Projektowanie starterów

PCR

Startery

starter - krótki syntetyczny oligonukleotyd

Startery

długość starterów – 17-28 pz

skład zasad – 50-60% (G+C)

temperatura topnienia - 55º- 80º C

unikanie struktur: primer-dimer, hairpin

Startery zdegenerowane

Asp Glu Gly Phe Leu Ser Tyr Cys Trp Leu Pro His Gln

GAT GAA GGT TTT CTT TCT TAT TGT TGG CTT CCT CAT CAA

C G C C T C AGC C C T C C C G

A A A A A

G G G G G

TATTGTTGGCTTCC

TACTGTTGGCTTCC

TATTGCTGGCTTCC

R: A, G

Y: C, T

M: A, C

K: G, T

S: C, G

W A, T

H: A, C, T

B: C, G, T

V: A, C, G

D: A, G, T

N: A, C, G, T

Startery – badanie właściwości

VectorNTI analyses oligo analyses

thermodynamic properties

TGTCGTACCTGCTAGGCTGG

Startery

VectorNTI Analyses Oligo analyses Oligo duplexes

Etap II

– poszukiwanie materiału

genetycznego

Prokariota

Amplifikacja genu

Eukariota

Biblioteki cDNA

RT-PCR

Synteza genów

Synteza genów

Możliwość zlecenia syntezy (GenScript, Eurofins)

Ograniczenia:

Wysoki koszt

Synteza genów (PCR assembly)

PCR Amplification

Wiele oligonukleotydów w pojedynczej reakcji PCR

http://openwetware.org/images/c/c9/Mulligan.ppt#564,10,PCR Assembly

Synteza genów (convergent assembly)

Ciąg prostych, łatwych do przeprowadzenia reakcji

Projekt wymagający czasu

Wysoki koszt

Synteza genów (convergent assembly)

Ciąg ligacji i oczyszczania jej produktów

http://openwetware.org/images/c/c9/Mulligan.ppt#564,10,PCR Assembly

Synteza genów – solid phase assembly

Podwójnoniciowe oligonukleotydy dodawane są kolejno na

kolumnę ze złożem stałym (na przemian z płukaniem kolumny)

Inside column

Synteza genów – solid phase assembly

Przyłączenie dupleksu do złoża

Inside column

Synteza genów – solid phase assembly

Płukanie kolumny

Inside column

Synteza genów – solid phase assembly

Dodanie drugiego dupleksu

Inside column

Synteza genów – solid phase assembly

Przyłączenie drugiego dupleksu

Inside column

Synteza genów – solid phase assembly

Etapy powtarzane, aż do momentu otrzymania “pełnego

genu”

Inside column