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Submitted on 1 Jan 1972

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PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES DU SÉRUMHYPERIMMUN PROVENANT DE RATS INFESTÉS

PAR NIPPOSTRONGYLUS BRASILIENSISG. Luffau, C. Carrat, R. Lhortolary

To cite this version:G. Luffau, C. Carrat, R. Lhortolary. PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES DU SÉRUM HYPERIM-MUN PROVENANT DE RATS INFESTÉS PAR NIPPOSTRONGYLUS BRASILIENSIS. Annalesde Recherches Vétérinaires, INRA Editions, 1972, 3 (2), pp.319-346. �hal-00900711�

PROPRIÉTÉS BIOLOGIQUES DU SÉRUM HYPERIMMUNPROVENANT DE RATS INFESTÉS

PAR NIPPOSTRONGYLUS BRASILIENSIS

G. LUFFAU

C. CARRAT R. LHORTOLARY

Station de Recherches de Virologie et d’Immunologie, I. N. R. A., .,

78 - Thiverval-Grignon

RÉSUMÉ

L’étude des propriétés biologiques du sérum provenant d’animaux hyperimmunisés au coursd’affections parasitaires démontre, dans le cas particulier d’une étude expérimentale chez desrats infestés par Nippostrongylus brasiliensis, que de tels sérums sont capables de protéger desanimaux neufs, donc que les anticorps circulants jouent un rôle dans les mécanismes de l’immunité.Son action s’exerce entièrement sur les formes adultes localisées à l’intestin.

Il intervient d’une manière indirecte et son action suppose que les anticorps responsables del’anaphylaxie cutanée passive - d’apparition régulière et à un taux très élevé dans les affectionsparasitaires - et les anticorps présents dans les sécrétions muqueuses jouent un rôle. Ces expé-riences sont relatées ici et essaient d’établir le rôle respectif de ces différents types d’anticorps.

INTRODUCTION

Des rats soumis à des injections de larves de Nipposirongylus brasiliensis serévèlent par la suite résistants à l’infestation (SARLES et al., ig36 ; CHANDLER, ig37).Cette résistance acquise est en général partielle après une seule injection, totaleaprès des injections répétées.

Diverses hypothèses ont été avancées pour interpréter le phénomène quant àsa nature et à son mécanisme. L’explication la plus facile était l’intervention dephénomènes immunitaires ; elle semblait d’autant plus plausible que cette résistanceapparaît progressivement, qu’elle n’est totale qu’après un certain nombre d’injec-tions de rappel et que chaque infestation est suivie de l’apparition d’anticorpscirculants (tels ceux responsables de l’anaphylaxie cutanée passive, OGILVIE, zg6q.).

La question se pose alors de savoir s’il existe une corrélation entre l’existenced’anticorps sériques et l’état d’immunité : c’est ce qui nous a amené à étudier deuxpropriétés connues de ces sérums, celle de protéger des rats neufs contre une infes-tation parasitaire expérimentale et celle de transmettre la sensibilité cutanée à

l’antigène parasitaire.

MATÉRIEL ET TECHNIQUES

Parasite et animaux de laboratoire

Le cycle évolutif et l’entretien en laboratoire de la souche de Nippostrongylus brasiliensis(TRAVASSOS, ig2i), Nématode parasite de l’intestin grêle du Rat ont été décrits précédemment(LUFFAU, 1969).

Nous utilisons des rats, de souche Wistar, toujours des femelles, qui proviennent soit duCentre animalier de l’Université de Poitiers, soit de l’élevage de la Station de Virologie et d’Immu-nologie de Thiverval-Grignon. Ils sont entretenus en cage à sol grillagé, abreuvés et alimentés àdiscrétion. L’âge des animaux est, au moment de leur utilisation, de 13 à r4 semaines (200 genviron).

Préparation de l’antigène

Pour préparer l’antigène, il faut, en premier lieu, récolter des vers adultes après autopsie derats infestés (LUFFAU, 1969) ; les parasites sont alors stockés par lots de 100 ooo à i5o 00o etconservés à très basse température - en second lieu, broyer les vers dans un mortier à - 700C(température de sublimation de la neige carbonique).

Nous utilisons comme antigène la partie surnageante, après centrifugation à 2 500 tr/mn,d’un broyat de vers adultes en suspension dans une solution tampon phosphate o,05 M, NaCI0,15 M, à pH 7,8. La teneur en matériel parasitaire de cet antigène est telle que i ml contientl’équivalent de i ooo vers adultes broyés.

Sérums hyperimmuns

a) Production.

Le sérum dit hyperimmun (SHI) correspond au sérum prélevé chez des rats ayant subisoit des injections répétées de larves infestantes (La) aux doses de 3 ooo La, 5 ooo L3’ 7 ooo La,à 15 jours d’intervalle, soit une implantation par voie duodénale de 1 zoo vers adultes.

Le prélèvement de sang se fait 5 jours après la dernière injection (ou après la dernièretransplantation), par ponction de l’aorte postérieure.

Le volume du sérum recueilli, après exsudation du caillot, est de 4,5 ml environ par rat ;nous constituons des lots homogènes de SHI en mélangeant le sérum provenant de 5o à 15o rats.

b) Test d’anaphylaxie cutanée passive.

On teste les sérums, en ce qui concerne l’anaphylaxie cutanée passive (ACP) ou PassiveCutaneous Anaphylaxis (PCA) des auteurs anglo-saxons, selon la technique décrite par B. M. OGIL-mE (1964). Elle consiste à injecter, dans un premier temps, o,2 ml de sérum dans le derme dela peau d’un rat neuf ; dans un deuxième temps, à inoculer par voie veineuse un mélange de0,5 ml d’une solution à 2 p. ioo de Bleu Evans (en un soluté NaCI o,i5 M) et de o,5 ml d’unesolution d’antigène. La lecture de la réaction se fait 30 mn après l’injection intraveineuse.

D’un point de vue pratique, on injecte le sérum à tester dans la région dorsale d’un rat.Le sérum subit une série de dilutions (pur, 1/10, 1/20, 1/40, i/8o, etc.) ; trois rats reçoivent lesinjections de la série des dilutions auxquelles s’ajoute l’injection de sérum provenant d’ani-

maux neufs (SN) (1) et l’injection de sérum provenant d’animaux hyperimmuns (SHI) (2) diluéà i/zoo (fig. r).

Nous notons arbitrairement + + + + la surface bleue d’extravasation du plasma, déter-minée par l’injection intradermique de o,2 ml d’un SHI dilué à i/ioo, connu pour sa hauteteneur en anticorps responsables de 1’ACP ; nous considérons que la réaction est positive si lasurface de la tache d’extravasation est au moins égale à la moitié de la surface (notée + +) duSHI de référence. La plus grande dilution qui peut encore être notée -!- !-- nous donne le tauxen anticorps responsables de l’ACP (0 ACP) d’un sérum.

c) Incicbation des parasites dans le sévum.

L’incubation des parasites dans le sérum peut avoir deux buts : faire subir aux parasitesl’action in vitro du sérum ou épuiser le sérum en anticorps spécifiques.

Action in vitro du sérum sur les pavasites.Les 12 000 larves L. (nombre nécessaire à infester 8 rats) sont mises à incuber dans 36 ml

de sérum (SHI ou SN) pendant 2 heures à 370C (bain-marie agité). Le sérum est rejeté aprèsune centrifugation à petite vitesse ; on ajoute 36 ml de sérum et on fait incuber à nouveaupendant 2 heures.

Le même procédé est utilisé pour mettre à incuber les parasites des stades intestinaux(vers prélevés 85 heures après l’infestation ou larves L!, vers prélevés 8 jours après l’infestationou vers adultes ; la transformation L4 -+ L5 se faisant à la 115’’heure selon TWOHY, 1956) avantde les transplanter chez des rats neufs. Les quantités utilisées sont io 00o vers pour 72 ml

de sérum.

Épuisement du sévum par les parasites.Lorsque nous épuisons les sérums par du matériel parasitaire vivant (larves, adultes), nous

utilisons la technique décrite ci-dessus à la seule différence que les proportions de parasites etde sérum changent (Soo 00o La pour 80 ml ou qo 00o vers adultes pour 80 ml).

(I) S N = sérum normal par opposition au(2) S H I = sérum hyperimmun.

Recherches vétérinaires.― 1972.

Pour ce qui est du matériel parasitaire broyé et desséché, les opérations d’incubation se dé-roulent aussi en 2 temps ; l’incubation se prolonge pendant toute la nuit à -f- 40C. On épuise80 ml de sérum par 400 mg de vers adultes (1) ou par 30 mg de larves (a). Finalement, oncentrifuge pendant 20 mn à 50 00o g (Rotor type 50 ; centrifugeuse Beckman L 2 65B).

d) Récolte du mucus intestinal

Immédiatement après le sacrifice, l’intestin grêle du rat est fendu longitudinalement, placédans une solution tampon acétate o,25 M, pH 5,4 refroidie à o°C. La muqueuse et le contenuintestinal sont recueillis par raclage ; la suspension obtenue est centrifugée à 23 ooo g. Le surna-

geant est alors soumis à une filtration sous pression (appareil Diaflo) à travers une membranede polymères synthétiques (XM. ioo-Amicon), puis dialysé contre de l’eau distillée et lyophilisé.

Dose d’épreuve. Larves infestantes (stade La)La récolte des larves infestantes, le mode d’infestation des animaux et les techniques

d’autopsie ont déjà été décrits (LUFFAU, ig6g). Après une injection d’épreuve de 1 ooo (ou3 ooo) L2,la détermination du nombre des larves dans les poumons, du nombre des vers adultesdans l’intestin (méthode préconisée par MULLIGAN et al., rg6g), du nombre des oeufs dans lesfèces, donne une bonne appréciation de l’état d’immunité ; elle est d’autant plus forte que lenombre des parasites (larves, vers adultes, oeufs) est faible par rapport à celui des témoins.

Nous obtenons ces chiffres soit à la faveur d’une étude cinétique de la population de para-sites, soit, plus simplement, en autopsiant des rats à la 48e heure (taux de larves le plus élevédans les poumons des rats témoins) et au 8e jour (taux de vers adultes le plus élevé dansl’intestin des rats témoins). Nous établissons systématiquement la cinétique du taux d’éliminationdes oeufs par des numérations journalières.

Simultanément, on mesure le taux des anticorps dans le sang selon la technique de l’ana-phylaxie cutanée passive (ACP).

Laparatomie et transplantation des vers adultes dans une anse duodénale

La technique décrite par OGILVIE (1968), MULLIGAN et al. ig6g), a été reprise par nous-même (LUFFAU, 1969).

Les vers adultes sont transplantés dans l’anse duodénale à l’aide d’un trocard (! = 2 mm).Le sérum est injecté dans le duodénum, après laparotomie, à l’aide d’une seringue à injectionhypodermique (aiguille 3z-7/ro).

Interprétation statistique des résultats

La répartition des animaux dans leur groupe d’expérience respectif est systématiquementfaite à l’aide d’une table de nombres au hasard. Chaque chiffre est le résultat de la moyenne des

valeurs obtenues sur 6 à rats ; l’intervalle de confiance est alors donné par la formule ! ts nVn

où s = écart-typen = nombre d’animauxt = t de Student-Fisher déterminé pour un degré de liberté n ― r, au risque consenti

de 5 p. 100

RÉSULTATS

Les expériences relatées dans les pages qui vont suivre tendent pour les unes,à mettre en évidence un éventuel pouvoir de protection du sérum sanguin ou celuides sécrétions muqueuses intestinales provenant de rats infestés, et pour les autresà étudier les propriétés biologiques du sérum hyperimmun (composition de ce sérumen anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanée passive, épuisement par l’antigènespécifique).

(’) i.ooo vers broyés et lyophilisés # 5 mg.(8) 1.000 larves broyées et lyophilisées # o,o6o mg.

1. - Protection des rats par du sérum hyperimmun

Nous avons été amené à vérifier l’action du SHI soit en l’injectant par voiegénérale, soit en le mettant au contact direct des parasites.

A. Injection du sérum hyperimmun par voie !arentérale.

a) Efficacité du sérum hyperimmun selon le moment de l’injection.

Après l’injection de 3 000 larves infestantes Ls, par voie sous-cutanée, à desrats auxquels on a administré en une dose unique (non répétée) 5 ml de SHI

(2 ml par voie veineuse, 3 ml par voie péritonéale), une certaine population de versadultes s’installe dans l’intestin grêle ; nous en apprécions l’importance par desautopsies pratiquées le ge jour après l’infestation. Les rats sont répartis en 10 lots ;on leur administre respectivement du SHI entre le 2e jour qui précède l’infestationet le ge jour qui lui succède.

Des injections de SN ont également été effectuées (4 lots de rats) afin de mettreen évidence un éventuel facteur humoral aspécifique. I,a courbe n° 2 traduit les.résultats obtenus.

Il ressort de cette expérience :10 I,e nombre de vers adultes recueillis à l’autopsie est moindre si l’on injecte

simultanément (dans les heures qui précèdent ou qui suivent immédiatement) larvesinfestantes et SHI.

2o Le SHI, injecté aussi tardivement que le q jour après l’infestation, affectel’importance de la population des parasites intestinaux qu’il contribue à réduiredans de grandes proportions (50 vers adultes chez des animaux soumis à des injec-tions de SHI, contre 1 200 chez des animaux ayant reçu du SN, lorsque l’injectionde sérum est faite le jour même de l’infestation).

3° Le SHI injecté après le 5e jour est inefficace.q.! La population de vers n’est pas affectée par l’injection de SN ; en effet

si l’on peut dénombrer i 255 vers chez des rats ainsi traités, on en dénombrel 277 chez les témoins.

b) Cinétique d’évolution de la population de larves (poumons) et de la Populationde vers adultes (intestin).

Nous avons suivi la cinétique du passage des larves à travers les poumons etla cinétique d’installation des vers adultes dans l’intestin grêle après injection de8 ml de SHI par voie générale, soit 0,04 ml/g, le jour même de l’infestation(taux ACP = 1/320).

Ces expériences nous ont montré que le nombre de larves dans les poumonset celui des vers dans l’intestin évoluent comme l’indique la figure 3.

Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus, après une dose d’épreuve, chezdes animaux immunisés non plus passivement mais par voie active (injection préa-lable de larves I,3 par voie sous-cutanée). Nous avons au cours de cette expérience,comme de la précédente, établi la cinétique du passage des larves à travers lespoumons et la cinétique d’installation et d’expulsion des vers adultes de l’intes-tin (fig. 4).

I,’examen des chiffres des expériences ci-dessus permet de conclure :I Le SHI possède effectivement un pouvoir de protection ; à l’acmé de l’infes-

tation (8e jour après injection des larves) la population de vers adultes est de l’ordrede 550 chez les animaux ayant reçu du SN tandis qu’elle est de l’ordre de 107 chezles animaux traités par du SHI. Cette population est de 567 vers chez les animauxtémoins n’ayant reçu ni SN, ni SHI;

2° Le SHI a une certaine activité inhibitrice sur la migration des larves dela peau vers le poumon ; à la z8e heure, nous ne trouvons dans les poumons que8 larves chez les animaux ayant été traités, alors que chez les animaux ayant reçuune injection de SN nous en trouvons 68;

30 Le SHI n’arrête pas la migration des larves dans le tissu pulmonairepuisque, dès la 72e heure, il n’y a plus que 15 larves dans les poumons aussi bienchez les animaux ayant reçu du SHI que chez ceux ayant reçu du SN ; elles ontmigré vers l’intestin. Le 8e jour, il n’en reste pratiquement plus dans les poumonsdes rats des uns ou des autres groupes ;

40 Le nombre des vers dans l’intestin atteint sa valeur maximale le 6e jour,que les rats aient reçu du SHI ou du SN. Il est beaucoup plus grand (et sem-blable à celui trouvé chez les témoins) chez les rats qui ont reçu une injection deSN, que celui trouvé chez les animaux traités par SHI, lors des autopsies à j + 8.

Les animaux du groupe ayant reçu du SHI expulsent la population de versadultes d’une manière plus précoce (6-7e jour) que ceux auxquels on avait injectédu SN (II-I2e jour) ;50 L’élimination des oeufs est affectée par l’administration de SHI ; le taux

d’élimination est moindre (8 00o contre 58 ooo oeufs par gramme de fèces) le 8 jouraprès l’infestation, date à laquelle l’élimination est à son taux le plus élevé, etl’émission en est pratiquement arrêtée le ge jour alors que cet arrêt n’a lieu quele I2e ou le 13’ jour chez les animaux qui avaient reçu du SN (fïg. 5) ;

60 En première approximation, le passage des larves à travers les poumonsse fait d’une manière analogue, que les rats aient été préalablement infestés ou non ;par contre, dès le 6e jour, la population de vers adultes est rejetée de l’intestindes rats immunisés alors qu’elle ne l’est que le I3e jour chez des animaux témoins(fig. 4).

’

Il est important de signaler que, parmi les lots de sérums que nous avons utilisés,il en est un nombre élevé qui sont inaptes à transmettre l’immunité par voie passive.Ces sérums provenaient d’animaux immunisés (et totalement résistants à une dosed’épreuve) après la série usuelle d’injections par voie sous-cutanée. Rien ne distin-guait les animaux donneurs (quant à leur âge, leur sexe, le nombre et le rythmedes injections, les modalités de prélèvement des sérums, etc.) à l’origine de « bonssérums » de ceux à l’origine de « mauvais sérums ». Tous les essais destinés à mettre

en évidence le facteur susceptible d’avoir une influence sur la qualité du sérumn’ont fait ressortir que des différences minimes.

Nous devons conclure à la présence fugace des anticorps de protection dansle sérum des animaux immuns.

B. Mise en contact direct des vers et du séyum hyperimmun (ou du mucus intestinal).Au cours des expériences rapportées précédemment, le sérum avait été injecté

par voie parentérale ; l’absence de contact intime entre les vers et le sérum pourraitfort bien expliquer son efficacité toute relative et inconstante.

Nous avons alors mis à l’épreuve cette hypothèse. Nous avons procédé diffé-remment selon qu’il s’agissait de larves La ou des stades parasitaires localisés à l’intestin.

- Les larves sont mises à incuber dans le SHI puis injectées par voie sous-cutanée.- Pour ce qui est des stades parasitaires intestinaux le contact direct avec

le SHI (ou le mucus provenant de rats hyperimmuns ou MIH) peut être obtenu dedeux façons :

a) par incubation des parasites qui sont ensuite transplantés chez les animauxneufs ;

b) par injection du SHI (ou du mucus intestinal) directement dans le duodé-num de rats parasités (c’est-à-dire infestés depuis huit jours et hébergeant donc desvers adultes dans l’intestin).Nous n’avons pas fait incuber les stades larvaires dans le mucus intestinal

hyperimmun ; cela ne s’imposait pas car seuls les vers adultes sont naturellementau contact du mucus intestinal.

a) Mise en incubation des parasites dans le SHI et infestation de l’7zôte.- Incubation des larves infestantes I,a dans le sérum.Avant leur injection, les larves infestantes Iva sont mises à incuber soit dans

du SHI (6 ACP = 1/200), soit dans du SN.Après des autopsies effectuées les unes 42 heures, les autres 8 jours après l’in-

jection des larves, nous dénombrons les larves dans les poumons et les vers dansl’intestin ; par ailleurs, nous avons suivi le taux d’élimination des oeufs dans les fèces.

Le tableau i résume les résultats obtenus.

Cette expérience montre que le SHI se révèle, dans les conditions de notreexpérience, inefficace sur les larves au stade infestant (larves L3)’- Incubation des larves L4 dans le sérum.

L’incubation des larves Là est sans effet sur leur vitalité si l’on en juge parles résultats exposés dans le tableau 2.

- Incubation des vers adultes dans le sérum.

Après incubation des vers adultes dans le sérum hyperimmun (6 PCA = I!320),ils sont transplantés dans l’intestin de rats neufs. Parallèlement des vers sont misà incuber dans du sérum provenant d’animaux normaux (SN).

Des autopsies au 8e jour après la transplantation, montrent que les vers

adultes ne sont pas affectés in vitro par le contact direct du sérum hyperimmun(tabl. 3).

b) Mise en contact des vers et du SHI par introduction du SHI dans l’intestin.Un lot de rats a été préalablement infesté par voie sous-cutanée selon la

méthode usuelle; nous injectons, après laparotomie, 2 ml de SHI dans le duodénum.Cette injection peut être faite soit avant la 115! heure (4e jour) qui suit l’infes-

tation, soit après (7e jour), le sérum atteignant alors soit des parasites au stade I,4,soit des parasites au stade Lo.

I,e tableau 4 (injection de sérum après la 115e heure) résume les résultatsdes autopsies faites les 8-, ge jours après l’infestation (acmé de l’infestation).

Il apparaît que le sérum hyperimmun ― comme le sérum normal - injectésin loco, sont également inefficaces qu’on les injecte avant ou après la II5 heure.

Dans l’un, comme dans l’autre cas, l’expulsion des vers adultes n’est pasaccélérée.

C. Mise en contact des parasites et du mucus intestinal provenant d’animaux hyper-immuns.

Afin de juger de l’activité du mucus provenant de l’intestin de rats hyperimmunssur une population de vers adultes, nous avons procédé à deux séries d’expé-riences.

Dans la première série, après incubation de 45 00o vers adultes (= autopsiede 20 rats) pendant 2 heures à 37°C dans le mucus recueilli à partir de l’intestingrêle de 5o rats, ces vers ont été transplantés après laparotomie dans le duodénumde rats neufs (tabl. 5).

Dans la deuxième série, des rats ont été infestés normalement par injectionsous-cutanée avec des larves 1/g ; le 4 jour après l’infestation pour les uns, le 6s jour(donc après la mue I;4 -! L5) nous injectons le mucus par voie duodénale mettantainsi en contact mucus hyperimmun et parasites (tabl. 6). Par des autopsies, nouscomparons le comportement des populations de vers au contact du mucus à celuides populations témoins.

Par ailleurs, des vers ont été incubés dans la fraction du sérum préci-pitable par une solution de sulfate d’ammonium à 75 p. 100 ou à 100 p. ioo (satu-ration).

Dans les conditions dans lesquelles nous nous sommes placés, le comportementdes parasites (autostérilisation, élimination des oeufs) ne semble pas affecté par lecontact avec des fractions précipitables de mucus ou le « mucus hyperimmun »

total.

2. - Anticor!s responsables de l’anaphylaxie cutanée Passive (ACP)au cours de l’immunisation

Ive test d’ACP, tel qu’il a été défini dans le chapitre ic Matériel et techniques »,fut pratiqué sur les sérums provenant : -.

A. de rats infestés une ou plusieurs fois,B. de rats chez qui les parasites n’ont accompli qu’une partie du cycle évolutif,C. de rats infestés une ou plusieurs fois, placés sous l’effet de substances cor-

ticoïdes,D. de rats ayant subi des injections de sérum hyperimmun par voie parentérale.Nous avons également étudié les propriétés, après épuisement par les parasites

eux-mêmes ou le produit de leur métabolisme, de sérums provenant de rats ayantété infestés à plusieurs reprises (cf. paragraphe A, ci-dessus).

A. Cinétique du taux des ant.icov!s responsables de l’anaphylaxie cutanée Passive chezdes yats primo-infestés et chez des animaux ayant subi des infestations yéitérées.Des rats, infestés selon la méthode déjà décrite (IuPPATi, ig6g), sont saignés

soit totalement à l’occasion d’autopsies, soit par ponction du sinus rétro-orbitalin vivo ; on recherche la présence d’anticorps cytophiles par le test d’ACP.

En portant en abscisse la date des prélèvements sanguins (après l’infestationou la transplantation) et en ordonnée le cologarithme de la plus grande dilutiondu sérum qui donne une réponse positive, nous avons pu tracer les courbes quiexpriment l’évolution du taux des anticorps.

L’examen de ces courbes nous permet de voir que :

a) les anticorps ne sont décelables qu’après le 15e jour et que leur taux va enaugmentant pour atteindre leur taux maximum dès le I7e jour (fig. 6) ;

b) le taux des anticorps se maintient au moins jusqu’au 30 ou 40e jour, puisil décroît ;

c) chaque injection de rappel est suivie d’une chute du taux des anticorps(72 heures après l’inoculation), avant de le voir augmenter à nouveau pour atteindreun taux supérieur à celui des animaux n’ayant pas reçu de seconde injection ;

d) chez des animaux hyperimmuns, des anticorps peuvent être décelés aussitard que le 70e jour.

B. Cinétique du taux des anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanée Passive chezdes animaux quand les parasites n’ont accompli qu’une partie du cycle évolutif.Ce cycle partiel peut être obtenu soit par le seul développement des larves

dans les poumons grâce à des vermifugations systématiques (résultats non publiés)

ou l’injection de larves irradiées (LUFFAU, ig6g), soit par la seule présence de para-sites dans l’intestin (transplantation de vers adultes dans le duodénum, après lapa-rotomie).

Nous avons suivi l’évolution du taux des anticorps chez ces animaux, maisaussi chez ces mêmes animaux après qu’ils aient reçu une nouvelle injection de larves(injection de rappel) 20 jours plus tard. La figure 7 résume les résultats obtenus.Il apparaît :

a) l’injection de larves, en évitant absolument le séjour d’adultes dans l’intestin,ne s’accompagne pas de l’apparition d’anticorps ;

b) la transplantation de vers adultes dans l’intestin est suivie de l’apparitiond’anticorps circulants, dès le i2e jour (au lieu du iy jour chez des animaux norma-lement infestés par voie sous-cutanée par des larves infestantes au stade I,$) aprèsla transplantation, à un taux relativement élevé mais il baisse très rapidement ;

c) une injection de rappel de 3 000 larves par voie sous-cutanée détermine

l’apparition d’anticorps dans les 72 heures suivant l’administration des larves, queles animaux aient été infestés et vermifugés ou qu’ils aient été infestés par trans-plantation de vers adultes.

Nous avons montré que l’injection de vers adultes broyés (ou de larves), avecou sans adjuvant de l’immunité (adjuvant de FxEtn·rn), ne s’accompagne pas del’apparition d’anticorps ACP. De tels animaux ne sont aucunement résistants àdes infestations ultérieures.

I,’administration par voie intestinale de vers adultes broyés (soit en une seuleinjection par voie duodénale après laparotomie, soit par abreuvement des animaux

avec une solution de vers broyés et lyophilisés à raison de 15 mg/rat/jour, pendant8 jours) n’engendre ni une immunité ni la production d’anticorps responsables del’ACP. Une injection de larves Ls par voie sous-cutanée, trois semaines après, n’estsuivie de l’apparition d’anticorps responsables de l’ACP que le I7e jour ; c’est doncune réponse de type primaire et non de type secondaire (fig. 8).

C. Cinétique du taux des anticorps responsables de l’ACP chez des animaux primo-infestés, ou ayant subi des infestations réitérées, et placés sous l’effet de subs-tances corticoïdes.

On sait, entre autres effets, que les substances corticoïdes suppriment le phé-nomène d’autostérilisation (LUFFAU, ig6g), à condition qu’elles soient injectées àune dose suffisamment élevée (0,1 mg/rat pour la Triamcinolone) (1) et qu’ellessoient administrées avant le 9e jour après l’infestation.

Nous avons suivi l’évolution du taux des anticorps responsables de l’ACPchez des animaux infestés mais qui recevaient une injection de Triamcinolone parvoie sous-cutanée toutes les 48 heures, à la dose de o,666 mg/rat (soit 3,5 mg/kg).

(’) Triamcinolone (Canitédarol S.P.E.C.I.A.) ! fluorO-9OC hydroxy-16oc delta-i déhydrocortisone.

La figure 9 montre les résultats obtenus pour un groupe de rats auxquels nousavons administré la Triamcinolone 48 heures avant l’infestation, pour un autregroupe de rats auxquels la Triamcinolone n’a été administrée qu’à partir du7e jour suivant l’infestation. On poursuit les injections jusqu’au ye jour dans lesdeux groupes.

L’examen de ces courbes montre :

a) les anticorps responsables de l’ACP apparaissent bien chez des rats à quion avait administré des substances corticoïdes ;

b) le profil de la courbe et la date d’apparition des anticorps sont en toutpoint semblables à ceux des témoins si les animaux ne reçoivent les substancescorticoïdes qu’à partir du 7e jour après l’infestation ;

c) les anticorps ACP apparaissent avec un certain retard chez les animauxqui ont été traités par les substances corticoïdes avant même l’infestation ; leurtaux atteint malgré tout celui du sérum provenant d’animaux témoins ou celuidu sérum provenant d’animaux traités par les substances corticoïdes à partir du7e jour ;

’

d) l’injection de rappel détermine, comme chez les témoins, une chute du tauxdes anticorps (vers la 72e heure après l’infestation) puis une remontée de ce taux,mais il n’atteint jamais celui observé chez les témoins.

D. Cinétique du taux des anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanée passive chezdes rats neufs immunisés passivement.Au cours d’expériences d’immunisation passive des rats infestés par i ooo L3

administrées par voie sous-cutanée, nous avons établi la cinétique de l’évolutiondu taux des anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanée passive après injectionde SHI le jour même de l’infestation.

Nous avons injecté 8 ml de sérum à des rats dont le poids moyen était 185 g.Nous estimons que ce sérum est dilué par 2 (la saignée d’un rat fournit en moyenne4,o ml or nous savons que l’exsanguination n’est jamais totale) ; le taux des anti-corps ACP passe alors de 1/320 (celui du SHI injecté) à 1/160 au moment mêmede l’injection. Iae taux de ces anticorps tombe rapidement ; il est nul dès la

q.8e heure. Leur disparition se fait d’une manière exponentielle ; il est remarquableque l’élimination ne se fasse pas en deux temps et que la courbe n’ait pas une allurediphasique (fig. 10).

E. Épuisement du sérum hyperimmun par des antigènes de larves ou des antigènesde vers adultes.

L’incubation du matériel parasitaire dans du sérum hyperimmun altère lespropriétés biologiques de ce sérum, en particulier celle de protéger par immunisationpassive des rats neufs d’une invasion parasitaire et celle de transmettre l’anaphy-laxie cutanée passive.

Nous avons épuisé le sérum hyperimmun par les antigènes correspondants :vers adultes vivants, vers adultes broyés, produit du métabolisme des vers adultes,larves vivantes, larves broyées.

Seuls, les sérums hyperimmuns incubés avec les vers adultes (vivants, broyésou le produit de leur métabolisme) perdent l’aptitude à transmettre l’anaphylaxiecutanée passive. Dans ce cas l’adsorption est totale.

Ni les sérums incubés avec des vers adultes, ni les sérums incubés avec deslarves ne perdent leur aptitude à protéger les rats par immunité passive.

DISCUSSION

L’injection de sérum provenant d’animaux immuns protège effectivement desanimaux neufs d’une éventuelle infestation. Ces résultats confirment ceux de SARDESet al. (1939) et ceux de B. M. OGILVIE (ig68).

En ce qui concerne Nippostrongylus brasiliensis tout au moins, la possibilitéde transmettre passivement l’immunité et celle de transmettre passivement l’ana-phylaxie cutanée passive démontrent la présence d’anticorps circulants après infesta-tion des rats.

Il se pose alors une question, celle du rôle joué par ces anticorps circulantsdans l’immunité au cours des affections parasitaires et peut-être ensuite l’élucida-tion du mécanisme de cette immunité.

A. - Rôle du sérum hy!erimmun dans la protection des yats

La transmission passive de l’immunité à l’aide du sérum appelle deux remarques.D’une part, il faut injecter de très grandes quantités de sérum de l’ordre de 8 ml alorsque l’exsanguination totale d’un rat en fournit de 4 à 4, 5, d’autre part, les résultatsobtenus sont inconstants selon les lots de sérum utilisés ; un tiers d’entre eux serévèle inapte à la transmission passive de l’immunité.

W. JARRETT et al. (1955) avaient également réussi à transmettre l’immunitépar voie passive dans la Dictyocaulose bovine par injection de quantités énormesde sérum. Par ailleurs, B. M. OGWVW (1968) a rapporté l’inconstance de l’activitédes sérums.

L’immunité obtenue par cette voie contraste donc avec celle que laisse subsisterune injection de larves La par voie sous-cutanée ; elle est, dans ce dernier cas,solide et constante (I,uxxAU et al., 1969).

Les autopsies pratiquées le huitième jour après l’infestation ne reflètent qu’unaspect global dans lequel activité du SHI sur les larves et activité sur les adultesse trouvent confondues.

Les larves sont épargnées par tous les mécanismes immunitaires comme on peuten juger par les expériences d’incubation, par les études cinétiques de la migrationdes parasites chez des rats immunisés activement (après injection de larves I,3 parvoie sous-cutanée) ou immunisés passivement.

Les larves ne soyat apparemment pas sensibles aux mécanismes immunitaires:

L’immunité s’exerce donc essentiellement à l’encontre des stades parasitairesadultes. Des expériences (TAFFS, ig6i, en ce qui concerne Ascaris suum; SARDES,ig38, en ce qui concerne Nippostrongylus brasiliensis) montraient que des vers incubésdans du sérum hyperimmun laissaient apparaître des précipités aux orifices de leurcorps (bouche, anus, pores excréteurs) ; des auteurs (SARLES, Sour;sBSt, MULLIGAN)furent amenés à penser que ces précipités jouaient un rôle essentiel dans les méca-nismes de défense. Les expériences d’incubation des parasites (stade L4 précoce,

’

adultes) suivie de transplantation ou bien d’introduction de SHI par voie duodénaledémontrent que le sérum n’intervient pas par action directe sur les vers.

Par contre, l’examen des courbes traduisant, en fonction du temps, l’impor-tance de la taille de la population des larves dans les poumons, du nombre de versadultes dans l’intestin soit chez des rats ayant été préalablement immunisés, soitchez des rats immunisés passivement ou chez des rats ayant subi des injections desérum hyperimmun (MULI,IGAN, 1965) au moment de la transplantation des vers,montrent clairement que les larves ne sont jamais affectées par les phénomènesimmunitaires ; tout se passe comme si seule, la population des parasites intestinauxétait, la cible du sérum hyperimmun. La réaction immunitaire se traduit parl’expulsion précoce des vers adultes.

L’état d’immunité, pour le modèle Parasitaire Nippostrongylus brasiliensis duRat, est le résultat de réactions immunitaires locales situées au niveau de l’intestin.

Pour en déterminer le mécanisme, nous avons essayé de voir quel était le rôledes anticorps locaux ce qui nous a amené à rechercher la présence des immunoglobu-lines de la classe A, l’immunoglobuline des sécrétions (NASH et al., ig6g). Faciles àisoler du lait, nous les avons alors caractérisées par des méthodes biochimiques etimmunologiques (à l’aide d’un sérum de lapin anti IgA) dans le mucus intestinal(J. POULAIN et al., zg72). L’incubation des vers dans le mucus intestinal provenantd’animaux hyperimmuns n’altère pas leur vitalité ; cependant dans l’état actuel denos connaissances nous n’éliminons pas l’action d’anticorps locaux.

Par ailleurs, il faut noter que l’expulsion des vers ne survient qu’après un cer-tain laps de temps après l’injection de sérum hyperimmun ; on observe ce phénomènesoit au cours des expériences de transplantation de vers accompagnée de l’injectionde SHI (NEILSON, 1970), ou au cours des expériences d’infestations par voie sous-cutanée suivies de l’injection de sérum. Ce délai laisse à penser que le SHI agit d’unemanière indirecte et que l’expulsion des vers est consécutive à un mécanisme inter-médiaire.

B. - Immunité et anticorps responsablesde l’anaphylaxie cutanée passive (ACP)

La teneur de sérum en anticorps responsables de l’ACP est toujours très élevéelorsqu’il est prélevé chez les animaux immuns. Doit-il son efficacité à la présencede ces anticorps ?

Il y a lieu de distinguer, dans le mode d’action du SHI, un effet sur les parasitesdans leur phase pulmonaire (stade larvaire) et un effet dans leur phase intestinale(stade adulte).

Le phénomène d’autostérilisation (phénomène essentiellement intestinal) a lieualors même que les anticorps responsables de l’ACP ne sont pas encore décelablesdans le sérum dans lequel ils n’apparaissent que le z5e jour après l’infestation.

De plus, on sait que des vers adultes transplantés chez des rats neufs se main-tiennent dans l’intestin pendant un certain temps (9 jours environ) comme le feraitune population de vers adultes issue d’une infestation normale par voie sous-cutanéepuis sont expulsés par un mécanisme semblable à celui de l’autostérilisation (I,u!-!nu ; à paraître) alors que les anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanéepassive n’apparaissent que vers le 13e jour.

Il est possible que ces anticorps soient synthétisés beaucoup plus précocementmais, étant donné qu’une de leurs propriétés essentielles est de se fixer très fortementaux cellules, ils ne seraient décelables dans le sang que tardivement.

L’expérience nous a montré effectivement que tous les anticorps ACP ontdisparu 48 heures après l’injection du sérum dans le torrent circulatoire ; les versadultes ne sont expulsés, lors de l’immunisation passive, que le 6e jour. Il faut ad-mettre que si les anticorps ACP jouent un rôle dans l’immunité, ils le font aprèsavoir été fixés sur des cellules réceptrices.

Le phénomène d’autostérilisation peut cependant avoir lieu en dehors de laprésence de tout anticorps ACP décelable dans le sang ; le sérum hyperimmun semontre tout à fait apte à protéger des rats après incubation en présence de versadultes, or le taux en anticorps responsables de l’ACP tombe à o (R. E. THORSON,1954), comme nous l’avons mis en évidence dans une série d’expériences.

B. M. Oeuvra a pu recueillir un sérum dépourvu de toute activité ACP etcapable de protéger des rats neufs.

V. JONRS et al. (1967) arrivaient à la même conclusion : la thymectomie des ratsnouveau-nés abolit la production d’anticorps responsables de l’ACP ; ces rats semontrent incapables d’expulser la population de parasites. Si, 4 semaines après laprimo-infestation, on administre une nouvelle dose de larves, les anticorps respon-sables de l’ACP n’apparaissent pas dans le sang, alors que les animaux sont haute-ment résistants.

Inversement, nous avons constaté que les sérums provenant de lots derats tous hautement immuns, mais incapables de protéger des rats neufs par immu-nisation passive, possédaient tous un taux élevé en anticorps responsables del’ACP. De même chez des rats soumis à des injections de cortisone, à partirdu 7e jour suivant l’infestation, on peut noter la persistance simultanée des anticorpsresponsables de l’anaphylaxie cutanée passive dans le sérum et celle de vers adultesdans l’intestin (LUFFAU et al., 1969).

CONCLUSION

La possibilité d’immuniser passivement des rats avec du sérum provenantd’animaux préalablement infestés et résistants à une invasion parasitaire, démontreformellement la présence d’anticorps circulants. Cependant quelques restrictionssont à apporter quant à l’efficacité de tels sérums : le degré de protection n’estjamais absolu, même lorsqu’on utilise des doses très élevées ; de plus, une proportionimportante de sérums sont impropres à transmettre l’immunité passive.

Le sérum hyperimmun n’a pas d’action directe sur les formes parasitaires

qu’elles soient larvaires ou adultes; après injection par voie veineuse, seule la popu-lation de vers adultes localisée dans l’intestin se trouve affectée lors de l’immunisa-tion passive ; les larves n’y sont pas sensibles - comme, d’ailleurs, elles ne sontpas affectées par les mécanismes immunitaires chez des rats immunisés par injec-tions sous-cutanées de larves infestantes.

Le sérum hyperimmun (anticorps circulants) affecte principalement les formesparasitaires adultes localisées à l’intestin selon un processus qui reste à découvriy.

En ce qui concerne les anticorps responsables de l’anaphylaxie cutanée passive,leur présence est constante dès le roC jour après l’installation de vers adultes dansl’intestin des rats ; après injection du sérum hyperimmun dans le torrent circulatoire,ils en disparaissent dans les q.8 heures après avoir vu leur taux décroître d’unemanière exponentielle. Ils ont une affinité particulière pour l’antigène responsablede l’induction de l’immunité ; les vers adultes (vivants, broyés, ou le produit deleur métabolisme) représentent le système antigène et immunigène pour les anti-corps responsables de l’anaphylaxie cutanée passive. Ces faits corroborent les vuesde G. M. URQUHART et al. (1965), W. JARRETT et al. (1971) relatives à l’immunitédans les parasitoses intestinales. Nous n’éliminons cependant pas le rôle éventueldes immunoglobulines contenues dans les sécrétions.

Reçu pour publication en janvier 1972.

REMERCIEMENTS

Nous tenons à exprimer nos remerciements à MM. les Docteurs FOUGEREAU et PARAF pourles conseils qu’ils nous ont prodigués au cours de l’élaboration d’une grande partie de ce tra-vail, ainsi qu’à M. CARRAT pour sa participation à l’établissement des courbes et à l’interprétationstatistique des résultats.

SUMMARY

BIOLOGICAL PROPERTIES OF HYPERIMMUNE SERUM

FROM RATS INFESTED WITH NIPPOSTRONGYLUS BRASILIENSlS

The existence of immunity in rats previously infested with Nippostrongylus bvasiliensis hasalready been widely demonstrated. The problem of the mechanism of this immunity howeveris unresolved and has consequently been the subject of this study on the biological propertiesof hyperimmune serum (HIS) of rats infested with Nippost-Yongylus bvasiliensis:

Passive immunization of the animals can be accomplished with HIS providing thathigh doses are used (8 ml per animal) and that the injection is given before the 5th day followinginfection. The HIS does not act directly on the parasites (L,, larvae up to adults) impli-cating an intermediary and local mechanism.

The action of hyperimmune serum is exercised essentially on the adult worms localized inthe intestinal lumen of the animals. The incubation of parasites in the H I S. does not alter theability of the serum to immunise passively, although the serum after adsorption with adult wormsis incapable of causing an anaphylactic skin reaction in rats. The protective role of the serum

may perhaps be attributed to the antibodies responsible for PCA., or to the antibodies pre-sent in the intestinal mucus secretions, or to both. In the light of our experiments it is thoughtthat the antibodies do play a role but one cannot decide exactly that of the one or the other.

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