PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO … · Iniciaram-se as pesquisas sobre as causas...

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTIFICA

CNPQ/UFPA

RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO

Período: fevereiro/2005 a agosto/2005

( ) Relatório Parcial

(x) Relatório Final

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa: Investigação Química de Plantas Amazônicas

com Propriedades Biológicas Úteis.

Resolução CONSEP ou Número de Portaria de Aprovação: 16771/71

Nome do Orientador: Lourivaldo da Silva Santos

Titulação do Orientador: Doutor

Departamento: Química

Unidade: Centro de Ciências Exatas e Naturais

Laboratório: Química / Pesquisa

Nome do Bolsista: Isabel Cristina Serrão Ferreira

Título do Plano de Trabalho: "Estudo Químico e Atividade Biológica da

Biomassa Produzida por Fungo Endofítico Associado às Folhas de Virola Michellii"

1. INTRODUÇÃO:

A espécie Virola michelii, conhecida popularmente como “ucuúba preta”, é

uma planta da Amazônia cujas folhas são utilizadas por nativos da região como

emplastos para alívio de irritações causadas por fungos e no tratamento de

infecções da pele1. Em trabalho2 anterior foram isoladas substâncias pertencentes

a classe dos flavonóides (flavonas) e lignanas furufurânicas a partir de extratos

obtidos das folhas desta espécie. Neste momento a proposta é estudar os fungos

associados a ela como endofíticos.

Fungos endofíticos são fungos que durante um certo período de suas vidas,

colonizam os tecidos internos de plantas sem causar sintomas à esta3.

As relações entre plantas e microorganismos já são conhecidas há muito

tempo, entretanto, com raras exceções, acreditava-se que estas interações

levavam a lesões nos tecidos vegetais4. Mais recentemente, vem sendo registrada

a presença de microorganismos no interior de tecidos vegetais sadios,

especialmente bactérias e fungos, abrindo novas perspectivas para o estudo da

interação planta/microorganismos5-6.

Nos anos 80 começaram a surgir na literatura relatos que evidenciavam

que os microorganismos endofíticos, no caso fungos, podiam desempenhar um

importante papel dentro de suas plantas hospedeiras. Foi demonstrado que a

existência de um ou mais desses microorganismos podia ocasionar redução do

ataque de insetos nos seus hospedeiros vegetais. Iniciaram-se as pesquisas sobre

as causas dessas proteções e as variáveis envolvidas no processo. Atualmente,

sabe-se que vários metabólitos secundários produzidos por esses endófitos são

os agentes responsáveis pela proteção desses vegetais, o que vem a constituir

um vasto campo de pesquisas na área da fitoquímica6.

Com base nessas informações, nosso grupo de pesquisa iniciou a

implantação de uma nova linha de estudo no laboratório de Química/Pesquisa.

Das folhas jovens da espécie Virola michelli foram isolados vários fungos

que dentre esses isolados escolheu-se o fungo identificado como Pestalotiopsis

guepinii para realização do estudo químico e biológico da biomassa produzida por

este endofítico.

Neste relatório, será descrito o processo de isolamento dos fungos

endofíticos da espécie Virola michelii, a obtenção dos extratos fúngico de

Pestalotiopsis guepinii, o fracionamento dos extratos fúngicos, assim como os

resultados dos bioensaios de alelopatia realizado com os extratos fúngicos brutos

e o isolamento das substâncias ergosterol e peróxido de ergosterol obtidas do

extrato hexânico .

2. OBJETIVOS:

2.1 GERAL:

Isolar e cultivar fungo endofítico associado a Virola micheli e verificar as

propriedades biológicas da biomassa produzida.

2.2 ESPECÍFICOS:

• Cultivar o fungo em diferentes meios de cultura e obter os extratos

fúngicos: objetivo alcançado, pois os fungos foram isolados e escolheu-se o

endofítico Pestalotiopsis guepinii para cultivo em grande escala e obtenção

dos extratos brutos.

• Verificar as propriedades alelopáticas: objetivo alcançado, pois os

bioensaios foram realizados com os extratos brutos na EMBRAPA sob a

orientação do prof. Dr. Antônio Pedro da Silva Souza Filho. Os ensaios anti-

microbianos dos extratos ainda não foram realizados, pois as bactérias

solicitadas à FIOCRUZ não foram liberadas no período desejado pelo

nosso grupo de pesquisa.

• Treinamento de bolsista de Iniciação Científica na técnica de isolamento

e cultivo de fungos endofíticos: objetivo alcançado, e que vem sendo

desenvolvido constantemente.

• Implantação de uma nova linha de pesquisa no Laboratório de

Química/Pesquisa: objetivo alcançado.

3. JUSTIFICATIVA:

Apesar de devidamente comprovada a existência de microbiologia

endofítica, existe uma série de razões para que se aprofundem estudos a respeito

de aspectos ecológicos, genéticos, fisiológicos e químicos dessa interação.

A aplicação desses microorganismos já é realidade e configura-se como

avanço nas seguintes áreas: controle biológico de pragas e doenças, bioerbicidas,

bioindicadores de vitalidade, vetores para introdução de genes em plantas,

biorremediação de solos contaminados com poluentes e como produtores de

antibióticos e outros metabólitos secundários de interesse farmacológico7.

Observou-se que alguns compostos de origem vegetal são produzidos por

fungos que habitam essas plantas indicando haver um transmissor de genes entre

vegetais e fungos em uma verdadeira engenharia genética in vivo8.

A quase totalidade das pesquisas desenvolvidas nessa linha tem sido

realizadas com plantas de clima temperado, particularmente gramíneas que são

largamente usadas na alimentação do gado, porém já foi comprovada uma maior

riqueza desses microorganismos endofíticos relacionada à estação de chuvas.

Assim, neste projeto elegemos como planta hospedeira a espécie Virola michelii

(Myristicaceae), planta originária da região amazônica e que apresenta diversas

atividades biológicas9.

O uso de fungos endofíticos abre novas áreas de exploração

biotecnológica, que dita a necessidade de isolar, caracterizar e investigar os

metabólitos secundários oriundos da relação planta/microorganismo, sendo que

muitas dessas substâncias são inéditas e que podem ser utilizadas na indústria

farmacêutica e na agricultura. Esta é uma nova linha de pesquisa que pode ser

considerada implantada em nosso Laboratório.

4. DESENVOLVIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Equipamentos

• Espectrofotômetro de ressonância Magnética Nuclear – Modelo GEMINI

300- Varian. 75MHz (RMN 13C) e 300MHz (RMN 1H).

• Rotavapor – MICRONAL.

• Autoclaves verticais- Modelo Au 75 PHOENIX

• Capela de fluxo laminar- Modelo PA 320 PACHANE

• Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Shimadzu, composto por 2

bombas, modelo LC-10AD, detector de absorbância UV, modelo SPD-

10AV, degaseficador de membrana, modelo DGU-14A, injetor de amostras

Rheodyne 7752i, com alça de amostragem de 20 ì L, interface de

comunicação Shimadzu, modelo CBM 10A acoplado a microcomputador

Pentium II com software de integração Class LC-10.

• Balança analítica Sartorius;

• Ultra-som Branson 2200.

4.1.2 Solventes

Isolamento e purificação de amostras: hexano, acetato de etila, diclorometano e

metanol (SYNTH e QUIMEX).

Espectros de RMN 1H e 13C: solvente deuterado – CDCl3.

Solventes Grau HPLC: Acetonitrila, Metanol, isopropanol, tetrahidrofurano todos

da TEDIA BRASIL. A água foi purificada em um sistema de água Milipore ELGA

MAXIMA (18,2M’Ω).

4.1.3 Substratos utilizados para o cultivo em meio sólido

Arroz “Uncle beens”

Milho “Yoki” para canjica

4.1.4 Substâncias utilizadas para o cultivo em meio líquido

NaNO3

K2HPO4

MgSO4.7H2O

FeSO4.7H2O

Água destilada

4.1.5 Técnicas Cromatográficas

• Cromatografia em coluna (CC): colunas de vidro, diâmetro e altura

conforme o peso da amostra. Cerca de 20g de sílica gel 60G (70-230 e

230-440 mesh, ASTM. Merck) por grama da amostra.

• Cromatografia em coluna à vácuo (CCV).

• Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC): placas de vidro

de 5x10 cm ou 10x20 cm, preparadas com camadas de sílica (sílica gel

60G- Merck) de 0,5 mm de espessura.

• Cromatografia em Camada Delgada Preparativa (CCDP): placas de vidro

de 20x20 cm, preparadas com camada de sílica (sílica gel 60 PF-254 –

MERCK) DE 1 mm de espessura.

• Cromatografia Líquida de alta eficiência (CLAE): colunas com fase

estacionária C18 com dimensões de 250x4.60mm e 250x10.00 mm (Luna

5u e Synergi fusion 4u) ambas fornecidas pela Phenomenex.

• Para o tratamento das amostras foram utilizados cartuchos com fase

estacionária C18 da Phenomenex.

Glucose

Extrato de levedura

Dextrose

Batata inglesa

4.2 MÉTODOS

4.2.1 COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO

As folhas de Virola michelii foram coletadas em Belém-PA por técnicos da

EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) e identificadas por

Botânicos da mesma instituição em cujo herbário encontra-se depositada uma

exsicata.

TABELA 01: Fungos endofíticos isolados de Virola michelii

Os fungos isolados codificados nesta tabela ainda não foram identificados, mas o

processo está em andamento.

Parte da planta Fungo isolado

Folhas jovens

Pestalotiopsis guepinii

Coelomyceto

Paecylomyces variotii

Fungo 01

Fungo 09

Fungo 14

Fungo 18

Fungo 19

Fungo 23

Fungo 24

Fungo 24

Galhos

Colletotrichum gloeosporioides

Paecylomices varioti

Fungo 02

Fungo 08

Fungo 15

Fungo 16

Fungo 25

4.2.3 Cultivo em meio líquido.

Para o cultivo em meio CzapeK’s, enriquecido com 2% de extrato de

levedura, foram utilizados 36 Erlenmeyeres de 1L contendo 300 mL do meio de

cultivo, os quais, após autoclavagem foi introduzido o fungo e incubado a 25ºC

durante 30 dias.

TABELA 2: Meio Czapek’s enriquecido com 2% de extrato de levedura

Reagentes Quantidades

NaNO3 3,0g

K2HPO4 1,0g

MgSO4.7H2O 0,5g

KCl 0,5g

FeSO4.7H2O 0,01g

Glicose 30g

Extrato de levedura 20g

H2O qsp 1L

4.2.4 Obtenção dos extratos.

Após os 30 dias de incubação do fungo P. guepinii no meio Czapek’s foram

obtidos dois materiais por filtração utilizando como filtro duas fraldas de algodão: o

micélio e o filtrado.

a) Extrato micelial

Ao micélio foi acrescentado metanol por um período de cinco horas com

dois objetivos: o metanol, por ser tóxico, destrói os esporos o que diminue o risco

de contaminação durante o manuseio e o segundo é a obtenção imediata de um

extrato (MeOH 1).

b) Extrato do Filtrado

O filtrado obtido foi submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila

(3x) sempre na proporção 1:1. A fase acetato foi posteriormente concentrada para

a obtenção do extrato acetato de etila. Ver fluxograma 01.

4.2.5 Cultivo nos cereais (arroz e milho)

Para o cultivo nos cereais foram colocados 100g do cereal em de 500mL

contendo 30mL de água destilada, totalizando 40 Erlenmeyers. Esse meio foi

autoclavado por 45 minutos à temperatura de 121ºC. Deixou-se o material atingir a

temperatura ambiente e introduziu-se o fungo nos Erlemeyeres, então estes foram

incubados a 25ºC por 30 dias.

a) Obtenção dos extratos

Após o período de incubação foi acrescentado metanol aos frascos de

Erlemeyeres com o mesmo objetivo que o descrito no item 4.2.4 Após o período

de cinco horas o cereal foi seco em estufa a 45ºC. Do material seco foram obtidos

os extratos conforme mostra o fluxograma 02.

b) Fracionamento dos extratos.

Os extratos foram fracionados em coluna cromatográfica (CC). As frações

obtidas foram purificadas por CC, por cromatografia em camada delgada

preparativa (CCDP), recristalização e CLAE. As estruturas dos constituintes

químicos isolados foram determinadas através de métodos espectroscópicos, tais

como RMN 1H e RMN 13C uni e bidimensional.

Foram obtidos seis extratos ao todo. O extrato metanólico originado do

processo de eliminação do fungo cultivado em ckzapec, o extrato da fase acetato,

o extrato metanólico (MeOH-1) originado do processo de eliminação do fungo

cultivado em arroz, assim como os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico

(MeOH-2) originados do processo de percolação a partir do arroz seco. O extrato

metanólico por não ser guardado em geladeira fungou, e, portanto foi descartado.

A fase acetato de etila após concentração rendeu 1,5g de extrato que foi

fracionado e as suas frações refracionadas, porém sempre resultando em frações

com pouca quantidade de massa e em grandes misturas, por este motivo,

resolveu-se fracionar os extratos em apenas uma etapa, com sistemas pré-

estabelecidos num total de cinco a seis frações, em seguida essas frações seriam

injetados no cromatógrafo líquido de alta eficiência para uma análise prévia do

perfil cromatográfico de cada uma das frações e assim se fez.

O extrato hexânico obtido da extração por percolação do meio sólido (arroz)

após concentração consistiu de duas fases, uma liquida e uma sólida. O sólido foi

lavado com hexano a frio e os cristais resultantes foram analisados através de

técnicas uni e bidimensionais de RMN 1H e 13C, o que levou a identificação do

esteróide ergosterol S1, ver fluxograma 03. A fase líquida foi fracionada em coluna

cromatográfica de sílica gel, com o sistema de eluentes em gradiente crescente de

polaridade com hexano e acetato de etila e as frações obtidas foram submetidas à

análise de RMN 1H, fluxograma 04.

A fração hex/AcOEt 60% foi analisada por CLAE, usando um sistema

isocrático MeCN:H2O 37%, uma coluna analítica com fase estacionária C18 da

synergi fusion, de acordo com o tempo de retenção dos picos observados

submeteu-se à fração a um novo fracionamento, sendo este analítico, usando um

cartucho com fase estacionária C18 com 1mL de volume. Tomou-se 10mg da

fração hex/AcOEt 60% e solubilizou-se em 1mL de MeCN:H2O 50% fazendo-a

passar pelo cartucho seguida de dois outros sistemas, MeCN:H2O 50% e MeCN

100% de iguais volumes. Esse novo fracionamento resultou em três novas frações

que analisadas por CLAE mostrou um bom resultado, ou seja, conseguiu-se

separar os metabólitos em bloco de acordo com os novos tempos de retenção

observados. Visto que a metodologia foi eficiente, a mesma foi repetida, porém

não mais em um cartucho analítico e sim em um com 25mL de volume. As duas

primeiras frações estão sendo estudadas por obter a melhor metodologia de

isolamento por CLAE e a terceira fração foi submetida a análises espectroscópicas

levando a identificação do peróxido de ergosterol S2, o fluxograma 05 abaixo

resume este procedimento experimental. As demais frações do extrato hexânico

consistem de um triglicerídeo que se encontra em fase de identificação estrutural.

O extrato acetato de etila obtido do processo de percolação do meio sólido

(arroz) consistiu de um único triglicerídeo que também se encontra em fase de

determinação estrutural.

O extrato metanólico-2 obtido do meio sólido por percolação foi particionado

com eluentes em gradiente crescente de polaridades, hexano, diclorometano e

acetato de etila, estas fases foram submetidas as análises espectroscópicas,

porém ainda não foram estuda por CLAE.

O extrato metanólico-1 obtido do processo de eliminação do fungo foi

submetido à partição com hexano, diclorometano e actetato de etila, onde o

procedimento utilizado, assim como a fase obtida encontra-se resumidas no

fluxograma 06 abaixo.

A fase hexânica obtida da partição do extrato metanólico-1 foi fracionada e

as suas frações analisadas no cromatógrafo líquido de alta eficiência, onde a

análise cromatográfica da fração C14 hexano/acetato 20% usando um sistema

isocrático MeCN:H2O 37% e o par de colunas analítica e semipreparativa com

fase estacionária C18 da synergi fusion levou ao isolamento da substância S3 em

fase de identificação estrutural.

A fase diclorometânica assim como a fase acetato de etila foram

fracionadas e as suas frações estão sendo analisadas no cromatógrafo líquido de

alta eficiência. Os fluxogramas abaixo resumem de forma clara os procedimentos

experimentais aqui descritos.

FLUXOGRAMA 01: Obtenção dos extratos de P. guepinii do cultivo no meio-líquido.

Resíduo


Micélio Filtrado

Filtrado Resíduo Fase AcOEt

Extrato MeOH Extrato da fase AcOEt (1,53g)

1- Cultivo em czapek`s (30 dias) 2- Filtração

1- Adição de MeOH (5 horas) 2- Filtração

Concentração a vácuo em evaporador rotativo

Partição em Acetato

Concentração a vácuo em evaporador rotativo

FLUXOGRAMA 2: Representação dos processos de obtenção dos extratos de P.

guepinii do cultivo no meio sólido (arroz).


MeOH Cereal

Extrato MeOH1 157,304g

Cereal Extrato Hexanico 5,074g

Cereal

Cereal

1- Cultivo em arroz (30 dias) 2- Adição de MeOH 3- Filtração

Concentração em evaporador rotativo

1- Secagem em estufa a 45ºC 2- Extração com Hexano 3- Filtração e concentração

1- Extração com AcOEt 2- Filtração 3- Concentração

Extrato AcOEt 34,3078g

Extrato MeOH2 135,176g

1- Extração com MeOH 2- Filtração 3- Concentração

FLUXOGRAMA 3 : Isolamento do ergosterol a partir do extrato bruto hexânco.

Extrato Hexânico 9g

Separacão dos cristais por catação

Cristais 300mg

Extrato Hexânico 8,5g

(S1)

RMN 1H e 13C

FLUXOGRAMA 4: Fracionamento do extrato hexânico

CCVU normal concentração

Extrato Hexânico 8,5g

Hex 100% Hex/acet 20%

Hex/acet 40%

Hex/acet 60%

Acet 100%

Acet/MeOH 30%

Acet/MeOH 60%

MeOH 100%

FLUXOGRAMA 5: Estudo da fração hexano/acetato 60% originada do extrato

hexânico.

Hex/Acet 60% 700Mg

Cartucho de 25 mL de Volume em C18 da Phenomenex

F1 231mg

F2 75mg

F3 56 mg

Hex/Acet 60% em MeCN:H2O 1:1

MeCN:H2O 1:1

MeCN 100%

RMN 1H e 13C

S2 56 mg

FLUXOGRAMA 6: Partição do extrato metanólico obtido do processo de

eliminação do endofítico P.guepinii

Como a biomassa foi produzida por fungo e que foi cultivaldo em um meio

bastante nutritivo a possibilidade de proliferação de microorganismos é muito

maior que biomassa produzida por vegetais, por este motivo, os extratos foram

guardados na geladeira e dessa forma não foi possível uma total secura dos

MeOH-1 105g

350 mL de H2O + 150 mL de MeOH solubilização adição de hexano filtração concentração

Fase Hexância 1,026g

Solução hidroalcóolica


adição de diclorometano filtração concentração

Fase diclorometância 1,045g adição de acetato de etila

filtração concentração


Fase acetato de etila 2,366g

mesmos, ou seja, o peso mencionado do extrato metanólico-1 é um peso

aparente.

A partição foi feita em duas etapas na primeira foi usado 20g e na segunda

85g o que resulta na massa exposta no fluxograma, ambas as partições foram

realizadas com a mesma metodologia, usado 500 mL de cada solvente (hexano,

diclorometano e acetato de etila) em triplicata.

5. ALELOPATIA.

O termo alelopatia foi criado pelo pesquisador alemão Hans Molisch10 e

significa do grego allelon = mútuo, pathos = prejuízos. O conceito descreve a

influência de um indivíduo sobre o outro, seja prejudicando ou favorecendo o

segundo. Sugere que o efeito seja realizado por biomoléculas (denominadas

aleloquímicos) produzidas por uma planta e lançadas no ambiente, seja na fase

aquosa e liberadas para o solo ou substrato, seja por substâncias gasosas

volatilizadas no ar que cerca as plantas11. Rice12 definiu alelopatia como:

”qualquer efeito direto ou indireto danoso ou benéfico que uma planta (incluindo

microorganismo) exerce sobre outra pela produção de compostos químicos

liberados no ambiente”.

A atividade dos aleloquímicos pode ser utilizada como alternativa

estratégica ao uso de herbicidas, inseticidas e nematicidas (defensivos agrícolas).

A maioria dessas substâncias provém do metabolismo secundário, porque na

evolução das plantas representaram alguma vantagem contra ação de

microorganismos, vírus, insetos, e outros patógenos ou predadores, seja inibindo

a ação destes ou estimulando o crescimento das plantas13-14.

Assim, a vegetação de uma determinada área pode ter um modelo de

sucessão condicionada às plantas pré-existentes e as substâncias químicas

que elas liberam no meio. Da mesma forma, nos manejos agrícolas, florestais e

na horticultura, a ocupação prévia da área pode ter significativa influência sobre

os cultivos que estão sendo instalados.

5.2 BIOENSAIOS ALELOPÁTICOS DOS EXTRATOS HEXÂNICO, ACETATO

DE ETILA, MEOH- 1 E MEOH- 2.

Os extratos hexânico, acetato de etila e metanólico obtidos a partir do

processo de extração do meio sólido (arroz) seco e moído, assim como o extrato

metanólico obtido do processo de morte do fungo Pestalotiopsis guepinii foram

submetidos aos bioensaios de alelopatia na concentração de 1% (m/v), utilizando

como testemunha água destilada frente as espécies invasoras de pastagens

Senna obtusifolia (Mata-pasto) e Mimosa pudica (malícia).

Os ensaios foram realizados em um período de 5 dias, em condições de

25°C de temperatura constante e fotoperíodo de 12 horas, visando a inibição da

germinação, do desenvolvimento do hipocótilo e da radícula, onde cada ensaio foi

feito em duplicata. Cada placa de petri de 9,0 cm de diâmetro recebeu 3,0 mL dos

extratos. Após evaporação do solvente, adicionou-se água destilada, quando

necessário, mantendo-se, dessa forma, a concentração original.

Na analise da germinação cada placa de petri recebeu 10 sementes, sendo

contadas diariamente e eliminadas as sementes germinadas. Nos ensaios sobre o

desenvolvimento da radícula e do hipocótilo, foram utilizadas quatro sementes

pré-germinadas por placa de petri. Ao final do período de cinco dias de

crescimento mediu-se o comprimento da radícula e do hipocótilo para determinar a

variação de desenvolvimento.

As sementes das plantas invasoras utilizadas nos bioensaios foram

coletadas em áreas de pastagens cultivadas no município de Castanhal, Estado

do Pará. Passaram por um processo de limpeza e expurgo e foram tratadas com

vista à quebra de dormência.

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.

6.2 DISCUSSÂO DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS 6.2.1 SUBSTÂNCIA S1: ERGOSTEROL

HO

1

2

3

45

6

7

89

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23 24 25

26

27

28

No espectro de RMN 1H de S1 (Fig.1) observa-se um multipleto em 3,63 ppm

típico de hidrogênio ligado a carbono carbinólico. O multipleto em 5,20 ppm é

característico da presença de hidrogênios olefínicos. Esses sinais juntamente com

os sinais em 0,63; 0,81; 0,85; 0,94; e 1,02 (ppm) caracterizam uma substância

com esqueleto esteroidal. Por se tratar de uma substância isolada de um fungo,

logo pensou-se no esteróide ergosterol muito comum e abundante na maioria das

espécies fúngicas. Para confirmar esta hipótese foi realizado um espectro de RMN 13C e DEPT, onde esses dados foram comparados com os reportados na

literatura15, os quais mostram total similaridade.

TABELA 3: Dados de RMN 13C (75 MHz, CDCl3) de S1 em comparação com dados publicados na literatura15 .

C äS 2 ä15 C äS 2 ä15 1 38,8 38,6 15 23,0 23,1 2 31,9 32,6 16 39,1 39,4 3 70,4 69,7 17 55,8 56,0 4 40,8 41,1 18 12,0 11,8 5 141,3 140,7 19 16,2 16,0 6 119,6 119,4 20 40,4 40,5 7 116,3 116,7 21 19,6 19,4 8 139,8 140,6 22 132,0 132,2 9 46,2 46,5 23 135,5 136,0

10 37,0 37,2 24 42,8 43,0 11 21,1 21,2 25 19,9 19,7 12 28,3 28,3 26 33,1 33,2 13 42,8 43,0 27 21,1 21,0 14 54,5 54,6 28 17,6 17,4

6.2.2 SUBSTÂNCIA S2: PERÓXIDO DE ERGOSTEROL

O

OHO

1

2

34

5

89

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

21

22

23 24 25

26

27

28

20

A substância S2 foi isolada em mistura com um composto graxo, este mesmo

composto graxo foi isolado da mesma fração em estudo e analisado por métodos

espectroscópicos de RMN 1H e 13C na qual foram de fundamental importância,

visto que a partir de seus espectros foi possível excluir os sinais deste composto

graxo dentre os do peróxido de ergosterol.

Ao analisar o espectro de RMN 1H (Fig.2) da mistura, observa-se para S2 um

multipleto em 3,93 ppm, típico de hidrogênio carbinólico, o conjunto de sinais entre

5,00 ppm e 5,30 ppm associado ao número de metilas nos levou a informação de

que se tratava de uma substância com esqueleto esteroidal. Os dupletos em 6,24

ppm e 6,50 ppm com J=8,4 Hz sugere que estes hidrogênios estejam cis

relacionados.

No espectro de RMN 13C (Fig.3) observa-se 28 sinas de carbonos (excluídos os

sinais do composto graxo) o que é coerente com substâncias que apresentam

esquelo esteroidal. Dentre esses, três sinais são típicos de carbono carbinólico

(66,35 ppm; 79,41 ppm e 82,16 ppm). A comparação destes dados com dados da

literatura mostrou uma total coincidência dos valores de deslocamento químico de

S2 com o do esteróide peróxido de ergosterol16-18. Além das coincidências dos

deslocamentos químicos, os espectro de COSY(Fig.4), DE, HETCOR(Fig.5) e

HMBC (Fig.6) confirmam a proposta estrutral.

O espectro de DEPT, mostra de forma clara onze sinais de carbonos metínicos

(CH), sete sinais de carbono metilênicos (CH2) e seis sinais de metilas, excluídos

os sinais referentes ao composto graxo.

O espectro de COSY mostra a correlação dos sinais em 6,22 ppm e 6,48 ppm

referente ao acoplamento de H6 com H7 e uma outra correlação entre os sinais

em 5,12 ppm (dd, J= 15,3 Hz e J= 7,2 Hz) e 5,21 ppm (dd, J= 15,3 Hz e J= 7,2 Hz)

referentes aos hidrogênios H22 e H23, respectivamente, e destes com os sinais

em 1,82 ppm e 1,98 ppm atribuídos pelo espectro de HETCOR aos hidrogênios

H20 e H24, respectivamente. Além das correlações mencionadas, são observadas

uma série de outras atribuídas aos carbonos metilênicos do peróxido de ergosterol

e do composto graxo.

O espectro de HETCOR mostra 5 correlações bem evidentes, a correlação dos

sinais em 135,1 ppm (C6) com o sinal em 6,22 ppm (H6); 130,6 ppm (C7) com o

sinal em 6,48 ppm (H7); 135,4 ppm (C22) com o sinal em 5,21 ppm (H22); 132,2

ppm (C23) com o sinal em 5,12 ppm (H23) e 66,3 ppm (C3) com o sinal em 3,93

ppm (H3).

Ao analisar o espectro de HMBC é possível assinalar a correlação entre H6 (6,22

ppm) com C5 (82,2 ppm), C7 (130,6 ppm) e C8 (79,4 ppm), assim como a

correlação entre H7 (6,48 ppm) com C5 (82,2 ppm), C8 (79,4 ppm) e C6 (135,14

ppm). Além destas correlações também observa-se a correlação do H22 (5,21

ppm) com C20 (39,7 ppm) e com o C24 (42,7 ppm), assim como a correlação do

H23 (5,12 ppm) com o C20 (39,7 ppm) e com o C24 (42,7 ppm). Esse conjunto de

informações mostra de forma clara que a substância S2 em questão, é o peróxido

de ergosterol.

TABELA 4: Dados de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de S2 em comparação com dados publicados na literatura16.

H äH S 2 äHS 216

H-3 3,93 (m) 3,96 (m)

H-6 6,22 (d) 6,24 (d)

H-7 6,48 (d) 6,50 (d)

Me-18 1,24 (s) 1,23 (s)

Me-19 0,88 (s) 0,88 (s)

Me-21 0,90 (d) 0,90 (d)

H-20 1,82 (m) -

H-22 5,21 (dd) 5,20 (dd)

H-23 5,12 (dd) 5,15 (dd)

H-24 1,98 (m) -

Me-26 0,83 (d) 0,84 (d)

Me-27 0,80 (d) 0,81 (d)

TABELA 5: Dados de RMN 13C (75 MHz, CDCl3) de S2 em comparação com dados publicados na literatura17.

C äS 2 ä17 C äS 2 ä17

1 29,9 30,2 15 23,3 23,4

2 34,6 34,8 16 28,6 28,6

3 66,3 66,5 17 56,1 56,3

4 39,2 39,4 18 12,8 12,9

5 82,2 82,1 19 18,1 18,2

6 135,1 135,2 20 39,7 39,4

7 130,6 130,8 21 20,8 20,9

8 79,4 79,4 22 135,4 135,4

9 51,0 51,2 23 132,2 132,4

10 36,7 37,0 24 42,7 42,8

11 20,6 20,7 25 33,00 33,1

12 36,7 37,0 26 19,6 19,6

13 44,5 44,6 27 19,9 19,6

14 51,6 51,8 28 17,5 17,6

6.2 AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ALELOPÁTICAS DOS EXTRATOS

BRUTOS FRENTE À GERMINAÇÃO DAS SEMENTES, DESENVOLVIMENTO

DA RADÍCULA E DO HIPOCÓTILO.

Nos testes realizados em geral, os extratos metanólico 1 e 2 (extratos mais

polares), apresentaram maior potencial alelopatico. Das espécies receptoras, as

sementes de malícia foram inibidas com mais intensidade. É importante relatar

que ao final dos ensaios as espécies receptoras, plantas invasoras de pastagens,

morreram. Os gráficos abaixo exibem de forma clara os resultados obtidos.

66 66

100

67

0

20

40

60

80

100

Hexânico Acetato MeOH 1 MeOH 2

Gráfico 1: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre a

germinação das sementes de mata-pasto. Dados expressos em percentual de

inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

34

14

94

80

0

20

40

60

80

100

Hexânico Acetato meOH 1 MeOH 2

Gráfico 2: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre a

germinação das sementes de malícia. Dados expressos em percentual de inibição

em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

712

51

38

0

10

20

30

40

50

60


Gráfico 3: Efeitos dos extratos brutos na concentração de 1% (m/v) sobre o

desenvolvimento da radícula das sementes de mata-pasto. Dados expressos em

percentual de inibição em relação ao tratamento testemunha (água destilada).

18

4449 48

0

10

20

30

40

50



desenvolvimento da radícula das sementes de malícia. Dados expressos em


3

24

4843

0

10

20

30

40

50



desenvolvimento do hipocótilo das sementes de mata-pasto. Dados expressos em


35

5155

51

0

10

20

30

40

50

60



desenvolvimento do hipocótilo das sementes de malícia. Dados expressos em


7. CONCLUSÃO.

A partir das folhas e galhos jovens da espécie Virola michelii foram isolados

17 fungos endofíticos: Pestalotiopsis guepinii, Coelomyceto, Paecylomyces variotii,

Colletotrichum gloeosporioides e os demais fungos estão em fase de identificação.

Dos endofíticos isolados escolheu-se o fungo identificado como

Pestalotiopsis guepinii que foi cultivado em grande escala utilizando meios de

cultura diferentes. Do filtrado obtido pela incubação do P. guepinii no meio

Czapek’s, que foi submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila,

obteve-se o extrato da fase acetato. A partir do processo de extração do meio

sólido (arroz) que foi seco e moído obteve-se os extratos hexânico, acetato de

etila e os extratos Metanólicos 1 e 2. Do estudo químico do extrato hexânico foram

isoladas duas substâncias: o ergosterol (S1) e o peróxido de ergosterol (S2),

assim como um triglicerídeo que se encontra em fase de identificação estrutural.

Também encontram-se em fase de determinação estrutural um triglicerídeo

isolado no extrato acetato de etila, a substância S3 isolada na fração C14

hexano/acetato 20% obtida da fase hexânica do extrato metanólico-1.

Os extratos hexânico, acetato de etila e metanólicos 1 e 2 (MeOH-1 e

MeOH-2) foram submetidos aos bioensaios de alelopatia utilizando como plantas

invasoras de pastagens a Mimosa pudica (malicia) e a Senna Obtusifolia (mata-

pasto).

Nos testes realizados, os extratos mais polares mostraram-se mais ativos nos

ensaios visando à inibição do desenvolvimento da radícula, do hipocótilo e

germinação. Frente à espécie malícia os extratos MeOH-1 e MeOH-2 inibiram,

respectivamente, o desenvolvimento da radícula (49% e 48%), do hipocótilo (55%

e 51%) e da germinação de sementes (94% e 80%). Já frente à espécie mata-

pasto os extratos MeOH-1 e MeOH-2 inibiram o desenvolvimento da radícula (51%

e 38%), do hipocótilo (48% e 43%) e da germinação (100% e 67%).

A partir desses dados conclui-se que das espécies receptoras, no conjunto

de dados, a malícia apresentou maior sensibilidade aos efeitos inibitórios dos

extratos. Entretanto, na germinação de sementes da espécie mata-pasto, o extrato

MeOH1 apresentou 100% de inibição.

Um fato importante que deve ser relatado é a morte das espécies

receptoras, as plantas invasoras de pastagens, ao final dos bioensaios e este

resultado encontra-se em investigação.

8. TRABALHOS BUBLICADOS.

Lima, M. N.; Ferreira,I. C. S.; Souza Filho, A.P. S.; Arruda, M. S. P., Guilhon, G.

M.S.P.; Muller, A.H.; Santos, A.S.; Rodrigues-Filho, E.; Marinho, A. M. R. e

Santos, L.S.. “Potencial alelopático dos extratos do endofítico Pestalotiopsis

guepinii associado à espécie Virola michelii”. 28a Reunião Anual da Sociedade

Brasileira de Química-SBQ 2005. Poços de Caldas-MG.

Cavalcante, F.O.R.; Lima, M. N. ; Borges, F. C.; Monteiro, M. N. P.; Ferreira,I. C.

S ; Santos, A.S.; Rodrigues-Filho, E.; Marinho, A. M. R.; Guilhon, G. M.S.P.;

Santos, L.S. Isolamento e dentificação de fungos endofíticos associados à Virola

michelii. XLV Congresso Brasileiro de Química. Belém-PA. Setembro- 2005.

(aceito para apresentação).

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

1. GOTTLIEB, O.R.; Yoshida, M., Química Nova, 7, 250 (1984) 2. BORGES, F. C.; Estudo Fitoquímico, Alelopático e Farmacológico de

Constituintes Químicos das Folhas de Virola michelii e Virola surinamensis. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós -Graduação em Química- UFPA, Belém-PA, 2003.

3. PETRINI, O.; Sieber, T. N.; Toti, O. “Ecology, metabolite production, and substrate utilization in endophytic fungi”. Natural toxis, 1: 185-196, 1992.

4. MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L. Controle Biológico. Jaguariúna: Embrapa Meio

Ambiente, 2000. V.3, p 57-87. 5. MARINHO, A. M. do R.; Investigação e Propriedades Biológicas dos Extratos

do Fungo Penicillium janthinellum aos Frutos de Melia azedarach(Meliaceae). São Carlos. Programa de Pós -Graduação em Química - UFSCar, 2002. Dissertação de Mestrado.

6. TRABULSI, L.R. Microbiologia. 3ª ed. São Paulo. Atheneu Editora, 2002. p. 365-

424. 7. AZEVEDO, J.L.; Microorganismos Endofíticos. In: MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L.,

ed. Ecologia Microbiana. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 1998. P.117-137.

8. CARVALHO, J.C.T.; SANTOS, L.S.; CORRÊA, M.J.C.; CAMPOS, L.M.O.;

BASTOS, J.K. e SARTI, S.J., Anti-inflammatory activity of flavone and some of its derivates from Virola michellii Heckel. Journal of Ethnopharmacology 64(2), 173-177 (1999).

9. SANTOS, L.S.; CORRÊA, M.J.C.; CAMPOS, L.M.O. e ANDRADE, M.A.

Contituents from the leaves of Virola michellii. Fitoterapia, 67 (6), 555-556 (1996)

10. MOLISCH, H. Der einfluss einer Pflanze auf die andere Allelopathie. Jena, Fischer (1937).

11. RIZVI, S.J.H.; HAQUE, H.; SINGH, U.K.; RIZVI, V. A discipline called

allelopathy. In: RIZVI, S.J.H.; RIZVI, H (Eds.). Allelopathy: Basic and applied aspects. London, Chapman & Hall,.1(1992).

12. RICE, E.L., Allelopathy. 2nd ed, New York, Academic Press (1984). 13. WALLER, G.R., Introduction. In: MARCIAS, F.A.; GALINDO, J.C.G.;

MOLINILLO, J.M.G.; Cutler, H.G. (Eds.) Recent advances in allelopathy. Cadiz, Serv. Pub. Univ. Cadiz. 1, sem paginação(1999).

14. WALLER, G.R.; Feug, M.C.; Fujii, Y., Biochemical analysis of allelopathic

compounds: plant, microorganisms, and soil secondary metabolites. In: INDERJIT; DAKSHINI, K.M.M. & FOY, C.L (Eds.). Principles and practices in plant ecology. Boca Raton, CRC Press, 75 (1999).

15. BREITMAEIR, E., Carbon-13 NMR Spectroscopy. New York, Jonh Wiley e

Sons, 1987. 16. BARROS, F.A., Dissertação de Mestrado. DQ-UFSCar, 2002. 17. YUE, J.; CHEN, S.; LIN, Z; SUN, H. Sterol from the Fungos Lactarium

Volumes. Phytochemistry. 2001, 56, 801-806. 18. MARINHO, A. M. R., Dissertação de Mestrado ‘’Investigação Química e

Propriedades Biológicas dos Extratos do Fungo Penicillium janthinellum Associado como Endofítico aos Frutos de Mellia azedarach (Meliaceae)”, pp.160. DQ-UFSCar,2002.

PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do aluno e justificativa do pedido de renovação, se for o caso.

A bolsista desenvolveu seu trabalho com seriedade e dedicação, cumprindo

o cronograma previsto no Plano de Trabalho e, como descrito neste Relatório

Final, obteve resultados significativos, isolando e identificando duas substâncias

produzidas por fungos. Vale ressaltar que esta linha de pesquisa (Metabólitos

Secundários de Fungos Endofíticos) está sendo implantada em nosso grupo de

pesquisa. Os resultados deste estudo foram divulgados na 28º Reunião Anual da

Sociedade Brasileira de Química. Poços de Caldas (MG), com apresentação de

um trabalho, e um outro trabalho foi aceito para apresentação no XLV Congresso

Brasileiro de Química, a ser realizado em setembro/2005, em Belém-PA.

Portanto, somos de parecer FAVORÁVEL à aprovação deste relatório.

DATA : 26 / 08 / 2005

_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR

Prof. Dr. Lourivaldo da Silva Santos

____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO

Isabel Cristina Ferreira Serrão

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