DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA

QUÍMICA FARMACÉUTICA BIOLÓGICA

MÓDULO: OBTENCIÓN DE METABOLITOS DE INTERÉS INDUSTRIAL PARA LA SALUD

(336020)

Comisión de actualización de la carta descriptiva Dra. Rina María González Cervantes Dr. Lino Mayorga Reyes Dr. Alejandro Azaola Espinosa Dr. Juan Esteban Barranco Florido

Fecha de conclusión de la actualización 30/11/2009

UNIVERSIDAD AUTONOMA

METROPOLITANA UNIDAD

XOCHIMILCO

Casa abierta al tiempo

2

ÍNDICE

Pág.

DATOS GENERALES 3

INTRODUCCIÓN 4

OBJETO DE TRANSFORMACIÓN 4

PROBLEMA EJE 6

OBJETIVO DEL MÓDULO 7

LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN 8

ESTRUCTURA DEL MÓDULO 9

UBICACIÓN DEL MÓDULO EN EL PLAN DE ESTUDIOS 9

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 10

PRIMERA UNIDAD

SEGUNDA UNIDAD

TERCERA UNIDAD

CUARTA UNIDAD

QUINTA UNIDAD

SESIONES EXPERIMENTALES

BIBLIOGRAFÍA

MODALIDADES DE EVALUACIÓN

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DATOS GENERALES

Nombre del módulo: OBTENCIÓN DE METABOLITOS DE INTERÉS INDUSTRIAL PARA LA SALUD Clave del módulo: 336020 Trimestre de impartición: Trayectoria A, XI; Trayectoria B, IX y Trayectoria C, VIII Créditos: 45 Módulo precedente: Prevención y control de la propagación microbiana Módulo subsiguiente: Trayectoria A, Aseguramiento de la calidad en la industria químico farmacéutica, o

Tecnologías moleculares para el diagnóstico y la terapéutica, o Tratamiento de residuos industriales, o Evaluación biofarmacéutica, o Análisis instrumental aplicado; Trayectoria B, Diseño y obtención de medicamentos de calidad y Trayectoria C, Los fármacos como modificadores de la funciones biológicas

No. Hrs./teoría/semana: 15 No. Hrs./prácticas/semana: 15 No. Hrs./ totales por trimestre: 330 No. Unidades Tres Fecha de elaboración: Diciembre 2004 Comisión de diseño del módulo Dr. Alejandro A. Azaola Espinosa, Dr. Juan Esteban Barranco Florido, M. en C. Francisco

Bravo Alemán, Dra. Rina María González Cervantes, Dra. Marisol López López y Dr. Lino Mayorga Reyes

Fecha de actualización: Septiembre 2009 Comisión de actualización de la carta descriptiva

Dra. Rina María González Cervantes, Dr. Lino Mayorga Reyes, Dr. Alejandro Azaola Espinosa

Responsable de la actualización Dr. Juan Esteban Barranco Florido Perfil idóneo del profesor de este módulo

Lic. Químico Farmacéutico Biólogo, Ingeniero Bioquímico Industrial, Ingeniero en Alimentos. Maestría en Biotecnología, Doctorado en Biotecnología

4

INTRODUCCIÓN

El módulo “Obtención de metabolitos de interés industrial para la salud” se ubica en el Tronco de Carrera de la licenciatura de QFB de la División

de Ciencias Biológicas y de la Salud, y corresponde a la segunda u.e.a. del eje de biológicos y lo antecede el módulo de “Prevención y control de la

infección y la contaminación microbiana y sus implicaciones en el ámbito de la farmacia”. En este módulo el alumno relaciona los avances

científicos y tecnológicos del campo del conocimiento de la biotecnología con la producción de metabolitos para la salud de la sociedad.

Asimismo, dispone de una oportunidad valiosa de apropiarse de la comprensión de textos y del análisis de contenidos teóricos recientes de este

campo de la ciencia que les serán útiles para fundamentar sus conocimientos y transformar su visión del mundo.

El Objetivo General del módulo es que el alumno se capacite para manipular los procesos bioquímicos y genéticos de los microorganismos para la

producción de metabolitos de interés para la salud. Al finalizar este módulo, el alumno será capaz de analizar y comprender procesos en los que

intervengan microorganismos y aplicarlos en su práctica profesional dentro de la industria química farmacéutica y de alimentos, así como en las

áreas ambientales de las industrias en general. Además, le permitirá al alumno intervenir en la planeación de estrategias metodológicas donde la

utilización de los microorganismos sean indispensables para la producción de metabolitos, en el monitoreo y análisis de fermentaciones, así como

en la degradación biológica de residuos industriales y urbanos que tienen un impacto directo en el medio ambiente, en el análisis de factores de

riesgo del uso de microorganismos silvestres o nativos y de los microorganismos genéticamente modificados (OGM). Por otro lado, el alumno

estará capacitado para integrarse en estudios de posgrado y en la enseñanza de nivel medio y medio superior.

OBJETO DE TRANSFORMACIÓN:

El Objeto de Transformación de este módulo es la obtención de metabolitos de interés industrial para la salud. Este objeto de transformación

permite al estudiante adentrarse en la comprensión de un conjunto de procesos biológicos relacionados con la manipulación de los

microorganismos, ya sea en sus condiciones fisico-quimicas o en su genoma dentro del vastísimo campo de la biotecnología. En términos

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generales, la biotecnología se puede definir como el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener

productos de valor para el hombre. La biotecnología moderna está compuesta por una variedad de conocimientos y técnicas derivadas de la

investigación en microbiología, bioquímica, genética, ingeniería, biología celular y molecular, así como las matemáticas, las cuales pueden ser

utilizadas en cualquier industria que emplee microorganismos o células vegetales o animales. La aplicación comercial de organismos vivos o sus

productos, involucra la manipulación deliberada de sus genomas, de los procesos de regulación y síntesis de proteínas y de las vías metabólicas

para la producción de compuestos de interés industrial y el mejoramiento de procesos industriales

Por tanto, se puede decir que la biotecnología abarca desde los procesos biotecnológicos tradicionales, como por ejemplo la fermentación de

alimentos, hasta la biotecnología moderna, basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (ingeniería genética), los

anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos.

En las últimas décadas, la biología ha sufrido un cambio revolucionario. Muchos de los problemas que en el pasado sólo podían estudiarse a nivel

descriptivo se pueden ahora analizar a nivel molecular, por lo que los sistemas vivos se pueden caracterizar en términos moleculares. El

advenimiento de la tecnología de DNA recombinante ha resultado en un aumento exponencial correspondiente del conocimiento de los procesos

celulares fundamentales. Por lo tanto, es muy importante que el QFB actual conozca y aplique estos conceptos de biología molecular en la

resolución de los problemas biológicos que competen a su área profesional.

Por otra parte, este módulo pretende que el alumno sea capaz de comprender la literatura científica, así como de diseñar experimentos y realizar

investigaciones que utilicen técnicas de cultivo y fermentación de microorganismos para la producción de biomasa celular y de metabolitos

derivados del metabolismo primario y secundario; técnicas bioquímicas para determinar características fisiológicas de las células en estudio, de

enzimas y técnicas de biología molecular para la tipificación de microorganismos, el estudio de vías metabólicas hasta el mejoramiento genético.

Al final del módulo, el alumno comprenderá la potencialidad de manipular a los microorganismos con un enfoque dinámico, donde todos los

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procesos biológicos internos se encuentran presentes al mismo tiempo, solo que regulados. Asimismo, el alumno aprenderá a comunicar los

resultados de su investigación de manera escrita y oral, utilizando las formas y el lenguaje apropiados.

PROBLEMA EJE

Obtención de metabolitos de origen microbiano

El diseño, análisis, modificación y control de procesos bioquímicos y genéticos que realizan los microorganismos son herramientas que cada día

tienen más importancia en una sociedad altamente tecnificada para la producción de metabolitos de interés para la salud humana y animal. La

biotecnología ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparación del pan y de bebidas

alcohólicas o el mejoramiento de cultivos y de animales domésticos. Aunque el concepto de biotecnología es nuevo –esta denominación surge en

los años sesentas del siglo XX- su primera expresión la encontramos hace 5000 años en los alimentos fermentados por hongos inferiores en China

y en la elaboración de pan y cerveza en Egipto y consideramos que esta primera etapa termina con los experimentos de Pasteur, quien junto con

Joubert observó que en un cultivo de la bacteria del cólera, el crecimiento fue inhibido por una bacteria contaminante que llamaron bacilo común,

probablemente E coli y postularon por primera ocasión la posibilidad terapéutica de las bacterias. Este postulado se confirmó con el

descubrimiento de la penicilina por Fleming en 1929. La segunda etapa de la biotecnología se inicia con el descubrimiento del factor de

transformación por Avery y colaboradores en 1944 y finaliza con Watson y Crick con el descubrimiento de la doble cadena de ADN en 1953. La

tercera etapa de la biotecnología se inicia con la elaboración de la primera molécula de ADN recombinante por Cohen en 1973, dando origen a un

crecimiento exponencial en esta área de conocimiento (cuyo mayor impacto ha sido en la industria farmacéutica) mostrando que el desarrollo de la

ciencia básica y su aplicación tienen un potencial económico ilimitado.

Actualmente el impacto más evidente de la biotecnología se observa en cuatro sectores; biomedicina, agricultura, química y ambiental, siendo la

primera la que mayor crecimiento e influencia tiene en la sociedad. Así, en 1981 se aprueba y sale al mercado el primer producto comercial de

7

diagnóstico con anticuerpos monoclonales. Al año siguiente se inició la comercialización de la primera molécula recombinante, la insulina

humana. De 1982 a 1989, fueron aprobados por la Federal Drug Administration (FDA USA) 18 fármacos basados en procesos biotecnológicos. En

la última década del S. XX, se aprobaron 125 productos nuevos (promedio de 10 por año).

OBJETIVO DEL MÓDULO

Manipular los procesos bioquímicos y genéticos de los microorganismos para la producción de metabolitos de interés para la salud.

Para cumplir este objetivo, el presente módulo se organiza en tres unidades. Las unidades y sus correspondientes objetivos son:

I. Metabolismo microbiano y su regulación. Objetivo: Que el alumno integre los conocimientos básicos de las vías metabólicas primarias y

secundarias de los microorganismos a la luz de las perspectivas actuales y futuras de la producción de metabolitos de interés industrial

II. Procesos de fermentación. Objetivo: Que el alumno se capacite para realizar, describir y analizar procesos de fermentación para la

producción de metabolitos de interés para la salud y la industria.

III. Manipulación genética de los microorganismos. Objetivo: Que el alumno integre los conceptos básicos de bioquímica microbiana, genética

microbiana y de ingeniería genética para manipular la producción de metabolitos de los microorganismos que permitirá un gran avance en

todas las ciencias biológicas, incluyendo la biotecnología.

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LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN

Para el desarrollo del proyecto de investigación del módulo se proponen las siguientes líneas de investigación, que ofrecen posibilidades de

formación para el manejo de las técnicas implicadas en los procesos de producción de metabolitos de origen microbiano.

1. Producción de antibióticos a partir de cultivos de hongos filamentosos (Penicillium chrysogenun) y actinomicetos (Streptomyces ssp)

2. Producción de metabolitos por fermentaciones sumergidas o por fermentaciones en estado sólido

3. Producción y caracterización de enzimas de interés para la salud o la industria química farmacéutica

4. Aislamiento y selección de cepas productoras de metabolitos de interés para la salud o la industria química farmacéutica

9

ESTRUCTURA DEL MÓDULO:

Corresponden tres unidades.

Unidad I. Metabolismo microbiano y su regulación

Unidad II Procesos de fermentación

Unidad III Manipulación Genética de los microorganismos

Las competencias que desarrollarán en el alumno serán:

Habilidades Destrezas Capacidades Actitudes

Para realizar diseños experimentales

Para proponer las técnicas analíticas para la determinación de parámetros establecidos

Para integrar los conceptos teóricos con los resultados experimentales.

En la manipulación adecuada de microorganismos con las medidas de seguridad pertinentes

En la utilización de técnicas analíticas, instrumentos y equipo del área de la microbiología

De análisis de los resultados obtenidos en los diseños experimentales

De comprensión de los procesos bioquímicos de las células y su modificación para la producción de metabolitos

Para comprender textos y artículos científicos referentes al campo de la biotecnología

Fomentar el trabajo colectivo

Comprensión del impacto en el uso de organismos modificados en el medio ambiente

UBICACIÓN DEL MÓDULO EN EL PLAN DE ESTUDIOS

El módulo Obtención de metabolitos de interés industrial para la salud (336020), se imparte de acuerdo con la Trayectoria A en el trimestre XI; para la Trayectoria B en el trimestre IX y para la Trayectoria C en el trimestre VIII de la Licenciatura de Química Farmacéutica Biológica. Le antecede el módulo Prevención y control de la propagación microbiana y le son posteriores en la Trayectoria A, los módulos Aseguramiento de la

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calidad en la industria químico farmacéutica, o Tecnologías moleculares para el diagnóstico y la terapéutica, o Tratamiento de residuos industriales, o Evaluación biofarmacéutica, o Análisis instrumental aplicado; respecto a la Trayectoria B es posterior el módulo Diseño y obtención de medicamentos de calidad y en la Trayectoria C es posterior el módulo Los fármacos como modificadores de la funciones biológicas

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sesiones Teóricas

Unidad I Unidad II Unidad III Evaluación Global

Modelos experimentales

Modelos 1 y 2 Modelo 3 Modelo 4

Investigación Selección del tema

Elaboración del protocolo

Elaboración del marco teórico y desarrollo experimental Análisis de resultados

Elaboración del informe

final

Entrega y presentación del informe

Evaluación de la

investigación

Evaluaciones X X X X

Semana 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

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PRIMERA UNIDAD METABOLISMO MICROBIANO Y SU REGULACIÓN

OBJETIVO GENERAL DE LA UNIDAD. Que el alumno integre los conocimientos básicos de las vías metabólicas primarias y secundarias de los microorganismos a la luz de las perspectivas actuales y futuras de la producción de metabolitos de interés industrial.

Contenidos Objetivos de proceso Actividades Duración en sesiones

Bibliografía

1.1 Discusión y ubicación del módulo en el programa de estudios y en el perfil profesional

Lectura del módulo. Discusión en clase con el profesor sobre los objetivos, contenidos del mismo y comparación con los módulos cursados anteriormente. Organización de los alumnos por equipos para presentaciones orales de los temas.

1

Módulo

1.2 Importancia de los procesos de fermentación y biotransformación en la industria

Que el alumno comprenda la importancia de los diferentes procesos de fermentación para la producción industrial

Localización de libros en la biblioteca sobre biotecnología, microbiología industrial, ingeniería bioquímica y biotecnología de las fermentaciones. Localización en nternet las principales páginas de consulta académica útiles para búsqueda de información en el módulo. (Actividad en biblioteca y Hemeroteca)

2

-Varias, sobre los libros mas recientes sobre el tema

1.3 La biotecnología en los procesos de fermentación para la producción de metabolitos

1.3.1 Ubicación histórica de la biotecnología

Que el alumno comprenda, a través de la revisión científico técnica la diversidad de productos de fermentación, así como los productos que se pueden obtener a partir de los microorganismos

Discutir en clase las diferentes definiciones de biotecnología encontradas en la literatura y porque se le denomina a la biotecnología según la generación. Presentación de un equipo de alumnos del tema. Discutir e integrar información, con la coordinación del docente.

1

Varias, sobre los libros mas recientes sobre el tema

1.4 Principales productos metabólicos obtenidos por fermentación

1.4.1 Metabolitos primarios y secundarios 1.4.2 Biomasa 1.4.3 Ácidos orgánicos

Que el alumno se informe acerca del potencial de producción de metabolitos de interés a través del estudio de la microbiota que existe en la naturaleza

Presentación de un equipo sobre principales productos obtenidos por fermentaciones microbianas. Discusión del tema en coordinación con el docente.

2

3, Capítulo 12 “Microbiología Industrial”

12

1.4.4 Aminoácidos 1.4.5 Enzimas de uso industrial y terapéutico 1.4.6 Esteroides y hormonas 1.4.7 Polisacáridos 1.4.8 Colorantes 1.4.9 Vitaminas

1.4.10 Antibióticos

1.5 Las enzimas como catalizadores biológicos

1.5.1 Estructura y función de las enzimas 1.5.2 Enzimas como catalizadores biológicos 1.5.3 Concepto de Energía libre de Gibbs 1.5.4 Reacciones de 1er orden y de orden 0 1.5.5 Cinética enzimática; Modelo de Michaelis y Menten 1.5.6 Reacciones [S] --- > [P]

1.5.7 Inhibición enzimática; modelos

Que el alumno comprenda la función de las enzimas en las vías metabólicas

Que el alumno sea capaz de medir y analizar la actividad de las enzimas

Exposición de Tema por equipo de alumnos, discusión en clase en coordinación con el docente. Se resolverá un cuestionario sobre el tema por equipos y se discutirán las respuestas en coordinación con el docente. Así mismo se resolverán ejercicios para cálculo de Vmax, y Km. Tarea sobre los mismos ejercicios

5

4, Capítulo de Enzimas

1.6 Metabolismo

1.6.1 Regulación y coordinación del metabolismo primario 1.6.2 Regulación del metabolismo secundario 1.6.3 Regulación fisiológica

1.6.3.1 Regulación y coordinación del metabolismo primario y secundario 1.6.3.2 Retroalimentación por

Que el alumno adquiera y aplique el conocimiento de las rutas metabólicas para la producción de metabolitos

Que el alumno entienda los mecanismos de regulación de las enzimas que participan en una vía metabólica o catabólica a nivel bioquímico y las diferencias de regulación entre vías primarias y

Análisis de las vías primarias principales (Glucólisis, Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y Disimilación del Piruvato) en Escherichia coli, identificando las enzimas de control en cada una de estas vías, así como las conexiones con otras vías. Así mismo se analizarán los genes que codifican para cada una de estas enzimas y la información sobre su regulación, tanto a nivel actividad como a nivel genético. Se resolverá un cuestionario sobre el tema por equipos y se discutirán las respuestas en coordinación con el docente

2

5, Capítulo 11.

6

13

producto final 1.6.3.3 Enzimas alostéricas 1.6.3.4 Represión catabólica 1.6.3.5 Activación por sustratos

1.6.4 Acceso de nutrientes a las células procariontes

1.6.4.1 Difusión facilitada 1.6.4.2 Transporte facilitado o mediado 1.6.4.3 Transporte activo 1.6.4.4 Translocación de grupos (Sistema de fosfotransferasa PTS)

1.6.5 Análisis de vías metabólicas 1.6.5.1 Definición de vía metabólica 1.6.5.2 Análisis de flujos metabólicos. Vías metabólicas centrales y conexión con vías primarias y secundarias 1.6.5.3 Distribución del flujo de carbono en las vías metabólicas primarias 1.6.5.4 Sitios de control: nodos de control rígidos y flexibles

secundarias

Que el alumno conozca los diferentes mecanismos de ingreso de nutrientes a la célula y como el uso de alguno de estos va a determinar la preferencia del microorganismo por ciertos sustratos

Que el alumno retome los conocimientos de las principales vías metabólicas, profundizando en el estudio de las reacciones enzimáticas que se presentan en cada paso de las vías y que determinan la producción de energía, y a su vez la velocidad de crecimiento en la célula.

Que el alumno adquiera un enfoque de estudio del metabolismo celular de una forma integrada al contrario del enfoque que estudia las reacciones de forma individual y así poder estudiar las interacciones de las reacciones bioquímicas que participan en una red metabólica.

Que el alumno aprenda a identificar las enzimas susceptibles de regulación en las vías en estudio y como esto va a

Exposición del tema por equipo en clase. Discusión con el profesor. Actividad extra-aula:. Diagrama sobre la vía de síntesis de un aminoácido, indicando las enzimas involucradas en la vía y que son reguladas por acumulación del producto final.

Conexión con el metabolismo secundario, Análisis de la vía de un metabolito secundario, identificando a su precursor generado en una vía metabólica primaria.

1

3

7, 8, 9

14

1.6.6 Metabolismo primario 1.6.6.1 Producción de ácidos orgánicos 1.6.6.2 Producción de aminoácidos

1.6.7 Metabolismo secundario 1.6.7.1 Producción de antibióticos 1.6.7.2 Producción de vitaminas 1.6.7.3 Producción de colorantes

determinar el flujo de carbono hacia la producción de metabolitos

Que el alumno comprenda cómo se distribuye el flujo de las vías metabólicas que participan en los microorganismos para su crecimiento y producción de metabolitos

Que el alumno se capacite para manipular la biosíntesis microbiana de metabolitos primarios y secundarios como productos finales de una fermentación

Que el alumno entienda la diferencia entre metabolismo primario y secundario y su importancia en la producción de metabolitos de interés industrial

.

3

Total de sesiones 20

15

SEGUNDA UNIDAD. PROCESOS DE FERMENTACIÓN OBJETIVO GENERAL DE LA UNIDAD. Que el alumno se capacite para realizar, describir y analizar procesos de fermentación para la producción de metabolitos de interés para la salud y la industria.

Contenido Objetivos de proceso Actividades Duración en sesiones

Bibliografía

2.1 Procesos de fermentación para la producción industrial

2.1.1 Modelos de crecimiento 2.1.1.1 Crecimiento individual 2.1.1.2 Crecimiento poblacional

2.1.1.3 Modelos matemáticos de crecimiento microbiano; modelo de Monod y modelo exponencial

2.1.1.4 Tasas de crecimiento (µ), tiempo de duplicación, tiempo de generación

Que el alumno comprenda las diferentes formas de crecimiento que presentan las bacterias, hongos y levaduras, microorganismos utilizados en los proceso de fermentación para la producción de metabolitos

Que el alumno estudie las diferentes formas de medir el crecimiento de microorganismos (producción de biomasa) durante los procesos de fermentación. Métodos directos y métodos indirectos Que el alumno comprenda el uso de modelos matemáticos para describir el crecimiento celular y su uso para controlar el ambiente químico y físico de los procesos de fermentación y su relación con el metabolismo microbiano

Discusión en el aula de lecturas y artículos científico-técnicos Trabajo de laboratorio Observación al microscopio de los microorganismos utilizados en su proyecto de investigación Discusión en el aula de lecturas y artículos científico-técnicos. Discusión en el aula para medir el crecimiento celular en medios de cultivo sólidos, líquidos y con sustratos insolubles Trabajo de laboratorio Medición del crecimiento por la metodología propuesta en su protocolo Discusión en el aula de lecturas y artículos científico-técnicos. Discusión en el aula sobre las metodologías reportadas la literatura para medir el crecimiento celular en medios de cultivo sólidos, líquidos y con sustratos insolubles Trabajo de laboratorio. Medición del crecimiento por la metodología propuesta en su protocolo

1 1 2

1, 2, 11, 12

2.1.2 Parámetros cinéticos de las fermentaciones

2.1.2.1 Rendimientos 2.1.2.2 Tasas de producción;

Que el alumno comprenda los modelos matemáticos simples que permiten describir y controlar un proceso de

Discusión en el aula de lecturas y artículos científico-técnicos para comprender como los parámetros cinéticos permiten relacionar el metabolismo celular con el consumo de sustratos y

4

1, 2, 11, 12

16

volumétricas y específicas 2.1.2.3 Productividad 2.1.2.4 Tasas de consumo

fermentación y su posible optimización a partir de las relaciones entre producción de biomasa, rendimientos, consumo de sustrato y formación de producto y los patrones cinéticos que permiten describir la formación de metabolitos primarios y secundarios

la formación de productos En discusión y trabajo grupal el alumno calcule los rendimientos de biomasa por unidad de fuente de carbono utilizada y las velocidades volumétricas y específicas de biomasa y producto a partir del consumo de la fuente de carbono

2.2 Transferencia de masa (KLa)

2.2.1 Cultivos aerobios 2.2.2 Cultivos anaerobios 2.2.3 Transferencia de masa; concepto 2.2.4 Agitación y aireación como limitantes de la transferencia de oxígeno

Que el alumno comprenda cómo se puede estudiar los procesos de transferencia de masa utilizando como modelo el oxígeno como un sustrato poco soluble en el medio de cultivo para las células que necesitan de oxígeno. Así también, cómo se proporcionan los requerimientos de oxígeno necesarios para la producción de biomasa en condiciones de trabajo experimental a nivel matraz o fermentador

Discusión en el aula de lecturas y artículos científico-técnicos para comprender como los parámetros cinéticos permiten relacionar el metabolismo celular con el consumo de sustratos y la formación de productos En discusión y trabajo grupal el alumno calcule los rendimientos de biomasa por unidad de fuente de carbono utilizada y las velocidades volumétricas y específicas de biomasa y producto a partir del consumo de la fuente de carbono de los datos generados durante su trabajo de investigación

3

1, 2, 11, 12

2.3 Tipos de fermentaciones 2.3.1 Procesos en lote 2.3.2 Procesos en lote alimentado 2.3.3 Procesos continuos

Que el alumno comprenda la importancia de los diferentes procesos de fermentación para la producción industrial

Que el alumno comprenda, a través de la revisión científico técnica la diversidad de procesos de fermentación, así como los sustratos y productos que se pueden obtener a partir de los microorganismos

Discusión en aula de lecturas y artículos científico-técnicos Trabajo de laboratorio fermentación en lote

2

1, 2, 11, 12

2.4 Formulación de medios de cultivo

2.4.1 Relación carbono nitrógeno 2.4.2 Medios de cultivo mínimos y complejos; concepto y uso 2.4.3 Diseño de medios de cultivo

Que el alumno comprenda como a partir del metabolismo microbiano y de algunos parámetros de cinéticas de fermentación como los rendimientos es posible calcular

En discusión y trabajo del grupo los alumnos relaciones los requerimientos de sustratos para los microorganismos en diferentes condiciones de cultivo y por medio de problemas calculen los requerimientos de carbono, nitrógeno y oxígeno para la producción de biomasa

2

1, 2, 11, 12

17

con base a la composición celular y a sus requerimientos 2.4.4 Diseño experimental para la optimización de medios de cultivo. Diseños factoriales

las necesidades de sustrato para la obtención de biomasa

Total de sesiones 15

18

UNIDAD III. MANIPULACIÓN GENÉTICA DE LOS MICROORGANISMOS. OBJETIVO GENERAL DE LA UNIDAD, Que el alumno integre los conceptos básicos de bioquímica microbiana, genética microbiana y de ingeniería genética para manipular la producción de metabolitos de los microorganismos

Contenidos Objetivos de proceso Actividades Duración en sesiones

Bibliografía

Aspectos básicos de Genética Microbiana

Estructura y función de los ácidos nucleicos en procariontes y eucariontes

Procesos de replicación, transcripción y traducción en procariontes

Intercambio de material genético entre bacterias (transformación, conjugación y transducción)

Introducir al estudiante al campo de la Genética Molecular Microbiana

Que el alumno se conozca las bases químicas y moleculares de a vida

Que el estudiante conozca las bases de la expresión génica y de proteínas en organismos procariotes

Que el estudiante conozca las bases del intercambio de material genético entre los microoganismos

En equipos de trabajo se discutirá la importancia de la Genética molecular microbiana

En equipos de trabajo se analizará la importancia de loa ácidos nucleicos, de acuerdo a la bibliografía recomendada

En grupos de trabajo se analizará y discutirá los procesos de replicación, transcripción y traducción en organismos procariontes, de acuerdo a la bibliografía recomendada

En equipos de trabajo se analizará y discutirá los mecanismos de transferencia de material genético, de acuerdo a la bibliografía recomendada

4

13, 14, Artículos de Revistas internacionales 14 (pags. 187-301)

3.1 Estrategias para el mejoramiento de cepas para la producción de metabolitos

Que el alumno conozca los mecanismos para el mejoramiento de cepas por alteración genética como cepas autotróficas, mutantes desregulados, mutantes resistentes a la inhibición por producto final y mutantes resistentes a la represión

En equipos de trabajo analizará las estrategias que permitan mejorar la producción de metabolitos, utilizando como base el artículo Improvement of microbial strains and fermentation processes y se discutirán en clase

1

20

3.2 Mutagénesis. Concepto de mutación, y tipos de mutación.

Que el alumno comprenda el efecto en el cambio de nucleótidos del ADN genómico microbiano

En equipos de trabajo se analizará la bibliográfica de textos y artículos en revistas internacionales

3 13, 14 (pags. 115-145) -Artículos de

19

3.2.1 Agentes mutagénicos físicos, químicos y biológicos

3.2.2 Tipos de mutación

3.2.2.1 Frameshift

3.2.2.2 Deleción

3.2.2.3 Inversión

3.2.2.4 Inserción

3.2.3 Mecanismo de reparación de ADN

3.2.4 Aislamiento de mutantes auxotróficas de interés industrial

revistas internacionales-

3.3 Regulación de la expresión del gen

3.3.1 Principios de la regulación del gen a nivel transcripciónal

3.3.2 Regulación negativa (Operón lac, gal en E. coli, regulación de operones biosintéticos).

3.3.3 Regulación positiva (Operón ara, maltosa en E. coli)

3.3.4 Regulación por atenuación de la transcripción en E. coli

3.3.5 Análisis genético de la regulación catabólica en E. coli

Que el alumno comprenda e integre los procesos de regulación que intervienen en el metabolismo celular

Que el alumno conozca las bases de la regulación genética en microorganismos procariotes

Que el alumno conozca los mecanismos de regulación del operón de la lactosa, y galactosa en E .coli

Que el alumno conozca los mecanismos de regulación del operón de arabinosa y maltosa en E. coli

Que el alumno conozca los

En equipos se discutirá y analizará la regulación del gen a nivel transcripcional en la bibliográfica correspondiente de textos y artículos en revistas internacionales Análisis y discusión de la bibliografía en textos y artículos en revistas internacionales

5 13, 14 (pags 404-442) -Artículos de revistas internacionales

20

diferentes mecanismos de regulación del operón del triptofano en E. coli

Que el alumno conozca algunas proteínas regulatorias en el control de algunos operones en E. coli

3.4 Tecnología del ADN recombinante

3.4.1 Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos

3.4.2 Enzimas de restricción

3.4.3 Vectores de clonación molecular

3.4.4 Construcción de genotecas

3.4.5 Estrategias de clonación en procariontes. Discusión

Que el estudiante se capacite para clonar segmentos de ADN que lleven un interés industrial Que el estudiante conozca diferentes mecanismos para aislar y purificar ADN genómico El alumno conocerá la aplicación de las enzimas de restricción en la clonación El alumno conocerá la aplicación y los diferentes vectores de clonación El alumno conocerá la importancia en la construcción de una genoteca microbiana

Análisis y discusión de la bibliografía en manuales y artículos en revistas internacionales

3 13, 15 -Artículos de revistas internacionales

3.5 Técnicas de Biología molecular en Biotecnología

3.5.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), RT PCR secuenciación, Southern blot, Northern blot, Western blot, mutagénesis dirigida, microarreglos, etc.

3.5.2 Organismos genéticamente modificados. Clonación en

Que el alumno comprenda las técnicas moleculares que se aplican en la ingeniería genética, en diversos organismos para la obtención de producto de interés industrial y de la salud.

El alumno conocerá la aplicación de la PCR, RT-PCR, RT-PCR en tiempo real, secuenciación Southern blot, Northern blot, Western blot, mutagénesis

Análisis y discusión de la bibliografía en manuales y artículos en revistas internacionales En grupos de trabajo el alumno discutirá y analizará la importancia de los microorganismos eucariotes, genéticamente modificados por ingeniería genética En equipos, el grupo discutirá y analizará la expresión homóloga y heterologa En grupos de trabajo el alumno discutirá y analizará la producción de proteínas recombinantes en procariotes

4 13, 15, 16, 17, 18, 19

21

eucariontes. Transferencia nuclear.

3.5.3 Sistemas de expresión homóloga y heteróloga,

3.5.4 Producción de proteínas recombinantes en células procariontes (E. coli, Bacillus)

3.5.5 Producción de proteínas recombinantes en eucariontes (Saccharomyces cerevisiae)

dirigida, microarreglos, etc en la fisiología de un microorganismo

Que el estudiante se capacite para proponer su propia estrategia en la clonación de algunos organismos y tener perspectivas de las aplicaciones en la ingeniería genética.

Que el alumno comprenda los diferentes sistemas de expresión homóloga y heteróloga de los microorganismos

Que el estudiante analice la importancia de la producción de proteínas recombinantes en bacterias

Total de sesiones 20

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SESIONES EXPERIMENTALES MODELOS EXPERIMENTALES PROGRAMADOS:

A lo largo del módulo y de forma paralela a la discusión de los contenidos teóricos y del proyecto de investigación, los alumnos desarrollarán los

modelos experimentales que les permitirán familiarizarse con la metodología básica para el manejo de microorganismos y evaluar su

comportamiento durante un proceso de fermentación y de mejoramiento genético. Los modelos seleccionados son:

1. Cinética enzimática: Este modelo permitirá al alumno desarrollar las habilidades y competencias necesarias para evaluar algunas de las

propiedades y características que definen a las enzimas. Para esto, el alumno deberá determinar qué puede medir, la desaparición de

sustratos o la aparición de productos, que medirán a partir de elaboración de curvas estándar de sustratos o de productos de reacción

2. Cinética de crecimiento: Este modelo permitirá al alumno desarrollar las habilidades y competencias necesarias para analizar el

crecimiento de microorganismos bajo condiciones controladas del laboratorio y cuantificar el consumo de sustratos y/o la aparición de

productos

3. Transformación y conjugación bacteriana: Con este modelo, el alumno desarrollará las habilidades y competencias necesarias para

conocer la metodología de transformación genética en células procariontes y sus potenciales aplicaciones.

4. Funcionamiento y regulación del operón de lactosa en Escherichia coli: Este modelo permitirá al alumno comprender las distintas fases

de regulación de la enzima ! galactosidasa, como ejemplo de la regulación genética en procariontes y en eucariontes.

CARTA DESCRIPTIVA: PROPUESTA DE FORMATO SESIÓN EXPERIMENTAL

Nombre de la Sesión experimental: Estudio del crecimiento de Kluyveromyces marxianus y de la inducción de diferentes actividades enzimáticas por sustratos especìficos

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Introducción: Uno de los principales productos biotecnológicos obtenidos para el servicio del ser humano son las enzimas, que tienen utilidad en procesos industriales, en medicina, en la industria farmacèutica, etc son las enzimas. Sin embargo, su producción está controlada por los sustratos que se quieren utilizar o transformar, la comprensión de la regulación de su expresión mejoraría la productividad de este metabolito. El consumo de fuentes de energía por los microorganismos está regulado genéticamente por mecanismos de inducción-represión, que en las bacterias esta dado por un sistema simple, en cambio en levaduras es de una alta complejidad. De este modo, la célula se adapta a medios ambientes con determinadas fuentes de carbono, al inducir la expresión de enzimas que ayuden a la utilización de los azúcares que se encuentren y por tanto, pueden ser también reprimidas estas enzimas cuando el microorganismo encuentra fuentes de carbono de fácil asimilación o con alta capacidad de producir energía (ATP). Kluyveromyces marxianus es una levadura anaerobia facultativa, de interés industrial por las actividades enzimáticas que posee (Fonseca et al. 2008) y por ser una cepa considerada segura (GRASS). Es la fuente para la obtención de la enzima !-galactosidasa (Bansal et al., 2008); excreta una !-fructofuranosidasa constitutiva con la cual se puede hidrolizar y fermentar polifructanos, sacarosa, xilosa, galactosa, entre otras (de Paula et al., 2008). Durante su crecimiento aerobio puede fermentar la glucosa hasta su completa oxidación a CO2, con una alta productividad celular. El objetivo de este proyecto de investigación es el estudio del crecimiento de células en diferentes sustratos, utilizando como control la glucosa y comparar la inducción y/o la represión de las enzimas !-galactosidasa y !-fructofuranosidasa con lactosa y sacarosa como fuentes de carbono. Objetivo: Utilizar como modelo de investigación experimental una cepa de K. marxianus para la producción de biomasa en tres fuentes de carbono, así como determinar los mecanismos de inducción y represión de las actividades enzimáticas de !-galactosidasa y !-fructofuranosidasa. También, cada equipo propondrá un modelo experimental en el que se utilicen desechos agroindustriales o de otras industrias que le permita observar y estudiar los fenómenos de inducción represión (Squarezi et al., 2009). Objetivos de enseñanza aprendizaje: ! Que los equipos de investigación comprendan que los experimentos control en un proceso de investigación son importantes para distinguir si las respuestas a las preguntas que hacen a su objeto de estudio son significativas. ! Que los equipos de investigación sean capaces de proponer un sistema de inducción/represión de actividades enzimáticas.y ! Que el equipo de investigación sea capaz de presentar sus resultados en un documento escrito y en seminario de grupo. Aprendizajes esperados de los alumnos: ! Analice la propuesta y la importancia de realizar experimentos diseñados como controles

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! Proponga en base al modelo y a los contenidos teóricos del módulo, un objetivo de estudio de regulación de la actividad enzimática ! Seleccione la metodología adecuada para su proyecto ! Comprenda el fundamento de las técnicas analíticas que va a utilizar ! Utilice las técnicas usuales en sistemas de fermentación simples que se proponen en este documento ! Analice y presente los resultados por su relevancia ! Elabore un documento tipo artículo científico los resultados de su investigación

Materiales, equipo y reactivos

Materiales Equipo Reactivos

Cajas Petri Matraces Erlenmeyer de 250 ml y de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Termómetro de Laboratorio Algodón Gasa Tubos de ensaye (Conforme a las necesidades) Tubos Eppendorf (Conforme a las necesidades) Tubos cónicos de 15 ml para centrífuga

Autoclave Potenciómetro Incubadora Orbital Espectrofotómetro Centrifugadora refrigerada Estufa de 30 °C Balanza Granataria Balanza Analítica Micropipetas de 1000 y 100 !l Refrigerador 4 °C Congelador -4°C

Extracto de Levadura Glucosa Lactosa Hidróxido de Sodio Ácido Clorhídrico 3-5 DNS, ácido dinitrosalicílico Tartrato de Na y K Fenol Metabisulfito de Na Sulfato de cobre pentahidratado Carbonato de sódio Fenoil-Folin

Procedimiento experimental:

La metodología que se les presenta, es general y servirá de igual manera para que cada equipo de investigación proponga el modelo que crea conveniente. Cada equipo de investigación deberá proponer un modelo o experimento que le permita estudiar los procesos de inducción o de represión de las actividades anteriores o bien, de algún otra actividad enzimática que bibliográficamente señale que lo tiene el modelo de estudio. También, deberá seguir toda la cinética de fermentación y la determinación de los parámetros cinéticos aprendidos en el módulo.

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Microorganismo Microorganismos de trabajo: Kluyveromyces marxianus, el alumno debe definir las condiciones ambientales de crecimiento. Activación de las células En un matraz de 100 ml de volumen con 50 ml de medio de cultivo que contiene 0.5% de extracto de levadura como fuente de nitrógeno y (1%) de glucosa, ajustar el pH a 5.5. Inocular un vial de la cepa seleccionada y dejar crecer por 24 hr a 28°C. Este será el cultivo de donde se partirá para los sistemas propuestos por el equipo de investigación. Inóculo Del matraz con células activadas, transferir 5 ml a un matraz de 100 ml con 50 ml del mismo medio de cultivo, al final utilizar un volumen de fermentación que sea con un tamaño de inóculo del 5%. Dejar incubar bajo las mismas condiciones por toda la noche Fermentación Preparar un matraz de 250 ml con 100 ml de medio para cada uno de los siguientes medio de cultivo: Medio de cultivo control (Manera y col., 2008) Extracto de levadura 0.5% Glucosa 1% pH 5.5 Medio de cultivo para inducir la actividad enzimática Extracto de levadura 0.5% Lactosa o sacarosa o la fuente alterna 1% pH 5.5 Ambos medios esterilizarlos en autoclave a 10lb/plg2 por 10 minutos Los matraces de medio de cultivo deben contener un tapón de algodón para el intercambio de gases. Para facilitar la comprensión del diseño experimental se presenta la siguiente tabla, con la propuesta de 5 tipos de medio de cultivo para el trabajo de investigación:

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Medio No

Extracto de levadura ( %)

Glucosa (%)

Lactosa (%)

Sacarosa (%)

Problema 1 2(%)

pH

1 2 3 4 5

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

1 1

1

5.5 5.5 5.5 5.5 5.5

A los matraces 4 y/o 5 se les agregará el inductor y/o represor que el equipo plantee en su investigación Inocular en los matraces de fermentación previamente esterilizados. El tamaño de inóculo será del 5% (v/v), como se mencionó anteriormente. Tomar muestras a partir del tiempo cero y posteriormente cada dos horas durante 8 horas. Cada muestra será de un mínimo de 6 ml. Un ml se coloca en un tubo Eppendorf y se congela para medir posteriormente la concentración de azúcares reductores y la concentración de proteína; 2 ml para medir el pH (inmediatamente); Un ml para medir el crecimiento por DO a 660 nm y 2 ml que se centrifugan a 5000 rpm por 15 minutos para separar la biomasa del medio de cultivo, que servirá para cuantificar la actividad enzimática en las células y en el sobrenadante. Determinación del crecimiento: En un tubo cónico de 15 ml poner 1 ml de medio de cultivo. Se centrifuga a 5000 rpm durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y al paquete celular se le agrega 5 ml de agua destilada, se resuspenden las células y se vuelve a centrifugar. Después de la última lavada, se desecha el sobrenadante y se resuspenden las células en el mismo volumen que se tomo como muestra inicial. Se lee la observancia a una longitud de onda de 660 nm. El peso seco se determina con base a la curva siguiente de peso seco vs densidad óptica

a = 0.9551 b = 0.0255 r2 = 0.9987 Medición de la actividad enzimática Para medir la actividad enzimática, es necesario determinar la concentración de azúcares reductores y de proteínas en la muestra a analizar. Posteriormente se puede medir la actividad. En seguida se muestran los procedimientos para ambas técnicas.

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Determinación de azúcares reductores Miller GL (1959) Reactivos NaOH 1.4 % 3-5 DNS 0.75 % Tartrato de Na y K 21.6 % Fenol 0.54 % Metabisulfito de Na 0.59 % Se disuelven los ingredientes en el orden arriba mencionado, en agua destilada, hasta completar la disolución de cada uno. Se agrega el volumen necesario de agua. Guardar en frasco ámbar y se deja reposar a temperatura ambiente por 24 h. Se prepara una solución de glucosa (10mg/10 ml) para la realización de la curva estándar Curva estándar de azúcares reductores La curva estándar contempla concentraciones de 0 µg hasta 1000 µg de glucosa por ml • Preparar una mezcla de reacción con un volumen final de 1.5 ml en agua destilada • 3 ml del reactivo de DNS • Hervir las muestras por 5 minutos • Dejar enfriar a temperatura ambiente • Llevar a volumen final de 20 ml con agua destilada • Agitar y leer a 550 nm

Sol Std. Glucosa

(ml)

Conc. Final glucosa (µg/ml)

H2O (ml)

DNS (ml)

H2O (ml)

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 100 200 400 600 800

1000

1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5

7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5

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Tenga presente que la concentración máxima de azúcar reductor que es lineal en esta curva es de 1000 µg/ml y que el medio de cultivo puede tener un exceso de azúcar, contemple las diluciones que crea convenientes y prepare sus muestras problemas siguiendo el mismo procedimiento de un punto de la curva estándar. Determinación de Proteínas Lowry, O.H. et al. (1951). Reactivos Reactivo A: CuSO4.5H2O al 1% en agua Reactivo B: tartrato doble de sodio y potasio al 2% en agua Reactivo C: Na2CO3 al 2% en NaOH 0.1N (4g NaOH + 20 g Na2CO3 en agua cb 1000) Reactivo D: 1A + 1B = 1D Reactivo E: 1D + 50C ó (0.5A + 0.5B + 50C) Reactivo fenol folin dil 1:1 Sol std. Albúmina 1mg/ml. Pesar 10 mg para 10 ml de agua destilada. Tomar 0.3 ml de esta solución y agregar 2.7 ml de agua destilada para una solución de 100µg/ml Proceso Colocar en un tubo alícuota de estándar de proteína Llevar a 1 ml con agua destilada Agregar 3 ml reactivo E y agitar vigorosamente Dejar reposar 10 min. a T. ambiente Agregar o.3 ml reactivo fenol 1:1, agitar Dejar reposar a T. amb. Leer a 540 nm

Std albúmina (ml)

Conc. Final albúmina (µg/ml)

H2O Reactivo E (ml)

Folin 1:1 (ml)

0 0.125 0.250 0.500 0.750 1.0

0 12.5 25 50 75 100

1 0.875 0.750 0.500 0.250 0

3 3 3 3 3 3

0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

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Determinación de la concentración de proteínas y azúcares en las muestras de fermentación por muestra Azúcares reductores:

Muestra (ml)

H2O (ml)

DNS (ml)

Hervir 5 min Dejar a T.

amb

H2O (ml)

0.1 0.9 1.5 7.5 Leer a 550 nm. Calcular en base a los datos de la curva estandar la concentración de azúcares reductores Proteínas

Muestra (ml)

H2O (ml)

Reactivo E (ml)

Reposar a T. amb

(min)

Reac Fenol folin (ml)

Reposar a T. amb

(min) 0.1 0.9 3 10 0.3 30

Leer a 540 nm. Calcular en base a los datos de la curva estándar de proteinas Con los datos de la curva estándar y la ecuación de la recta Y=mX + b, despejar el valor de X (concentración de problema) y multiplicar por el factor de dilución Actividad enzimática El objetivo de esta parte es analizar como se induce la actividad enzimática de K. marxianus en el caldo de fermentación. Se partirá de una solución estándar de lactosa o sacarosa (10mg/ml). De acuerdo al ejemplo de la siguiente tabla

Tubo #

Sol. std

(ml)

Caldo de fermentac

ión (ml)

Muestra del tiempo 0 min

(ml)

Muestra del tiempo 15min (ml)

1 2

1.0 1.0

0.1 0.1

0.1 0.1

0.1 0.1

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A cada muestra, agregar lo necesario para medir los azúcares reductores al tiempo cero minutos y al tiempo 15 minutos. Esto se debe hacer rápidamente para evitar errores. Cada equipo debe contemplar el material necesario que va a utilizar.

Mecanismo de eliminación de residuos: actividades de desecho de materiales (pertinentes con la noción de sustentabilidad)

Para los desechos biológicos:

a) Microorganismo y material de vidrio, esterilización y limpieza

Para los desechos químicos:

a) Recolección en recipiente de plástico con tapa los desechos del reactivo del DNS y de Lowry

Forma de presentación y discusión de resultados

A través de tres seminarios:

En el primero presentan un protocolo de trabajo que contenga su propuesta de trabajo en el laboratorio, consistente en una introducción, una hipótesis, los objetivos, la metodología, un diagrama de flujo, la calendarización y la bibliografía.

En el segundo se presentan avances conteniendo los resultados con las propuestas de formato de los resultados para que se discuta en grupo

En el tercero la presentación final del trabajo, consistente en una introducción, los objetivos, la metodología, los resultados, su discusión, conclusiones y la bibliografía.

Bibliografía de la propuesta experimental

Bansal S, Oberoi HS, Dhillon GS y Patil RT (2008). Production of beta-galactosidase by Kluyveromyces marxianus MTCC 1388 using whey

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34. Snustad PD, Simmons MJ. (2000) Principles of Genetics. 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc

MODALIDADES DE EVALUACIÓN Global 1. Evaluación objetiva 40% 2. Participación 20% 4. Trabajo de investigación 40% Para ser considerados todos los rubros, deberá tener calificación aprobatoria en cada uno de ellos. La calificación final será el promedio de los tres rubros anteriores, siempre y cuando sean aprobatorias. Si alguna de ellas es inferior a 6, la calificación final será NA. MODALIDADES DE EVALUACIÓN DE RECUPERACION Sólo podrá tener derecho a examen si el alumno ha aprobado el trabajo de investigación. El examen teórico se basará en los contenidos del módulo