Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de ... · GENÉTICA E MELHORAMENTO DE...
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LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - BrasilTelefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Controle de Insetos Praga Mediado por RNA de interferência
Aluno: Celso Spada Fiori
Orientador: Dr. Daniel Scherer de Moura
Controle de Pragas
� QuímicoAplicação de inseticidas
Milho: Aprox. 60 milhões de dólares anuais (40% lagarta-do-cartucho)
� BiológicoUtilização de controladores naturais
Ex.: Vespa Cotesia flavipes no controle da Diatraea saccharalis
� TransgênicosTecnologia Bt
Ex. Algodão Bt resistente a inseto
� Integrado
Defesas Naturais das Plantas
Nitrogenados
Terpenóides
Fenólicos
Físicas
Cutícula
Epiderme Espessa
Tricomas
Fibras
Químicas
Metabólitos Tóxicos e/ou Repelentes
RNA dupla fita (dsRNA):
onde tudo começa
siRNA: Em busca do alvo específico
DICER: A RNAse do processamento
Complexo RISC: Localizando e
eliminando os mensageiros
Silenciamento Gênico
O Silenciamento Gênico Pós-Transcricional
David Baulcombe, 2004. Nature
RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA)
Clivagem do mRNA
RNAiUm mecanismo suficientemente conservado!
Plantas Insetos Nematóides
Gordon & Waterhouse, 2007. Nature Biotech
Primeira Hipótese:
Plantas Insetos
Sileciamento Gênico
na Lagarta!
Possível! Porém, apenas em dietas artificiais com altas doses do siRNA correspondente
Nova Hipótese
Sileciamento Gênico
na Lagarta!
Amplificação!
BINGO: Funciona!!
Relativa
Expressão
Dias de dieta
Precedentes
Baum et al., 2007. Nature Biotech
Objetivo:
Promover a morte das lagartas!
Através de um “RNA Inseticida”
Genes candidatos: Funções essenciais para a lagarta
Baum et al., 2007. Nature Biotech
Alvos ideais: Silenciamento sob baixas quantidades de RNA
-Diluições seriadas
dsRNA aplicado na dieta artificial em concentrações elevadas (520-780 ng/cm2)
Determinação da “DL50”:
Concentração causadora de 50% de mortalidade em 12 dias
Anotação DL50
Dias
Controle
TubulinadsRNA
ATPase
dsRNA
Baum et al., 2007. Nature Biotech
Foram geradas plantas Transgênicas expressando dsRNA para silenciamento do gene
V-ATPase A
Selvagem Transgênica
Transgênica Selvagem Resistente
~1000 ovos
Baum et al., 2007. Nature Biotech
Dano
Radicular
Relativo
Coevolução inseto-planta
Como o inseto resiste aos metabolitos de defesa das plantas?
Análise da tolerância da lagarta ao Gossipol:(em dieta artificial)
Exemplo: Helicoverpa armigera
Tolera o gossipol produzido pelo algodão?
Ganho de
peso (mg)
s/ glândulas c/ glândulas
Ganho de
peso (mg)
Mao et al., 2007. Nature Biotech
P450 Monooxygenases: Enzimas
envolvidas na adaptação a inseticidas
e metabólitos naturais
Ganho de
peso (mg)
Ganho de
peso (mg)
Ganho de
peso (mg)
Como ocorre essa tolerância?
Neste caso específico, estaria a P450 Monooxigenase participando da tolerância
ao gossipol?
Respondendo
Experimentos:
Biblioteca de cDNA de intestino de lagartas expostas ou não ao Gossipol
Dentre os genes diferencialmente expressos – CYP6AE14
Mao et al., 2007. Nature Biotech
P450 Monooxigenase
Expressão de CYP6AE14 é
dependente de dose:...e tecido específica:
mg/g de gossipol
Existe relação do crescimento da lagarta (H. arimgera)
com a expressão desse gene?
Outra Monooxigenase envolvida?
Existe especificidade?
Mao et al., 2007. Nature Biotech
Ganho de
peso (mg)
Ganho de
peso (mg)
Provada a necessidade de alta expressão do gene para tolerância,
o silenciamento deste deve reduzir a resistência ao gossipol!
Hipótese: Alimentar a lagarta com plantas transgênicas expressando o dsRNA
do gene necessário à adaptação
Plantas transgênicas: dsGFP (controle)
dsCYP6AE14
Plantas de Arabidopsis e Tabaco sem fenótipo aparente
Mao et al., 2007. Nature Biotech
Análise dos transcritos do gene no intestino da lagarta:
Alimentadas com:
O dsRNA produzido pela planta pode efetivamente silenciar o RNA da
lagarta ao ser ingerido!Mao et al., 2007. Nature Biotech
E da proteína:
Alimentadas com plantas:
Selvagem
Transgênica
Influência no desenvolvimento da lagarta
Plantas transgênicas de algodão, expressando o dsRNA do gene CYP6A14
das células do intestino de lagarta, apresentam relativa resistência a essa praga!
Ganho de
peso (mg)
Mao et al., 2007. Nature Biotech
Ganho de
peso (mg)
Conclusões
� A utilização de RNAi no controle de insetos apresenta grande potencial
� Este sistema apresenta vantagens:
-Não requer a aplicação de um segundo componente.
-Não depende da produção de nenhuma proteína pela planta
-Alta especificidade (apenas organismos alvo)
-Reduzida pressão de seleção
Perspectivas
� Aumento da eficiência de controle
� Teste de viabilidade em campo
� Potencial extensão a demais insetos, fungos, bactérias e virus.
Obrigado!
� Dúvidas?