Project 505.0740 Ontwikkeling van biotechnologische methoden van onderzoek Projectleider: drs R. Schilt

Rapport 90.44 december 1990

Ontwikkeling van een analysemethode voor de bepaling van bovine somatotropine (bST). Interim rapportage.

drs R. Schilt, dr R.J.A Paulussen en ir G .F.R. Renetriks

Afdeling Biofarmaceutische Analyse

Goedgekeurd door: clr F.A Huf

Rijks-Kwaliteitsinstituul voor land- en tuinbouwpraelukten (RIKILT) Bornsesteeg 45, 6708 PD Wageningen, Nederland Postbus 230, 6700 AE Wageningen, Nederland Telefoon 08370-75400 Telex 75180 RIKIL Telefax 08370-17717

Copyright 1990, Rijks-Kwaliteitsinstituut voor land- en tuinbouwprodukten.

Overname van de inhoud is toegestaan, mits met duidelijke bronvermelding.

Verzendlijst

INTERN:

directeur

hoofd hoofdafdeling Produktveiligheid

projectleider

afdeling Biofarmaceutische Analyse (3x)

afdeling Toxicologie

programmabeheer en informatievoorziening (2x)

circulatie

bibliotheek

EXTERN:

Dienst Landbouwkundig Onderzoek

Directie Wetenschap en Technologie

DirectieVoedings-en Kwaliteits Aangelegenheden

Directie Veterinaire Dienst

Directie Instituut voor Veevoedingsonderzoek

Directie Instituut voor Veeteeltkundig Onderzoek "Schoonoord"

Directie Veehouderij en Zuivel

- 1 -

Samenvatting

Runder groeihormoon of bovine somatotropine (bST) is een eiwithormoon dat gebruikt

kan worden om de melkgift van runderen te stimuleren. Sinds bST via recombinant DNA

technieken geproduceerd kan worden (r-bST) is veel onderzoek verricht naar toepas­

singsmogelijkheden van dit hormoon in de rundveehouderij. Om een goed inzicht te

krijgen in de daarbij behorende residu-problematiek is een bepalingsmethode voor het

bST gehalte van melk nodig. Voor de bepaling van het totale, d.w.z. recombinant en van

nature voorkomend (natief = n), bST gehalte is een verbetering noodzakelijk van de

detectielimiet van de tot nu toe toegepaste immunochemische methoden. Wordt de

vraagstelling uitgebreid met het aantonen (van het gebruik) van r-bST dan moet een

onderscheid gemaakt kunnen worden tussen recombinant en natief bST. Complicerende

factor hierbij is dat n-bST uit minimaal 4 varianten bestaat, terwijl de door de verschil­

lende fabrikanten geproduceerde r-bST varianten ook verschillen in (primaire) structuur.

Indien de r-bST varianten methionine als eindstamlig aminozuur bevatten, lijkt het ma­

ken van een onderscheid tussen r-bST en n-bST haalbaar. Voorwaarde is dat alle rele­

vante r-bST varianten voor het onderzoek ter beschikking zijn.

Binnen de afdeling Biofarmaceutische Analyse (BFA) wordt gewerkt aan de ontwikkeling

van een systeem bestaande uit immuno-affiniteitschromatografie voor préconcentratie

van totaal bST uit melkserum, gekoppeld aan een scheiding van recombinant en natief

bST m.b.v. vloeistofchromatografie (i.c. FPLC of HPLC). Voor de detectie en kwantifi­

cering wordt een enzym-immunoassay gebruikt.

Dit interim rapport beschrijft de huidige stanel van zaken en de perspectieven van het

onderzoek.

Dankbetuiging

Met dank aan de elirectie VKA en de elirectie Dienst Landbouwkundig Onderzoek die

door een projektsubsidie (1988-1989) respectievelijk door het ter beschikking stellen van

een formatieplaats dit project mogelijk maakten.

De auteurs zijn de firma Ehmco erkentelijk voor hun gift aan recombinant-hST en de

openhartige informatievoorziening.

De auteurs zijn ir. P.L.M. Berende dankbaar voor de door hem geleverde steun en het

aanleveren van melkserummonsters.

9044.1

- 2-

9044.2

- 3 -

Inhoudsopgave

Sarnenvatling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Dankbetuiging 1

Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Bovine somatotropine (moleculaire aspecten) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Residu-problematiek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Bepalingsmethode n voor bST in melk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Opzet van het onderzoek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Nadere uitwerking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

immuno-affiniteitschromatografie

vloeistof chromatografie (FPLC)

enzym-immunoassay

Contacten industrie

Resultaten . ... . .. . . .. . .. ... ... . . .. ... . ........................... .

immuno-affiniteitschromatografie

vloeistof chromatografie (FPLC)

enzyn1-in1munoassay .. . ....... . .................. . ... .. . ...... .

Conclusies en perspectieven ..... . ............ .. .................. . ... .

Literatuur ............... ..... .... . .. . ..... . .. . .... .. . ........... .

9044.3

10

10

11

12

12

12

13

14

15

16

- 4 -

9044.4

- 5 -

Inleiding

Somatotropine (ST, groeihormoon) is een eiwithormoon dat invloed heeft op o.a. groei

en instandhouding van weefsels en organen, maar ook op de melkproduktie. Somatotro­

pinen werden aanvankelijk geïsoleerd uit hypofysen, waardoor deze eiwitten slechts in

geringe hoeveelheden beschikbaar waren. Uitgebreide stuclies naar de toepassingsmoge­

lijkheden van het hormoon in de agrarische produktie (met name voor stimulatie van de

melkgift) werden pas mogelijk na het beschikbaar komen van recombinant bovine soma­

totropine (r-bST) in 1982. Kort na elkaar is het vier fabrikanten gelukt om r-bST op

grote schaal te kunnen produceren (American Cyanamid, Monsanto, Elanco (Eli Lilly),

en Upjohn).

Bovine somatotropine (moleculaire aspecten)

Natief bST is een eiwithormoon met een molecuulmassa van circa 21,5 kDa, bestaande

uit 191 aminozuren [13,17,18,21].

bST bevat twee intra moleculaire elisulfide verbindingen [12,21] en is niet geassocieerd

met koolhydraten of lipiden [13]. Er komen meerdere natieve bST varianten bij het rund

voor [10,16], met zeer kleine verschillen. In figuur 1 is de primaire structuur van één van

de varianten volgens Wallis [21] weergegeven (de nummering is niet officieel t.b.v. de

overzichtelijkheid). bST bestaat uit een constant en een variërend gedeelte. Het constan­

te gedeelte is voor alle genoemde recombinant en natieve bST moleculen hetzelfde. Dit

geldt ook voor de leucine/valine heterogeniteit, die op positie 118 aanwezig is. Een mole­

cuul met leucine op positie 118 krijgt de aanduiding a, die met valine b. De verschillen in

het variërend gedeelte worden nader aangegeven.

De natieve bST varianten,voor zover bekend staan met de in dit rapport gebruikte code­

ring, weergegeven in tabel 1. De oorzaak van de variantie in n-bST-3 wordt volgens

Langley et al. [14] veroorzaakt doordat een hypofyse protease in een zuur milieu n-bST-

2 omzet in n-bST-3. De N-terminale heterogeniteit tussen n-bST-1 en -2 wordt veroor­

zaakt door een twijfelachtige splitsingplaats van het pro-hormoon gedurende de biosyn­

these [14). De oorzaak van de variantie op positie 118 is een allelische variantie (14].

9044.5

- 6 -

-9. -8. -7. -6. -5 . -4 . -3. -2. -1. +1 . . ala.phe.pro.ala.met.ser.leu.ser . gly.leu.

+2 . +11 . . phe .ala.asn.ala.val.leu.arg.ala.gln .his. +12. +21 . . leu.his.gln . l eu.ala.ala.asp.thr.phe. lys. +22 . +31 .

. glu.phe.glu.arg.thr . tyr.ile.pro.glu . gly. +32. +41 . . gln . arg.tyr.ser.ile . gln . asn .thr.gln.val. +~2. +51 . . ala.phe.cys.phe.ser.glu.thr.ile.pro.ala. +52. +61 . . pro.thr.gly . lys.asn.glu.ala.gln.gln.lys . +62. ~1 . . ser . asp.leu.glu . l eu . leu . arg.ile.ser.leu. +72 . +81 . . leu . leu . ile.gln . ser.trp.leu.gly.pro.leu. +82. +91 .

. gln.phe.leu . ser.arg.val.phe.thr . asn.ser. +~2. +101 .

. leu .val.phe.gly.thr.ser.asp .arg.val . tyr. +102 . +111 . . glu.lys. leu.lys.asp . leu.glu.glu.gly . ile. +1l2 . +121 . . leu.ala. l eu.met.arg.glu.leu.glu.asp .gly. +122 . +l3L .thr.pro.arg.ala.gly.gln.ile.leu.lys.gln . +132. +l41 . . thr.tyr.asp.lys.phe.asp.thr.asn.met.arg. +142. +15~ . . ser.asp.asp.ala.leu.leu.lys.asn.tyr.gly.

+152. +l61 . . leu.leu.ser.cys. phe.arg.lys.asp.leu.his. +162. +171 . . lys.thr.glu .thr .tyr.leu .arg.val.met.lys. +1~. +181 . . cys.arg.arg.phe.gly.glu.ala.ser.cys.ala. +18'2 . . phe.

Figuur 1. Aminozuursequentie van n-l>st-1!.!. (voo r codering zie tekst) volgens Wallis (21). Het "variabele" gedeelte heeft negatieve positie coderingen, het "constante" gedeelte van dit l>ST molecuul heeft positieve positie coderingen. De N-terminus bevindt zich op positie -9, de C-terminus op + 182.

Tabell. Primaire aminozuursequentie van hel variabele gedeelte van verschillende natieve bST varianten.

Code N-terminale Structuur jPos. I Isolatie I 118 milieu

I Positie t.o .v. figuur 1. I , __ :~:_:~: _ :~: _: ~: _ :~: _ :~ : -~ _ ,

n - bST- laj ala .phe . pro .ala .met.ser . # I -lb j ala.phe . pro.ala.met . ser. # I

n-bST-2aj phe.pro .ala.met . ser. # I -2bj phe.pro.ala.met.ser. # I

n-bST-3aj met.ser . # I -3bj met.ser. # I

I

I leu j val ! l eu l valj leul val I

z,b z,b b b z z

Referenties

9,13,21,23 13,21,23 13' 21' 23 13,21,23 13,23 13,23

n-bST-4 I zelfde als n-bST-1 met uitzondering van 8 I positie 19 waar een tyrosine vermeld I wordt in plaats van een threonine

# rest variabele gedeelte heeft dezelfde aminozuursequentie a l s dat van n -bST- la (zie figuur 1).

z = zuur milieu b alkalisch milieu.

9044.6

- 7 -

r-bST varianten die met behulp van recombinant DNA technologie geproduceerd kun­

nen worden staan, voor zover bekend met de in dit rapport gebruikte codering, weer­

gegeven in tabel 2.

Volgens Hsiung et al. [11] krijgt zowel n-bST-1 als n-bST-2 een extra methionine aan he t

N-terminale gedeelte van het molecuul indien zij in Escherichia coli tot expressic ge­

bracht worden. Echter de rnethionine van r-bST-1 kan er weer door Escherichia coli

worden afgesplitst.

Tabel 2. Variabele gedeeltes van recombinant bST varianten geproduceerd in E'i­cherichia coli.

Code,N-terminale structuur ltypeiReferentie I positienummering t.o.v . figuur 1. a/b i I

1-17 . -16.-15.-14.-13.-12.-11 . - 10 .-9. -2.-1.1 I I -- ------------------- .. ------------- - ---- -- ------------------------- --r*l ala. # r*2 met.ala. # r*3 met . # r*4 met.asp. # r*S met.val. # r*6 met.asp.asp.lys. # r*7 I met. phe . pro .leu.glu.asp .asp .met. # r*8 lmet.phe.pro.leu.asp.asp.asp.asp .lys. #

1

I I

I I I

r*9 1 r*lOI

ser ., met . ser .

* -bST- , dus r*l = r-bST-1

ajb 111 1 ajb 11,19,20,22 1 a/b l11,19,20 I ajb 111,19 I a/b l11 I a/b l l9 I a/b l l9 I a/b l l9 I ajb 122 I a/bl22 I

# rest variabele gedeelte heeft dezelfde aminozuursequentie als dat van n-bST-la, z ie figuur 1.

Schoner et al. [19) noemen r-bST-2, -3, -4, -6, -7 en -8 methionine derivaten van n-bST-

2. Het door hun beschreven molecuul r-bST-8 is met behulp van enterokinase, dat he t

initiator aminozuur methionine en de acht daarop volgende aminozuren van het n-termi­

nale deel van een eiwit afsplitst, gemakkelijk om te zetten in n-bST-2.

Wingfield c t al. [22) melden dat r-bST-9 (a/b) geproduceerd kan worden in E.coli. Zij

gaan hierbij van de veronderstelling uit dat het door E.coli toegevoegde methionine

afgesplitst wordt. Zij tonen dit echter niet aan. Voor de volledigheid is daarom r-bST-10

ook in de tabel opgenomen. Leung et al. [15) beschrijven de produktie van r-bST-11

t/m -14 in muizen fibroblasten, waarbij er aanwijzingen zijn dat r-bST gesynthetiseerd in

cellen van eukaryoten (zoa ls hun fibroblast cellen) beter op het natuurlijk voorkomend

bST lijkt dan r-bST dat gesynthetiseerd wordt door prokaryoten (bacteriën).

9044.7

- 8 -

Over de structuur van hel r-bST dat door diverse fabrikanten geproduceerd wordt is

weinig bekend in de open literatuur. De recombinant vormen van de vier genoemde

producenten verschillen van de natieve bST vormen in de aanwezigheid van één of meer

extra aminozuren aan de N-terminale zijde van het eiwit, waarbij steeds een methionine

als laatste aminozuur aanwezig is. Deze extra sequenties zijn enerzijds nodig om het eiwit

in bacteriën te kunnen produceren, en spelen anderzijds een rol bij de patentaanvragen

van de respectievelijke fabrikanten.

Residu-problenwtiek

Aan de toepassing van recombinant somatotropine kleeft een aantal vragen, met name

op het gebied van de residu problematiek. Initiële studies gaven aan dat de bST concen­

tratie in melk niet significant toenam (het hormoon komt van nature in zeer lage con­

centratie voor in melk) na toediening van r-bST, maar het is niet aangetoond dat er geen

verandering in de "samenstelling" van het bST in de melk (in hoeverre ook r-bST in de

melk terecht komt) optreedt [1]. Onduidelijk is of er potentiële risico's voor de consu­

ment vastzitten aan het eten van praelukten waarin r-bST aanwezig is, gerelateerd aan

moleculaire verschillen met de natieve vorm. Daarnaast bestaan nog vragen m.b.t de

effectiviteit van bST(-fragmenten) na orale opname. Weliswaar wordt algemeen beweerd

dat eiwitten, zoals bST, in het maag-clarmkanaal volledig worden afgebroken tot amino­

zuren, maar er bestaan toch indicaties dat dit niet volledig opgaat [1]. Vragen die in dit

rapport zijn opgeworpen hebben geleid tot diepgaande studies door diverse fabrikanten

en een toename van de interesse en het belang van de opname van eiwitten in het maag­

darmkanaal.

Bepa/ingsnzetlwden voor bST in melk

Voor bepaling van het bST gehalte van melk is een aantal immunochemische methoden

ontwikkeld. Het betreft radio-immunoassays (RIA), en enzym-immunoassays (EIA). Een

belangrijk probleem in de residu bepalingen vormden tot nu toe de toegepaste analyse­

methoden. De detectiegrenzen van de gebruikte methoden (0.3-1 ng!ml), in het alge­

meen immunoassays, liggen rond of soms zelfs boven de natuurlijke concentratie bST in

melk. De gepubliceerde methoden zijn derhalve in het algemeen niet gevoelig genoeg

om een nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken. Ook kan geen onderscheid ge­

maakt worden tussen natief en r-bST.

9044.8

- 9 -

De openstaande vragen op analytisch gebied en de duidelijke signalen van de consument

[2, 3] hebben geleid tot de behoefte voor een onderzoek naar mogelijkheden voor een

verbeterde detectiemethode met een lagere detectiegrens.

Opzet van het onderzoek

Binnen de afdeling Bicfarmaceutische Analyse (BFA) van het RIKILT bestond reeds

veel ervaring met de analyse van zeer lage residu concentraties van steraidhormonen en

bèta-aganisten met behulp van immuno-affiniteitschromatografie (IAC) en HPLC analy­

se. [4, 5, 6].

Deze wijze van aanpak, préconcentratie met immuno-affiniteitschromatografie en ver­

volgens detectie met vloeistofchromatografie is uitstekend toepasbaar voor de bepaling

van de steraidhormonen nortestosteron en trenbolon en de bèta-aganisten clenbuterol

en mabuterol (zie figuur 2).

SAMPLE

AFFINITY COLUMN

ANALYTICAL COLUMN

IMMUNO-AFFINITY PRE-COLUMN

FOR ON-LINE SAMPLE PRETREATMENT

WITH HPLC ANAL YSIS

uv DETECTION

RESULT

.. M ___ .....

Figuur 2 Schematisch overzicht van de opbouw van een on-line IAC-J-IPLC systeem voor de bepaling van stercidhormonen en ~ta-agonisten.

Eiwithormonen, zoals bST, brengen een geheel eigen problematiek met zich mee. Ten

eerste is de stabiliteit minder clan bij de gebruikelijke dierbehandelingsmiddelen en ten

tweede zijn de mogelijkheden voor de detectie aanzienlijk beperkt. GC-MS is niet zon­

der meer mogelijk en de gangbare detectiemethoden voor HPLC (UV, fluorescentie)

9044.9

- 10 -

bieden onvoldoende gevoeligheid.

Voor de bepaling van bST is de aanpak derhalve aanmerkelijk meer gecompliceerd.

Als uitgangspunten is gekozen voor 1) een kwantificering van (totaal) bST in melk en 2)

de mogelijkheden voor een afzonderlijke bepaling van natief en recombinant bST.

In juni 1988 werd ir G.F.R. Hendriks aangesteld om dit onderzoek uit te voeren en is

van VKA een subsidie verkregen om een speciaal voor deze studie samengestelel vloei­

stof chromatografie systeem (FPLC) aan te kunnen schaffen.

Nadere uitwerking

Om een nauwkeurige bepaling van het bST gehalte van melk mogelijk te maken werd

gekozen voor een analysesysteem bestaande uit drie blokken (figuur 3).

BLOK 1

PRE- ~ CONCENTRA TIE

BLOK 2

a-AO.V1ATO­GRAFIE

Figuur 3. Schematisch overLicht van de aanpak van het project.

BLOK 1: IMMUN0-1\FFINITEITSCI-IRO.MATOGRAFIE

B LOK 3

DETECTIE (ELISA)

In een eerste stap wordt het ( n-, of r- of n- + r-) bST uit een groot volmne monster

geconcentreerd met behulp van immuno-affiniteitschromatografie (préconcentratie-stap ).

De polyclonale antilichamen die gebruikt worden voor het selectief ophopen van bST uit

he t monster kunnen geen onderscheid maken tussen natief bST en de recombinant-va­

rianten.

BLOK 2: VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE (FPLC)

Nadat het bST van de antilichamen van de immuno-affiniteitskolom geclesorbeerd is,

wordt het met behulp van FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) gescheiden van

andere componenten (waarmee de antilichamen een (beperkte) kruisreactie vertonen).

Het is waarschijnlijk dat hierbij ook recombinant en natief bST gescheiden kunnen wor­

den, zoals beschreven is voor humaan somatotropine [7].

9044.10

- 11 -

13LOK 3: ENZYM-IMMUNOASSAY

De uite indelijke kwantificering van bST in de verkregen kolomfracties wordt uitgevoerd

me t een enzym-immunoassay, zoals deze in gebruik is bij Elanco. Door de préconcen­

tratiestap ligt de absolute hoeveelheid eiwit voor de bepaling nu ruimschoots boven de

de tectie limiet

De voorkeur bestaat om blok 1 en blok 2 in een geautomatiseerd systeem op te nemen.

In figuur 4 is een meer gede tailleerd schema van het te gebruiken systeem weergegeven.

Monstertwen

Figuur 4. Gedetailleerd schematisch overzicht van de geautomatiseerde opstelling voor bST onderzoek.

In de literatuur en in de gegevens van de fabrikanten wordt voornamelijk gesproken over

de bepaling van (totaal) bST in melkserummonsters. Melkserum kan op twee manieren

worden gemaakt, namelijk door hoge snelheicl-centrifugatie of het neerslaan van eiwitten

m.b.v. enzymen. Van belang is de stabiliteit van bST, omdat hiervan bekend is dat deze

niet groot is. Aan dit aspect zal, na gereed komen van de me thode, aandacht besteed

moeten worden.

9044.11

- 12 -

Contacten industrie

Om reden dat de bij het onderzoek te gebruiken materialen, zoals r-bST standaarden,

niet commercieel verkrijgbaar waren, was een belangrijke voorwaarde bij het opzetten

van het onderzoek dat een samenwerking met minimaal één van de hST producerende

bedrijven mogelijk was.

Inmiddels waren reeds contacten gelegd met 2 producenten van recombinant hST, Ame­

ricml Cyanamid Benelux en Elanco. Beide fabrikanten waren zeer geïnteresseerd in het

onderzoek en zegden samenwerking toe in de vorm van beschikbaarstelling van materia­

len (r-bST, antisera, melkmonsters uit lactatieproeven met r-bST) en methoden.

Ondanks het aanvankelijke enthousiasme, bleek dat een samenwerking met Cyanamid

niet kon worden geëHectueerd.

Blanco was bereid om recombinant bST, antilichamen, en melkmonsters uit dierproeven

met r-bST beschikbaar te stellen, alsmede de ELISA methode die in het bedrijf ontwik­

keld was. Daarnaast kon technische ondersteuning gegeven worden om deze methode zo

snel mogelijk operationeel te krijgen op het RIKILT. Blanco stelde aanvankelijk geheim­

houding van de verkregen resultaten op prijs, maar afgesproken werd dat, na overleg, de

gegevens vrij gepubliceerd konden worden. Nadat Elanco toestemming voor deze samen­

werking gekregen had van het Amerikaanse moederbedrijf werd het onderzoek gestart

met de beschikbaar gestelde materialen.

Resultnten

Van Blanco werd recombinant bST ( 48 mg) en een r-bST referentie-standaard (5 mg)

verkregen, samen met de beschrijving van de ELISA procedure. De produktie van antili­

chamen tegen r-bST was door Elanco uitbesteed aan een ander bedrijf. Zodra voldoende

antistoffen geproduceerd waren zouden ook deze beschikbaar gestelel worden.

DLOK 1: IMMUNO-AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE

Polyclonale antilichamen tegen r-bST werden geïmmobiliseerd aan tresyl-geactiveerde

Sepharose 4B. De koppeling werd 2 maal uitgevoerd, resulterend in respectievelijk 5.6

en 8.4 mg immuunglobuline per mi Sepharose. Vervolgens werden de totale capaciteit en

de elutiecondities bestudeerd.

De problemen met deze kolommen spitsten zich toe op de elutie van gebonden r-bST.

hST opgelost in buffer met een lage zoutconcentratie en bij een neutrale pH wordt zeer

9044.12

- 13 -

efficiënt door de antilichamen gebonden, maar de recoveries bij elutie lagen aanvankelijk

slechts rond 10%. Na uitgebreid experimenteren met zeer vele varianten aan verschillen­

de buffers, chaotrope reagentia en pH's werd uiteindelijk een recovery van (nog slechts)

40% bereikt. De oorzaak van de relatief lage recovery is nog niet achterhaald. Aspecten

als ontleding van r-bST of een zeer hoge affiniteit voor de antilichamen kunnen hierbij

een rol spelen. Om kruiscontaminatie tussen direct na elkaar geanalyseerde monsters bij

hergebruik van de immuno-affiniteitskolom uit te sluiten, moet deze stap nader worden

uitgezocht. Het onderzoek is gecompliceerd doordat voor ieder toegepast elutie-systeem

moet telkens de invloed van de elutiebuffer op de kwantificering van het bST in de im­

munoassay worden bepaald, omdat, gezien de kleine hoeveelheden r-bST, de detectie

met de ELISA moet worden uitgevoerd. Indien ontleding van r-bST optreedt is dit met

de immunoassay wellicht niet kwantificeerbaar, aangezien de ontledingsprodukten moge­

lijk niet reageren met de antilichamen die in de immunoassay worden toegepast. Andere

detectiemethoden zijn moeilijk inzetbaar gezien de lage concentraties.

BLOK 2: VLOEISTOF CHROMATOGRAFIE (FPLC)

Ter bestudering van de mogelijkheden om r-bST chromatografisch van andere eiwitten te

scheiden met behulp van een FPLC systeem, is een groot aantal experimenten uitge­

voerd met verschillende scheidingssystemen. Om een mogelijke scheiding tussen r-bST en

de natieve bST vorm(en) te onderzoeken werd gewerkt met (commercieel verkregen)

natief bST. In de literatuur is een dergelijke scheiding tussen recombinant en natief voor

humaan somatotropine m.b.v. reversed-phase chromatografie beschreven [7). De experi­

menten werden uitgevoerd met relatief hoge concentraties bST, in combinatie met UV­

detectie. Dit type detectie is in de uiteindelijke opstelling echter niet mogelijk is, omdat

de hoeveelheden eiwit daar veel kleiner zijn.

Het lijkt mogelijk de 4 natieve bST varianten te scheiden van (Elanco) r-bST met behulp

van zowel 1) anion-uitwisselingschromatografie, 2) reversed-phase chromatografie als 3)

chromatofocusing. Dit betekent dat een ruime keuze mogelijk is die in het uiteindelijke

systeem kan worden toegepast.

Aangetekend moet worden dat hier alleen met Elanco r-bST gewerkt werd . Een defini­

tieve keuze kan pas gebaseerd worden op experimenten met alle 4 r-bST preparaten.

9044.13

- 14 -

13LOK 3: ENZYM-IMMUNOASSAY

Na het beschikbaar worden van de antilichamen tegen r-bST werd gestart met het opera­

tioneel maken van de EIA voor kwantificering van bST, o.a. t.b.v. de experimenten met

de immuno-affiniteitskolom.

De procedure die door Elanco beschikbaar gesteld werd bestond uit een sandwich ELI­

SA met een versterkingsstap. Nadat enige aanvangsproblemen (me t ondersteuning van

Elanco) opgelost waren, werkte de methode met bST standaarden in buffe r volgens de

opgegeven specificaties.

Met melkserummonsters, wamvoor de ELISA was ontwikkeld, werden echter wel matrix­

effecten waargenomen, die de gevoeligheid (i.e. steilheid van de standaardcurve) van de

assay verlagen, maar de onderste detectielimiet van ± 0.5 ng/ml niet beïnvloeden (zie

figuur 5).

1.40

1.20 E c

I{) 0

1.00

--: 0 .80

:ö (!j 0.60

~ g 0.40 n "' 0.20

0 .00 0.001 0 .0 1 0. 1 10 100 1000

no b ST /ml

- 0 - S/A ij<lif> ··· 0 ·· 7

figuur 5. Calibraticcurvc bepaald met de ELISA, waarbij 'S/A' = calibra tiecurvc in buffer en '7' in melkserum

In dit stadium werd het onderzoek gestaakt in verband met het einde van de

(aanvankelijk) geplande duur van het project (31 december 1989).

9044.14

- 15 -

Conclusies en perspectieven

De detectiestap m.b.v. de enzyme immunoassay werkt naar behoren. Hierbij moet wor­

den aangetekend dat ten tijde van het onderzoek uitsluitend r-bST van Blanco ter be­

schikking was. Een chromatografisch scheiding tussen n-bST en bovengenoemde r-bST

variant lijkt zeer goed mogelijk. Het gedrag van andere r-bST varianten moet worden

nagegaan. Wat betreft de préconcentratie m.b.v. immuno-affiniteitschromatografie be­

staat er nog een probleem met de tot nu toe niet verklaarde lage recoveries voor (Elan­

co) r-bST.

Een definitief systeem zoals eerder in dit rapport is geschetst, is nog niet operationeel,

omelat nog enkele noodzakelijke verbeteringen en aanpassingen noodzakelijk zijn, voor­

dat gestart kan worden met een definitieve koppeling van de afzonderlijke stappen tot

één systeem. Remmend werkt het feit dat iedere stap sterk beïnvloed wordt door de

voorafgaande, zodat veel optimaliserings-experimenten moeten worden uitgevoerd.

De belangrijkste verbetering die aangebracht moet worden is een verdere optimalisering

van de el u tie van bST van de affiniteitskalom (ook in verband met kruis-contaminatie

tussen monsters) en onderzoek van de effecten van de hierbij gebruikte elutiebuffer op

de keuze van de chromatografische scheiding van recombinant en natief bST (waarbij

ook de andere r-bST vormen betrokken moeten worden). Daarnaast zal bekeken moeten

worden in hoeverre de binding aan de antilichamen in de immunoassay beïnvloed wordt

door de buffer(s) uit de chromatografische stap.

De wijze waarop het onderzoek moet worden voortgezet is enigszins afl1ankelijk van de

hedendaagse vraagstelling. Voor een bepaling van totaal (n- + r-) bST bij concentrat ies

rond de huidige detectiegrens van de beschikbare immunoassay, blijft een préconcentra­

tie van essentieel belang. Significante verhogingen van het totale bST gehalte (n-bSt e n

in dit geval Elanco r-bST) kunnen wel worden waargenomen. Beantwoording van de

meer gerichte vraag naar het aantonen van het gebruik van r-bST vereist een scheiding

tussen r-bST en n-bST. Hiertoe kan een chromatografische stap worden toegepast zoals

in dit rapport is beschreven. Voor het verkrijgen van een kwalitatief antwoord is de

verdere ontwikkeling op een reelelijke termijn haalbaar. Waarschijnlijk kan hierbij ook

gebruik worden gemaakt van de aanwezigheid van ( eindstandig) methionine, dat in het

merendeel van de r-bST varianten aanwezig is.

Na het gereed komen van de complete methode moe t een validatieonderzoek uitgevoerd

worden op melk(serum) monsters van met bST behandelde dieren en controledieren.

9044.15

- 16 -

Literatum·

1. Paulussen, R.J.A., Schilt, R., Berende, P.J.M. en De Boer, S. [1988], Runder soma­totropine: enige aspecten rond gebruik en veiligheid, RIKILT rapport 88.05

2. Feenstra, M. en Van Zon, I. [1987], bST, wat moet je er mee? Consumenten geven een oordeel over de toepassing van bovine somatotropine bij de melkproduktie, Swokatern ~: 1-18

3. Meulenberg, M.T.G., Den Ouden, I. en Janissen, J.E.H.M. [1987], Opinies, attitudes en koopintensies van consumenten ten aanzien van melk, geproduceerd met toepas­sing van bovine somatotropine (bST), Bijdragen aan een discussiedag, Zeist, 23 ok­tober 1987, Oldenbroek, J.K. en De Wilt, J.G. (samenstellers).

4. Farjam, A , De Jong, G.J., Frei, R.W., Brinkman, U.A.Th, Haasnoot, W., Hamers, A.R.M., Schilt, R., Huf, F.A., J. Chromatogr. 452, 419-433 (1988)

5. Haasnoot W., Schilt, R., Hamers, A.R.M., Huf, F.A., Farjam, A, Frei, R.W., Brink­man, J. Chromatogr. 489, 157-171 (1989)

6. Haasnoot W., Ploum, M.E., Paulussen, R.J.A. , Schilt, R., Huf, F.A., J. Chromatogr. 519, 323 (1990)

7. Riggin, R.M., Dorulla, G.K. and Miner, D.J. [1987], A reversed-phase high-perfor­mance liquid chromatographic methad for characterization of biosynthetic human growth hormone, Anai.Biochem. 167: 199-209

8. Hart, I.C. en LD. Johnsson. Growth hormone and growth in meat producing ani­mals, Chapter 10, 135-159.

9. Hartman, P.A., Stodola, J.D., Harbour, G.C. en J.G. Hoogerheicle . Joumal o[

Chromatography, 360, 385 (1985).

10. Honing, Y. van de en Y.S. Rijpkema. Verslag Monsanto Europe N.V. bST symposi­um, 23+24 mei 1988, Nice, Frankrijk. Instituut voor Veevoedingsonderzoek "Hoorn" (IVVO) Lelystad.

11. Hsiung, H.M., en W.C. MacKellar. Methoeis in Enzymology, 153, 390 (1987).

12. Kievits, J.M.C.A., Dam, H.C.B. van, Hessel, H.W. en A Brand. Tijdschrift voor de Diergeneeskunde. 113, 14 (1988), 791-800.

13. K.N.M.v.D., Koninklijke Nederlandse Maatschappij voor Die rgeneeskunde. Tijd­schrift voor Diergeneeskunde, 113, 14 (1988) 839-843.

14. Langley, K.E., Lai, P-H., Wypych, J., Everett, R.R., Berg, T.F., Krabill, L.F., Davis, J.M. en L.M Souza. European Joumal of Biochemistry, 163, p. 323 en p. 313 (1987).

9044.16

- 17 -

15. Leung, F.C., Jones, B., Steelman, S.L., Rosenblum, C.l., en J.J. Kopchick. Enclocri­nology, 11, 1948, (1986).

16. Martinclale. Martinclale, the extra pharmacopoeia. 28 ed. (1982) Editor: Reynolcls, J.E.F. en A.B. Prasacl. Pbarmaceutical Press, Lonclon, U.K.

17. Nilsson K. en K. Mosbach.Methods in Enzymology vol 104 (1984) 56-69.

18. Roupas, P. en A.C. Herington. Molecular ancl Cellular Endocrinology, 61, 1 (1989) 1-12.

19. Santome, J.A., Dellacha, J.M., Paladini, A.C., Pena, C., Biscoglio, M.J., Daurat, S.T., Poskus, E. en C.E.M. Wolfenstein. European Joumal Biochernistry, 37 (1973) 164-170.

20. Secchi, C., Biondi, P.A., Berrini, A, Simonie, T. en S. Ronchi. Joumal of Irnmuno­logical Methods, 110 (1988) 123-128.

21. Wadsley, J.J. en R.M. Watt. Joumal of Imrnunological Methocls, 103 (1987) 1-7.

22. Wilson, M.B. en P.K. Nakane. Book: Immunofluorescence and relatecl staining tech­niques. (1978) 215-224. Editor: Knapp, W., Holubar, K. and G. Wiek. Publisher: Elsevier.

23. Wingfield, P.T., Graber, P., Buell, G., Rose, K., Sirnona, M.G. en B.D. Burleigh. Biochemica! Journal, 243, 829 (1987).

9044.17