromere Protein), Survivin ja Borealin, mis

kuuluvad samuti CPC koostisse, vastutavad süsteemi korrektse lokaliseerimise eest rakus.

12

INCENP on kogu kompleksi siduv valk, mille N-terminaalne ots moodustab koos teiste

valkudega kolmeheeliksilise "puntra" ja C-terminaal seob ning aktiveerib Aurora B kinaasi.

Muutused CPC lokalisatsioonis terve mitoositsükli vältel (vt peatükk 1.3.2.) tagavad

substraatide efektiivsema ja ruumiliselt piiratud fosforüülimise. CPC substraatidel on

omakorda tähtis roll kromosoomide kokkupakkimises, ebaõnnestunud kinetohoor-

miktotuubul kinnituste parandamises, mitootilise kontrollpunkti SAC (ingl spindle assembly

checkpoint) aktiveerimises ja tsütokineesis. (Carmena et al. 2012: 789-803)

Joonis 3. CPC kompleks. Sinisega on tähistatud INCENP, rohelisega Borealin, oranžiga

Survivin ja kollasega Aurora B.

Allikas: Carmena et al. (2012) Nature Review Molecular Cell Biology

1.3.1. Aurora B aktiveerimine

Aurora B aktivatsioon toimub mitmeetapilise ja üsna keeruka sündmuste jadana. Kõigepealt

seostub Aurora B-ga valgu INCENP üks osa (nn IN-BOX, mis asub INCENPi C-terminaalses

osas). Selle seostumisega kaasneb Aurora B katalüütilise aktiivsuse mõningane tõus.

Saavutatud aktiivsuse arvelt saab Aurora B edasi fosforüülida nii INCENPi C-terminaali kui

ka teise, lähedal paikneva Aurora B molekuli aktivatsiooniaasa (osa kinaasimolekulist, mis

tavaolekus seostub kinaasi katalüütilise "keskusega" ning blokeerib seega ensümaatilist

aktiivsust). Sel viisil tagatakse Aurora B maksimaalne aktivatsioon. Seega toimib põhimõte,

kus kinaasimolekul peab esmalt leidma rakus sobiva asukoha (tagatakse ühelt poolt INCENPi

seostumise kromatiiniga ning teiselt poolt INCENPi seostumise Aurora B-ga), mille

tagajärjena tõuseb kinaasi lokaalne kontsentratsioon ja kinaasimolekulide hulk ühes

13

lokatsioonis saab hakata oma ülesandeid täitma. (Carmena et al. 2012: 789-803)

Aurora B aktiivsust reguleerivad ka teised kinaasid (nt TLK-1, Chk1). Inimese rakus paikneva

PK täielikku aktiveerimist soodustab ka PK Chk1 (ingl Checkpoint kinase 1) ja valgu

Survivin fosforüülimine. Viimast viib läbi PK PLK1 (ingl polo-like kinase 1). (Petsalaki et al

2011: 449-466; Grossman 2001: 635-640)

1.3.2. Aurora B roll mitoosis ning sellega seotud võimalikud häired

Valgukompleks CPC paikneb mitoosi metafaasi käigus kromosoomi tsentromeeril. Selles

faasis fosforüülib Aurora B mitut substraati kinetohooridel (ingl kinetochore), mis parandavad

kinetohooride ja mikrotuubulite omavahelisel kinnitumisel tehtud vead. (Carmena et al. 2012:

789-803) Vigadeta kromosoomipaaride lahknemine hoiab ära soovimatud muutused

kromosoomide arvus. Kahekordistunud kromosoomid tuleb kinnitada käävile (ingl spindle;

mitotic spindle) bipolaarselt ja tagada, et lahknemine ei algaks enne selle faasi lõppu. Seega

tuleb pidurdada raku jagunemist kuni kõik tütarkromatiidid on korrektselt kinnitunud ja

tekkinud eksimused parandatud. (van der Waal et al. 2012: 1408)

Tsütokineesi (tsütoplasma jagunemine telofaasi lõpus) ajaks liigub CPC raku vahekehasse

(ingl midbody) (Adams et al. 2000: 1075-1078; Terada 2001: 653-657). Viimane on eriti

oluline: ilma selleta ei jagune tütarrakud teineteisest korrektselt ning jäävad seetõttu omavahel

tsütoplasmast ühendatuks. See võib omakorda põhjustada polüploidsust ehk

kromosoomikomplektide paljusust rakus. (Goldenson, Crispino 2015: 537-545)

Aurora B üleekspresseeritust on seostatud mitmete kasvajate ja vähkrakkude tekkega, sest on

vahetult seotud kromosoomide ebaühtlase jagunemisega mitoosi käigus. Siiski pole ainsana

ohtlik aktiivse Aurora B üleekspresseeritus – sama ohtlik võib olla ka tema üleküllus

mitteaktiivses olekus. CPC aktiveerijana ja lokaliseerijana tagab ta kogu kompleksi jõudmise

rakujagunemise tsütokineesi etappi. Kui seda ei juhtu, jäävad tütarrakud tsütoplasmat pidi

ühendatuks ning tekib polüploidne rakk. (Terada 2001: 653-657)

1.4. Aurora A versus Aurora B

Kõik kolm Aurora perekonda kuuluvat proteiinkinaasi on aminohappeliselt järjestuselt väga

sarnased. Eksperimentaalselt on koguni täheldatud, et vaid üksainus aminohappeline

muudatus Aurora A järjestuses (Gly198Asn) võib anda talle Aurora B funktsionaalsed

14

omadused. (Fu et al. 2009: 6939-6944; Hans et al. 2009: 3491-3502) Seepärast kasutatakse

Aurora perekonna kinaaside detailsetes uuringutes kontroll-kinaasidena sageli sama

perekonna esindajaid.

Aurora A seostub rakus tsentrosoomiga ja tagab raku valmiduse mitoosi alustamiseks; eriti

tähtis on tema osa tsentrosoomide eraldumisel ja kääviniitide moodustamisel. Metafaasis

seostub Aurora A käävi mikrotuubulitele valgu TPX2 abil, mis käitub nii PK-i aktivaatori kui

ka substraadina. (Marumoto et al. 2005: 42) Sarnaselt Aurora A-le nõuab Aurora B

aktiveerimine tema nn aktivatsiooniaasa (ingl T-loop) autofosforüülimist (Ma, Poon 2011:

18). Seda aitavad teostada CPC kompleksi liikmed, sh INCENP. Vaatamata asjaolule, et

Aurora A ja Aurora B paiknevad erinevatel käävi poolustel, aktiveeritakse erinevate

mehhanismide poolt ja koostööd tehakse erinevate valkudega, on nende kokkupuude käävi

mikrotuubulitel paratamatu ja lausa hädavajalik raku jagunemisprotsessi õnnestumiseks.

Antud töösse valiti eksperimentaalsete katsete jaoks Aurora A, millele on ka viimastel

aastakümnetel tehtud uuringutes leitud palju potentsiaalseid ja kõrge selektiivsusega

inhibiitoreid, mis sobituksid mõlemale PK-le. Töös kasutatud MLN8054 (vt joonis 5; IC50 = 4

nM Aurora A suhtes) inhibeerib PK Aurora A-d 40 korda kõrgema selektiivsusega kui Aurora

B-d (Manifredi et al. 2007: 4106-4111). Seetõttu on inhibiitor heaks võrdlustasandiks

arendatava inhibiitori omadustele ja selektiivsusele.

1.5. Inhibiitorid

Proteiinkinaaside tegevus raku signaaliradadel (sh raku kasvamises, paljunemises ja

hävimises) on ülioluline rakkude normaalseks elutööks ja loomulikult on igasugused

kõrvalekalded aluseks paljudele tõsistele haigustele. Nii ravimitööstuses kui teadusasutustes

on fookusesse tõusnud selliste inhibiitorite arendamine, mis pidurdaksid PK-de toimet

olukorras, kus viimased on kas üleekspresseeritud või anomaalselt kõrgendatud aktiivsusega.

Inhibiitor on aine, mis seostub sihtmolekuliga ja pidurdab keemilist reaktsiooni või muudab

selle võimatuks. (Roskoski Jr. 2015: 1-23)

Praeguseks on enamik väljatöötatud inhibiitoreid ATP-konkurentsed (st inhibiitor "võistleb"

ATP-ga sidumiskoha pärast), mille eeliseks on hea afiinsus ja tänu ATP-sidumissaitidele ka

selektiivsuselement (Cohen 2002: 309-315). ATP-d (ja teisi nukleosiidtrifosfaate) seovad aga

kõik 538 PK-d ja veel mitmed muud valgud. Seega pole sugugi välistatud, et ATP-d

15

jäljendavad molekulid võivad siiski seostuda mõne teise valguga. (Adachi et al. 2014: 5461-

5470; Chauhan et al. 2009)

1.5.1. Mono- ja multisubstraatsed inhibiitorid

Inhibiitori disainimisel tuleb jälgida kahte olulist tegurit – efektiivsus ja selektiivsus.

Ravimitööstuse suureks väljakutseks on sellise ravimi välja töötamine, mis mõjuks haigust

põhjustavale tegurile, kuid oleks samal ajal ohutu seda manustavale elusorganismile ja

osavõtmatu temas toimuvates protsessides. Loomulikult on olulised ka ravimikandidaadi

muud omadused, sh bioloogiline stabiilsus ning võime oma sihtmärk-valku õiges kohas „üles

leida“. (Swinney 2004: 801-808)

Kui ATP-saiti suunatud inhibiitorite puhul on põhiliseks riskiks võimalik vähene selektiivsus,

siis vaid substraadisaidile seostuvad inhibiitorid on sageli väheefektiivsed. Nimelt, on

substraadisait väga avatud solvendile, mistõttu inhibiitoril on raske luua piisavalt palju

efektiivseid vastasmõjusid selle konkreetse taskuga. Samuti nõuab kõrgema efektiivsuse

saavutamine seda, et inhibiitor sisaldaks võtmejääke, mida soovitud kinaas ära tunneb.

Näiteks basofiilsed kinaasid (nagu Aurora perekondki) fosforüülivad sellseid substraate,

millel fosforüülitava Ser/Thr/Tyr ümber paiknevad positiivselt laetud aminohappejäägid (nt

Arg või Lys). Ühe perekonna kinaasidel kipuvad aga olema sarnased peptiidsubstraadi

sidumissaidi funktsionaalrühmad, mis võtmejääke ära tunnevad. Taoliste probleemide

ennetamiseks pakuti 1972. aastal välja uus meetod – bisubstraatsete inhibiitorite disain ja

süntees. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)

1.5.2. Biligandsed inhibiitorid

Teades, et PK-l on kaks kinaasitaskut, millest ühega seostub ATP ja teisega valgusubstraat, on

sobivaks just sellised inhibiitorid, mis seostuksid kinaasi mõlema taskuga. Bisubstraatsete

inhibiitorite disainis on ühendatud kahe substraadi (PK puhul ATP ja fosforüleeritava

peptiidi) struktuursed elemendid, mis on omavahel seotud sobiva linkeriga. Linkeri pikkus,

jäikus, keemiline struktuur jt parameetrid võimaldavad suurendada arendatava ühendi

selektiivsust. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)

Bisubstraatse inhibiitori peamiseks eeliseks on entroopiafaktor – ühe molekuli sidumine on

lihtsam ja kasulikum kui kahe substraadi "tabamine". Samuti on taolise inhibiitori sünergism

16

eksperimentaalselt määratav: tema sidumisenergia on suurem vastavate üksikute

komponentide sidumisenergiate summast. Bisubstraatse inhibiitori kasuks räägib ka

tõenäosusteooria. PK ühe substraadi (ATP) sidumisel suureneb teise kinaasitasku

(fosfaataktseptori) juures teise substraadi kontsentratsioon ja inhibiitori sidumine toimub

kiiremini. (Lavõgina et al. 2010: 23-34)

Joonis 4. PK-ga seostunud biligandne inhibiitor. A, proteiinkinaasi kompleks nukleotiidi

analoogi ja substraatvalguga (PDB 4OUC); jooned tähistavad proteiinkinaasi, suuremad

sfäärid – fosforüülrühma doonorit (vasakul) ning aktseptorit (paremal). B, sama

proteiinkinaasi kompleks bisubstraatse inhibiitoriga; jooned tähistavad proteiinkinaasi,

suuremad sfäärid – inhibiitorit (PDB 5HTB).

Allikas: Lavõgina et al. (2010) Tartu Ülikooli meditsiinilise biokeemia rühma publikatsioon

Biligandse inhibiitori võib disainida aga nii, et üks inhibiitori osa seostub PK ATP-taskuga,

teine inhibiitori osa aga hoopis muu saidiga (st mitte substraatvalgu sidumissaidiga) (vt joonis

4). Näiteks võib olla teise saidi puhul tegemist taskuga, kuhu muidu seostuks valk, mis

vastutab kinaasi lokaliseerimise eest. Kuna see tasku on enamasti ka "unikaalsem" kui ATP-

tasku, on lootust kokkuvõttes disainida ühend, mis oleks eriti selektiivne. Sellise biligandse

inhibiitori disain oli ka antud töö eesmärk.

1.5.3. Aurora B inhibiitorid

Aurora B uurimine hoogustus, kui avastati, et kinaas on üleekspresseeritud ägedat lümfoidset

leukeemiat, ägedat müeloidset leukeemiat ja kroonilist lümfoidset leukeemiat põdevate

patsientide rakkudes (Goldenson, Crispino 2015: 537-545). AZD1152 on enim testitud

Aurora B inhibiitor (vt joonis 5A). Uuringud on näidanud, et AZD1152 kasutamine AML

vähirakkude ravis aitab vähendada nende vohamist ning kiirendab rakusurma. (Walsby et al.

17

2008: 662-669; Hartsink-Segers et al. 2013: 560-568) Kuigi ravim on osutunud nii mõneski

kliinilises katses edukaks, säilib riskifaktor, et ravi käigus "rünnatakse" terveid ka rakke (Oke

et al. 2009: 4150-4158).

Käeolevas töös kasutati Aurora B inhibiitorina MLN8054 (vt joonis 5B), kuna see on

sünteetiliselt kergesti derivatiseeritav ning omab piisavalt head afiinsust Aurora B suhtes.

MLN8054 võimet inhibeerida Aurora A-d loodeti vähendada, kasutades MLN8054

konjugeerimist INCENPi fragmendiga, mis peaks suurendama saadud biligandse inhibiitori

selektiivsust Aurora B suhtes.

Nii AZD1152 kui MLN8054 seostuvad Aurora B ATP-sidumissaidiga. Bisubstraatseid või

biligandseid inhibiitoreid pole Aurora B jaoks teadaolevalt varem arendatud.

Joonis 5. AZD1152 (A) ja MLN8054 (B) struktuurid

Allikas: MLN8054 ja Barasertib (AZD1152-HQPA). Selleckchem kodulehekülg

A B

18

2. Metoodika, aparatuuri ja reagentide kirjeldus

2.1. Fmoc-tahkefaassüntees

Tahkefaassünteesi (ingl solid phase peptide synthesis, SPPS) rajajaks on ameerika biokeemik

Robert Bruce Merrifield, kes avaldas 1969. aastal ajakirjas Journal of the American Chemical

Society samateemalise artikli ning pälvis 1984. aastal selle eest ka Nobeli keemiaauhinna.

Tänapäeval on tahkefaassüntees laboris peamine meetod peptiidide sünteesiks. (Chan, White

2000: 1)

Tahkefaassünteesis sünteesitakse peptiid tahkel kandjal, mille funktsionaalrühmad on

reaktsioonitsentriteks. Tahke kandjana (ingl resin) kasutatakse üldjuhul polüstüreeni, millesse

on divinüülbenseeni abil (tavaliselt 1-2 % massi järgi) tekitatud ristsidemed. Polümeeritera

külge kinnitatakse teatud hulk funktsionaalrühmi, mis on tulevase peptiidsünteesi

reaktsioonitsentriteks; tsentrite arv vaigu pinnal (ingl loading, tavaliselt väljendatuna

milliekvivalentides vaigu massiühiku kohta) peab olema optimaalne, et leida kompromiss

soovitava vaiguhulga väiksuse ja kasvavate peptiidahelate steeriliste nõudmiste vahel. (Chan,

White 2000: 26)

Üldiselt toimub süntees aminohappeahela karbonüülrühmast (C-terminaalist) aminorühma

(N-terminaali) suunas ning kasvav järjestus on üht otsa pidi (tavaliselt C-terminaali kaudu)

seotud tahke kandjaga, mistõttu pole tarvis C-terminaali kaitsta (vt joonis 6). Peptiidi

ülesehitus toimub astmeliselt, st tahkele kandjale kinnitatakse korraga vaid üks aminohape.

Lisatava aminohappe N-terminaal kaitstakse ajutiselt lämmastiku vaba elektronpaari

delokaliseerimiseks – nii ei saa aminorühm kuni kaitsva rühma mahavõtmiseni

reaktsioonidest osa võtta. Sünteesi käigus kaetakse ka aminohapete kõrvalahelad püsivate

kaitserühmadega. See on eeskätt oluline funktsionaalrühmade katmiseks, mis esinevad ka

põhiahelas ja võtavad reaktsioonidest osa (karboksüül- ja aminorühmad). Kaitserühmade

valik tuleb aga langetada ortogonaalsuse alusel, st kaitseid peab olema võimalik eemaldada

19

erinevates tingimustes. Nii ei ole peptiidahela kasvatamisel muret, et võetakse maha vale

kaitserühm või toimub reaktsioon mõne kõrvalrühmaga.

Joonis 6. Fmoc-tahkefaassünteesi skeem. X-ga on tähistatud N-terminaalse aminorühma

kaitserühm, Y-ga kõrvalahela kaitserühm ja A-ga karboksüülrühma aktiveeriv rühm. Hall ring

on vaik, mille külge on kinnitatud linker.

Enne ahela järgmise aminohappe lisamist eemaldatakse põhiahela eelmiselt aminohappelt

ajutine kaitserühm (tavaliselt 20% piperidiini lahus DMF-s). Seejärel saab toimuda

atsüülimisreaktsioon vabastatud aminohappe aminorühma ning uue, ülehulgas oleva

aminohappe karboksüülrühma vahel, mille tulemusel moodustub kahe aminohappe vahel

peptiidside. Liitumine (ingl coupling reaction) toimub aktiveeritud estri moodustamise või

reaktsiooni abistavate reagentide kasutamisega. Antud töös kasutati karboksüülrühma

aktiveerimiseks ja peptiidsideme moodustumiseks reagentidena HOBt-i ja HBTU-d või

HSTU-d. See aitab aktiveerida liidetava aminohappe karboksüülrühma, mis tagab rühma

suurema keemilise aktiivsuse ja kindlustab peptiidsideme moodustumise. Peale liitumist

eemaldatakse üleliigsed reagendid jm kõrvalsaadused filtreerimise abil, resin pestakse üle

DMF-ga ning viimasena liidetud aminohappelt eemaldatakse kaitserühm. Protseduur kordub

kuni soovitud peptiidahela valmimiseni. (Chan, White 2000: 9, 11, 26)

20

Käesolevas töös kasutati sünteesiks Fmoc-kaitserühmal põhinevat meetodit (ingl Fmoc solid

phase peptide synthesis, Fmoc-SPPS). See tähendab, et aminohapete N-terminaal on

tüüpiliselt kaitstud Fmoc kaitserühmaga. Fmoc-i meetod on ortogonaalne kahel viisil:

aminohapete ja nende kõrvalrühmade kaitserühmade eemaldamine ning peptiidi lõplik

mahavõtmine (ingl cleavage) teostatakse erinevatel tingimustel. Fmoc-i eemaldamiseks

kasutatakse tavaliselt nõrgalt aluselist 20% piperidiini lahust DMF-s. Lõplik peptiid ja enamik

kõrvalahelate kaitserühmadest eemaldatakse tahke kandja küljest aga happelise 95% TFA

lahusega. (Chan, White 2000: 11)

Tahkefaassünteesi eelisteks on selle tõhusus, universaalsus, kõrge saagis (korralikul

teostamisel 99.5% või rohkem ühe atsüülimise kohta) ja hõlbus puhastamine etappide

vahepeal (üksnes filtreerimine). Täiendavalt on võimalik kasutada erinevaid analüütilisi

meetodeid, kuigi kasvava peptiidi ahela kontrollimine sünteesi käigus on siiski veel piiratud.

Lihtsas sünteesis kasutatakse tihti värviteste funktionaalrühmade olemasolu või puudumist.

Käesolevas töös olid nendeks Kaiser-test (kvalitatiivne), mis näitab vabade aminorühmade

olemasolu (vt peatükk 3.1.1.), ja Fmoc-test (kvantitatiivne) (vt peatükk 3.1.2.). Fmoc-testis

kogutakse vaigult lahus, mis tekib pärast Fmoc-rühma eemaldamist; kaitserühma

mahavõtmisel tekib produkt, millel on talle iseloomulik neeldumine UV-alas (Chan, White

2000: 27). Fmoc-SPPS meetodi muudeks puudusteks on suur reagentide kulu (kasutatakse

3...10-kordset reagentide ülehulka vaigu loadingu suhtes), probleemid vaigu kandevõime ja

pundumisega.

2.2. HPLC ehk kõrgefektiivne vedelikkromatograafia

Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia ehk kõrgsurvevedelikkromatograafia (ingl high

pressure liquid chromatography/high performance liquid chromatography, HPLC) on

meetod, mida kasutatakse segude (sh väikeste molekulide, peptiidide ja nukleotiidide)

komponentideks lahutamiseks, tuvastamiseks ja nende kontsentratsioonide määramiseks

lahuses. Segu komponendid jaotuvad vastavalt polaarsusomadustele kahe faasi vahel:

liikumatu ehk statsionaarse ja liikuva ehk mobiilse. (Hitatchi 2014)

Proov sisestatakse kromatograafi dosaatori kaudu (vt joonis 7). Liikuv faas ehk eluent

paikneb mahutis ning liigub koos sisestatud prooviga läbi süsteemi pumba toimel. Pump

võimaldab eluendil liikuda läbi süsteemi ühtlasel voolukiirusel. Kõrge rõhk aitab eluenti

suruda läbi tihedalt pakitud kolonni – ainult gravitatsioon sellega toime ei tuleks. HPLC

21

muudab võrreldes teiste kromatograafia meetoditega kordades efektiivsemaks peeneteraline

kolonni täidis – nii saab toimuda rohkem komponentide üleminekuid statsionaarse ja mobiilse

faasi vahel lahutatavas segus. (Kromatograafia 2015)

Joonis 7. HPLC süsteem

Allikas: HPLC Basic Course. Hitatchi High-Technologies Corporation

Antud töös kasutatud pööratud faasi kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (ingl reversed-

phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) poorse täidisega kolonn on

mittepolaarne ning läbi selle liikuv mobiilne faas polaarne. Sel viisil on võimalik segu

lahutamine hüdrofoobsuse ja hüdrofiilsuse alusel, sest hüdrofiilsed osad jäävad eelistatult

eluenti ning läbivad kolonni kiiremini. Hüdrofoobsed molekulid seevastu kinnituvad kolonni

pinnal olevale poorsele kihile, mis koosneb pikkade alküülahelatega (C18) derivatiseeritud

ränidioksiidi osakestest. Liikuva faasina kasutati vee ja atsetonitriili (metüültsüaniidi,

CH3CN) segu. (Katz 1997: 13, 105)

Segu komponentide tuvastamiseks on kasutusel mitmed erinevad detektorid:

ultraviolettkiirgust mõõtev detektor ehk UV-detektor, elektrokeemiline detektor,

fluorestsentsdetektor, massispektromeetriline detektor (MS) jt. (Hitatchi 2014)

Dioodrividetektor (ingl diode array detector, DAD) on olemuselt ultraviolett- ja nähtava

valguse spektrofotomeeter. Detektor valgustab jooksvalt kolonnist väljuvaid proovi

komponente UV- ja nähtava kiirgusega ning registreerib samas komponentide

neeldumisspektrid. Selline tehnoloogia võimaldab HPLC süsteemis eraldunud aineid

identifitseerida ainele iseloomuliku neeldumisspektri alusel (iga aine neelab valgust kindlate

lainepikkusete vahemikus). Seejärel kujutatakse töödeldud andmed detektoriga ühendatud

arvutis graafikuna – kromatogrammina. Kromatogrammis vastab igale proovis esinenud

ainele piik, mis on iseloomulik just selle komponendi neelduvusele. Kui komponent läbib

22

detektorit, saadab viimane arvutisse signaali, millest tekib kromatogrammile piik. Mida

kõrgem on piik, seda kõrgem on aine kontsentratsioon lahuses. Seega on võimalik süsteemist

väljuvate ainete kogumine, kui on teada nende neeldumisspekter. (Hitatchi: 2014)

Vedelikkromatograafi MS detektoritest levinuim on elektropihustus-ionisatsioon (ingl

electrospray ionization, ESI). Massispektromeetria lähtub ainete määramisel nende

molekulidest või aatomitest tekitatud erineva massi ja laengu suhte (m/z) ioonide erinevast

liikumisest elektromagnetväljas. Spektomeeter registreerib ainult laetud osakesi ja jätab

neutraalsed fragmendid detekteerimata. ESI meetodil tekivad ioonid vahetult lahuses

elektrivälja toimel. HPLC kolonni väljundis pihustatakse gaas, mis tagab protoneerunud

osakeste tekke ja aurustumise. Edasi suunab elektriväli ioonid massispektromeetrisse ja jäägid

eraldatakse. ESI eripäraks on molekulide õrn käsitlus, mistõttu tekkinud kõrge energiaga

ioonid ei tekita fragmente, vaid pigem liituvad mitmelaengulisteks ioonideks või

liitioonideks. (Massispektromeetria: 2016)

Antud töös kasutatigi dioodrividetektorit (UV-detekror) ning segu esialgsel analüüsil ka ESI-

MS detektorit.

2.3. TLC ehk õhukese kihi kromatograafia

Õhukese kihi kromatograafia ehk planaarkromatograafia (ingl thin layer chromatography,

TLC) on üks kiiremaid jaotuskromatograafia meetodeid, mis võimaldab komponentide

tuvastamise ka väikese segu koguse või tugevasti lahjendatud proovi korral. Lisaks on tegu ka

küllaltki odava meetodiga. (Kromatograafia 2015)

Segude eraldamiseks kasutatakse statsionaarse faasina õhukese poorse aine (silikageel,

alumiiniumoksiid vms) kihiga metall- või klaasplaati ja mobiilse faasina voolutit (ehk

eluenti), mis liigub plaadil kapillaarjõudude toimel. Proov kantakse väikeste täpikestena

plaadi alaserva nn startijoonele, sageli koos posiitivse kontrolliga aine(te)st, mille sisaldust

segus kontrollida soovitakse. Plaat asetatakse voolutusanumasse, mille põhjas asub vooluti.

Kapillaarjõudude toimel hakkab uuritav proov mööda plaadi poorset kihti üles liikuma,

komponentide lahutumine toimub sõltuvalt ainete afiinsusest statsionaarse faasi suhtes. Mida

suurem on afiinsus, seda aeglasem on ka aine liikumiskiirus. Nii jäävad lahutunud ained

erinevatele kaugustele stardijoonest. (Kromatograafia 2015)

23

TLC meetodiga käib kaasas analüüsitavate ainete visualiseerimine või detekteerimine, sest

sageli on ained värvitud, mistõttu pole neid plaadil näha. Ilmutamiseks kasutatakse sobivaid

kemikaalide lahuseid, mis annavad ainetega reageerides värvilisi ühendeid, või

ultraviolettkiirgust. (Kromatograafia 2015)

Antud uurimuses kasutati analüüsitavate ainete lahutumise jälgimiseks

fluorestsentsmärgistusega markerit (TAMRA-kemptiid), mida oli võimalik visualiseerida

fluorestsentsskanneriga (vt lisa 6). Paralleelselt inhibiitorite arendamisega on viimastel

aastatel ühe enam katsetatud ka uusi lähenemisviise fluoromeetriliste meetoditega. Oma

paindlikuse ja kiiruse tõttu pakuvad nad konkurentsi radioaktiivsust kasutavatele

protseduuridele, millega töötamisel kaasnevad nii isiklikud riskid, keskkonnaprobleemid kui

ka suur radioaktiivsete jäätmete hulk. TLC-l ja fluorestsentsskanneril põhinev analüüs

võimaldab samaaegselt jälgida paljusid reaktsioone ega kasuta seejuures radioaktiivsust. (Viht

et al. 2005: 165)

Joonis 8. TLC meetod

Allikas: Thin Layer Chromatography. University of Leeds

24

3. Eksperimentaalne osa

Käesoleva uurimuse raames läbiviidud katsed korraldati kahes osas: peptiidi süntees tahkel

faasil ja biokeemilised katsed. Tahkefaassüntees teostati paralleelkatsena, kus ühes

katseanumas lisati kasvatatavale peptiidijärjestusele L-lüsiin ja teisele D-lüsiin. Eelnevad ning

järgnevad etapid olid mõlema sünteesi puhul identsed. Valminud peptiid koosnes kolmest

osast: INCENP valgu järjestust jäljendavast lõigust, ATP-d jäljendavast lõigust ning neid

ühendavast linkerist. Kõik sünteesi etapid teostati toatemperatuuril.

3.1. Tahkefaassüntees

Kommertsiaalse teenusena sünteesitud derivatiseeritud vaik (ingl resin) (vt lisa 1) asetati

üleöö lahustisse punduma. Pundumise tulemusena absorbeerub osa lahustist resin'i

molekulide vahele, võimaldades edasise sünteesi käigus lisatavate ainete osakestel paremini

vaigu reaktiivtsentrite juurde pääseda. Fmoc-kaitserühma eemaldamiseks peptiidi N-

terminaalilt pesti kandjat esmalt DMF lahusega ja seejärel võeti N-terminaalne Fmoc maha

20% piperidiinilahusega DMF-s. Regulaarselt järgnes viiekordne pesemisprotseduur DMF

lahuses pärast iga atsüülimist või kaitserühma eemaldamisetappi (vt joonis 6). Mahavõtmise

täielikkust jälgiti Kaiser testi abil, mis võimaldab vaheetappides kontrollida vabade

aminorühmade olemasolu reaktsioonisegus.

D- ja L-lüsiini kaitserühmadega ivDde ja Fmoc (3 ekv vaigu loadingu ehk tsentrite arvu vaigu

pinnal suhtes) aktiveerimiseks kasutati HOBt (2,9 ekv), HBTU (2,9 ekv) ja NMM (9 ekv)

segu. Lüsiini karboksüülrühma aktiveerimise tulemusena moodustub aktiivne ester, mille

elektrofiilne tsenter on karbonüülrühma süsinik. Nii on eelmise aminohappe vabal

aminorühmal võimalik seda rünnata. Pärast 3 min inkubeerimist pipeteeriti ester vaigule, et

moodustuks peptiidside.

Lüsiini Fmoc-kaitserühma mahavõtmisele järgnes peptiidi peaahela lõpetamine. Selleks seoti

lüsiini vaba aminorühm etaanhappe anhüdriidiga (20 ekv). Vaigule lisati tekkiva happe

neutraliseerimiseks aluselist DIPEA-d (20 ekv). Järgnes inkubeermine 2,5 h.

25

Järgmise etapina teostati ivDde-rühma selektiivne mahavõtmine, võimaldamaks sünteesitava

ahela edasist jätkamist D- või L-lüsiini külgahela kaudu. Kuna uurimisrühmas puudus

eelnevalt optimeeritud metoodika hüdrasiiniga töötlemise ajalise pikkuse kohta, jälgiti ivDde-

rühma eemaldamist vaigult spektrofotomeetriliselt (ε301=7000 M-1cm-1 ). Vastavalt Beer-

Lambert’i seadusele peab eemaldatud ivDde maksimaalne neelduvus olema 8,7

(A=ε·l·c=15000M−1cm−1·0,1cm·5,8·10-3M=8,7) eeldusel, et ivDde hulk on võrdne resin'i

loading'uga. Kokku kasutati 5 ml lahust. 15 minuti möödudes koguti loksutilt 10% N2H4

lahus DMF-s. Kuna ivDde hulk selles oli endiselt liiga kõrge, osutus lahus mõõtmiseks

ebasobivaks ning aine UV-spektri piiki polnud võimalik graafikult välja lugeda, sest

neelduvus ületas graafiku maksimaalse skaalanäidu. Kuna UV-spektromeeter näitab

neelduvust vaid 1 AU piires, lahjendati 15 minutit loksunud lahust DMF-ga 10-kordselt, et

võimaldada graafikult kaitserühma neelduvuse jälgimine. Lahjendatud proov oli nähtav 300

nm juures ning arvutuste kohaselt sai selleks ajaks eemaldatud 50% maksimaalsest ivDde

hulgast. Hiljem teostatud proov 30 min inkubeerunud lahusega näitas neelduvuse alanemist

ligi kaks korda võrreldes eelmise mõõtmistulemusega, st ivDde hulk lahuses oli vähenenud ja

30 minutiga õnnestus eemaldada kokku 75% maksimaalsest ivDde hulgast.

Kõrvalahelale lisati Fmoc aminoheksaanhappe (3 ekv), HOBt (2,9 ekv), HBTU (2,9 ekv) ja

NMM (9 ekv) segu abil. Järgnes inkubatsioon üleöö.

Nukleosiidse fragmendina lisati peptiidile MLN8054 (0,5 ekv resin'i suhtes). MLN8054

kalliduse tõttu otsustati seda kokku hoida ja viimases etapis lisada vähem. Lisareagentidena

kasutati HSTU-d (1,2 ekv MLN8054 suhtes) ja DIPEA-d (5 ekv MLN8054 suhtes) ning

inkubeeriti üleöö (reaktsiooniaeg üle 12 h).

Produkti mahavõtmisele (ingl cleavage) tahkelt kandjalt eelnes pesu kolme solvendiga: DMF

(5 korda), isopropanool (5 korda) ja DCM (5 korda). Produktiga vaiku kuivatati vaakumis 1 h.

Produkti mahavõtmiseks resin'ilt ja ühtlasi happetundlike kaitserühmade eemaldamiseks

kasutati TFA, TIPS ja H2O segu (90/5/5, v/v/v). Lahus koguti vaigu kohalt kolbi, roteeriti

vaakumis ning lisati destilleeritud vett. Lahust roteeriti uuesti kuivamiseni.

Produkt puhastati kasutades RP-HPLC meetodit, fraktsioone kontrolliti mass-

spektromeetriga. Peptiidid lahustati esmalt vees ja dietüüleetris ning seejärel sisestati süsteemi

5 µL (ARC-3523) või 2 µL (ARC-3524) kaupa. Peptiidide analüüsis kasutatakse lahustunud

aine elueerimiseks kasvavas kontsentratsioonis orgaanilise solvendi (antud töös atsetonitriili,

26

ACN) lahust, mis sisaldab ka TFA-d. ACN-i kasvav sisaldus aitab muuta mobiilset faasi (vesi

ja TFA) vähem polaarsemaks, et soodustada hüdrofoobsemate ühendite väljumist kolonnist.

Peptiid puhastati C18 kolonnis ACN/TFA/H2O mobiilse faasiga. Lineaarse gradiendina

kasutati 3-29/20-80 (ARC-3523) või 3-27/40-80 (ARC-3524) voolukiirusi (esimesed arvud

tähistavad aega minutites, kaldkriipsuga on eraldatud vastav solvendi kontsentratsioon

süsteemis).

Ainete olemasolu sünteesisegudes tõestati molekulaarmasside kontrolliga

massispektromeetria abil. Selleks segati väike kogus uuritavaid ühendeid maatriksiga, mis

aitaks kaitsta proove võimaliku lagunemise eest. Peptiididest tekitati ioniseeritud gaas, kus

molekulid kannaksid ühte või mitut positiivset laengut. Analüüsides ühelaengulisi molekule

on seega võimalik mõõta uuritavate peptiidide massi. Analüüsitava aine massi-laengu suhte

(m/z) vastavust kontrolliti vastava algoritmi abil juba varasemalt olemasolevast

väärtustetabelist, võttes aluseks ainete teoreetilise molekulmassi (vt lisa 5). Mõlema aine

puhul leiti nende detekteeritud ioonidele vastavuses olevad täpsed massi-laengu väärtused.

Süntees oli õnnestunud ja ained suudeti puhastada HPLC süsteemis 100% (ARC-3523) ja

>95% (ARC-3524) puhtustega.

Puhastatud saadused külmkuivatati ehk lüofiliseeriti ja puhastati nii, et vabastada aine HPLC

solventidest.

Kaiser test

Valmistati lahused 5% n-inhüdriin etanoolis ja 80% fenool etanoolis. Väiksesse katseklaasi

kanti reaktsioonisegust spaatli abil mõned eelnevalt pestud vaiguterad. Teradele lisati 20 µL

mõlemat lahust ja soojendati seejärel soojal pliidil 105°C juures 5 minutit. Vabade

aminorühmade olemasolul ehk positiivse tulemuse korral värvuvad vaiguterad sinisteks.

Fmoc-kaitserühma mahavõtmine

Fmoc-rühma mahavõtmiseks valmistati 20% piperidiini lahus DMF-s. Puhastatud vaigule

lisati piperidiini lahus ja asetati inkubaatorile 20 minutiks.

ivDde-kaitserühma mahavõtmine

27

Lüsiini kaitserühma ivDde mahavõtmiseks valmistati 20% hüdrasiini lahus DMF-s. Lahus

kanti vaigule 1,5 ml ning asetati seejärel 15+15 minutiks loksutile. Kaitserühma

eemaldamisele järgnes spektromeetriline kontroll. Kaitserühma mahavõtmist loetakse

õnnestunuks, kui neelduvusspekter on kahe mõõtmise vahepeal vähenenud.

3.2. Biokeemilised katsed

Biokeemiliste katsete eesmärk oli välja selgitada, kas sünteesitud peptiid sobib Aurora B

inhibiitoriks. Võrdlusena kasutati proteiinkinaasi Aurora A ja tema inhibiitorit MLN8054 (vt

peatükk 1.4.). Mõlema proteiinkinaasi puhul kasutati mõningates katsetes ka nende

looduslikku aktivaatorit, milleks Aurora A-l on TPX2 ja Aurora B-l INCENP, et võrrelda,

kuidas nende juuresolek inhibiitori efekti mõjutab.

Kuna uurimisrühmas polnud selleks ajaks arendatud meetodit Aurora B poolt katalüüsitava

fosforüülimisreaktsiooni jälgimiseks, tuli kõigepealt optimeerida varasemalt arendatud

meetod, mida on kasutatud proteiinkinaaside PKAc ja Aurora A jaoks. Selleks jälgiti, millise

Aurora B kontsentratsiooni ja ajakulu juures on fosforüülimisreaktsioon efektiivseim (ning

kas see üldse toimub). Seetõttu teostati esimesed katsed (I-II) kahel erineval PK

kontsentratsioonil ja viie erineva reaktsiooniajaga, et välja selgitada kinaaside

fosforüülimiskiirused ja -efektiivsused. Võrdluseks kasutati proteiinkinaasi Aurora A, mille

võime fosforüülida TAMRA-kemptiidi sai varasemalt eksperimentaalselt kinnitatud.

Tulemuste põhjal valiti välja sobivad PK-de kontsentratsioonid ning ajamärgistused katseteks

inhibiitoritega. Valikus lähtuti tulemuste analüüsil põhinevatel andmetel, mille seast valiti

kõrgeima fosforüleerimisprotsendiga näitajad, mis võimaldaksid edaspidi jälgida, kas ja kui

suurel määral takistavad inhibiitorid fosforüülülekannet (mida suurem saadav signaal on, seda

mugavam on jälgida selle vähenemist inhibiitori toimel). Samuti tuli arvesse võtta graafiku

lineaarset ala, st vahemikku, kus reaktsioon sõltub lineaarselt nii PK kontsentratsioonist kui

ka reaktsiooniajast.

Puhverlahus, mis hoiab reaktsioonide käigus organismilähedast pH-taset (7,4), valmistati

deioniseeritud vee (MQ), DTT, HEPES, MgAc2 ja EDTA seguna. DTT on tugev redutseerija,

mis loovutab elektrone ja seob puhvris hapnikku; Mg2+ ioonid tõstavad ATP sidumise

afiinsust PK-le; HEPES on laialt levinud puhver, mis normaliseerib lahuse pH-taset; EDTA

seob aga raskmetalle, mis võivad lahuses esineda. Seejärel valmistati 10 mM ATP lahus ning

28

150 µM Tamra-kemptiidi lahus puhvris. Esimese katse proteiinkinaaside ja nende

aktivaatorite andmed, lõppkontsentratsioonid ja lisamise järjekord on toodud tabelis 1.

Tabel 1. Andmed fosforüülimisreaktsioonidest (I-II)

Aurora A Aurora B TPX2 Aurora B+ INCENP

ATP TAMRA-kemptiid

Firma Sigma-Aldrich

Merck-Millipore

Caslo (sünteesitud)

Merck-Millipore Sigma Molecular Probes

Amino-happeline järjestus

täis-järjestus

täis-järjestus

aminohap-pejäägid 1-43

PK täisjärjestus, INCENP aminohappe-jäägid 821-lõpp

- Kemptiidi täis-järjestus

Lõpp-kontsentrat-sioon (c; nM)

250/50 250/50 50 250/50 1000 15 000

Reakt-siooni-segusse lisamise jrk

I I II (koos Aur A-ga)

I II või III (AurA+ TPX2 puhul)

III või IV (AurA+ TPX2 puhul)

Fluorestsentsmarkerina kasutati katsetes fluorestseeruvat värvi TAMRA. TAMRA on

kinnitatud fosforüülitava peptiidi leutsiini (leucine, Leu) N-terminaalsele aminorühmale.

Peptiid sisaldab lisaks ka seriini (serine, Ser), mille kõrvalahelas asuv hüdroksüülrühm seob

end ATP ja kinaasi juuresolekul fosforüülrühmaga. TAMRA-kemptiid on kinaasi substraat,

mida kasutati fluorestsentsmärgistusena fosforüülimata jäänud proteiinkinaasi fragmendi

jälgimiseks selle fosforüülitud osast. Saadud signaali tugevus võimaldas määrata ka lineaarse

ala katseteks inhibiitoritega. Ühtlasi kasutati TAMRA-kemptiidi proteiinkinaaside

inhibiitorite efektiivsuse määramiseks – fluorestsentsmärgistusega substraat eraldub TLC

voolutamise käigus fosforüülitud vormist, võimaldades nii hinnata fluorestsentsskanneri abil

fosforüülimisreaktsiooni efektiivsust ning seega ka reaktsiooni takistava inhibiitori tõhusust.

TAMRA-kemptiidi lähtelahuse neelduvust kontrolliti UV-Vis spektrofotomeetriliselt,

tuginedes Beer-Lambert'i seadusele (TAMRA-kemptiid; ε555=80000 M-1cm-1).

Proteiinkinaasid, aktivaatorid ja puhver pipeteeriti mikroliiterplaadi süvenditesse (vt tabel 2).

Segud soojendati inkubaatoris 30°C-ni, et kiirendada reaktsiooni, kuid samas vältida

proteiinkinaaside kui valkude denatureerimist reaktsiooni käigus vale temperatuuri mõjul.

Reaktsioonid käivitati TAMRA-kemptiidi lisamisega 20-sekundiliste vahedega, et tagada

reaktsioonide täpne kestvus.

29

Tabel 2. Fosforüülimisreaktsioonide I ja II reaktsioonisegud. Kahe plussmärgiga ("++")

on märgitud kangemad lahused. Siin ja järgnevates tabelites ning joonistel tähistab lühend

‘Aur’ Aurora-perekonna kinaase.

I II III IV V VI VII VIII

Aur A ++ - ++ - - - - -

Aur A - + - + - - - -

TPX2 - - + + - - - -

Aur B - - - - ++ - - -

Aur B - - - - - + - -

Aur B + INCENP - - - - - - ++ -

Aur B + INCENP - - - - - - - +

ATP + + + + + + + +

TAMRA-kemptiid + + + + + + + +

Samale plaadile kanti eraldi süvenditesse fosforhape, millega lõpetati reaktsioonid 5, 10, 15,

30 ja 60 minuti möödudes (igast reaktsioonisegust tehti fosforhappesse 12,5 µM lahjendus).

Hapet lisati reaktsioonisegude pH-taseme häirimiseks, mis katkestas koheselt PK edasise

fosforüülimisvõime.

Kõik segud kanti TLC silikageel-plaatidele (Macherey-Nagel, SiO2xH2O), lähtudes jaotusel

reaktsiooniajast. Lisaks pipeteeriti tulemuste analüüsimise tarbeks positiivse kontrollina

juurde fosforüleerimata TAMRA-kemptiid. Kuivanud plaadid asetati 30-35 minutiks TLC

voolutisse, mis koosnes butanool/püridiin/äädikhape/vesi (10/15/3/12, v/v/v/v) kokteilist.

Sellele järgnes plaatide analüüsimine BioRad fluorestsentsskanneri abil.

Inhibeerimisreaktsioonid (III-IV) teostati lähtudes samadest etappidest nagu fosforüüliminegi,

kuid igasse reaktsioonisegude komplekti (4x4 süvendit), mis sisaldas erinevat PK-i, lisati ka

inhibiitor (vt tabel 3). Inhibiitori lõppkontsentratsioon reaktsioonisegus oli 10 µM. Kontroll-

reaktsioonidesse lisati inhibiitori asemel sama ruumala DMSO-d ilma inhibiitorita (DMSO

30

lõppkontsentratsioon 2% mahu järgi1). Inhibeerimisreaktsioone jälgiti TLC abil ning

analüüsiti taas BioRad skanneriga.

Tabel 3. Inhibeerimisreaktsiooni reaktsioonisegud. Kõik reaktsioonisegud sisaldasid ka

puhvrit, mis pipeteeriti igasse süvendisse kõige esimesena.

1 Tüüpiliselt kasutatakse bioloogilistes süsteemides DMSO kontsentratsiooni alla 1%, kuid antud juhul oli suurem kontsentratsioon vajalik, tagamaks inhibiitorite lahustumist. Nagu näha tulemustest allpool, olid PK-d antud DMSO kontsentratsiooni juures siiski aktiivsed.

Lisa-

mise

jrk.

I II

II

I IV

V

VI

VII

VII

I

IX

X

XI

XII

XII

I

XIV

XV

XV

I

2. Aur A + + - - + + - - + + - - + + - -

2. Aur B - - + - - - + - - - + - - - + -

2. Aur B+

INCENP

- - - + - - - + - - - + - - - +

3. TPX2 - + - - - + - - - + - - - + - -

4. ATP + + + + + + + + + + + + + + + +

5. DMSO + + + + - - - - - - - - - - -

6. ARC-3523 - - - - + + + + - - - - - - - -

7. ARC-3524 - - - - - - - - + + + + - - - -

8. MLN8054 - - - - - - - - - - - - + + + +

9. TAMRA-

kemptiid

+ + + + + + + + + + + + + + + +

31

4. Tulemuste analüüs

4.1. Inhibiitorite disain

Inhibiitori disainil lähtuti kolmest osast:

1) nukleosiidi jäljendajast (MLN8054);

2) INCENP järjestust sisaldavast osast;

3) linkerist.

Kõigi eelduste kohaselt peaks moodustunud konjugaat täitma kinaasimolekuli Aurora B

nukleosiidse saidi ja suunama INCENPi järjestust sisaldava lõigu PK-l õigesse punkti. Linker

kinnitati peptiidahelale lüsiini kõrvalahela aminorühmale. Kuna Lys enda külgahel ei ole väga

pikk, kasutati lisaks Ahx. Linkeri kaugus ja pikkus optimeeriti Aurora B sidumistaskutesse

seostumise jaoks, lähtudes Aurora B ja Aurora A olemasolevatest kristallstrukutuuridest

(Aurora B kompleks INCENPiga ning Aurora A kompleks MLN8054-ga, vt joonis 2).

Arvestades, et kompleksi moodustamise käigus võivad proteiinkinaasidel esineda

konformatsioonilised muutused, siis otsustati linkeri koosseisus kasutada kiraalsete

elementidena kas L-lüsiini või D-lüsiini (vastavad inhibiitorid ARC-3523 ja ARC-3524).

Aminohappe stereokonfiguratsioonilise muutuse rakendamine võib seega aidata parandada

sidumise selektiivsust ja efektiivsust.

4.2. Inhibiitorite süntees ning RP-HPLC ja MS

4.2.1. Tahkefaassüntees

Biligandne inhibiitor sünteesiti tahkel faasil. Tahkefaassüntees teostati eksperimentaalses osas

kirjeldatud sünteesiskeemi põhjal. Kuigi SPPS-meetodil on pikaahelalise peptiidi sünteesil

palju eeliseid (nt suur saagis, kerge puhastamisvõimalus ja analüüs vaheetappides), ei ole see

sugugi täiuslik. Kommertsiaalse teenusena toodetud peptiid sai tootjapoolse (CASLO ApS)

32

kinnituse toote puhtuse osas, kuid seegi pole enne katselist proovimist täielikult

usaldusväärne. Seega ei saanud esialgu välistada sünteesi kõrvalproduktide teket peptiidi

ahela vale järjestuse tõttu. Sünteesitud aine struktuuri õigsuse lõplik analüüs toimus alles

pärast ühendi mahavõtmist vaigult (vt peatükk 2.2.).

Probleemid võivad tekkida ka pundumisel – vähepundunud vaigu korral kannatab aine

transport reaktsioonitsentrite juurde ja seeläbi ka saagikus. Käesolevas töös tõendasid aga

kõik vaheetappides läbi viidud analüüsid (Kaiser test, UV-Vis), et taolisi probleeme ei

esinenud.

Kõige murettekitavamaks osutus produkti mahavõtmise etapp, kus ainet roteeriti vaakumis.

Antud aine puhul esineb pikas ahelas nii polaarseid kui mittepolaarseid regioone. Seetõttu

käitub ta pindaktiivsuse tõttu kohati detergendina. Vaakumis tekkisid lahuse pinnale

õhumullid, mis ettevaatamatul käsitlemisel kippusid lõhkema. Tagajärjena vähenes aine

saagis, sest koos vedelikuga pritsitakse süsteemi ka kuivatatavat lõpp-produkti.

4.2.2. RP-HPLC ja MS

Produktide olemasolu identifitseeriti analüütiliselt RP-HPLC meetodil eksperimentaalses osas

toodud kirjelduse põhjal ja kontrolliti MS detektori (teoreetiliselt arvutatud monoistoopne

Mw=4380 Da) ja UV-Vis detektoriga (λmax=300 nm, MLN8054) (vt lisa 4). Produkti A

(ARC-3523) puhastamisel alustati analüütilisest süstist, kust muude ainete vahelt paistis ka

õige aine (λ=300 nm, m/z) (vt joonis 9A). Molekulmasse kontrolliti ESI-MS detektoriga (vt

joonis 9B). Sellele järgnesid suuremad preparatiivsed süstid (gradient 3-29/20-80, st et

ajamärgistuste 3' ja 29' juures oli ACN sisaldus voolutis vastavalt 20% ja 80%). Preparatiivse

kromatograafia ajal loobuti massispektromeetri kasutamisest, sest piik oli juba eelnevates

analüüsides kindlaks tehtud. Massispektromeetrias võivad molekuli ioniseerimisel tekkida eri

laenguga ioonid (z=1, 2 jne) ja molekulid saavad gaasifaasis moodustada ioonpaare TFA-ga

(eluenti lisatud lenduv hape). Seega esineb molekuli mass-spektris tõenäoliselt mitu massi-

laengu suhte väärtust. Võimalikud m/z väärtused arvutatakse algoritmist (vt lisa 5), mis

arvestab erinevaid aine z-väärtusi ja sellega interakteeruvate TFA molekulide arvu. ARC-

3523 mass-spektri (joonis 9B) kolm kõrgeimat tuvastatud piiki (1461, 1096 ja 877) sobisid

vastavalt 3-, 4- ja 5-kordsetele laengutele (vt lisa 5). Põhjus, miks pole võimalik lugeda

ühekordselt laetud ühendit, on molekuli suures molekulmassis (kasutatud aparatuur

võimaldab detekteerida ioone m/z väärtusega alla 2000).

33

Viimasena tehti süst juba kogutud puhastatud fraktsioonist. Kromatogramm lainepikkusel 300

nm näitas selget ja sümmeetrilist piiki. Preparatiivse kromatograafia käigus kogutud ARC-

3523 fraktsiooni puhtuse analüüsimisel selgus, et aine suudeti eraldada 100% puhtusega.

Joonis 9. ARC-3523 UV-VIS detektori (A) ja ESI-MS detektori (B) andmed

kromatograafilises analüüsis

Produkti B (ARC-3524) puhastamisel lähtuti samasugusest protokollist nagu ARC-3523

puhul, kuid sisestuskogust alandati 2 µL-ni ja vooluti gradient muudeti 3-27/40-80. Seega

erinevad ARC-3523 ja ARC-3524 kogumispunktid (vastavalt tR=23,5 min ja tR= 17,5 min).

Mass-spekter tuvastas (nagu ARC-3523 puhulgi) piigid 1461,1096 ja 877, kuid lisaks ka piigi

1753 juures, mis ei kattu ka mõõtemääramatuse (±1) korral ühegi algoritmi abil arvutatud

väärtusega (vt lisa 5). Preparatiivse kromatograafia käigus kogutud ARC-3524 fraktsiooni

puhtuse analüüs näitas, et aine eraldati puhtusega >95%.

Pikaahelalise aine puhastamisel RP-HPLC meetodil võib esineda mitmeid komplikatsioone:

ootamatute kõrvalproduktide teke, piikide rohkus, probleemid aine lahustuvusega kolonnis

jm eripärad. SPPS õnnestumist kinnitasid kromatograafilisel analüüsil olulised näitajad:

sümmeetriline piik õige kontsentratsiooni juures ja mõlema aine väljumine kolonnist sama

ACN kontsentratsiooni juures (65%). Viimane on käesolevas töös oluline, sest ARC-3523 ja

ARC-3524 olid enantiomeerid (nende erinevus seisnes vaid ruumilises konfiguratsioonis) ja

ainetel pidigi olema sarnane polaarsus (ja seega ka kolonnist väljumise aeg). ARC-3523 ja

A

B

34

ARC-3524 struktuuride õigust kinnitasid ka UV-Vis spektri kuju ning MS abil saadud m/z

väärtused.

Elueeritud ained külmutati vedelas lämmastikus ja kuivatati seejärel vaakumis, mis aitas

vabaneda HPLC käigus kogunenud solventidest, kuna viimased võivad häirida edasistel

katsetel PK-de aktiivsust.

4.3. Biokeemilised katsed

4.3.1. Inhibiitorite emalahuste ning vahelahjenduste valmistamine

Külmkuivatatud inhibiitorid lahustati katsete jaoks 50 µL DMSO-s. Kuna DMSO-s pole UV-

Vis spektri mõõtmine lainepikkustel 300 nm ja alla selle soovitav lahusti enda tugeva

neeldumise tõttu, siis tuli teha ainete emalahustest lahjendused vette. Antud juhul osutus

probleemiks asjaolu, et ainete hüdrofoobsuse tõttu oli nende lahustuvus puhtas vees üpris

kehv. Proovimise järel lahustati ained lõpuks 20% DMSO lahuses (20/80, v/v). Seejärel

mõõdeti NanoDrop UV-Vis süsteemiga ainete ARC-3523 ja ARC-3524 20-kordsete

lahjenduste konsentratsioonid ja tehti tagasiarvutus (vastavalt cARC-3523=663 µM ja cARC-

3524=1,67 mM). Sünteesisaagise kontsentratsioonide arvutamisel võeti arvesse produktide

mahavõtmise, lüofiliseerimise ja HPLC kontrolli käigus esinenud kadusid ning lähtuti

MLN8054 neeldumiskoefitsendist (arvutatud Beer-Lamberti seadusest).

Hiljem, katsete käigus (peale sügavkülmutamisi ja korduvsulatamisi) oli näha, et ained polnud

lahuses täielikult lahustunud ja andsid häguseid suspensioone, mis ei olnud biokeemilise katse

jaoks kõlblikud, kuna ei võimalda piisavat pipeteerimistäpsust. Seega otsustati tõsta DMSO

lahuse kangust 25%-ni ning tehti vahelahjendused kontsentratsiooniga 125 µM.

4.3.2. Fosforüülimisvõime määramine

Käesoleva töö eesmärk oli leida sobiv biligandne inhibiitor, mis pidurdaks proteiinkinaasi

Aurora B tööd. Selleks kasutati fosforüülimisel võrdlusena PK Aurora A, mille võime

fosforüülida TAMRA-kemptiidi on varasemalt juba kinnitust leidnud. Võrdleva inhibiitorina

kasutati MLN8054, mille omadused Aurora A inhibiitorina on samuti eksperimentaalselt

kinnitatud. Katsed sooritati mõlema PK puhul ka nende loodusliku aktivaatori juuresolekul.

35

Ostetud ja -80°C juures säilitatud PK-de katalüütilist aktiivsust kontrolliti TLC meetodiga

viiel erineval ajatähistusel ja kahe erineva kontsentratsiooni juures. Mida intensiivsem on

plaadil eraldunud fosforüülitud produkti tähistav laik, seda aktiivsem kinaas on. Saadud

tulemused võimaldavad langetada valikut optimaalseteks ajapunktide ja kinaaside

kontsentratsioonide jaoks edasiste katsete käigus.

Esmalt sooritati fosforüülimisreaktsioon PK Aurora A ja Aurora B ning nende aktivaatoritega

viiel erineval ajamärgistusel. Kuna antud tüüpi meetodit pole varem PK Aurpra B-ga

proovitud, oli lähenemine täiesti uudne ja polnud garanteeritud, et see antud kinaasidega ka

töötab. Teoreetiliselt võib juhtuda, et kemptiid substraadiks ei sobi ja kinaas tema

juuresolekul ei toimi (substraati pole võimalik varieerida). See tähendaks seda, et laigud ei

lahutu TLC plaadil, kuna TLC vooluti on optimeeritud just TAMRA-kemptiidi järjestuse

jaoks. Fosforüülitud substraadi kontsentratsioon arvutati fosforüülitud produkti ning

substraadi ja fosforüülitud produkti laikude summaarse intensiivsuse suhtest. Tulemused

kinnitasid ootuspäraselt, et pikem fosforüülimisreaktsiooni kestus (30 ja 60 min) on tõhusam

ja seda just eriti PK-de kõrgema kontsentratsiooni (25 nM) juures. Korduskatses otsustati

proovida PK-del kõrgemat kontsentratsiooni (50 nM), sest suurem signaal võimaldab paremat

ja objektiivsemat tulemuste kontrolli ning lisaks oli tegemist ka vanade lahustega (kõrgem

kontsentratsioon tõstab PK aktiivsust).

Nii Aurora A kui Aurora B puhul toimus fosforüülimine intensiivsemalt kõrgemal

kontsentratsioonil. Loogiliselt tõusis fosforüülitusprotsent aktivaatorite juuresolekul. Aurora

A fosforüülitus oli võrreldes Aurora B-ga 60 min möödudes samal kontsentratsioonil üle 20

korra kõrgem, mistõttu andis proovitud 25 nM kontsentratsioon juba piisavalt adekvaatseid

tulemusi edasisteks katseteks. Aurora B kontsentratsiooni pidi võrdluse võimaldamiseks

tõstma (70 nM). Aurora A fosforüülitust mõjutas enam kontsentratsiooni muutmine kui TPX2

lisamine. Kuigi viimane tõstis kinaasi fosforüülimisvõimet, olid tulemused nii Aurora A kui

ka Aurora+TPX2 puhul sarnaste suhetega kontsentratsiooni muutuse suhtes (vt joonis 10).

Aurora B fosforüülitusprotsent oli mõlemal kontsentratsioonil kõrgem INCENPiga kui ilma

selleta (vt joonis 11). Seega on valgu INCENP juuresolek Aurora B fosforüülimisvõime

suurendamisel määrava tähtsusega ja annab ka madalama kontsentratsiooni juures (10 nM)

vajaliku signaali.

36

Uuritavate ainete (ARC-3523 ja ARC-3524) kontrollimise jaoks valiti katsetest I-II

reaktsioonide ajapunktid ja PK-de kontsentratsioonid, mis asuksid lineaarsel alal, et tagada

võimalikult arusaadav inhibeerimisefekt.

Joonis 10. Aurora A ja Aurora A+TPX2 fosforüülimisreaktsiooni tulemused kahel

kontsentratsioonil

Joonis 11. Aurora B ja Aurora B+INCENP fosforüülimisreaktsiooni tulemused kahel

kontsentratsioonil

Uuritavate ainete (ARC-3523 ja ARC-3524) jaoks valiti ajapunktid ja kontsentratsioonid, mis

asuksid linaarsel alal, kuhu jääb kõige rohkem fosforüülitud produkti, et tagada (loodetavasti)

võimalikult arusaadav inhibeerimisefekt.

0

20

40

60

80

100

0 5 10 15 30 60

Fosf

orüü

litud

prd

ukt (

%)

Aeg (min)

50 nM AurA

25 nM AurA

50 nM AurA+TPX2 25 nM AurA+TPX2

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 30 60

Fosf

orüü

litud

pro

dukt

(%)

Aeg (min)

50 nM AurB

25 nM AurB

50 nM AurB+INCENP 25 nM AurB+INCENP

37

4.3.3. Katsed inhibiitoritega

Katseskeem I

Inhibiitoritest ARC-3523 ja ARC-3524 valmistati 125 µM lahused, mis reaktsioonisegudesse

pipeteeriti lõppkontsentratsiooniga 10 µM. Võrdlusühendina kasutati Aurora A inhibiitorit

MLN8054, mis on oma inhibeerivaid omadusi juba varasemates katsetes tõestanud.

Ajapunktideks valiti taaskord 30 min ja 60 min. Paraku ei saa antud katse tulemustele siiski

täielikult toetuda: enne inhibiitorite reaktsioonisegudesse pipeteerimist tsentrifuugiti neid ning

selgus, et tõeliste lahuste asemel oli tegemist hoopis suspensioonidega. Lahused vorteksiti (st

segati Vortex masinal kuni segude ühtlustumiseni) seejärel uuesti ning tööd jätkati vastavalt

esialgsele protokollile, kuid kuna suspensioonist pipeteerimine ei ole täpne, siis oli ka

inhibiitori kontsentratsioon lahuses tõenäoliselt plaanitust väiksem.

Peale 30 min inhibeerimisaega oli näha, et MLN8054 oli osutunud fosforüülülekande

takistamisel siiski kõige efektiivsemaks (vt lisa 6). Sünteesitud inhibiitorid töötasid, kuid

efekt oli oodatust väiksem. AurA+TPX2 fosforüülimise takistamisel osutus neist edukamaks

ARC-3524, AurB ja AurB+INCENP puhul jällegi ARC-3523.

Katseskeem II

Katse teostati sarnaselt eelnevale, kuid seekord tehti inhibiitoritele uued vahelahjendused

(12,5 µM) ning võeti lõppkontsentratsiooniks lahuses 1 µM (lahjem). Samades tingimustes

toimus ka korduskatse. Graafikutel liideti mõlema katse tulemused koos ajapunktidega ning

määrati andmete standardhälve. Inhibiitorite tulemused normaliseeriti inhibiitorita kontrolli

suhtes (DMSO).

Kõigi eelduste kohaselt oleks valgu INCENPi järjestust jäljendavad inhibiitorid ARC-3523 ja

ARC-3524 olema konkurentsivõimelised katses Aurora B ja INCENPiga. Inhibeerimise

tulemused tähelepanuväärset erinevust ei näidanud võrreldes reaktsiooniga, mis toimus ilma

INCENPita (vt joonis 12). Seega oli inhibiitorite afiinsus oodatust madalam. Inhibiitorite

kontsentratsiooni vähendamine lahuses suuri muutusi kaasa ei toonud, mis on positiivne märk

ainete efektiivsusest ja ühtlasi vähendab edasisel käsitlusel materjalikulu. Mõlemad Aurora B

fosforüülimisreaktsioonid takistati ligi 50% ulatuses. Võib oletada, et reaktsioonides ei

toimunud peptiidi sidumine Aurora B substraadi sidumistaskusse ja nukleosiidse fragmendi

MLN8054 sidumine ATP-saiti samaaegselt, mis vähendas inhibeerimisreaktsiooni. Märgatav

38

efekt annab aga lootust, et ühendite struktuure ja reaktsioonitingimusi optimeerides paraneks

inhibiitorite afiinsus Aurora B suhtes.

Katsetulemuste hajuvus oli enamikel Aurora A ja Aurora A+TPX2 katsetel väike. See-eest on

reaktsioonides Aurora B-ga märgata kõrget standardhälvet. Põhjuseks võib olla asjaolu, et

kõikidest kasutatud proteiinkinaasidest oli Aurora B puhul fosforüülimisreaktsiooni

efektiivsus kõige madalam ka inhibeerimata kontrollis (st ka 60 min järel oli fosforüülitud

vaid väike protsent TAMRA-Kemptiidist) ning seetõttu oli inhibiitorite efekti raske väga

täpselt kvantifitseerida. Selle vastu aitaks tõenäoliselt PK kontsentratsiooni tõstmine, kuid

antud töö raames soovitiAurora B-d võimalikult kokku hoida.

Kõige efektiivsemaks osutus inhibiitoritest siiski juba kasutusel olev MLN8054. Sünteesitud

ühenditest ei tõusnud kumbki inhibiitor oluliselt esile, suurim erinevus paistis silma vaid

Aurora A inhibeerimisel, mis polnud aga antud uurimuse eesmärk. Erinevate kiraalsete

elemendi kasutamine ühendite linkeris ootustele vastupidiselt ei avaldanud efekti

inhibeerimise karakteristikutele, mis annab samuti märku asjaolust, et inhibiitori kahe

fragmendi seostumine Aurora B vastavatele sidumistaskutele ei toimunud tõenäoliselt

samaaegselt.

0 20 40 60 80

100 120

Nor

mal

isee

ritu

d ak

tiivs

us

DM

SO k

ontr

olli

suht

es Aurora A

0 20 40 60 80

100 120

Nor

mal

isee

ritu

d ak

tiivs

us

DM

SO k

ontr

olli

suht

es Aurora A+TPX2

39

Joonis 12. Inhibeerimiskatsete tulemused

4.4. Võimalikud arengusuunad

Kuigi töös sünteesitud ühendid osutusid planeeritust tagasihoidlikemaks Aurora B

inhibiitoriteks, on siiski lootus nende struktuursete analoogide sünteesil saavutada biligandne

inhibeerimine. Näiteks võimaldaks linkeri struktuuri muutmine ja edasine optimeerimine

ühenditel saavutada efektiivsemaid tulemusi Aurora B inhibeerimisel.

Töö käigus arendati ka uudne biokeemiline meetod Aurora B aktiivsuse ning sellele suunatud

inhibiitorite efektiivsuse hindamiseks. Antud meetodiga saaks edaspidistes uuringutes

keskenduda Aurora B katalüütilise mehhanismi uurimisele INCENPi juuresolekul ja mitte.

Näiteks saaks määrata INCENPi, ATP ja TAMRA-Kemptiidi seostumise parameetreid ning

metalliioonide mõju katalüüsile. See annaks kokkuvõttes väärtusliku informatsiooni

proteiinkinaaside kui rakusiseste katalüsaatorite funktsioneerimise kohta.

Üheks huvipakkuvaks edasiarenduseks võiks olla ka inhibiitorite sisse viimine rakkudesse, et

kontrollida, kas esineb efekt, mis vihjaks Aurora B inhibeerimisele. Ühtlasi võimaldaks see

testida nii ühendite bioloogilist aktiivsust kui võimet siseneda rakku (kuigi tegemist on suurte

peptiididega, võib nende hüdrofoobsus aidata kaasa inhibiitorite läbiminekule raku

plasmamembraanist).

0 20 40 60 80

100 120

Nor

mal

isee

ritu

d ak

tiivs

us

DM

SO k

ontr

olli

suht

es

Aurora B

0 20 40 60 80

100 120

Nor

mal

isee

ritu

d ak

tiivs

us

DM

SO k

ontr

olli

suht

es Aurora B+INCENP

40

Kokkuvõte

Rakusisestes protsessides on tähtis roll ensüümidel, nendevahelisel koostööl ja loodavatel

signaaliradadel. Üheks sellistest ensüümidest on proteiinkinaasid, mis katalüüsivad rakkudes

valkude fosforüülimist, reguleerides ja kontrollides nii valgu aktiivsust. Vead taolises

kontrollitud süsteemis häirivad raku normaalset toimimist ja võivad pikas perspektiivis olla

põhjuseks erinevatele haigustele, nende hulgas Alzheimeri tõvele ja mitmetele kasvajatele.

Ravimitööstuses on probleemile pakutud potentsiaalseks lahenduseks inhibiitorid – ained, mis

blokeeriksid üleekspresseritud proteiinkinaaside tööd.

Aurora B on proteiinkinaas, mis osaleb aktiivselt kogu rakujagunemistsükli vältel selle

reguleerimises. Aurora B-d aitab aktiveerida regulaatorvalk INCENP. Käesolevas töös töötati

välja sellised biligandsed inhibiitorid, mis sisaldavad INCENP järjestust ning tagavad seega

Aurora B sidumistaskustesse seostumisel selektiivsuse ja afiinsuse antud proteiinkinaasi

suhtes. Biligandse inhibiitori tööpõhimõte seisnebki seostumises korraga kahe kinaasitaskuga.

Fmoc-tahkefaassünteesil sünteesitud ühendid sisaldasid lisaks INCENP järjestusele

nukleosiidset fragmenti ning abistava linkerina lüsiini, mille kõrvalahelale kinnitati

aminoheksaanhape. Nukleosiidse ATP-d jäljendava fragmendina kasutati MLN8054, mis

seostus seega ATP sidumistaskuga. Linkerites kasutati kiraalset elementi (D- või L-lüsiini) ja

pikemat alküülahelat (Ahx), võttes arvesse valgu ja inhibiitori kompleksi tõenäoliselt

geomeetriat. Mõlemad sünteesid õnnestusid ning HPLC-ga eraldati puhtad ühendid.

Uurimistöö käigus kasutati Aurora B-ga esmakordselt fluorestentsil põhinevat meetodit

kinaasi aktiivsuse hindamiseks ja inhibiitorite efektiivsuse määramiseks. Selleks lisati

reaktsioonisegudesse substraadina fluorestseeruv TAMRA-kemptiid, mis võimaldas jälgida

fosforüülitud ja fosforüülimata jäänud substraadi eraldumist TLC plaadil. Kuigi üldiselt on

teada, et kemptiid on basofiilse Aurora B jaoks sobiv substraat, pole TAMRA-ga märgistatud

kemptiidi teadaolevalt Aurora B substraadina kasutatud. Seega oli raske ennustada, milliseks

kujuneb fluorestsentsmarkeri mõju kinaasile substraadi fosforüülimises. Uurimuse

41

tähelepanuväärseima osakaalu moodustab sobiva mitte-radioaktiivse inhibeerimismeetodi

väljaarendamine Aurora B aktiivsuse jälgimiseks ning sellele suunatud inhibiitorite

efektiivsuse hindamiseks INCENPi juuresolekul ja ilma. Näiteks on sellist meetodit võimalik

hiljem kasutada Aurora B-le suunatud ravimikandidaatide esialgsetes biokeemilistes

uuringutes.

Sünteesitud inhibiitorid osutusid eeldatust veidi tagasihoidlikemaks, kuid siiski toimisid ja

omasid inhibeerivat efekti. Sellega sai uurimistöö eesmärk ka täidetud. Sünteesitud ainete

struktuure ja karakteristikuid edasi optimeerides on potentsiaalselt võimalik välja arendada ka

veelgi kõrgemat afiinsust ja selektiivsust omavad inhibiitorid, mida kasutada in vivo Aurora B

aktiivsuse jälgimiseks ja mõjutamiseks.

42

Kasutatud materjalid

Adachi, J., Kishida, M., Watanabe, S., Hashimoto, Y., Fukamizu, K., Tomonaga, T. (2014)

Proteome-Wide Discovery of Unknown ATP-binding Proteins and Kinase Inhibitor Target

Proteins Using an ATP Probe. Journal of Proteome Research, nr 13 (12), lk 5461-5470

Adams, J.A. (2001) Kinetic and Catalytic Mechanisms of Protein Kinases. Chemical

Reviews, nr 101 (8), lk 2271-2290

Adams R.R., Wheatley, S.P., Gouldsworthy A.M., Kandels-Lewis S.E., Carmena M., Smythe

C. et al. (2000) INCENP binds the Aurora-related kinase AIRK2 and is required to target it to

chromosomes, the central spindle and cleavage furrow. Current Biology, nr 10, 1075-1078

Carmena, M., Wheelock, M., Funabiki, H., Earnshaw, W.C. (2012) The Chromosomal

Passenger Complex (CPC): From Easy Rider to the Godfather of Mitosis. Nature Review

Molecular Cell Biology, nr 12(13), lk 789-803

Chan, W.C., White, P.D. (2000) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. Oxford: Oxford

University Press

Chauhan, J.S., Mishra, N.K., Raghava, G.P.S. (2009) Identification of ATP binding residues

of a protein from its primary sequence. BMC Bioinformatics, nr 434

Cohen, P. (2002) Protein kinases – the major drug targets of the twenty-first century? Nature

Reviews Drug Discovery, nr 1 (4), lk 309-315

Fu, J., Bian, M., Liu, J., Jiang, Q., Zhang, C. (2009) A single amino acid change converts

Aurora-A into Aurora-B-like kinase in terms of partner specificity and cellular function.

Proceedings of the National Academy of Sciences, nr 108, lk 6939-6944

43

Geneetika sõnastik. Loetud: http://geneetika.ee, 27.12.2016

Goldenson, B., Crispino, J.D. (2015) The Aurora Kinases in Cell Cycle and Leukemia.

Oncogene, January 29, nr 34(5), lk 537-545

Grossman, D., Kim, P.J., Schechner, J. S., Altieri, D.C. (2001) Inhibition of melanoma tumor

growth in vivo by Survivin targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, nr 98, lk 635-640

Hans, F., Skoufias, D.A., Dimitrov, S., Margolis, R.L. (2009) Molecular Distinctions

Between Aurora A and B: A Single Residue Change Transforms Aurora A into Correctly

Localized and Functional Aurora B. Molecular Biology of the Cell, nr 20, lk 3591-3502

HPLC Basic Course [joonis 7]. (2014) Hitachi High-Technologies Corporation. Loetud:

http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/, 01.10.2016

Hitachi High-Technologies Corporation (2014) HPLC Basic Course. Loetud:

http://www.hitachi-hightech.com/global/products/science/tech/ana/lc/basic/, 01.10.2016

Katz, E.D. (1997) High Performance Liquid Chromatography: Principles and Methods in

Biotechnology. Norwalk.

Kim, H.J., Kwon, H.R., Bae C.D., Park, J., Hong, K.U. (2010) Specific primary sequence

requirements for Aurora B kinase-mediated phosphorylation and subcellular localization of

TMAP during mitosis. Cell Cycle, nr 9 (10), lk 2027-2036

Lavõgina, D. (2006) Proteiinkinaaside efektiivsete inhibiitorite konstrueerimine ja süntees.

[bakalaureusetöö]

Lavõgina, D., Enkvist, E., Uri, A. (2010) Bisubstrate Inhibitors of Protein Kinases: from

Principle to Practical Applications. ChemMedChem, nr 4, lk 23-34

Lavõgina, D., Enkvist, E., Uri, A. [joonis 4] (2010) Bisubstrate Inhibitors of Protein Kinases:

from Principle to Practical Applications. ChemMedChem, nr 4, lk 23-34

Lehninger, A.L., Nelson, D.L. Cox, M.M. (2005) Lehninger Principles of Biochemistry

Fourth Edition. New York: W.H. Freeman

44

Lehninger, A.L., Nelson, D.L. Cox, M.M. (2012) Lehninger Principles of Biochemistry 6th

Edition. New York: W.H. Freeman

Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H.,

Matsudaira, P. (2007) Molecular Cell Biology 6th Edition. New York: W. H. Freeman

Ma, H.T., Poon, R.Y.C. (2011) How protein kinases co-ordinate mitosis in animal cells.

Biochemical Journal, nr 435, lk 17-31

Manfredi M.G., Ecsedy, J.A., Meetze K.A., Balani, S.K., Burenkova, O., Chen, W., Galvin,

K.M., Hoar, K.M., Huck, J.J., LeRoy, P.J., Ray, E.T., Sells, T.B., Stringer, B., Stroud, S.G.,

Vos, T.J., Weatherhead, G.S., Wysong, D.R., Zhang, M., Bolen, J.B., Claiborne, C.F. (2007)

Antitumor activity of MLN8054, an orally active small-molecule inhibitor of Aurora A

kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences, nr 104 (10), lk 4106-4111

Manning, G., Whyte, D.B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. (2002) The protein

kinase complement of the human genome. Science, nr 298, lk 1912-1934

Marumoto, T., Zhang, D.W., Saya, H. (2005) Aurora-A - A Guardian of Poles. Nature

Reviews Cancer, nr 5, lk 42

Massispektroskoopia. (2016) Tartu Ülikooli Keemia instituudi kodulehekülg. Loetud:

http://tera.chem.ut.ee/~ivo/ak2/ak2_ms.pdf, 05.01.2017

Meditsiiniline keemia (2015) Kromatograafia. Loetud:

http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/krom.pdf, 02.10.2016

MLN8054, Barasertib (AZD1152-HQPA) [joonis 5] Selleckchem kodulehekülg. Loetud:

http://www.selleckchem.com, 08.02.2017

Oke, A., Pearce D, Wilkinson, R.W., Crafter, C., Odedra, R., Cavenagh, J. et al. (2009)

AZD1152 rapidly and negatively affects the growth and survival of human acute myeloid

leukemia cells in vitro and in vivo. Cancer Research, nr 69 (10), lk 4150-4158

Open Biology kodulehekülg. Loetud: http://rsob.royalsocietypublishing.org, 13.01.2017

45

Petsalaki, E., Akoumianaki, T., Black, E.J., Gillespie, D.A., Zachos, G. (2011)

Phosphorylation at serine 331 is required for Aurora B activation. The Journal of Cell

Biology, nr 195 (3), lk 449-466

Roskoski Jr., R. (2015) A historical overview of protein kinases and their targeted small

molecule inhibitors. Pharmacological Research, nr 100, lk 1-23

Ruchaud, S., Carmena, M., Earnshaw, W.C. (2007) Chromosomal passengers: conducting cell

civision. Nature Review Molecular Cell Biology, nr 8 (10), lk 798-912

Selleckchem kodulehekülg. Loetud: http://www.selleckchem.com/products/MLN8054.html,

27.12.2016

Protein Data Bank. Structures 4AF4, 2X81 [joonis 2] Loetud:

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, 08.02.2017

Swinney, D.C. (2004) Biochemical mechanisms of drug action: what does it take for success?

Nature Reviews Drug Discovery, nr 3, lk 801-808

Terada, Y. (2001) Role of chromosomal passenger complex in chromosome segregation and

cytokinesis. Cell Structure and Function, 26 (6), lk 653-657

Thin Layer Chromatography [joonis 8] University of Leeds. Loetud: http://www.virtual-

labs.leeds.ac.uk/brewing/TLCtheory.php, 08.02.2017

Van der Waal, M.S., Hengeveld, R.C.C., van der Horst, A., Lens, S.M.A. (2012) Cell

Division Control by the Chromosomal Passenger Complex. Experimental Cell Research, nr

318, lk 1407-1420.

Viht, K., Vaasa, A., Raidaru, G., Enkvist, E., Uri, A. (2005) Fluorometric TLC assay for

evaluation of protein kinase inhibitors. Analytical Biochemistry, nr 340, lk 165-170

Walsby, E., Walsh, V., Pepper, C., Burnett, A., Mills, K. (2009) Effects of the aurora kinase

inhibitors AZD1152-HQPA and ZM447439 on growth arrest and polyploidy in acute myeloid

leukemia cell lines and primary blast. Haematologica, nr 93, lk 662-669

46

Wang, Z., Cole, P.A. (2014) Catalytic mechanisms and regulation of protein kinases. Methods

in Enzymology, nr 548, lk 1-21

What is HPLC (High Performance Liquid Chromatography)? [joonis A] Waters

kodulehekülg. Loetud: http://www.waters.com/waters/en_EE/HPLC---High-Performance-

Liquid-Chromatography-Explained/nav.htm?locale=en_EE&cid=10048919, 04.02.2017

47

Lisa 1 Tellitud dervatiseeritud vaigu andmed

\/0/6a,f49 lF

-'--

oO

\J

;CASLOCertificate of Analvsis

For rgsearch use onlv!

Product: Synthetic peptide

Lot No.: P150416-01-01

Manufacturing date: May l3th 2015

Peptide Sequence: Fmoc-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Ala-Ile-Ile-His(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu) -Hi s(Trt)-Pro-Pro-Asn(Trt) -Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-Phe-Gly- Thr(tBu) - Ile-Leu-Pro -Leu-Asp(tBu) -Leu-

Glu(tBu) -Asp(tBu)-Ile-Phe-Lys (Boc)-amide resin

Modifications: Fully protected and resin bound peptide.

Format: Resin bound.

Theoretical M.W.ofpeptide: 3860.56 (measured on a sample of cleayed deprotected peptide, but

with Fmoc side chain protection on)

,J M.W. (M.W. +Na)Measured by MS: 3883.17

M.W. Measured bv MS: 3860.17

Match: Approved.

purity: 57.24%o (meastxed on a sample of cleaved deprotected peptidewithout Fmoc Protection grouP)

Delivered quantity: 0.5 g resin (coreesponding to approx 200 mg crude peptide)

HPLC results: Enclosed.

Mass sPec. results: Enclosed.

CASLO ApS, Diplomvej 381, DK-2800 Lyngby, DenmarkTel: +45- 70 23 28 60, pa1; +45- 70 23 29 90

e-mail: info@caslo.com Web page: www.caslo.com

48

Lisa 2 Sünteesitud peptiidi struktuur

Peptiidi MLN fragment on ümbritsetud punase kastiga ja linker sinise kastiga.

49

Lisa 3 Kasutatud mõisted ja definitsioonid2

Kinetohoor - Kromosoomi tsentromeerse piirkonnaga asuv valguline struktuur eukarüootsete

rakkude mitoosil/meioosil, kuhu rakkude jagunemisel kinnituvad käävi mikrotuubulid.

Kromatiin - Eukarüootse organismi rakutuumas paiknev kromosoomide DNA-st ja valkudest

histoonidest koosnev kompaktne kompleks.

Kromosoom - Eukarüootsetes rakkudes valkudega komplekseerunud suur DNA molekul;

normaalse inimese sugurakkudes on 23 kromosoomi ning keharakkudes 46 (=2×23)

kromosoomi.

Mikrotuubulid - Seest õõnsad kõige suuremad tsütoskeleti elemendid raku tsütoplasmas, mis

koosnevad valgust tubuliinist ning millel on suur tähtsus raku kuju muutmumise ning

rakusisese transpordi tagamises.

Polüploidsus - Üle kahe kromosoomikomplekti organismi rakkudes (st 3×23 või enam).

Sait - Ensüümi sidumistasku, kuhu tavaliselt seostub substraat ning mille läheduses toimub katalüüsitav reaktsioon.

Tsentromeer - Koht, kus kaks tütarkromatiidi on teineteisega seotud. Tsentromeeri piirkonda

tekib ka kinetohoorne kompleks, kuhu raku jagunemisel seostuvad kääviniidid.

Tsütokinees - Tsütoplasma ja rakuorganellide lõplik jagumine pärast rakutsükli lõppemist.

Toimub mitoosis ja meioosis.

2 Mõistete defineerimiseks kasutati virtuaalset üldgeneetika õpikul "Geneetika" põhinevat sõnastikku

50

Lisa 4 RP-HPLC tulemused ja puhtusesüstid

ARC-3523 esialgne kromatograafiline analüüs koos UV-Vis ja ESI-MS andmetega

Musta kastiga on ümbritsetud antud aine teoreetiliste m/z väärtustega ühtivad väärtused.

3.08.2016 10:26:31 Page 1 / 1

C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\DL20160801_Mirel_MS2.lcd

Analysis Report

Sample Name : DL20160801_Mirel_MSSample ID : 3-29/20-80Data Filename : DL20160801_Mirel_MS2.lcdMethod Filename : Darja MS-ga.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 5 uLDate Acquired : 8/1/2016 1:48:06 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/1/2016 3:30:16 PM Processed by : System Administrator

<Chromatogram>

<Sample Information>

Datafile Name:DL20160801_Mirel_MS2.lcdSample Name:DL20160801_Mirel_MSSample ID:3-29/20-80

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 min

0

50

100

150

200

250

300

350

400

mAU

0,0

25,0

50,0

75,0

MPaB.Conc300nm,4nm

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

500

750

mAU 23,734/ 1,00

201

300

658

796

260

649

777

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000110012001300140015001600170018001900m/z0,00

0,25

0,50

0,75

1,00Inten.(x10,000,000)

1461

1096

877 175382 432 13591211 1608226 805 933 1304 18611688619 1928493

51

ARC-3523 puhtuse kromatograafiline kontroll pärast preparatiivset kromatograafiat

5.08.2016 16:20:14 Page 1 / 3

C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\DL20160802_Mirel_A_purity1.lcd

Analysis Report

Sample Name : DL20160802_Mirel_A_puritySample ID : 3-25/40-80Data Filename : DL20160802_Mirel_A_purity1.lcdMethod Filename : Darja MS-ta.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 15 uLDate Acquired : 8/3/2016 3:09:36 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/3/2016 3:39:55 PM Processed by : System Administrator

<Chromatogram>

<Sample Information>

Datafile Name:DL20160802_Mirel_A_purity1.lcdSample Name:DL20160802_Mirel_A_puritySample ID:3-25/40-80

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 min

0

5

10

15

20

25

30mAU

0,0

25,0

50,0

75,0

MPaB.Conc300nm,4nm

Peak TablePDA Ch1 300nm

Peak# 1

Total

Ret. Time 16,985

Area 309020 309020

Height 29502 29502

Conc. 100,000

Unit

Mark

Name

PDA Ch2 200nmPeak#

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14

Ret. Time 0,678 0,847 0,960 1,021 1,205 1,333 1,409 1,729 1,852 1,888 1,994 2,132 2,175 2,353

Area 441846 166670 127383 151760 213226 232450 231779 723154

71610 220520 126517 342945 304682 796317

Height 18094 20902 22865 23770 26653 28798 30098 35630 37339 37970 39743 42109 42803 45419

Conc. 0,541 0,204 0,156 0,186 0,261 0,285 0,284 0,885 0,088 0,270 0,155 0,420 0,373 0,975

Unit

Mark V V V V V V V V V V V V V

52

ARC-3524 esialgne kromatograafiline analüüs koos UV-Vis ja ESI-MS andmetega

Musta kastiga on ümbritsetud antud aine teoreetiliste m/z väärtustega ühtivad väärtused.

5.08.2016 9:22:03 Page 1 / 1

C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\MM20160805_Mirel_B_MS1.lcd

Analysis Report

Sample Name : MM20160805_Mirel_B_MSSample ID : 3-27/40-80Data Filename : MM20160805_Mirel_B_MS1.lcdMethod Filename : Darja MS-ga.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 2 uLDate Acquired : 8/5/2016 8:31:26 AM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/5/2016 9:03:13 AM Processed by : System Administrator

<Chromatogram>

<Sample Information>

Datafile Name:MM20160805_Mirel_B_MS1.lcdSample Name:MM20160805_Mirel_B_MSSample ID:3-27/40-80

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 min

0

100

200

300

400

500

600

700

800

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

MPaB.Conc300nm,4nm

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

500

750

mAU 17,980/ 1,00

201

300

484

656

726

260

468

743

705

785

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Inten.(x1,000,000)

14611096

175387782

142 761 1845694 194315451301342 14141222610 971 1671485

53

ARC-3524 puhtuse kromatograafiline kontroll pärast preparatiivset kromatograafiat

5.08.2016 16:18:58 Page 1 / 1

C:\Users\kasutaja\Desktop\Data\Project1\MM20160805_Mirel_B_purity1.lcd

Analysis Report

Sample Name : MM20160805_Mirel_B_puritySample ID : 3-21/40-70Data Filename : MM20160805_Mirel_B_purity1.lcdMethod Filename : Darja MS-ta.lcmBatch Filename : Vial # : -1 Sample Type : UnknownInjection Volume : 10 uLDate Acquired : 8/5/2016 3:50:46 PM Acquired by : System AdministratorDate Processed : 8/5/2016 4:16:53 PM Processed by : System Administrator

<Chromatogram>

<Sample Information>

Datafile Name:MM20160805_Mirel_B_purity1.lcdSample Name:MM20160805_Mirel_B_puritySample ID:3-21/40-70

0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

MPaB.Conc300nm,4nm

Peak TablePDA Ch1 300nm

Peak# 1 2 3

Total

Ret. Time 14,076 16,370 17,683

Area 23368 30141

1125655 1179163

Height 3172 3315

104860 111347

Conc. 1,982 2,556

95,462

Unit

Mark

Name

54

Lisa 5 Massi-laengu suhte väärtused massispektromeetrias

laeng\hape   0   1   2   3   4   5   6   7   8  

0    4  380            4  494            4  608            4  722            4  836            4  950            5  064            5  178            5  292          

1    4  381            4  495            4  609            4  723            4  837            4  951            5  065            5  179            5  293          

2    2  191            2  248            2  305            2  362            2  419            2  476            2  533            2  590            2  647          

3    1  461            1  499            1  537            1  575          1  613    1  651            1  689            1  727            1  765          

4    1  096            1  125            1  153            1  182            1  210            1  239            1  267            1  296            1  324          

5    877            900            923            945            968            991            1  014            1  037            1  059          

6    731            750            769            788            807            826            845            864            883          

7    627            643            659            676            692            708            724            741            757          

8    549            563            577            591            606            620            634            648            663          

Punasega on näidatud tulemused, millega mass-spektris nähti mõlema aine – ARC-3523 ja

ARC-3524 – piike. Detektori m/z väärtuste ülemine piir on 2000 ja alumine 50.

55

Lisa 6 Fosforüülimisreaktsiooni tulemused TLC plaadil

Fotol on kujutatud TLC plaadil eraldunud fosforüülitud (märgitud sinise noolega) ja

fosforüülimata (märgitud punase noolega) substraadid. Numbritega 1-4 on vastavas

järjestuses tähistatud Aurora A, Aurora A+TPX2, Aurora B ja Aurora B+INCENP, 5-8

tähistavad vastavaid katseid DMSO (kontroll), ARC-3523, ARC-3524 ja MLN8054-ga.

TAMRA-kemptiidi täielikul üleminekul fosforüülitud produkti (ehk täielikul fosforüülimisel)

oleks laik algsetest segudest (ülemine rida) kadunud.

0

5

10

15

20

25

30

DMSO ARC-3523 ARC-3524 MLN8054

Fos

forü

ülit

ud k

empt

iid

(%)

30 min AurA AurA+TPX2 AurB AurB+INCENP

30 min

60 min

1 2 3 4

5 6 7 8

56

0

5

10

15

20

25

30

35

40

DMSO ARC-3523 ARC-3524 MLN8054

Fosf

orüü

litud

kem

ptiid

(%)

60 min AurA AurA+TPX2 AurB AurB+INCENP

57

Resümee

Proteiinkinaasidel on organismis tähtis ülesanne tagada rakkude normaalne elutegevus: nad

koordineerivad rakutsükli tööd, käivitavad valkude transkriptsiooni ning tagavad vajadusel

mitoosi ja apoptoosi toimumise. Katalüüsides rakkudes valkude fosforüülimist, on neil võime

muuta ja seeläbi kontrollida valkude bioloogilist aktiivsust. Proteiinkinaaside kõrgendatud

aktiivsuse ja üleekspresseeritusega rakus on leitud seoseid mitmete tõsiste haigustega, muu

hulgas ka mitmete kasvajavormidega. Lahendusena probleemile nähakse inhibiitoreid –

ühendeid, mis seostuvad proteiinkinaasi sidumistasku(te)sse ja otseselt takistavad

fosforüülülekannet. Inhibiitorid on tõusnud viimase kahe aastakümne jooksul farmakoloogias

ühtedeks huvipakkuvamateks ravimiarendusobjektideks.

Võimalikult selektiivsed ja kõrge afiinsusega ühendid on defektsetest proteiinkinaasidest

põhjustatud haiguste ravimi leidmiseks esimene samm. Inhibiitorite disainis ja sünteesis tuleb

lähtuda proteiinkinaaside struktuurilistest eripäradest, et takistada selle poolt katalüüsitavat

fosforüülrühma ülekannet. Mida rohkem kinaasitaskuid inhibiitor korraga täidab, seda

rohkem vastasmõjusid tal kinaasiga tekib – seega on inhibiitoril ka suurem efektiivsus.

Lisaks, kuna erinevate kinaaside taskud on mõnevõrra erineva struktuuriga, siis on võimalik

inhibiitori disainis seda ära kasutada ja luua võimalikult selektiivsed ühendid. Ühendeid, mis

sisaldavad endas kahe substraadi struktuurseid elemente, nimetatakse biligandseteks

inhibiitoriteks.

Käesoleva töö eesmärgiks oli luua kõrge efektiivsuse ja selektiivsusega ühendid

farmakoloogiliselt huvipakkuva mitootilise kinaasi Aurora B jaoks. Biligandsete inhibiitorite

sünteesil kasutati Fmoc-tahkefaassünteesi ja ainete puhastamisel kõrgefektiivset

vedelikkromatograafiat. HPLC meetodil suudeti eraldada puhtad ühendid, mille struktuurset

korrektsust tõestati UV-Vis spektroskoopiliselt ja ESI-MS mass-spektromeetriliselt.

Biokeemiliste katsete käigus proteiinkinaasiga Aurora B ning sellele struktuurselt lähedase

võrdluskinaasiga Aurora A arendati välja uudne inhibeerimismeetod, mis kasutab õhukese

58

kihi kromatograafia eeliseid ja fluorestsentsmärgistust. Esmakordselt kasutati Aurora B

substraadina TAMRA-kemptiidi, mille fosforüülitud ja fosforüülimata vormide lahutamiseks

kasutati planaarkromatograafiat. Sel viisil sai võimalikuks inhibeerimisreaktsiooni jälgimine

fluorestsentsi detekteerimise kaudu. Meetodi eeliseks on asjaolu, et reaktsioonide tulemusi

saab vaadelda ilma radioaktiivsust kasutamata, nagu seda on teinud paljud varasemad

kasutusel olevad protseduurid.

Tulemustest selgus, et sünteesitud inhibiitoritel oli küll eeldatust nõrgem inhibeerimisefekt

(Aurora B ning Aurora B/INCENP ligi 50% inhibeerimine saavutati 1 µM inhibiitori

kontsentratsiooni juures), kuid täiustamisel võiksid ühendid siiski realiseerida oma biligandset

iseloomu. Uurimistöö käigus välja arendatud mitte-radioaktiivne inhibeerimismeetod võib

edasist rakendust leida Aurora B jaoks arendatavate inhibiitorite, aktivaatori ning isegi

ravimikandidaatide esmasel biokeemilisel iseloomustamisel.

59

Abstract

The Development of Biligand Inhibitors and Non-radioactive Inhibition Assay for

Protein Kinase Aurora B

Protein kinases have one of the most important tasks in the regulation of the cellular

signalling. Among other roles, these enzymes are responsible for coordination of the cell

cycle, and progression of the cell through mitosis or apoptosis. These tasks are accomplished

by protein kinases via catalysis of a reaction termed phosphorylation. During

phosphorylation, a donor (commonly ATP) transfers a phosphoryl group to the acceptor,

resulting in conformational changes of the phosphorylated protein. It has been found that the

abnormally amplification and/or overexpression of protein kinases is connected to various

diseases, including several types of cancer, Alzheimer's disease and diabetes. Inhibitors are

compounds that interfere with the phosphorylation reaction by binding to protein kinases,

therefore preventing binding of the natural substrates. As protein kinases have evolved as a

major class of drug targets, the inhibitors targeting these enzymes have become a subject of

extensive research in pharmacology over the last few decades.

The two most important features of inhibitors are high affinity and high selectivity. The

affinity of inhibitor towards its target depends on the number of interactions between the

inhibitor and the enzyme. The selectivity of inhibitor reflects its ability to recognize

specifically its target and not other enzymes. The structural and conformational differences of

protein kinases should be considered and taken as advantage in the design and synthesis of the

compounds. Protein kinases have two binding sites for the substrates and mostly some extra

binding pockets for the activating/localizing proteins. Thus, inhibitors can be developed that

target simultaneously different regions of the protein kinase catalytic domain.

The aim of this work was to develop effective and selective inhibitors of the mitotic protein

kinase Aurora B. In order to achieve higher selectivity towards Aurora B, three fragments

were included in the inhibitor: INCENP-like fragment, nucleoside analogue (MLN8054) and

a connecting linker. INCENP is a natural activator and substrate of Aurora B; in the structure

60

of inhibitor, a fragment of INCENP was used that is responsible for the correct localization of

Aurora B in vitro. MLN8054 binds to the ATP-binding site of Aurora family protein

kinases.Next, the purification of the compounds with HPLC was performed successfully , and

the structural analysis of the synthesized compounds was carried out by the UV-Vis

spectroscopy and by ESI-MS mass-spectrometry.

In addition, during the biochemical characterization of compounds with Aurora B and a

closely related control kinase Aurora A, a new inhibition assay was developed. The assay

used fluorescently labeled TAMRA-Kemptide as a substrate and took advantages of TLC for

separation of the phosphorylated and non-phosphorylated substrate forms. The

phosphorylation reaction in the presence or absence of inhibitors and activators could be

monitored by both the generation of the phosphorylated product and the disappearance of the

substrate. Furthermore, no radioactive reagents were required for the assay.

Although both synthesized compounds showed lower inhibitory efficiency than expected

(50% inhibition of Aurora B and Aurora B/INCENP at 1 µM concentration of compounds),

upon further modification those could still take full advantage of their biligand nature. The

fluorometric non-radioactive inhibition assay developed during the project could be well

applicable for further screening of selective activators, inhibitors or even drug candidates

targeting Aurora B.

61

Kinnitusleht

Kinnitan, et

• koostasin uurimistöö iseseisvalt. Kõigile töös kasutatud teiste autorite töödele ja

andmeallikatele on viidatud;

• olen teadlik, et uurimistööd ei edastata teistele tulu teenimise eesmärgil ega jagata

teadlikult plagieerimiseks.

…………………………………………….…………………………

kuupäev / nimi / allkiri

Tunnistan uurimistöö kaitsmisvalmiks.

Juhendaja

………………………………………….……………..……………..

kuupäev / nimi / allkiri