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MANUAL DE PRÁCTICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA MEDICA

PROGRAMA DE MEDICINA

ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA

Y PARASITOLOGIA

DPTO. CIENCIAS BASICAS

ICB, UACJ.

Agosto 2012

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INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMEDICAS

DIRECTOR

M.C. Hugo Staines Orozco

DEP. CIENCIAS DE LA SALUD

M. C. Carlos Cano Vargas

PROGRAMA MEDICINA

Dr. Jorge Camargo Nassar

DEP. CIENCIAS QUIMICO BIOLOGICAS

Dr. Alejandro Martínez

COORDINADORA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA

M.C. Bertha Alicia Borrego Ponce

PROFESORES

Dra. Evangelina Olivas

M. C. Luis Alarcon Morales

AGRADECIMIENTOS:

A TODOS LOS PROFESORES DE LA ACADEMIA DE MICROBIOLOGIA Y

PARASITOLOGIA, POR SUS VALIOSAS SUGERENCIAS EN LA ELABORACION

DE ESTE MANUAl.

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CONTENIDO: Pag.

Portada……………………………………………………………………………………………………………1

Agradecimientos……………………………………………………………………………………………..2

Contenido………………………………………………………………………………………………………..3

Reglamento de laboratorios……………………………………………………………………………4

Introducción a la Microbiología………………………………………………………………………6

CAPÍTULO I BACTERIOLOGÍA……………………………………………………………………….. 7

Práctica #1 Aislamiento de Bacterias y Tinciones…………………………………………. 9

Práctica # 2 Microflora Normal y Control Microorganismos………………………….17

Práctica #3 Cocos Gram Positívos…………………………………………………………………21

Práctica # 4 Enterobacterias ……………………………………………………………………….25

CAPITULO II VIROLOGIA………………………………………………………………………………..29

Práctica # 1 Diagnostico de Virus Humanos……………………………………………….…31

Práctica # 2 Bacteriófagos…………………………………………………………………………….40

Práctica # 3 Diagnóstico de Hepatitis B…………………………………………………………43

Práctica # 4 Diagnóstico Rubeola…………………………………………………………..……...47

Práctica # 5 Diagnóstico de Rotavirus………………………………………………..……….…50

CAPITULO III PARASITOLOGIA…………………………………………………………………..….52

Práctica # 1 Manejo Muestras y coproparasitoscópico Directo…………………….53

Práctica # 2 Protozoarios Intestinales y Tisulares ………………………………………..62

Práctica # 3 Tinciones Permanentes y Técnica de Flotación……… ……………….65

Práctica # 4 Identificación de Helmintos y Técnica de Richtie………………………69

CAPITULO IV MICOLOGIA……………………………………………………………………………...75

Práctica #1 Eumycetos………………………………………………………………………………....75

Práctica # 2 Micosis Superficiales………………………………………………………………….80

Práctica # 3 Micosis Oportunistas…………………………………………………...…………….84

Práctica # 4 Micosis Subcutáneas y Sistémicas………………………………………….….88

Bibliografía…………………………………………………………………………………………………….94

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REGLAMENTO PARA ESTUDIANTES

INTRODUCCION

Este reglamento regirá la actitud, el comportamiento y el desempeño del estudiante dentro de los laboratorios de Microbiología y tiene como finalidad evitar riesgos al personal y estudiantes que laboran en él, ya que el laboratorio es un área donde se manejan microorganismos patógenos, parásitos y algunos compuestos químicos peligrosos. Asimismo, se debe cuidar el equipo valioso como son los microscopios y el material delicado como la cristalería.

REGLAS

1. Todos los alumnos deberán asistir con bata blanca larga y el cabello recogido. 2. La entrada al laboratorio quedará restringida exclusivamente a los alumnos

inscritos 3. Se PROHIBE INTRODUCIR AL LABORATORIO CUALQUIER ALIMENTO O

BEBIDA, para evitar el riesgo de contaminación con microorganismos patógenos.

4. Está estrictamente PROHIBIDO FUMAR dentro del laboratorio. 5. Queda prohibido introducir mochilas, cajas de herramienta, etc., debiéndose

colocar estas en los lockers de la entrada de 6. Cualquier accidente en el laboratorio o derrame de microorganismos, se

deberá comunicar inmediatamente al profesor, para evitar el riesgo de contaminación con los microorganismos patógenos o parásitos manejados en las prácticas.

7. Se nombrará un jefe de mesa quien será el responsable del cuidado del material y equipo y de que la mesa quede aseada y desinfectada. También vigilará que todos los integrantes de la mesa se laven las manos con antiséptico antes de retirarse. El jefe de mesa recibirá del profesor los microscopios y otros materiales y aparatos necesarios para el desarrollo de las prácticas, y posteriormente los devolverá en las mismas condiciones que los recibió, a excepción de los materiales especiales indicados por el profesor. (ejemplo cultivos). En caso de algún daño al material o aparatos, los alumnos integrantes del equipo estarán obligados a reparar dicho daño en forma que indique el profesor.

8. Para tener derecho a la evaluación final en la teoría, el alumno deberá tener el 80 % de asistencia.

9. Para poder tener derecho a la asistencia se dará 10 minutos como retardo 10. La calificación final de la materia de Microbiología quedará constituida por la

puntación obtenida en la práctica y en la teoría, cuya suma se efectuará en la forma siguiente:

a) La calificación final obtenida en el laboratorio tendrá un valor del 30 % de la calificación final total.

b) La calificación total de la teoría corresponderá al 70 % de la calificación final.

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c) La suma de ambas calificaciones (teoría y práctica) será igual al 100 %. d) El alumno no podrá acreditar la materia si obtiene calificación reprobatoria

en el laboratorio o en la teoría. Debe aprobar ambas para promediarse.

11.- El alumno deberá capacitarse con la NOM-087 sobre la Separación, Tratamiento y Destino de los Residuos Biológico- Infecciosos

Introducción.- El Sistema Nacional de Salud debe garantizar la prestación de servicios

para promoción, prevención, diagnóstico, tratamiento y rehabilitación de la salud,

regulando los servicios médicos para que respondan a las demandas y necesidades de la

población.

Los servicios médicos deben ser de alta calidad en todos los establecimientos,

independientemente del subsector de salud al que pertenezcan, ya sea público, social o

privado.

Las soluciones tecnológicas que se instrumenten en los establecimientos objeto de esta

norma, deben ser el resultado de las demandas de actividades de promoción y prevención

de la salud, así como aquéllas dirigidas al diagnóstico y tratamiento de las diversas

patologías. Se debe indicar qué tecnologías diagnósticas, terapéuticas y de rehabilitación

se utilizarán en los establecimientos médicos para atender correctamente tales demandas,

lo cual integra el programa médico.

La indicación o el uso de las tecnologías para la salud dependen de la motivación, de los

conocimientos, de las habilidades y las capacidades del personal de salud y de una

correcta organización funcional de los establecimientos de atención que asegure realizar

las actividades médicas. Para ello es indispensable contar con una adecuada integración

de la infraestructura y el equipamiento.

En esta norma se presentan los requisitos mínimos de infraestructura y equipamiento para

hospitales y consultorios de atención médica especializada, incluyendo la infraestructura

y el equipamiento para ejercer actividades directivas y de formación de personal de salud,

establecido como obligatorio por la Ley General de Salud y su Reglamento en materia de

prestación de Servicios de Atención Médica.

1. Objetivo

Esta Norma Oficial Mexicana tiene por objeto establecer los requisitos mínimos de

infraestructura y de equipamiento para los hospitales y consultorios que presten atención

médica especializada.

2. Campo de Aplicación Esta Norma Oficial Mexicana es obligatoria para todos los

hospitales de los sectores público, social y privado, cualquiera que sea su denominación,

que realicen internamiento de enfermos para la ejecución de los procesos de diagnóstico,

tratamiento médico.

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MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

INTRODUCCION.

La microbiología es la rama de la biología encargada del estudio de los

microorganismos, seres vivos pequeños (del griego «μικρος» mikros "pequeño", «βιος»

bios, "vida" y «-λογία» -logía, tratado, estudio, ciencia), también conocidos como

microbios. Es la ciencia de la biología dedicada a estudiar los organismos que son sólo

visibles a través del microscopio: organismos procariotas y eucariotas simples. Son

considerados microbios todos los seres vivos microscópicos, estos pueden estar

constituidos por una sola célula (unicelulares), así como pequeños agregados celulares

formados por células equivalentes (sin diferenciación celular); estos pueden ser

eucariotas (células con núcleo) tales como hongos y protistas, procariotas (células sin

núcleo definido) como las bacterias]. Sin embargo la microbiología tradicional se ha

ocupado especialmente de los microorganismos patógenos entre bacterias, virus y

hongos, dejando a otros microorganismos en manos de la parasitología y otras

categorías de la biología.

Aunque los conocimientos microbiológicos de que se dispone en la actualidad son muy

amplios, todavía es mucho lo que queda por conocer y constantemente se efectúan

nuevos descubrimientos en este campo. Tanto es así que, según las estimaciones más

habituales, sólo un 1% de los microbios existentes en la biosfera han sido estudiados

hasta el momento. Por lo tanto, a pesar de que han pasado más de 300 años desde el

descubrimiento de los microorganismos, la ciencia de la microbiología se halla todavía en

su infancia en comparación con otras disciplinas biológicas tales como la zoología, la

botánica o incluso la entomología.

Al tratar la microbiología sobre todo los microorganismos patógenos para el hombre, se

relaciona con categorías de la medicina como patología, inmunología y epidemiología.

La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata

de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por

debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga

determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los

microorganismos. Con la invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de

una nueva rama del conocimiento, inexistente hasta entonces. Durante los siguientes 150 años su

progreso se limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos microbianos, y a los primeros

intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los "sistemas naturales" de los

Reinos Animal y Vegetal.

Tras la Edad de Oro de la Bacteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y

Koch, la Microbiología quedó durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y

aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la

Química, que le aportaría varios avances metodológicos fundamentales.

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CAPITULO 1 BACTERIOLOGIA

La Bacteriología es una disciplina de la Microbiología, que ha estado presente a lo largo

de la historia de la humanidad.

Las bacterias son responsables de millones de muertes de personas a nivel mundial.

Entre algunas enfermedades infecciosas bacterianas, causantes de grandes epidemias que

han mermado la población, se encuentran: la difteria, cólera, tuberculosis, sífilis, tétanos,

tos ferina, y fiebre tifoidea. Sin embargo, también existen infecciones bacterianas que

aunque están asociadas en menor frecuencia como causa de muerte, son un problema de

salud pública en países en vías de desarrollo como el nuestro, entre las que podemos

mencionar: diarreas (causadas por Shigella o Escherichia coli), infecciones de vías

urinarias, faringoamigdalitis, gonorrea, tracoma y brucelosis.

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS

De acuerdo al Árbol de la Vida de Woese, microbiólogo creador de la nueva taxonomía

molecular basada en la comparación entre especies de la fracción 16s del ARN

ribosomal, se proponen 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, en los que se incluye a

todos los seres vivos, aunque existen controversias.

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Los dominios Archeae y Bacteria corresponden a las células procariotas, una de cuyas

características es la de carecer de membrana nuclear. Con base en el estudio de fósiles y

modelos, se calcula que emergieron hace unos 3.6 - 4 billones de años. Su importancia

radica en el hecho de haber desarrollado una pared celular o membrana externa que les

confirió, desde el principio, de autonomía y protección con respecto a su medio ambiente.

Desde entonces constituyeron la forma de vida más abundante en el planeta en términos

de biomasa y número de especies. A pesar de su menor complejidad en relación a

Eucarya, los integrantes de los dominios Archeae y Bacteria pueden vivir en hábitats

extremos: se les encuentra en las profundidades de la Tierra, sobreviviendo gracias al

lento catabolismo del carbono orgánico depositado en los sedimentos, y en las profundas

fuentes hidrotermales submarinas.Se acepta la aparición del dominio Eukarya, con

membrana nuclear y orgánulos más desarrollados, desde hace unos dos billones de años;

de este dominio derivan todos los organismos eucariontes uni y multicelulares. Otra

clasificación de los seres vivos muy utilizada es la propuesta por Whitaker y Margulis.

Ellos clasifican a los organismos en cinco reinos, Animalia, Plantae, Fungi, Protista y

Monera, en éste último reino se incluyen todas las bacterias.

MORFOLOGíA BACTERIANA

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PRACTICA #1

TECNICAS DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y MEDIOS DE

CULTIVO

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.

Que los alumnos desarrollen las técnicas de siembra comunes de aislamiento de bacterias y

que conozcan algunos medios de cultivo comunes para bacterias y adquieran el criterio para

seleccionarlos según sus necesidades.

INTRODUCCION.

El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido a su

tamaño tan pequeño, por lo que es necesario recurrir a medios nutritivos artificiales, donde

se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes poblaciones. En estas condiciones se

pueden manipular y efectuar las investigaciones deseadas.

Los materiales nutritivos donde se desarrollan y multiplican los microorganismos contienen

los nutrientes necesarios para su crecimiento, y se denominan medios de cultivo, cuyos

componentes son muy variados. La elección del medio se basa en el propósito del estudio.

Los medios de cultivo pueden ser sintéticos, es decir de composición química conocida, o

pueden ser complejos, en los cuales por lo menos hay un componente de composición

desconocida.

En general, los medios son ricos en proteínas no específicas, con el fin de estimular el

crecimiento de los microorganismos que se desean aislar. La mayor parte de los

microorganismos requieren un medio enriquecido o suplementado por substancias como

sangre, suero, vitaminas, etc.

Los medios líquidos se pueden transformar en sólidos, mediante la adición de agar. Esto

significa que conservan la misma fórmula nutritiva.

Los medios de cultivo además de nutrientes y agua pueden contener sustancias inhibidoras

de ciertos grupos microbianos, sin interferir con otros, convirtiéndose en medios selectivos.

Cuando la muestra procede de una parte del cuerpo que contiene microorganismos de la

flora normal, el desarrollo de éstos es inconveniente y puede inhibir a los microorganismos

patógenos, por lo que el espécimen debe sembrarse en un medio que los inhiba y permita el

desarrollo del patógeno. Estos medios son complejos y altamente selectivos para ciertos

organismos. Por ej.: el de Shigella-Salmonella agar (SS), el citrato-desoxicolato-agar y el

sulfito de bismuto-agar, inhiben el crecimiento de la mayoría de los coliformes y permite el

desarrollo de patógenos entéricos. El agar-sangre-alcohol feniletil, es selectivo para el

aislamiento de cocos grampositivos positivos a partir de especímenes contaminados con

organismos gramnegativos, los cuales crecen en colonias muy pequeñitas. Los medios con

telurito de potasio y con suero o sangre favorecen el aislamiento de Corynebacterium,

mientras que inhiben todos los cocos grampositivos comunes en las muestras. En sal-

manitol-agar las colonias de estafilococos patógenos crecen con un halo amarillo.

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La adición de algunas sustancias indicadoras al medio, los convierte en medios

diferenciales, debido a que permiten el desarrollo de las bacterias con una apariencia

colonial distintiva, según la especie. En virtud de la composición química de estos medios,

se pueden caracterizar ciertos géneros bacterianos por la apariencia colonial distintiva en el

medio, por ej: el medio agar-eosina-azul de metileno (EMB) y el agar-MacConkey

contienen lactosa y un colorante o un indicador de pH. Las colonias fermentadoras de

lactosa y productoras de aldehído, producen colonias de un color especial.

Los medios para identificación de las bacterias, contienen sustratos específicos de prueba,

para diferenciar unas especies de otras, en base a su capacidad enzimática. Cada especie se

presenta un equipo enzimático característico de su especie.

Los medios con antibióticos: son inhibitorios para unos organismos, permitiendo aislar a

otros, a partir de una población mixta. Por ej: agar-Sabouraud con cicloheximida y

cloranfenicol, permite el crecimiento de hongos dermatofitos y de la mayoría de hongos

patógenos, e inhibe a los hongos saprófitos y a las bacterias.

Los medios de mantenimiento contienen los requerimientos necesarios para conservar las

cepas bacterianas puras en el laboratorio, haciendo resiembras periódicas.

Otros medios son muy especiales, para permitir el crecimiento de grupos poco comunes de

bacterias, como los anaerobios, las mycobacterias, los mycoplasmas, etc.

Bactrrias no cultivables que no se pueden cultivar en ninguno de los medios conocidos

hasta ahora, como las Rickettsias y Chlamydias, el Mycobacterium leprae, y el

Treponema palidum.

El material bacteriano que se inocula en el medio de cultivo se denomina inóculo. Una vez

que los microorganismos se desarrollan en el medio, el resultado es un cultivo.

Cuando se inocula un medio solidificado adicionado de agar, contenido en una caja de Petri

(medio en placa ), las bacterias pueden esparcirse en la superficie, mediante una técnica de

rayado (estriado) con el asa , en tal forma que las células queden separadas

individualmente, lejos unas de otras. Durante la incubación, cada célula bacteriana se

reproduce tan rápidamente, que en 18 a 24 hs se producen masas bacterianas visibles a

simple vista, denominadas colonias. Cada colonia presumiblemente procede de una bacteria

progenitora, cuyos individuos son de una sola especie. Una colonia que se desarrolló

separada de las otras, al ser transferida a un medio de cultivo nuevo, dará lugar a un cultivo

puro, es decir con individuos de una sola especie.

MATERIALES Y METODOS.

I. Cultivo y aislamiento de bacterias en placa, por la técnica de estría cruzada

1. Siembre por placas por separado de medio tripticasa-agar-soya o de agar-nutritivo, con

cultivos puros de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

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Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes. Para lograrlo,

desarrolle el método de siembra de la estría cruzada en placa, girando la caja al ir

rayando hasta formar un pentágono, siguiendo las indicaciones del profesor, con el fin

de ir diluyendo el inóculo. Al final de la siembra las bacterias quedarán bien separadas

unas de otras.

2. Siembre una mezcla de todas las bacterias en una placa del mismo medio y con la

misma técnica, a partir de una suspensión en caldo nutritivo o en agua destilada.

3. Invierta todas las placas, con la tapa hacia abajo y métalas a la incubadora a 37°C,

durante 24 hs.

4. Saque las placas de la incubadora y observe el crecimiento bacteriano.

5. Determine y anote los errores efectuados en la siembra, cuando no se obtuvo la

separación de las colonias.

6. Note las diferencias entre las colonias, según la especie bacteriana. Haga una tabla de

características morfológicas con los datos observados, para cada bacteria, tomando en

cuenta diámetro aproximado, color, transparencia, brillo, elevación pigmentos

Esterilización del asa

Estría cruzada

II. Cultivo en medio líquido.

1. Siembre las mismas bacterias, en tubos con caldo-tripticasa-soya inoculando una

asada de la bacteria. Deje un tubo testigo sin inocular.

2. Incube todos los tubos sembrados a 37 C por 24 hs.

3. Saque de la incubadora sin agitar los tubos. Note una turbidez, un sedimento, una

película superficial, o combinados.

4. Deduzca la causa por la que no se forman colonias en medio líquido y por qué no se

aíslan las bacterias. Anote detalladamente sus resultados en todos los experimentos.

Compare sus resultados personales con los de los otros equipos.

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Siembra en agar inclinado Siembra en caldo

ESTUDIO MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Desarrollar las técnicas microscópicas comunes para observar, teñir y medir a las

bacterias y sus estructuras.

INTRODUCCION

El tamaño tan pequeño de las bacterias no permite observarlas a simple vista, ya que su

promedio oscila entre 0.5 a 2.0 micrómetros (µm) de diámetro. En cuanto a su forma, las

bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, curvos o helicoidales. Los

extremos de los bacilos pueden ser redondos, angulares o agudos y pueden ser móviles o

inmóviles. Las bacterias esféricas (cocos) pueden presentarse solas, en pares, en tetradas,

en cadenas o en racimos. Los bacilos también pueden agruparse en dos o en cadenas.

Las características morfológicas de las bacterias se pueden apreciar mediante técnicas

microscópicas, ya sea en su estado vivo o muerto. Las ventajas del estudio directo al

microscopio de células vivas en referencia a su forma, disposición y tamaños naturales,

han sido antagonizadas por el hecho de que, el índice de refracción del protoplasma de

los microbios se acerca al del agua y por ello, las células y sus estructuras no pueden

diferenciarse en forma neta entre sí, ni del líquido en que están incluídas. El estudio

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microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes,

apreciándose su forma y tamaño.

Preparación en fresco:

Permite observar en los microorganismos la movilidad, el color, el tamaño, la forma y la

agrupación en su forma natural viva y sin alteraciones. Sin embargo, la observación es

difícil debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el índice de refracción del

medio y de los microorganismos. Este problema se resuelve utilizando el microscopio de

campo oscuro y el de contraste de fases.

- Una forma de preparación en fresco es la Preparación en portaobjetos normal

con cubreobjetos

- Otra forma es la Preparación en gota suspendida. Se utiliza un portaobjetos

excavado y un cubreobjetos.

Técnicas de tinción:

Tinción simple o directa:

Tiñen homogéneamente la célula y solo utilizan un colorante, que puede ser azul de

metileno, safranina, cristal violeta, etc.

Tinción compuesta o diferencial:

Requieren combinaciones de dos o más colorantes, como en la técnica de Gram, la de

Ziehl Neelsen, tinción de esporas, etc.

Algunas de estas técnicas permiten la demostración de estructuras específicas como

cápsula, flagelos, esporas, etc. Otras tiñen selectivamente bacterias de un grupo

específico.

Tinciones negativas:

En realidad no colorean los microorganismos, se limitan a depositarse en el campo del

rededor, delimitando las células.

MATERIALES Y METODOS

I. Preparación en fresco.

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En este tipo de preparación se perderán varios detalles de las bacterias.

1. Para el montaje en gota suspendida, unte un poco de vaselina con un palillo,

alrededor de la concavidad de un portaobjetos excavados.

2. A continuación, coloque en el centro de un cubreobjetos una gota de suspensión

bacteriana en agua y coloque encima el portaobjetos excavado, haciendo

coincidir la excavación con la gota.

3. Permita la adhesión del porta con el cubre.

4. Invierta el portaobjetos con el cubreobjetos arriba y observe al microscopio a 10

X y posteriormente a 40 X.

5. Haga dibujos de lo observado. Detalle la forma, agrupación, color, movilidad, etc.

6. Al terminar, haga una preparación en fresco entre porta y cubre, substituyendo el

portaobjetos excavados por uno normal y anote sus observaciones y los detalles

en las células, sobre todo la movilidad, comparando en las dos preparaciones en

donde se observó mejor. Diga si pudo observar la forma de las células y su

agrupación.

II. Técnica de elaboración de frotis bacterianos (antes de la tinción)

1. Queme el asa al rojo vivo en la flama del mechero y déjela enfriar en el área de

esterilidad

2. Destape un cultivo bacteriano líquido junto a la flama del mechero y tome con el asa

una gotita del cultivo, depositándola en el centro de un portaobjetos limpio; extienda con

el asa para hacer un frote.

3. Si el cultivo no es líquido, coloque una gotita de agua destilada con el asa, en el centro

de un portaobjetos. Queme el asa y déjela enfriar, tomando a continuación una poca de

la masa bacteriana de la superficie del medio, para hacer una suspensión de bacterias en

la gotita del porta. Enseguida extienda con el asa para hacer un frote.

4. Deje secar el frote al aire libre.

5. Fije la preparación con calor, pasándola tres veces sobre la flama del mechero en

forma rápida.

III. Tinciones Diferenciales

Tinción de Gram.

Esta tinción separa las bacterias en dos grandes grupos, las gram positivas que retienen el

primer colorante usado (cristal violeta) y las gram negativas que se tiñen con el segundo

colorante (safranina). Estas diferencias están basadas en la estructura y composición

química de la pared celular. Las gram positivas tienen una pared gruesa de péptidoglicano

y además, muchas de estas especies presentan ácidos teicoicos en la pared.

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Las gram negativas contienen menos péptidoglicano y su capa es mucho más delgada,

pero que está rodeada de una bicapa más externa de lípidos, llamada membrana externa.

Los mejores resultados se obtienen utilizando cultivos jóvenes de bacterias, no mayores

de 24-48 hs, pues de lo contrario los resultados son ambiguos. La pared celular es dañada

en las células viejas.

1. Prepare un frote de cada una de las siguientes bacterias: Staphylococcus aureus,

Escherichia coli y Bacillus subtilis, en cultivos de 24-48 hs.

2. Después de fijar los frotes, cúbralos con cristal violeta durante un minuto y enjuague

con agua.

3. Cubra con lugol durante un minuto y lave con agua.

4. Decolore con alcohol-acetona unos segundos y lave con agua.

5. Cubra con safranina medio minuto y lave con agua.

6. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a100 X con aceite

de inmersión.

7. Las bacterias teñidas de rojo se consideran gramnegativas; las de morado,

grampositivas.

8. Note las diferencias en la observación de bacterias teñidas con las no-teñidas.

Observación de cápsula.

La cápsula es una capa gruesa de polisacárido (ocasionalmente de polipéptido), más

externa a la pared celular, que rodea a la bacteria y está adherida a ella. Sus dos funciones

principales son favorecer su adhesión a las superficies y protegerla de los predadores. Por

ejemplo el Streptococcus mutans productor de una gran cápsula, es uno de los

iniciadores de la caries dental, debido a su capacidad para adherirse a los dientes y sus

ácidos que degradan el esmalte dental. El Streptococcus pneumoniae ataca el pulmón,

causando pneumonía cuando es capsulado y no causa enfermedad cuando pierde la

cápsula, debido a que es fácilmente fagocitado por los macrófagos. La cápsula es difícil

de teñir con los colorantes, por lo que se recurre a tinciones negativas. El campo del

rededor se tiñe con un colorante ácido, mientras que la célula se tiñe con un colorante

básico de otro color. En estas condiciones se observa como un área brillante translúcida

alrededor de la célula.

1. En el extremo de un portaobjetos coloque una gota de suspensión bacteriana de

Klebsiella pneumoniae (cultivo de 24-48 hs) en agua.

2. Adicione una gota de tinta china y mezcle con el asa.

3. Con otro portaobjetos extienda la preparación, como para realizar un frote. Deje secar

al aire libre. No se requiere fijar con calor.

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4. Cubra la preparación con safranina por un minuto y lave con agua rápidamente y con cuidado, para no despegar la preparación.

5. Deje secar al aire libre y observe al microscopio a 10 X y después a

100 X

PARED GRAM NEGATIVA PARED GRAM POSITIVA

Anote detalladamente los resultados en cada experimento e interprete los resulta

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Practica # 2

MICROFLORA NORMAL HUMANA y CONTROL DE MICROORGANISMOS

I.-MICROFLORA NORMAL HUMANA.-

OBJETIVO

Conocer la microflora normal de las diferentes partes del cuerpo y comprobar su presencia

en piel y cavidad bucal mediante técnicas de laboratorio.

INTRODUCCION.

Los microorganismos normalmente existen en diversas regiones del cuerpo y estas

poblaciones representan lo que se conoce como microflora nativa, pero su simple presencia

no debe interpretarse como indicación de enfermedad.

La contaminación microbiana del cuerpo se inicia durante el nacimiento y continúa al

respirar y al alimentarse. Abarca superficies de partes anatómicas, tales como el tracto

digestivo, el tracto respiratorio, el tracto genitourinario, la piel y oído externo. Sin embargo,

los microorganismos en todos estos lugares sólo están superficialmente y nunca en el

interior de los tejidos.

La flora normal se encuentra constantemente en un sitio dado, a una edad dada y está

compuesta por grupos relativamente fijos, permaneciendo sin alterarse. Si se le trastorna,

vuelve a restablecerse. Si la microflora normal sufre alteraciones o es eliminada, los

microorganismos patógenos pueden responder aprovechando la situación y entonces

proliferar, llegando a causar enfermedad.

Las poblaciones de esta microflora de varias regiones del cuerpo, pueden contribuir en

varias funciones útiles. Por ejemplo la flora intestinal sintetiza varias vitaminas y también

ayuda en la digestión de alimentos. Normalmente, ella tiende a desalojar formas que puedan

ser patógenas. En cualquier situación ecológica se puede lograr un equilibrio entre la flora

normal y los parásitos, sin evidencia de enfermedad.

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MATERIALES Y METODOS

I. Estudio de la flora normal bucal.

1. Con ayuda de un palillo estéril extraiga una pequeña cantidad del sarro existente entre los

dientes y con cuidado deposítela en el extremo de una placa con tripticasa-agar-soya;

enseguida proceda a extender el inóculo en la superficie con un asa bacteriológica, por estría

cruzada.

2. Con otro palillo tome otra muestra de sarro y extiéndalo en un portaobjetos para hacer un

frote. Deje secar y fije con calor. Tiña con Gram. Observe a 100 X. Haga dibujos.

3. Acerque a la boca una placa abierta de agar nutritivo y pronuncie cinco veces cada una de

las siguientes palabras: fantástico, pústula, satisfecho, chichimecas, pusilánime, ferrocarril.

II. Estudio de la flora normal de la piel.

1. Con un hisopo estéril humedecido en s.s.f. estéril, frote la palma de la mano y deposite el

inóculo en una placa de tripticasa-agar-soya, extendiendo después con el asa por estría

cruzada.

2. Lave con agua la misma mano y sin secar, nuevamente frótela con otro hisopo estéril,

depositando el inóculo en otra placa de agar nutritivo y extendiendo con el asa por estría

cruzada.

3. Incube todas las placas sembradas a 37 C por 24 hs. y compare la abundancia del

crecimiento bacteriano, en los diferentes experimentos. Compare también los diferentes

tipos de crecimiento bacteriano, y determine si hay variaciones en las diferentes cajas. Haga

deducciones.

II.- CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVO

Desarrollo de técnicas de laboratorio para comprender la diferencia entre esterilización y

desinfección y determinar la sensibilidad microbiana a diferentes agentes físicos y

químicos.

INTRODUCCION

Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por agentes físicos,

procesos físicos o agentes químicos.

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En los métodos de esterilización queda implícita la destrucción total de todas las formas de

vida.

En la desinfección no se logra la destrucción total.

Un agente físico es una condición física o propiedad física que causa un cambio. La

temperatura, la presión y la radiación son ejemplos de agentes físicos que actúan sobre los

microorganismos. Los filtros los retienen. Mediante los procesos físicos se causan

cambios en los microorganismos, por ejemplo la esterilización y la incineración que los

conducen a la muerte. En la higienización, por ejemplo el lavado, los desprende de los

materiales.

Un agente químico es una sustancia (sólido, líquido o gas) que se caracteriza por una

composición molecular definida y que causa una reacción en los microorganismos, por

ejemplo los compuestos fenólicos, los alcoholes, el cloro, el yodo y el óxido de etileno.

Dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición, los daña o los mata

3. Incube a 37 C por 24 hs. mida el radio de inhibición alrededor de cada círculo de papel

para cada compuesto y compare entre las dos bacterias probadas. Determine si hay

diferencias en el efecto del mismo compuesto para las dos bacterias.

4. Forme una tabla con los datos del MATERIALES Y METODOS.

I. Factores Físicos:

A: Efecto del calor sobre la viabilidad bacteriana.

1. Para iniciar el experimento se contará con un cultivo líquido de E. coli y uno de Bacillus

subtilis. Enseguida siembre con una bacteria la mitad de una placa de agar nutritivo por

estría contínua cerrada. En otra caja siembre la mitad con la segunda segunda bacteria.

2. A continuación coloque los frascos de los cultivos líquidos en un baño María a 70 C por

10 min. y después sáquelos.

3. Ahora, con cada uno de los cultivos calentados siembre la otra mitad de cada placa.

4. Incube las placas sembradas a 37 C por 24 hs. Compare la abundancia del crecimiento en

las cajas sembradas, antes y después de calentar.

II. Actividad bacteriostática o bactericida de algunos compuestos:

1. Siembre la superficie de una placa totalmente por medio de un hisopo impregnado de

una suspensión bacteriana de S.aureus. Haga lo mismo en otra caja con E. coli.

20

2. Distribuya varios círculos de papel (5 círculos por caja) impregnados con antisépticos,

limpiadores comerciales y domésticos, colorantes, desinfectantes, jabones, antibióticos, etc.

Deben ser los mismos para las dos bacterias.

halo de inhibición medido en mm. para hacer las comparaciones.

Anote detalladamente los resultados en cada experimento e interprete los resultados.

21

PRACTICA # 3

COCOS GRAMPOSITIVOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Aprender a aislar e identificar los cocos grampositivos.

INTRODUCCION

El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de la flora normal, incluyendo

estreptococos, estafilococos, neisserias, difteroides, levaduras y bacilos entéricos

Gramnegativos. Los cocos grampositivos patógenos se aíslan en agar enriquecido y

suplementado con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica,

parcial (alfa hemólisis) o total (beta hemólisis)

El género Staphylococcus se separa de otros cocos grampositivos por sus propiedades

microscópicas, morfológicas coloniales y bioquímicas. S. aureus es el único coagulasa

positivo y forma grandes colonias cremosas y frecuentemente con pigmentación amarilla si

se incuba a temperatura ambiente y es beta hemolítico. Es muy resistente a la acción del

calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes químicos, sobrevive semanas o

meses en el polvo, pus o esputo. Es altamente tolerante a altas concentraciones de sales,

sobreviviendo en alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de

3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Es resistente a la penicilina. A diferencia de

aquél, S. epidermidis es coagulasa negativo, no-hemolítico.

El género Estrerptococcus antigénicamente, presenta 13 grupos (clasificación de

Lancefield) en base al carbohidrato C de la pared celular y son denominados de la A a la O.

Los estreptococos del grupo A, también denominados Streptococcus pyogenes forman

colonias de 1-2 mm, sin color, muy transparentes, beta hemolíticas y son los más

virulentos. La proteína M es el principal antígeno en las cepas virulentas. Son sensibles a la

Bacitracina. Sobreviven semanas en esputo u otras excretas y meses en sangre o pus.

Los estreptococos del grupo B incluyen a S. agalactia y dan la prueba de CAMP positiva:

una hemólisis marcada en forma de punta de flecha en el punto de unión de su crecimiento

con S. aureus.

El Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB.

22

El Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y

desarrolla colonias de 1-3 mm, apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y

beta hemolíticas en anaerobiosis. Las cepas virulentas dan colonias mucoides debido a que

presentan una gran cápsula, lo que constituye su factor de virulencia.

Es difícil de mantener en las resiembras. Es sensible a la Optoquina.

MATERIALES Y METODOS

1. Tome un exudado faríngeo de un compañero con un hisopo estéril en la forma

tradicional y deposite la muestra en el extremo de una placa de agar sangre. Extienda el

inóculo con un asa por estría cruzada. Incube a 37 C por 24 hs.

2. El resto de la muestra que quedó en el hisopo deposítelo en un portaobjetos y haga un

frotis. Tiña con gram.

3. Simultáneamente, Haga un Gram de cepas puras de Staphylococcus aureus,

Staphylococcus sp, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Observe al

microscopio.

4. Siembre las cepas puras en agar sangre. Incube a 37 C por 24 hs.

5. Haga una tinción de Gram con las cepas puras.

6. Determine en todas las placas sembradas, cuáles colonias produjeron hemólisis y de

qué tipo.

7. Haga un gram de las colonias del exudado.

8. Para la cepa pura de S. aureus y las colonias semejantes a S. aureus o a Staphylococcus

sp., desarrolladas del exudado faringeo, haga la siguientes pruebas:

- Prueba de la catalasa (tome una colonia bien aislada con el asa estéril y sumérjala

en una gota de agua oxigenada. Observe una efervescencia por desprendimiento del

O2).

- Prueba de la coagulasa: Con el asa estéril obtenga una colonia beta hemolítica

bien aislada y mézclela con 0.5 ml de plasma. Incube a 37 C por 30 min. y lea el

resultado. Si hay coagulación del plasma, es coagulasa positivo.

- Cultivo en medio sal-manitol. Tome con el asa estéril una colonia bien aislada,

beta hemolítica y siémbrela en una placa de sal-manitol-agar por estría cruzada. Incube

a 37 C durante 24 hs. Observe el desarrollo de colonias color dorado y el cambio

de color del medio a amarillo. Esto, debido a la fermentación del manitol y

acidificación.

9. Para S. pyogenes (estreptococos del grupo A) y en las colonias semejantes del exudado,

determine su sensibilidad a la Bacitracina. Para ello siembre una colonia bien aislada en

la mitad de una placa de agar-sangre y coloque un círculo de papel filtro impregnado

con Bacitracina

10. En el otro sector de la caja , coloque un círculo impregnado con Trimetroprim para

determinar su resistencia. Incube a 37 C por 24 hs. Determine el diámetro del halo de

23

inhibición alrededor de cada antibiótico para determinar la sensibilidad.

11. Para la identificación del estreptococo beta hemolítico del grupo B (Streptococcus

agalactiae), realice la prueba de CAMP:

- Tome una colonia beta hemolítica con el asa y siémbrela en una sola línea

perpendicular a otra línea previamente sembrada con S. aureus. Incube a 37

C por 24 hs.

- Determine si hubo hemólisis en forma de punta de flecha, en el lugar donde

se unen las dos bacterias.

12. Para identificar S. pneumoniae y en las colonias semejantes determine su

susceptibilidad a la optoquina, colocando un círculo de papel impregnado con el

antibiótico en un medio con agar-sangre donde se sembró la bacteria. Incube a 37 C por

24 hs. Mida el halo de inhibición para determinar la sensibilidad.

Prueba de Camp Prueba de Bacitracina, Optoquina y camp

24

Diagnóstico

Anote detalladamente y analice los resultado

25

PRACTICA # 4

ENTEROBACTERIAS

Objetivo.- Desarrollar las técnicas de aislamiento e identificación de enterobacterias, comprendiendo el significado de las pruebas bioquímicas.

INTRODUCCION

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, anaerobios

facultativos que fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo oxidasa negativos;

reducen los nitratos a nitritos. Cuando son móviles son flagelados peritricos. Son

llamadas enterobacterias porque con frecuencia residen en el aparato digestivo de

animales y humanos, pero algunas especies también viven en la tierra y en el agua.

Incluye los géneros Escherichia, Shigella, Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter,

Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella, Proteus, Providencia, Yersinia,

Erwinia y Pantoea. La mayoría forman parte de la flora normal o son bacterias

ambientales, a excepción de los géneros Salmonella, Shigella y Yersinia, quienes son

causantes de infecciones gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces,

es muy probable que estén causando daño.

Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen

enfermedades como neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia, infecciones

neonatales, infecciones de heridas y de cirugías. Se comportan como patógenos

oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.

A semejanza de las enterobacterias, los géneros Campylobacter y Helicobacter causan

enfermedades gastrointestinales. Campylobacter es un bacilo curvo gramnegativo,

microaerofílico, con un solo flagelo polar. Causa enteritis aguda.

Helicobacter es un bacilo un poco curvo, microaerofílico, con flagelos polares múltiples.

Requiere medios específicos para cultivarse. Causa gastritis crónicas y úlceras gástricas y

duodenales.

MATERIALES Y METODOS.

Aislamiento en medios selectivos:

.

- A partir de una cepa pura siembre por estría cruzada placas de SS, EMB y

agar-verde-brillante, descargando la muestra con el asa en un extremo de la

caja y extendiendo después. Incube 24 hs a 37o C.

26

- En agar-verde brillante todas las salmonellas, excepto S. typhi, forman

colonias rojas o rosas a las 48 hs de incubación. El Proteus mirabilis forma

colonias amarillas o amarillo-verdosas con un halo amarillo verdoso. E. coli

no crece.

- En EMB E. coli forma colonias negruzcas o moradas, usualmente con brillo

verde metálico. Las shigellas producen colonias sin color

- En SS el Enterobacter forma colonias rojas o rosas a las 24 hs. Salmonella

forma colonais sin color con centro negro. E. coli crece poco.

1. Haga un Gram de las colonias obtenidas y compruebe que son de bacterias

gramnegativas.

II. Pruebas bioquímicas para la identificación de enterobacterias:

Elija las colonias de enterobacterias a partir del desarrollo en las placas de medio

selectivo sembradas con la cepa. Cada tipo diferente de colonia deberá sembrarse en

todos los medios para pruebas bioquímicas.

A. Medio Doble azúcar Agar Kligler (fermentacion de lactosa y dextrosa) en tubo

inclinado (medio de color naranja):

1. Con una asa normal con anillo, se toma una colonia bien aislada y se siembra por

estría en la superficie de agar del tubo

2. Usando una asa recta sin anillo, tome otra colonia igual a la anterior y siembre por

picadura en el centro del tubo, sin tocar el fondo, cuidando que no le tiemble la mano.

Incube 24 hs a 37o C. Al cabo de este término, la fermentación de la glucosa ocurre

en anaerobiosis hasta ácido, lo cual se manifiesta por un cambio de color del

indicador de pH en el medio, de rojo a amarillo en el fondo del tubo. La

degradación de la lactosa en aerobiosis es indicada por un color amarillo en la

superficie del agar.

B. Medio de SIM en tubo (color beige):

A partir de una colonia siembre un tubo por picadura en el centro, sin tocar el fondo,

cuidando que no le tiemble la mano e incube 24 hs a 37o C.

- La producción de sulfuros toma lugar a partir r de aminoácidos con azufre y

es indicada por la aparición de un color negro

- La movilidad positiva es demostrada al crecer la bacteria homogéneamente

en todo el medio, observándose una turbidez

27

- La producción del metabolito indol es indicada por un anillo de color rojo

que se forma después de adicionar unas 2 o 3 gotas del reactivo de Kovacs.

C. Medio MIO en tubo (color café):

Siembre una colonia por picadura en el centro e incube igual. El indicador de pH en el

medio cambia de color, de café a color violeta al alcalinizarse, lo que indica la

descarboxilación de la ornitina por la enzima ornitína descarboxilasa

D. Citrato como única fuente de carbono (color verde) en tubo inclinado:

Siembre una colonia por estría en la superficie del agar e incube igual. El crecimiento y

el cambio de color del indicador de pH a azul en condiciones alcalinas, indica la

utilización del citrato positiva.

E. Urea (color beige) en tubo inclinado.

Se siembra por estría y se incuba igual. La aparición de un color fucsia(rosa mexicano)

en el medio, indica la acción de la ureasa y alcalinización del medio. El indicador de pH

se torna rosa en condiciones alcalinas.

F. Fenil alanina

Se siembra en la superficie y por picadura, se agrega después de la incubación cloruro

férrico, interpretándose como positivo si da una coloración verdosa. O desanimación de

la fenil alanina

G. Lisina Iron Agar (LIA)

Se siembra por estría en la superficie y por picadura Alcalino toma color violeta, acido,

color amarillo. Se utiliza para conocer la acción de la Lisina descarboxilasa

H. Voges proskawer

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar

la glucosa con producción de acido por la vía acido-mixta o con producción de acetoína

por la via butanodiólica.

Haga una tabla de resultados y compare con los datos de la literatura. La identificación de

las bacterias encontradas puede efectuarse hasta género o hasta especie, según el número

de datos. Una vez identificada la bacteria, investigue las enfermedades que ocasiona.

28

29

II.- VIROLOGIA.

INTRODUCCION.-Los virus varían en tamaño en un rango desde menos de 100

nanómetros en diámetro a varios cientos de nanómetros en longitud en el caso de los

filoviridae

Todos los virus contienen un genoma de ácido nucleico (ARN o ADN) y una capa

proteínica protectora (llamada cápside). Al conjunto del genoma y cápside se le llama

nucleocápside y la misma puede tener forma icosaédrica, helicoide o compleja. Los virus

pueden o no tener envoltura. Los virus envueltos obtienen sus envolturas por gemación a

través de las membranas de las células huésped. En algunos casos, los virus atraviesan la

membrana plasmática pero en otros casos, la envoltura puede provenir de otras

membranas como del aparato de Golgi o el núcleo. Algunos virus, geman a través de

porciones especializadas de la membrana plasmática de la célula huésped.

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden

clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del

virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de

anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas

30

serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas.

Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten

precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear

nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de

ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo

de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la

identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad.

31

PRACTICA #1

DIAGNOSTICO DE VIRUS HUMANOS.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Que el alumno conozca teóricamente los principales métodos de diagnóstico de virus

humanos.

INTRODUCCION.

Los virus son organismos tan pequeños, que su tamaño les permite pasar a través de los

filtros que retienen bacterias. Las características básicas para identificar a un virus son: la

composición del ácido nucleico, la disposición de la cápside, la presencia o ausencia de una

envoltura, el tamaño del virus y el huésped.

MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO:

Las muestras deben tomarse precozmente en la fase aguda de la infección. Deben trasladarse

al laboratorio a la mayor brevedad posible, en medio de transporte. Las muestras más

comunes son:

- Torundas nasofaríngeas:

Adecuados para el diagnóstico de enterovirus, adenovirus, y herpes simplex. Las

nasofaríngeas se prefieren para el virus respiratorio sincitial y la mayoría de los otros

respiratorios. Las nasales son las mejores para los rinovirus.

- Aspirados faríngeos:

son mejores que los hisopos (torundas) nasofaríngeos, pero estos últimos son más prácticos.

- Torundas rectales y muestras de heces: en virus no cultivables, como rotavirus, o

adenovirus, que se detectan por microscopía electrónica o con técnicas de detección de

antígenos.

- Secreciones, Sangre o Líquido cefalorraquídeo. Como en los virus VIH, Hep. B y C

- En algunas virosis excepcionalmente el diagnóstico solo puede efectuarse en Biopsia de

cerebro, como en la encefalitis por herpes simplex; en Huéspedes inmunodeprimidos y con

citomegalovirus, el virus solo puede identificarse en el órgano afectado.

DIAGNOSTICO VIRAL

1. Métodos para detectar virus.

1.1. Observación del efecto citopático, en cultivo de tejidos inoculados con ciertos virus.

32

La etiología de un determinado síndrome viral puede demostrarse recuperando el agente

causal en tejidos celulares de diversos tipos (por ej: riñón de mono, pulmón humano fetal,

amnios humano o células tumorales humanas). Los huevos embrionados actualmente solo se

utilizan para cultivar el virus cuando se desea preparar vacunas. El empleo de animales de

experimentación es excepcional en el diagnóstico.

- Las células primarias de riñón de mono son excelentes para cultivar mixovirus,

paramixovirus y muchos enterovirus; también para algunos adenovirus.

- Las células diploides fetales humanas son células fibroblásticas en las que crece un

amplio espectro de virus, como el de herpes simple, varicela zoster, adenovirus,

picornavirus, y sólo en éstas pueden cultivarse los citomegalovirus.

- Las células HEP-2 son epiteliales provenientes de un cancer humano, útiles para recuperar

el virus respiratorio sincitial, adenovirus, y herpes simple.

- Células mononucleares normales normales humanas de sangre periférica, que no suelen

estar disponibles, permiten el cultivo del virus ( SIDA) de la inmunodeficiencia, el

coxsackie A y los togavirus.

El crecimiento de un virus se detecta mediante la observación de cambios en la monocapa

del cultivo celular, denominado efecto citopático (ECP). Cuando aparecen cambios en la

morfología celular, lisis celular, vacuolización, formación de cincitios y existen cuerpos de

inclusión, se produce un efecto citopático característico. Los cuerpos de inclusión son

cambios histológicos que se producen en las células por los componentes virales o por

variaciones en las estructuras celulares.

Un técnico experto puede distinguir los efectos citopáticos característicos de las principales

familias de virus. Según el cultivo celular en el que aparece el ECP y el tipo de crecimiento

viral, se puede realizar un diagnóstico de presunción de un gran número de virus de

importancia clínica.

Algunos virus no producen rápidamente ECP en las líneas celulares que se suelen utilizar en

los laboratorios de virología clínica. No obstante se pueden determinar por otras técnicas,

como la interferencia en la replicación de otros virus (por ej. los picornavirus no pueden

replicarse en células previamente infectados con el virus de la rubeola, lo que se denomina

interferencia heteróloga).

33

1.2. Fijación de eritrocitos en cultivos celulares infectados con virus. En el caso de virus

que dan lugar a este fenómeno, como mixovirus o virus de la parotiditis, se observa una

hemaglutinación al adicionar eritrocitos a la monocapa de células.

1.3. Detección de antígenos virales. Cuando los virus se pueden detectar antes de

desarrollar el efecto citopático, se utilizan anticuerpos monoclonales dirigidos contra

antígenos tempranos y técnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa.

1.4. Inmunofluorescencia directa, Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares...

1.5. Detección de ácidos nucleicos virales por reacción de polimerasa en cadena, las cuales

permiten amplificar una porción pequeña de ácido nucleico en un período de tiempo corto.

1.6. Microscopía electrónica.

Cuando algunos virus comunes no se aíslan con los métodos de cultivo habituales, ni pueden diagnosticarse por técnicas serológicas, pueden estudiarse con otras técnicas, como la microscopía electrónica. Tal es el caso de los calcivirus, los minirrotavirus, los astrovirus y los parvovirus del cerebro. Sin embargo, hay tres grandes dificultades para su uso: el instrumento es caro y es difícil su mantenimiento. Por otro lado, deben estar presentes grandes cantidades de particulas virales en la muestra para poder detectarse. Finalmente, la morfología no es suficientemente diferencial para un diagnóstico preciso.

2. Métodos para detectar anticuerpos específicos virales.

La mera presencia de anticuerpos específicos en contra de un determinado virus, no permite

el diagnóstico de dicha infección. Debe tomarse en cuenta el cambio en los títulos en un

34

lapso corto de tiempo, o ver si hay seroconversión. En muchas virosis la presencia de IgM

sugiere infección reciente.

2.1. Fijación de complemento:

Es una técnica estándar, pero de difícil ejecución. La muestra se procesa con el antígeno o el

anticuerpo y el complemento; el complemento residual se determina mediante la lisis de

eritrocitos cubiertos de anticuerpos que actúan como indicadores. Los anticuerpos medidos

por este método se suelen desarrollar tardíamente en el desarrollo de la enfermedad. Los

miembros de algunos grupos como adenovirus, influenza A y B, poseen antígenos comunes

que se detectan por este método. Los demás grupos deben analizarse individualmente.

2.2. Neutralización:

Cuando se incuba un virus con anticuerpos homólogos específicos de tipo, el virus no es

capaz de producir la infección en un sistema de cultivos celulares indicadores. La respuesta

de anticuerpos neutralizantes es específica del tipo de virus y se desarrolla al comienzo de

los síntomas, elevándose los títulos rápidamente durando mucho tiempo.

2.3. Inhibición de la hemaglutinación:

Se puede realizar con diversos virus que aglutinan selectivamente los eritrocitos de varias

especies animales (por ej: pollo, cobaya y humanos). La capacidad de hemaglutinación del

suero se inhibe por el suero humano específico. Los anticuerpos inhibidores de la

hemaglutinación se desarrollan tras el comienzo de los síntomas, posteriormente se elevan y

al final disminuyen. Esta prueba es útil para detectar virus de rubeola y para determinar el

estado inmunitario.

2.4. Ensayo inmunoenzimatico ( prueba de elisa)

Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color característico.

En el caso de la fosfatasa la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color. Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para

35

leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más objetiva. Fig. 2.

2.5. Método de Aglutinación

El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para la detección de antígenos virales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.

El test de aglutinación ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces (el más importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápida y barata. También se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.

En las reacciones de aglutinación el antígeno es una célula o una partícula. la adición del

anticuerpo homólogo provocará la aglutinación o la agregación, dando como resultado la

formación de agregados visibles de células o partículas. Pueden llevarse a cabo en

portaobjetos o en tubos de ensayo. La mayoría de estas pruebas se efectúan en tubo, con

diluciones seriadas del suero conteniendo el anticuerpo (antisuero), añadiendo una cantidad

fija del antígeno (la célula o la bacteria). Después de la incubación se observa la formación

de agregados, determinándose el título.

El título es un valor relativo representado por el recíproco de la máxima dilución que

provoca aglutinación. Por ejemplo, si un antisuero aglutina a una dilución 1:256, pero no a

1:512, su título es 256.

Ejemplo de esta técnica es la Prueba de Vidal para diagnóstico de Salmonella, la Prueba de

Weill-Felix para Rickettsias, etc.:

Prueba de Reacciones febriles:

Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de ciertas

infecciones con acceso febril, causadas por bacterias. Son reacciones de aglutinación entre

los antígenos de Salmonella, Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antígenos

presentes en el suero del paciente.

Esta técnica comprende:

- Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea, entérica y ondulante. La

reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensión de

antígenos conocidos de Salmonella typi , S. paratyphi A y S. paratyphi B.

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- Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus, B.suis o B. melitensis).

- Reacción de Weil-Felix para el tifo. Las especies de Rickettsias que causan tifo, tienen

componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19, OX-2 y OX-K). En esta

prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo.

Antígenos comerciales:

Brucella (B. abortus) Paratífico B (flagelar)

Tífico O (somático) Tífico H (flagelar)

Paratífico A (flagelar) Proteus OX-19

Obtención de la muestra sanguínea:

1. Se revisan ambos brazos del paciente para localizar una vena adecuada.

2. En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule látex, aproximadamente a 6 cm por

encima de la vena.

3. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje secar antes de

sangrar, para evitar posibles reacciones alérgicas y que no arda.

4. Introduzca la aguja del vacutainer paralelamente a la vena para no perforarla, cuidando

que el en el bisel de la aguja, el orificio quede hacia arriba.

5. Se introduce el tubo para recolección de muestra, en el soporte del vacutainer y

automáticamente se obtendrán 3 ml.

6. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga más sangre del

paciente.

7. Deje coagular la sangre y centrifugue.

8. Separe el suero con una pipeta pasteur y deposítelo en un tubo limpio, para las pruebas

serológicas.

PRUEBA CUANTITATIVA

Pozo # ml Suero Antígeno Aglutinación Título

problema

ml

1……………..0.08………………….1 gota……….. 4+……………1:20

2……………..0.04………………….1 gota……….. 4+……………1:40

3 …………….0.02………………….1 gota………...3+……………1:80

4 …………….0.01………………….1 gota………...2+……………1:160

37

5 …………….0.005 ………………..1 gota ………..1+……………1:320

6……………..suero…………………1 gota………...3+……………1:80

control(+)

0.02

7……………. Suero…………………1 gota……….no debe mostrar aglutinación

control(-)

0.02

Interpretación de los resultados: Se observa la aglutinacion macroscópica y se valoran los

resultados en la siguiente forma:

4+ 100% aglutinación

3+ 75 % "

2+ 50 % "

1+ 25 % "

0 -

Los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas 1:80 o mayor. Pueden

persistir por meses o años.

Un título tífico somático (O) significativo es 1:80, pero mayor es importante.

Para el tifo, el menor título significativo es 1:80. Un aumento cuádruple se considera

importante.

Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete días. Si en la

segunda muestra se encuentra un título más elevado que en la primera, indicará una

infección activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un título menor que

en la primera, indica que el paciente está en recuperación y los anticuerpos detectados son

de memoria.

Anote el resultado de las pruebas febriles, por ejemplo tífico “O” positivo 1:80, Proteus

negativo, etc.

Discuta los resultados, indicando en las reacciones positivas, cómo se puede saber

en base al título obtenido, si el resultado de una titulación alta es a consecuencia de

una enfermedad activa o de inmunoglobulina (IgG) de memoria.

38

En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre

células o sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen. Entre los extraños

se incluyen células de otros organismos, virus, bacterias, toxinas, toxoides, vacunas, etc.

Cuando estos materiales penetran en el organismo son reconocidos como sustancias

extrañas.

La Inmunología estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del hospedador

frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la inmunidad adquirida

específica. Las células germinales de la médula ósea que participan en las respuestas

inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles poblaciones de linfocitos:

1.- Linfocitos B, o Células B. Reciben ese nombre, porque las células precursoras

maduran en un pequeño órgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en las aves (en los

mamíferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de Peyer del tracto digestivo)

y se transforman en linfocitos B. Sólo el 20 % de los linfocitos circulantes son Células B; el

resto de las células están en el tejido linfoide. Viven días o semanas. Las Células B son las

responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el

antígeno, originan células plasmáticas productoras de anticuerpos. También pueden originar

células con memoria, linfocitos de larga supervivencia que están en reposo después de haber

sido estimulados por un antígeno; cuando se renueva el contacto con un antígeno igual,

producen la llamada "respuesta secundaria" que es más rápida y vigorosa que la "respuesta

primaria", porque hay una mayor y más rápida producción de anticuerpos. El resultado es

que el individuo responda con mayor prontitud e intensidad a una segunda exposición al

antígeno.

2.- Linfocitos T, o Células T, que también se originan a partir de precursores producidos en

médula ósea por las células germinales. Se desarrollan en el Timo, de donde toman su

nombre. Abandonan el timo y se concentran en bazo, ganglios linfáticos y también van a la

sangre. Viven durante varios meses. Como consecuencia de la activación antigénica, los

Linfocitos T dan lugar a las células Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria

celular. Los linfocitos T participan en la muerte o eliminación de materiales extraños y

microorganismos invasores, e incluso células cancerosas. Son las principales responsables

del rechazo de trasplantes y de reacciones alérgicas cutáneas. Se encargan de movilizar a los

macrófagos en la destrucción de patógenos y de estimular a las células B para intensificar la

producción de anticuerpos (hay una "cooperación celular").

Aunque más difícil de medir, la inmunidad celular también está reforzada por una segunda

exposición a un antígeno, lo que es representado por una nueva y mayor población de

células T con memoria, capaces de responder a la segunda aparición del antígeno.

En el laboratorio clínico, la Serología permite el estudio de las reacciones antígeno-

anticuerpo que se encuentran en el suero sanguíneo. Las reacciones serológicas son

39

específicas entre un antígeno y un anticuerpo y pueden ser usadas para el trabajo de

diagnóstico. Cuando uno de los componentes es conocido, el desconocido puede ser

detectado con un alto grado de sensibilidad y exactitud. Las pruebas serológicas de reacción

antígeno-anticuerpo, amplían la capacidad diagnóstica del clínico y orientan la terapéutica.

Hay muchas técnicas disponibles.

Anote detalladamente y analice los resultados

40

PRACTICA #2

BACTERIOFAGOS

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El alumno aprenderá a manejar los fagos en el laboratorio y conocerá su importancia en la Microbiología.

INTRODUCCION.

Las bacterias son huéspedes de un grupo especial de virus denominados bacteriófagos o "fagos". Los fagos constituyen modelos ideales para estudios sobre la infección a nivel celular, la relación huésped parásito, la multiplicación viral y, estudios de ingeniería genética. Por otro lado, también son muy útiles en la tipificación de cepas bacterianas.

1. Fagos lisogénicos, también denominados moderados o temperados:

aquí el genoma del fago se replica sincrónicamente con el cromosoma bacteriano, pasando a la progenie. En este estado lisógeno, los fagos integrados al cromosoma bacteriano adquieren genes de la bacteria durante su separación. Estos genes permiten a la bacteria lisógena expresar nuevas actividades y producir nuevas proteínas.

El genoma del fago lisógeno puede modificar la estructura del polisacárido bacteriano y su antigenicidad, o puede codificar la producción de toxinas bacterianas que causan enfermedades como la difteria, la escarlatina, el botulismo.

2. Fagos líticos: se replican dentro de la bacteria huésped y la lisan, liberando nuevos fagos. Los fagos más estudiados hasta ahora son los de Escherichia coli, mismos que se han designado con la letra T y diferentes números. Los fagos virulentos al destruir a las bacterias producen placas de lisis que se tornan evidentes en cultivos de placas de agar.

41

MATERIALES Y METODOS.

I. Prueba cualitativa.

1. Siembre una placa de agar-cerebro-corazón, depositando en la superficie 0.2 ml de una suspensión de Escherichia coli, que será el huésped específico del fago.

2. Enseguida distribuya el inóculo homogéneamente con un asa bacteriológica.

3. A continuación, marque 4 puntos separados en el reverso de la misma caja y en cada uno deje caer una gotita de suspensión del fago T7, usando una pipeta Pasteur.

4. Incube a 37 C por 24 hs.

5. Observe las áreas circulares sin crecimiento de la bacteria, equivalentes a zonas de bacterias lisadas por replicación del fago.

II. Prueba cuantitativa por dilución en placa.

1. Haga diluciones de una suspensión del fago en la forma siguiente: En un tubo estéril coloque 0.5 ml del fago, más 4.5 ml de caldo cerebro corazón (c.c.c.).

2. De ahí transfiera 0.5 ml a otro tubo conteniendo 4.5 ml de solución salina fisiológica y continúe haciendo diluciones con s.s.f. hasta obtener una dilución de 1:1000 000.

3. De cada dilución del fago, transfiera 0.1 ml a tubos conteniendo 0.l ml de la bacteria. Mezcle e incube a 37 C por 20 min.

4. Al cabo de este tiempo adicione a cada tubo 4 ml de a.c.c. blando (0.5%), mezcle y vacíe en cajas de Petri estériles con a.c.c

5. Deje solidificar e incube a 37 C durante 24 hs. Determine las calvas y cuéntelas.

6. Para calcular el número de partículas virales /ml, cuente el número de placas líticas en las cajas de cultivo que presenten pocas placas y aplique la siguiente fórmula:

42

UFP / ml = PV x FD

PV = número de placas virales

FD = Factor de dilución de la caja de Petri

UFP / ml = unidades formadoras de placas, por ml de suspensión original del fago.

43

PRACTICA # 3

DIAGNOSTICO SEROLOGICO

DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Que el alumno desarrolle una técnica serológica para diagnosticar el VHB en suero humano

y comprenda el fundamento para poder interpretar los resultados.

INTRODUCCION

El virus de la hepatitis B es el miembro más importante de los Hepadnavirus. Infecta el

hígado y posiblemente el páncreas, pero solo de humanos y chimpancés. El virión completo

es una partícula esférica de 42 nm de diámetro. La principal proteína es el antígeno de

superficie (HBsAg). La nucleocápside contiene el ADN circular, parcialmente bicatenario,

una ADNpolimerasa y el antígeno del "core" (HBcAg). En la superficie de este antígeno se

expresa otro, llamado antígeno "e" (HBeAg) y es uno de los principales constituyentes de la

cápside.

El suero de los individuos infectados muestra más partículas virales incompletas, que

viriones; por microscopía electrónica se pueden observar tres tipos de partículas, compuestas

de proteína, lípidos y carbohidratos, pero sin contener ácido nucleico:

1) Partículas completas de 42 nm, 2) partículas esféricas de 22 nm y 3) partículas tubulares

de longitud variable hasta de 200nm.

El antígeno de superficie (HBsAg) se halla en la cubierta y en la superficie de las partículas

esféricas y filamentosas y éste mismo induce la aparición de una inmunidad protectora; está

compuesto por lípidos y por siete o más polipéptidos que contienen los determinantes

específicos de grupo y de tipo del VHB.

Las infecciones agudas y crónicas se diferencian entre sí por la prevalencia del HBsAg en el

suero y por el patrón de anticuerpos frente a los antígenos HBs y HBc. Los linfocitos B no

pueden fabricar anticuerpos hasta que no detectan los antígenos y, por otro lado, los

anticuerpos unidos a los antígenos en forma de complejos no se pueden determinar. Los

antígenos HBsAg y HBeAg pueden detectarse en el laboratorio.

En la mayoría de los casos de hepatitis aguda por virus B, el HBsAg desaparece en pocas

semanas o meses. La persistencia del HBsAg por más de 6 meses sugiere un estado de

portador. Conforme el título de HBsAg declina en la hepatitis aguda, empiezan a aparecer

anticuerpos contra HBsAg (es decir anti-HbsAg). Estos anticuerpos son neutralizantes y su

ausencia correlaciona con estado de portador.

44

El VHB resiste el éter, los pH reducidos, la congelación y temperaturas moderadamente

altas, lo que facilita su transmisión de un individuo a otro mediante sangre, vía percutánea y

contacto personal íntimo.

MATERIALES Y METODOS

Prueba serológica de hemaglutinación inversa para la detección del antígeno de

superficie del Virus de la Hepatitis B (antígeno HBs).

En la hemaglutinación inversa, se cubren eritrocitos de pollo con anticuerpos antihepatitis B

de superficie, previamente preparados en cobayos. En esta técnica se buscan antígenos en el

suero, a diferencia de la hemaglutinación directa , donde se buscan anticuerpos en el suero.

Esta prueba se basa en el principio de hemaglutinación inversa de eritrocitos de pollo

sensibilizados con inmunoglobulina (IgG altamente purificada) anti-HBs, obtenida de

cobayos. Esta aglutinación inversa es específica cuando existe antígeno de HBs en el suero

(o plasma) de prueba. Esta técnica ofrece varias ventajas prácticas, en comparación con

otras, ya que detecta al antígeno con mayor sensibilidad. Es sencilla y no requiere mucho

tiempo (aproximadamente una hora) y se puede leer a simple vista.

Reactivos:

B. Reactivo de absorción: Buffer de fosfatos salino que contiene suero normal de

conejo y de cobayo para diluir la muestra de suero, así como para reconstituir las Células

Sensibilizadas y las Células Control.

C. Células Sensibilizadas con Anticuerpos (liofilizadas):

Contiene eritrocitos de pollo, sensibilizados con inmunoglobulina anti-HBs. Para la

reconstitución agregue la cantidad especificada de diluyentes de absorción en el momento

de usarse.

D. Células Control (liofilizadas):

Preparación de eritrocitos de pollo sensibilizados con IgG normal de cobayos. Para la

reconstitución agregue la cantidad especificada de diluyente de absorción en el momento de

usarse.

E. Suero Control (líquido):

Una dilución 1:10 de suero humano positivo inactivado (con título de 1:320) para el

antígeno HBs que contiene alrededor de 20 ng/ml de antígeno HBs.

F. Absorbente (liofilizado):

Debe usarse para la absorción del suero de prueba. En el momento de usarlo agregue la

cantidad especificada de diluyente de absorción.

45

Procedimiento:

1. Preparación del suero problema: 3 ml de sangre del paciente se deja coagular y se

centrifuga. El suero no debe contener eritrocitos ni otros componentes visibles del plasma.

2. Ejecución de la prueba Cualitativa: Realice la prueba en una microplaca, usando dos

pozos para cada muestra:

Pozos

I II III

Dilu 100 µl 25 µl 25µl

yente

Suero 25 µl ------->25 µl ---> 25 µl ---->25 µl descartar

problema

Células - 25ul -

control

Células - - 25ul

sensibi

lizadas

Agite durante 5 min y enseguida cubra la placa para evitar la evaporación. Deje reposar 1

hora a temperatura ambiente.

Interpretación de los resultados: la prueba es positiva, cuando se observa:

a) asentamiento de los eritrocitos en forma de anillo mayor en diámetro y más delgado

que el del control.

46

b) eritrocitos aglutinados dispersos uniformemente en el fondo.

CUESTIONARIO.

1. Haga un esquema del VHA y uno del VHB. (anexe hoja)

2. Investigue la incidencia del virus de la hepatitis A, hepatitis B y hepatitis no-A ni B, en

México.

3. Investigue el riesgo de contraer cáncer hepático en portadores de Virus de la Hepatitis

A, B

47

PRACTICA # 4

DIAGNOSTICO DEL VIRUS

DE LA RUBEOLA

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Conocer una técnica serológica común para diagnóstico de rubeola y comprender su

fundamento.

INTRODUCCION

Los virus de la rubeola (sarampión alemán) comparten propiedades estructurales y el modo

de replicación de los togavirus, pero se diferencian en la vía de diseminación y transmisión.

Son partículas esféricas de 60-70nm, con tres tipos de proteínas estructurales asociadas con

la envoltura viral y una proteína que forma parte de la nucleocápside interna. El virión

contiene una densa región central rodeada por una doble capa de lípidos. Son virus con

ARN monocatenario.

La rubeola es un virus respiratorio, que causa una enfermedad exantemática leve en los

niños, pero de serias consecuencias para los neonatos. La rubeola materna causa graves

defectos congénitos.

El aislamiento del virus de la rubeola es difícil y rara vez se lleva a cabo. El diagnóstico

suele confirmarse por la presencia de anticuerpos IgM específicos. Un incremento del 400%

en las tasas de IgG, entre la fase aguda y la convalecencia indica infección reciente. Los

anticuerpos contra el virus se determinan al principio del embarazo para conocer el estado

inmunitario del paciente; esta determinación es obligatoria en algunos países. Cuando es

necesario aislar el virus, puede detectarse en muestras de orina, notándose una interferencia

en la replicación del virus ECHO 11 en cultivos de células primarias de mono verde

africano. Se previene con la vacuna hecha de virus vivos, subcutáneamente. Puede

permanecer indetectable en personas asintomáticas.

MATERIALES Y METODOS.

Desarrolle un método serológico, haciendo reaccionar suero del paciente con antígenos

específicos, siguiendo las instrucciones del Kit serológico comercial.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbente Assay) El

La técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada regularmente

para la detección de numerosas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del

48

reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.

El área de sus aplicaciones médicas se ha expandido en forma sostenida, siendo la técnica

de referencia utilizada para la medición de determinadas hormonas, toxinas,

inmunoglobulinas, antígenos y anticuerpos desarrollados en todo tipo de infecciones

tanto bacterianas, como fúngicas parasitarias o víricas.

La prueba de ELISA es la primera que se hace porque resulta barata, sencilla y da

resultados confiables. Si la prueba de ELISA sale negativa, no se hacen más pruebas.

Cuando sale positiva, es preciso practicar la IFA o la Western Blot para confirmar los

resultados.

La confiabilidad de una prueba médica depende de dos factores: el nivel de sensibilidad

de la prueba y el grado de especificidad. La prueba ELISA es sumamente sensible (~

99,5%), lo que significa que puede detectar cantidades muy pequeñas de anticuerpos al

VIH. Gracias a eso se reduce la probabilidad de que dé un resultado "falso negativo"

cuando hay anticuerpos al VIH. Suponiendo que una persona se haga la prueba después

del periodo de ventana, si la ELISA da un resultado negativo, es prácticamente imposible

que haya VIH.La elevada sensibilidad de esta prueba implica que tiene una especificidad

ligeramente baja. Esto significa que en algunas ocasiones puede dar un resultado "falso

positivo". Para contrarrestar esta posibilidad, se administran automáticamente otras

pruebas confirmatorias cuando la ELISA da un resultado positivo.

Mecanismo de acción

Se basa en la reacción inmunológica (antígeno Ag o anticuerpo Ac) a un soporte sólido,

poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo

complementario.

El complejo inmunológico, una vez formado, es reconocido por moléculas capaces de

reconocer a su componente más superficial, marcadas con una enzima al que

posteriormente se agrega un sustrato cromógeno.

Posteriormente este sustrato cromógeno es medido por espectrofotometría la cantidad de

producto enzimático resultante., cuantificando así la cantidad producto enzimático

marcado, y por tanto resultante de la reacción inmunológica, unión antígeno-anticuerpo

de inicio.

CUESTIONARIO.

Investigue cuál es la incidencia de la Rubeola en México.

Investigue con cuáles enfermedades se puede confundir la rubeola.

49

50

PRACTICA #5

DIAGNOSTICO DE ROTAVIRUS.

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Conocer una técnica común para diagnóstico de rotavirus y comprender su fundamento.

INTRODUCCION.

Los Rotavirus forman un grupo de virus productores de gastroenteritis en mamíferos y

aves. Desde 1973 se conocen como agentes comunes causantes de diarrea infantil.

Pertenecen a la familia de los Reovirus y son icosaédricos, de 65-75 nm de diam. Presentan

una cápside de doble capa, un genoma ARN bicatenario y segmentado que es inactivo

como ARNm. En la primera etapa de replicación, ocurre la transcripción de la cadena

menos, como matriz para fabricar el ARNm. Los Rotavirus se dividen en:

- Grupos. Se basan en la antigenicidad de la proteína VP6 y en la movilidad electroforética

de los segmentos del genoma.

- Subgrupos. Son definidos por la fijación del complemento y dependen de la proteína de la

cápside interna VP6.

- Serotipos. Se determinan por reacciones de neutralización y dependen de la proteína VP7.

Entre las técnicas de diagnóstico se incluyen la detección directa del antígeno, el

aislamiento en cultivos celulares y el diagnóstico serológico. La detección directa del

antígeno viral en heces representa el método diagnóstico de elección. La disponibilidad de

anticuerpos específicos ha permitido el empleo del enzimoinmunoensayoy la aglutinación

con látex. Se prefieren estos métodos por rápidos y sencillos, relativamente baratos y de

efectividad.

MATERIALES Y METODOS.

Desarrolle una técnica serológica para detectar rotavirus en heces de un paciente, siguiendo

las instrucciones de la etiqueta del Kit.

Anote detalladamente la técnica desarrollada y lo que ocurrió en cada paso. Interprete el

resultado en base a los datos de la literatura y concluya.

51

CUESTIONARIO.

Investigue en la biblioteca la incidencia de rotavirus en México.

Investigue qué enfermedades pueden confundirse con la de rotavirus

52

CAPITULO III PARASITOLOGIA

Las asociaciones biológicas entre los seres vivos se iniciaron con la aparición de la vida

misma sobre el planeta Tierra al competir éstos por el espacio y ponerse en contacto

íntimo. Algunos autores señalan asociaciones parasitarias encontradas en restos fósiles de

foraminíferos (protozoos con concha calcárea) y algas marinas con más de 530,000,000

años.

En la actualidad se sabe que hay más clases de organismo parásitos que no parásitos, ya

que esta modalidad de asociación entre los seres vivos es una de las más exitosas. El

hombre es huésped de cientos de especies de parásitos, sin contar a los virus, bacterias y

hongos que en general las especies de éstos son también parásitos en su mayoría.

La parasitología se inicia con el hallazgo de los parásitos por el hombre, hecho que tiene

su origen en los tiempos más remotos y que se pierde en la bruma del pasado histórico de

la humanidad, pero los descubrimientos a este respecto por los antiguos chinos, griegos,

egipcios, persas, etc., han quedado consignados de tal manera que el estudiante actual es

capaz de reconocerlos por el análisis de los manuscritos que dejaron para la posteridad,

los adelantos que sobre los parásitos y enfermedades parasitarias se realizaron hace

muchísimos años.

Las enfermedades parasitarias han producido a través de los tiempos más muertes y daño

económico a la humanidad que todas las guerras juntas. Generalmente en los países con

poco desarrollo socioeconómico es en donde las enfermedades parasitarias y la

parasitosis se presentan con mayor frecuencia, viéndose favorecido esto por las

condiciones climáticas cálidas o templadas y por la falta de cultura médica en el pueblo

Es importante señalar que alguna parasitosis transmitida por el suelo y por fecalismo

(ascariosis, uncinariosis, tricocefalosis, amibiosis, giardiosis, etc.) no solo se presenta en climas cálidos sino inclusive en zonas templadas y aún en frías.

La República Mexicana, debido a su diversidad geográfica y al desigual desarrollo

económico, presenta frecuencias variables de enfermedades parasitarias en las diferentes

regiones.

Entre las principales causas de mortalidad en país, se observa que las defunciones por

enfermedades infecciosas y parasitarias asociadas a naciones subdesarrolladas ocupan el

4to lugar. La mortalidad por enfermedades parasitarias es un problema común a los

diferentes grupos etáreos, pero su magnitud destaca en la niñez, evaluándose en términos

de muerte prematura y que repercute en Años de Vida Potencial Perdidos (AVPP) que es

un valioso indicador para países en desarrollo pues otorga mayor importancia a las causas

de defunción que inciden a edades tempranas.

53

PRACTICA #1

MANEJO DE MUESTRAS Y COPROPARASITOSCOPICO

DIRECTO

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA.

Aprender el tipo, recolección y manejo de muestras utilizadas para el diagnostico de

parasitosis, así como también desarrollar la técnica del coproparasitoscópico directo y

adquirir el criterio para saber cuándo usarlo.

INTRODUCCION.

Un examen coproparasitoscópico es el estudio de material fecal, para la búsqueda e

identificación de formas parasitarias intestinales. Puede ser cualitativo o cuantitativo. Las

muestras fecales son seriadas con un mínimo de tres y deben colocarse en frascos de boca

ancha, guardados en lugares frescos, mientras se analizan, pues con el calor se aceleran los

fenómenos de fermentación y con el frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de

protozoos. Si son heces formadas, para conservar los parásitos se puede utilizar refrigeración

a 10 C. Los métodos químicos permiten la conservación durante un tiempo más

prolongado, sin correr el riesgo de que los parásitos se deformen o se destruyan, por ejemplo

con soluciones que contienen formol, yodo-mertiolate, etc.

En el manejo de los productos biológicos es donde va a radicar el éxito o el fracaso de un

diagnóstico en enfermedades parasitarias. Es necesario seguir ciertos lineamientos

preestablecidos para cada producto.

Recolección. La obtención de la materia fecal se puede hacer de diferentes maneras; la

más frecuente es por la expulsión natural. La segunda se puede obtener con purgantes y

la otra es de qué se toma por medio de la cucharilla rectal. La que se utiliza con mayor

frecuencia es la primera, la segunda se utiliza en casos muy especiales como en

amebosis intestinal crónica y en estrongiloidosis; Finalmente, la toma con cucharilla

rectal se utiliza en los lactantes. Las muestras serán seriadas en tres días consecutivos,

salvo otras indicaciones

Manejo. Se deben utilizar frascos limpios de boca ancha, se evitará la contaminación con

tierra, agua u orina. Los frascos se guardarán en lugares frescos, pues el calor acelera los

fenómenos de fermentación y con frío se pueden destruir los quistes y trofozoítos de

protozoos (Goldman y Johnson, 1950; Chang, 1955); deberán etiquetarse con el nombre de

54

la persona, edad, sexo, fecha, de preferencia, hora de expulsión de las heces.

Conservación. Los conservadores pueden ser físicos o químicos. Los medios físicos, son

las temperaturas bajas, de 10º C que es la temperatura del refrigerador; se utilizan sobre

todo para heces formadas, las cuales incluso pueden llegar a examinarse 24 y hasta 48 horas

después de evacuadas, lo que no sucede con las heces diarreicas, que deben examinarse en

un plazo no mayor de una hora y no deberán refrigerarse.

Los medios químicos permiten la conservación de las muestras durante un tiempo

mayor, sin correr el riesgo de que las formas parasitarias se deformen o destruyan.

Conservadores y preservadores

Solución de formalina* al 10 %.

Solución de formalina al 5%.

Solución de merthiolate-yodo-formaldehído (MIF).

Fijador de fenol alcohol y formol (PAF)

CARACTERES MACROSCÓPICOS A ANALIZAR

- CANTIDAD.- Depende fundamentalmente de los residuos alimenticios procedentes de

la dieta, según su contenido en verduras y frutas, es decir, en celulosa. Y de la presencia

de estreñimiento o diarrea en el enfermo.

- CONSISTENCIA.- Puede ser acuosa ó líquida, blanda, pastosa o semiformada,

formada y dura. Normalmente y con dieta mixta, la deposición debe ser sólida y formada,

es decir cilíndrica y consistente para mantener esta forma después de ser excretada. (Ver

anexo)

- COLOR.- Normalmente y con dieta mixta, la deposición es de color pardo o café

marrón más o menos oscuro en el adulto, en niños debido a la dieta Láctea es amarillenta,

con dieta carnea se hace marrón oscuro. Una alimentación rica en verduras, tiñe las heces

de color verdoso, mientras que si preponderan papas o pan las

heces se aclaran a marrón amarillento.

- OLOR.- El olor fecal característico, se hace fétido en todos los procesos que cursan con

putrefacción de las proteínas ingeridas o endógenas, dado por productos aromáticos

originados por la acción de microorganismos de fermentación o de putrefacción que

actúan sobre carbohidratos y proteínas como el indol y el escatol.

- MOCO.- Su aparición en las deposiciones suele ser reconocible macroscópicamente. Si

se encuentra finamente dividido y mezclado en las heces, dándole un color brillante ,

entonces procede del intestino delgado a diferencia del moco en copos visibles tiene un

origen mas bajo y sobre todo el que se observa en tira tiene un origen en el colon distal.

55

SANGRE.- Su presencia es anormal debida a una acción traumática por algún agente

infeccioso. se puede encontrar fresca dándole una coloración rojo brillante cuando los

daños son en el colon o bien encontrarse metabolizada, proporcionándole a las heces un

color rojo oscuro o negrusco cuando los daños son a nivel de intestino delgado.

- PRESENCIA DE PARÁSITOS MACROSCÓPICOS.- Algunos parásitos como

Ascaris lumbricoides pueden ser observados a simple vista, los oxiuros pueden hallarse

en la superficie inicial de las heces, algunos otros parásitos pueden salir como fragmentos

como las tenias y es necesario buscarlos en la totalidad de la muestra.

EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO.

En este estudio, el material fecal más utilizado es el recién obtenido por expulsión natural

del paciente, ya sean heces bien formadas o evacuaciones disminuidas de consistencia, con

moco y/o sangre. Este método es de gran utilidad para la detección en fresco de trofozoítos

de Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli, Trichomonas hominis y

Blastocytis hominis. En la suspensión teñida con lugol se pueden identificar con facilidad

quistes de protozoos.

Este examen en fresco es sencillo, rápido y económico, pues requiere poco material.

-Es excelente para la búsqueda de trofozoítos y protozoos.

-Es eficaz en la búsqueda e identificación de quistes, huevos y larvas.

-Sin embargo, la muestra utilizada es muy pequeña y poco representativa.

Los montajes en solución salina tienen la ventaja de que retienen la movilidad de los

trofozoitos, sin embargo, es difícil la observación de las estructuras internas, pues con

frecuencia son poco definidas. El Yodo se emplea para destacar las estructuras internas de

los parásitos presentes, pero inmoviliza trofozoítos.

Existen otras tinciones para observación de estructuras de protozoarios como tinción de rojo

de metilo (para vacuolas digestivas), tinción con tinta china (observación de inclusiones) y

solución de Noland (observación de flagelos). Ver anexo.

MATERIALES Y METODOS

Cada alumno debe trabajar por lo menos con dos especímenes diferentes, además de la

muestra testigo que proporcione el profesor. Una muestra debe ser propia del alumno y una

segunda puede ser de otra persona.

La muestra debe ser recolectada de manera correcta como se menciono anteriormente.

*Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo

el procedimiento.

56

COPROPARASITOSCOPICO DIRECTO.

1. Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La

muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al

laboratorio.

2. Observar cuidadosamente las características macroscópicas de la muestra a analizar

con la finalidad de determinar su consistencia, color, olor, presencia de moco, sangre o

parásitos macroscópicos.

3. Con un aplicador se toma una muestra de heces (lo que se embarre solo en la punta), de

preferencia que contenga moco y sangre y se deposita en la gota de sol. salina, haciendo una

suspensión (no se hace frote). Se monta con un cubreobjetos.

4. Se repite la operación en la gota de lugol, con una gota de rojo de metilo, una gota de tinta

china y finalmente en una gota de solución de Noland (Hacer en total 5 laminillas)

5. Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos

6. Observe al microscopio, a 10 X y después a 40 X.

7. Con ayuda de la bibliografia, se aprecian los diferentes tipos de residuos fecales, así como

los posibles parásitos.

8. Realice dibujos detallados de los protozoarios encontrados en las heces estudiadas. Hay

posibilidad de que encuentre Giardia, E. histolytica, Balantitdium y Cryptosporidium

principalmente.

9. Con el lugol se observaran estructuras internas de los parásitos

Con el rojo de metilo se observaran vacuolas ácidas:coloración roja y Vacuolas

alcalinas: coloración amarilla

Con tinta china diluida se observaran partículas incluidas por pinocitosis

Con la solución de Noland observara presencia de flagelos

RESULTADOS

Se informará detalladamente aquellas características macroscópicas observadas

durante el análisis coproparasitoscopico

57

CARACTERISTICAS

MACROSCOPICAS

OBSERVACIONES

CONSISTENCIA

COLOR

OLOR

MOCO

SANGRE

PRESENCIA DE PARASITOS

MACROSCOPICOS

Resultados de la observación Microscópica

a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:

c) Aumento utilizado:

d) Estructuras observadas:

a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:

c) Aumento utilizado:

d) Estructuras observadas:

a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:

c) Aumento utilizado:

d) Estructuras observadas:

DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Con los resultados observados durante el desarrollo de la práctica realice su discusión y

conclusión

58

BIBLIOGRAFIA

Consultada por el alumno

ANEXOS

Regularmente en el área de Parasitología , las muestras más analizadas para demostrar la

presencia de parásitos intestinales del hombre son las heces fecales; sin embargo , existen

otros parásitos cuya presencia se puede evidenciar en muestras biológicas como : bilis,

jugo duodenal, esputo, secreción , biopsia o frotis perianal , no obstante estas pruebas se

harán tomando en cuenta los antecedentes clínicos específicos del paciente y tienen

utilidad en la integración del expediente cuando se sospecha de enfermedades

parasitarias.

Tipos de muestra parasitológica

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SIGNIFICADO CLINICO DEL COLOR DE LAS HECES:

El color de las heces proporciona una significativa información al químico clínico, ya que

con solo realizar un detallado análisis macroscópico de estas , le puede orientar en gran

parte para detectar alguna patología, disfunción orgánica, hemorragia, o bien hacer de su

conocimiento el tipo de alimentación o ingestión de algún medicamento que este

presentando el paciente en ese momento . El color anormal ayuda al médico a

seleccionar las pruebas tanto químicas como microbiológicas necesarias para llegar

finalmente a extender un buen diagnostico, pronostico y plan de tratamiento adecuados

para el paciente.

A continuación se hará referencia a los colores más comunes que pueden presentar las

heces fecales ya sea por alguna patología o bien por algún otro factor externo:

MEDICAMENTOS QUE PROVOCAN CAMBIOS EN LA COLORACIÓN DE

LAS HECES:

· Negro: Sales de hierro, Sales de bismuto, carbón.

· Verde: cloruro de mercurio, indiometicina, calomel.

60

· Verde a azul: ditiazanina.

· Marrón: antraquinonas.

· Rojo: fenolftaleína, pamoato de pirivino, tetraciclinas em jarabe,

bromosulfaleína.

· Amarillo: santonina, antibióticos.

· Claro a blancuzco: bário, antiácidos.

· Naranja rojizo: fenazopiridina.

· Rosa a rojo a negro: anticoagulantes dosis excesivas, salicilatos.

Tipos de materia fecal de acuerdo a la escala de Bristol

Los tipos 1 y 2 indican estreñimiento; los 3 y 4 son heces ideales, especialmente el 4, ya que son los más

fáciles de defecar; los tipos 5, 6 y 7 tienden hacia diarrea o cólera.

61

PREPARACIÓN DE COLORANTES PARA TINCIONES DE PROTOZOARIOS

Solución Noland:

Fenol saturado en agua ……………………..80 ml

Formol 40%....................................................20 ml

Glicerina…………………………………….4 ml

Violeta de genciana…………………………20 mg

Mezclar todos los componentes y guardar en frasco ambar.

Rojo Neutro:

Solución madre

Rojo neutro…………………………………. 0.5 g

Alcohol 70%: ……………………………….100 ml

Disolver el colorante en el alcohol. Para la solución de trabajo , diluir 1 parte de la solución madre en 10

partes de agua destilada. Guardar en frasco ambar por 6 meses

Tinta china diluida:

Tinta china……………………………………1-2 gotas

Agua destilada………………………………...1 ml

62

PRACTICA #2

Protozoarios intestinales y tisulares

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Identificar los protozoarios intestinales y tisulares de importancia medica mediante la observación de laminillas

INTRODUCCION.

Los Protozoarios son organismos unicelulares que se consideraron durante mucho tiempo

como un solo phylum, pero recientemente se han dividido en una serie de grupos con

carácter de phylum. Los phyla que incluyen especies parásitas humanas son

Sarcomastigophora, Ciliophora, Apicomplexa y raras veces Microspora.

Los protozoarios parásitos incluyen animales unicelulares que muestran modificaciones

fisiológicas parásitas fuertes en aquellos grupos que son completamente parásitos, en

relación a aquéllos que incluyen especies de vida libre y especies parásitas. Con frecuencia

los órganos que no son necesarios para una existencia parásita se han perdido. El único

grupo de protozoos que sólo incluye especies parásitas es el phylum Apicomplexa. Los

miembros de este phylum carecen de órganos locomotores, mientras que estas estructuras de

uno u otro tipo existen en los phyla restantes de protozoos.

PHYLUM SARCOMASTIGOPHORA.

Subphylum Mastigophora: se mueven mediante estructuras especializadas denominadas

flagelos, que son extensiones citoplásmicas largas como hilos. Los flagelos se originan en

estructuras citoplásmicas denominadas blefaroplastos. Su número varía en cada especie.

Algunos son parásitos hemáticos o tisulares y otros son intestinales. Se reproducen

generalmente en forma asexual. Los principales géneros patógenos son Giardia lamblia,

Trichomonas vaginalis, Dientamoeba fragilis, Leishmania y Trypanosoma.

Subphylum Sarcodina: incluye a protozoos que se mueven por medio de extensiones

citoplásmicas denominadas pseudópodos. La especie patógena importante es Entamoeba

histolytica, una amiba intestinal. El grupo incluye también los géneros Naegleria y

Acanthamoeba que aunque son amibas de vida libre, su potencial invasivo ya se ha

demostrado al causar meningoencefalitis y otros daños serios como queratitis.

63

PHYLUM APICOMPLEXA.

Los miembros de este phylum (antes denominado Sporozoa), son parásitos estrictos,

tisulares. Presentan un ciclo de vida complejo con una alternancia de generaciones sexuales

y asexuales. Los géneros patógenos más importantes son Plasmodium, Toxoplasma,

Isospora, Cryptosporium, Pneumocystis y Sarcocystis.

PHYLUM CILIOPHORA.

En estos organismos la locomoción se lleva a cabo por medio de cilios, que son

proyecciones citoplásmicas relativamente cortas, que se originan en pequeños gránulos

basales.

Son más cortos y más numerosos que los flagelos. El único género parásito es Balantidium,

en el intestino.

MATERIALES Y METODOS.

Observe al microscopio Protozoarios parásitos intestinales, montados en laminillas fijas.

Observe al microscopio Protozoarios parásitos tisulares, montados en laminillas fijas.

Note las diferencias morfológicas fundamentales entre los protozoarios observados, así

como sus estructuras mostradas en cada caso y haga dibujos. (ver anexo)

RESULTADOS

Estudie detalladamente y dibuje, guardando proporción al campo, los estadios de desarrollo

de los protozoarios provenientes de laminillas.

Realizar un análisis de cada protozoario y su estadio observado contestando los siguientes

rubros:

a) Género y especie del parásito

_________________________________________________

b) A que grupo taxonómico pertenece _____________________________________

c) Estadío desarrollado ________________________________________________

d) A que órgano (s) o sitio (s) invade o parásita ______________________________

e) Especificando si fue en fresco ó que tinción se utilizo

___________________________________________________________

f) Describe las características y /o criterios morfológicos.

____________________________________________________________________

____________________________________________________________________

64

Realice los dibujos observados:

DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Con los resultados observados durante el desarrollo de la práctica realice su discusión

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA POR EL ESTUDIANTE

65

PRACTICA #3

TECNICAS DE TINCIONES PERMANENTES Y CONCENTRACION DE

PARÁSITOS POR FLOTACION

OBJETIVO DE LA PRACTICA. Que el alumno se familiarice con diferentes técnicas de tinción de parásitos para poder

distinguirlos al microscopio y utilizarlas en diagnóstico. Se desarrollará y comprenderá el

fundamento de la técnica de concentración para diagnostico de parásitos intestinales.

INTRODUCCION.

En la mayoría de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar bien con

tinciones temporales, como es el caso de los exámenes directos con lugol, solución salina o

Sudán, efectuados en prácticas anteriores. En algunas ocasiones es necesario teñir los

parásitos en forma definitiva, para obtener preparaciones permanentes; otras veces estas

tinciones son necesarias porque se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares,

usando tinciones especiales permanentes. Algunos parásitos requieren tinciones especiales,

para poder observarse. Igualmente, el inmunodiagnóstico puede realizarse recurriendo a la

tinción con anticuerpos marcados con colorantes fluorescentes, facilitando la identificación.

Las preparaciones fecales permanentes son hechas por diferentes razones:

- Proporcionan información sobre el material estudiado: tinción de Romanowsky)

- Utiles en la identificación exacta de flagelados: tinción de Romanowsky, tinción de Fierro-

hematoxilina

- Cuando el parásito no puede ser detectado en preparaciones en fresco o por técnicas de

concentración, la tinción permanente de material fecal fresco puede revelar la presencia de

parásitos intestinales: tinción de Romanowsky, tinción Tricromo, Tinción de Ziehl Neelsen

modificada

- Son útiles en la demostración de patrones nucleares de quistes, facilitando la

identificación: tinción de fierro-hematoxilina, tinción Tricromo

La mayoría de los Nematodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol acético (1

parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se almacenan en alcohol

70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de impedir la desecación en caso de

evaporarse el alcohol durante ese tiempo.

La concentración de parásitos por flotación en muestras fecales permite comprobar la

existencia de quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos, aún cuando estén presentes

en pequeñas cantidades. Esta técnica se basa en la propiedad que tienen las soluciones de

densidad mayor, para hacer flotar objetos menos densos, como los huevos y quistes de

parásitos, los cuales son colectados en la superficie del líquido y observados al microscopio.

La técnica de concentración con sulfato de zinc proporciona una suspensión de parásitos

muy limpia y es útil para la recuperación de quistes de protozoarios y de la mayoría de los

huevos de helmintos. Aunque no es muy usada en forma rutinaria, por su sencillez se puede

utilizarse en encuestas.

El método de Faust, con ZnSO4, es uno de los más utilizados, aunque es poco eficaz para

huevos pesados como los de Tremátodos o como los huevos no fértiles de Ascaris. Tampoco

es muy efectivo para muestras de heces ricas en grasas. Este método puede realizarse en

muestras recientes, refrigeradas o fijadas con formol (5% ó 10%).

66

MATERIALES Y METODOS.

1. Tinción de Romanowsky

a). Tinción de Giemsa

El colorante de Giemsa puede ser usado para frotes de heces no-formadas, exudados fecales

y aspirados duodenales.

Una tinción permanente de Romanowsky como la tinción Giemsa o tinción rápida de Field

debe ser usada para diarrea sanguinolenta y para heces semi-formadas con sangre y/o moco.

Proporciona información sobre el exudado presente, presencia de trofozoítos de flagelados

como Giardia lamblia. Permite determinar la presencia de protozoarios que son difíciles de

detectar o no son detectados en preparaciones en fresco, como Blastocystis hominis.

Materiales

Colorante de Giemsa: 1 g de polvo de Giemsa + 66 mL de glicerina calentado a 50

grados durante 2 horas, añadir 66 mL de actohol metílico absoluto, dejar a temperatura

ambiente 7-14 días (maduración). Filtrar antes de su empleo.

Método

Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La

muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al

laboratorio.

1. Haga un frote delgado de exudado fecal. Deje secar al aire libre.

2. Fije en metanol por 1 minuto. Escurra y deje secar.

3. Cubra el frote con colorante Giemsa diluido 1:10 con agua destilada. Cada vez debe

prepararse el colorante.

4. Deje colorear por 20-25 minutos.

5. Lave con agua de la llave y no deje precipitar el colorante en el frote. Deje secar al aire

libre.

6. Examine el frote a 100 X.

7. Los Flagelos, cilios y núcleos se tiñen de rojo y el citoplasma azul.

b) Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-resistente) Modificada

Esta técnica es útil en la identificación de ooquistes de coccidios como Cryptosporidium,

Isospora, y Cyclospora, que son difíciles de detectar con colorantes rutinarios. Esta tinción

de Ziehl-Neelsen Modificada no requiere el calentamiento de los reactivos al teñir.

Espécimen: Puede utilizarse el sedimento concentrado, de heces frescas o preservadas en

formalina.

Materiales

Reactivos para la tinción: Se efectúan cuatro pasos en el proceso, con diferentes reactivos:

Metanol Absoluto

Alcohol Acido: 10 ml de acido Sulfúrico + 90 ml de etanol Absoluto. Almacene a

temperatura ambiente.

Carbol fucsina

Verde de Malaquita al 3%: disuelva 3 g de verde de malaquita en 100 ml de agua destilada.

67

Almacene a temperatura ambiente.

Método

1. Preparar un frote con 1 a 2 gotas del espécimen fecal sobre un portaobjetos y secar en

una platina caliente a 60°C. Los frotes no deben quedar demasiado gruesos.

2. Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos.

3. Teñir con carbol Fucsina por un minuto.

4. Lavar con agua destilada brevemente y escurrir.

5. Decolorar con alcohol- ácido durante 2 minutos. Enjuagar con agua destilada y escurrir.

6. Teñir con el colorante de contraste verde de malaquita durante 2 minutos.

7. Lavar brevemente con agua destilada y escurra.

Secar el portaobjetos sobre una platina caliente a 60 °C durante 5 minutos. Montar la

preparación con un cubreobjetos usando un medio de montaje.

Examinar 200 a 300 campos usando el objetivo seco fuerte 40×.

Para confirmar la morfología interna, use el objetivo de aceite de inmersión 100x.

2. Concentración por flotacion

Método de Faust, con ZnSO4

Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La

muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al

laboratorio. Además de su muestra, se examinará una muestra positiva proporcionada por el

profesor.

Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo

el procedimiento.

1. Con un abatelenguas se toma aproximadamente 1 g de heces (el tamaño de un cacahuate)

y se deposita en un vasito que contenga de 10 a 15 ml de agua de la llave y se mezclan con

un aplicador de madera.

2. La suspensión se filtra a través de una coladera o malla y se recibe el filtrado en un tubo

de centrífuga de 14 ml. Se le adicionan 1-2 ml de éter. Se tapa con un tapón de hule y se

agita vigorosamente. Se adiciona agua hasta que la muestra quede a 1cm por debajo del

bordo superior del tubo.

3. Se centrifuga por 45 segundos a 2500 rpm. Debe romperse cualquier acúmulo que

pudiera haberse formado en la parte superior y se decanta el sobrenadante.

4. Se Añaden 2 a 3 ml de agua de la llave y se agita para resuspender el sedimento. Se

resuspende nuevamente el sedimento, adicionando agua de la llave poco a poco, hasta que

quede la muestra a 1 cm del borde superior del tubo. Se centrifuga de nuevo.

5. Se decanta el sobrenadante y se agregan al sedimento 2 a 3 ml de sulfato de zinc (dens.

1.180. Lo cual equivale a 330 g de sulfato de zinc en 1 litro de agua), moviendo con un

aplicador para resuspender. Se agrega más sulfato de zinc hasta que llegue a unos 0.5 cm del

borde superior del tubo.

6. Se centrifuga a 2300 rpm durante 2 min. y no debe sacarse el tubo de la centrífuga.

7. Sin sacar el tubo de la centrífuga, se recogen algunas gotas del material que flota en la

superficie con una asa de platino (se debe cuidar que el asa no penetre demasiado bajo la

superficie) o con una pipeta Pasteur.

8. Se depositan las gotas en un portaobjetos y se agrega una gota de lugol. Enseguida se

68

completa la preparación con un cubreobjetos.

9. Se observa al microscopio, a 10X y 40X. Es posible el hallazgo de protozoarios y

helmintos.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Describa sus observaciones y resultados. Dibuje los organismos observados, compare con la

literatura para identificar los parásitos

a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:

c) Aumento utilizado:

d) Estructuras observadas:

69

PRACTICA #4

IDENTIFICACION DE HELMINTOS Y CONCENTRACION DE PARASITOS

POR SEDIMENTACION.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA Aprender a diferenciar morfológicamente Helmintos parásitos comunes, mediante

observación de ejemplares en diferentes etapas adultos, larvas y huevos con el fin de

identificarlos, comprendiendo sus ciclos biológicos.

Desarrollo y comprensión de la técnica para aprender a concentrar por sedimentación e

identificar parásitos intestinales en heces. Asimismo analizará la utilidad de los recursos

para el diagnóstico.

INTRODUCCION.

Los Helmintos incluyen los phylum de los Platyhelminthes y de los Aschelminthes.

El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares que se

caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría son

hermafroditas.

La mayoría de los miembros son simbiontes que viven sobre o dentro de sus

hospedadores. Las clases Trematoda y Cestoda incluyen solo organismos parásitos.

Los miembros de la clase Cestoda tienen cuerpo alargado en forma de cinta segmentada,

que lleva en el extremo anterior un órgano especial de fijación: el escólex. No poseen

aparato digestivo. Los céstodos adultos o tenias, viven en el intestino delgado. Un ejemplo

común es Echinococcus granulosus cuyo adulto parasita el intestino de canidos. Por otro

lado, en su etapa larvaria parasita las vísceras de humanos y herbívoros, causando el quiste

hidatídico (hidátide) al ingerir alimentos o agua contaminados con heces caninas

conteniendo los huevos del parásito adulto.

En el caso de Taenia solium sus larvas afectan músculos y sistema nervioso central de

humanos y cerdos, causando cisticercosis; los huevos de T. solium al ser ingeridos por

humanos o cerdos (en alimentos contaminados con heces humanas conteniendo huevos del

adulto) dan lugar a larvas que se dirigen a los órganos o tejidos del cuerpo, donde

desarrollan los cisticercos. La presencia de unos pocos cisticercos en áreas no vitales (tejido

subcutáneo) puede ser asintomática, pero puede producirse una enfermedad grave cuando se

fijan en áreas de importancia vital. Localización: a) mucosas, b) tejido celular subcutáneo, c)

muscular, d) ocular, e) sistema nervioso central, f) otros.

El diagnóstico de estos parásitos puede ser: a) clínico, b) de laboratorio, c) de gabinete. El

diagnóstico debe hacerse mediante la correlación de todos los datos obtenidos.

Tanto el cisticerco como la larva hidatídica, pueden recuperarse completo o demostrarse

histológicamente, en los tejidos separados por cirugía.

El phylum de los Platyhelminthes o gusanos planos incluye animales pluricelulares que se

caracterizan por tener el cuerpo aplanado con simetría bilateral. La mayoría son

hermafroditas. Los adultos pueden tener menos de 1 mm de longitud o alcanzar una longitud

de varios metros.

La clase Trematoda o "duelas" presenta organismos con forma de hoja alargada, delgados,

con órganos de fijación consistentes en ganchos o en depresiones musculares en forma de

copa terminada en ventosas. Su aparato digestivo es muy simple. De los tres órdenes de

Trematoda, el Orden Digenea incluye todas las especies parásitas humanas. Los miembros

70

tienen ciclos de vida complejos, por lo menos con un huésped intermediario, un molusco.

Hay especies hepáticas, hemáticas y pulmonares en humanos. Las especies más comunes

son Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski, Paragonimus westermani.

En patología se observan muchos parásitos tisulares, uno de los más comunes e importantes

es el caso de la Trichinella spiralis. Las larvas del parásito se observan en los músculos y es

importante distinguirlos en su dimensión y morfología.

Los aschelmintos parásitos humanos quedan incluidos en la Clase Nematoda. Los

nemátodos o gusanos redondos son animales cilíndricos, alargados, generalmente con los

extremos adelgazados. Poseen una cutícula gruesa que puede ser lisa, o puede extenderse

formando

una serie de estructuras, sobre todo en los extremos anterior y posterior. Los sexos están

separados, siendo el macho generalmente más pequeño que la hembra. Tienen un aparato

digestivo bien desarrollado. Las especies humanas tisulares humanas importantes son

Trichinella, Strongyloides, Toxocara, Gnathostoma, Wuchereria, Onchocerca, Mansonella,

Brugia, Loa Loa, Dipetalonema, Dracunculus.

Aunque los adultos de algunas especies son intestinales en humanos, las fases larvarias son

tisulares, como en los casos de Ascaris, Necator, Strongyloides y Ancylostoma.

La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por centrifugación ligera o por

gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios,

huevos y larvas, especialmente huevos de tremátodos. Concentra bien estas formas y

elimina bastantes detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los

protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en heces con

cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de los quistes de

protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos, incluyendo los huevos con

opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma .

La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que interfieren en

los métodos de flotación. .

Las modificaciones al método de Ritchie utilizar acetato de etilo

La técnica de sedimentación concentra los parásitos presentes en la muestra fecal. La técnica

incluye tamizar primeramente las heces para separar los residuos grandes, tratar con formol

para matar y preservar los organismos, y adicionar un solvente como éter o acetato de etilo

para disolver las grasas. Sin embargo, durante la sedimentación, aparte de concentrarse los

parásitos, se quedan reunidos también algunos otros materiales, abundando los artefactos

durante la observación. Debido a que se usan varios reactivos resulta antieconómico, no

obstante su eficacia.

MATERIALES Y METODOS.

1. Observación de Helmintos

1. Observe al microscopio o macroscópicamente, según el tamaño del ejemplar, ya sean

huevos,larvas o adultos de Platelmintos, por ejemplo Taenia solium, Taenia saginata,

Fasciola hepática

2. Igualmente observe huevos, larvas y adultos de nemátodos, como Ascaris

lumbricoides,

uncinarias, Trichuris, Enterobius, Trichinella, Onchocerca.

71

3. Note las diferencias morfológicas para su identificación. Haga dibujos detallados con

el

nombre de sus estructuras y el nombre científico correspondiente de cada parásito.

4. Haga dibujos detallados de los diferentes estadíos observados en cada parásito Haga un

esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los parásitos observados.

2. Técnica de sedimientación

Obtenga una muestra de heces en un frasco estéril equivalente al tamaño de una nuez. La

muestra debe ser reciente. Si es de la noche anterior debe ser refrigerada mientras se lleva al

laboratorio. Además de su muestra, se examinará una muestra positiva proporcionada por el

profesor.

Las heces son potencialmente infectantes. Se deben extremar las precauciones durante todo

el procedimiento.

Método del Formol-éter (Método de Ritchie)

1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate) mediante la

ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución salina fisiológica. Mezcle

con un aplicador de madera y homogenice.

2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en un tubo de

centrífuga de vidrio de 14 ml

3. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solución

salina.

4. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el sedimento en

solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento más

limpio.

5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% en solución salina, mezcle y deje en

reposo durante 5 min.

6. Añada 3 ml de éter y agite vigorosamente 30 segundos.

7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m.

8. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente.

1) éter y lípidos en la superficie

2) un tapón de restos fecales

3) formaldehido

4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos.

9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas gotitas de lugol

y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur y se monta entre porta y

cubre. Se observa a 10 y a 40 X.

10. Fuentes comunes de error: una suspensión fecal demasiado cargada, suspensión fecal

pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de centrifugación inadecuados.

TÉCNICA PARA MUESTRAS FRESCAS

1. En un tubo de centrifuga, desmenuce una porción de heces de unos 2 cms. De diámetro

en suero fisiológico para conseguir que 10 ml, de suspensión contengan cerca de 1 ml.

Del sedimento centrifugado.

72

2. Colar 10 ml de suspensión a través de dos capas de gasa en un embudo. Recolecte en

tubo de centrifuga de 15 ml.

3. Centrifugue durante 1 a 2 min. a 1,500 rpm o 600g.

4. Decante el sobrenadante .El sedimento ocupara entre 1 a 1,5 ml de sedimento. Si la

cantidad es mayor o menor ajuste a la cantidad adecuada. Si el sedimento es mayor

resuspender en solución salina y eliminar la cantidad necesaria. Si es menor añada una

segunda porción tratada de la misma manera que la primera.

5. Resuspenda el sedimento en sol. salina, centrifúguese y vuélvase a decantar.

6. Añadir 9 ml. De formalina al 10%, mezclar bien y dejar reposar por 5 min. o más.

7. Añadir 3.0 ml. De éter o acetato de etilo. Cierre el tubo con tapón y agite

vigorosamente en posición invertida por lo menos 30 seg. Retirar el tapón con cuidado.

8. Centrifugue por 1 min. a 450 - 500 g.

9. Retire el tubo y observe la formación de 4 capas como sigue:

• Capa de Éter.

• Tapón de restos fecales.

• Sol. De Formalina

• Sedimento que contiene parásitos.

10. Marcar cuidadosamente con un aplicador de madera un anillo alrededor de la capa de

restos fecales para liberarlo de los lados del tubo, volcar el líquido sobrenadante en un

recipiente. Arrastrar el sedimento, añadir una cantidad similar de colorante de Yodo

(Lugol) y colocarlo sobre un portaobjetos. Agregar un cubreobjetos y observar.

11. Fuentes comunes de error: Una suspensión fecal demasiado cargada,

Suspensión fecal pobre, Centrifuga mal equilibrada, Tiempo y velocidad de

centrifugación inadecuados.

12. Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos mediante la

comparación de su morfología con los manuales y libros.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

1. Discuta el fundamento de las técnicas serológicas utilizadas en el inmunodiagnóstico

para cisticercos de Taenia solium ofrecidas en el mercado

2. Investigue como se diagnostica la cisticercosis en cerdos en el rastro.

3. Haga un esquema con dibujos del ciclo vital completo para cada uno de los parásitos

observados. Anote los nombres de las etapas de desarrollo correspondientes en cada uno.

4. Consulta la literatura y diga cuales son los animales que actúan como huéspedes

intermediarios de Fasciola hepatica. Haga dibujos

5.Discuta las dificultades y las facilidades de la técnica de Ritchie, con respecto a las

anteriores.

a) Género y especie del parásito:

b) Estadio desarrollado:

c) Aumento utilizado:

d) Estructuras observadas:

73

ANEXO

Morfología diferencial de Cestodos

Parasitosis TENIOSIS

SAGINATA

TENIOSIS

SOLIUM DIFILOBOTRIOSIS HIMENOLEPIOSIS

Parásito Taenia saginata Taenia solium Diphyllobothrium latum Hymenolepis nana

Clasificación Helminto / cestodo Helminto /cestodo Helminto / cestodo Helminto /cestodo

Medidas de los ejemplares adultos 5 - 8 m 3 - 5 m 4 - 25 m 2 - 4 cm

Características del escólex

Cuadrangular

1 - 2 mm

4 ventosas

acetabulares

Piriforme

0,5 - 1 mm

4 ventosas

acetabulares

Rostelo con doble

corona de ganchos

Forma de espátula

4 - 10 mm

2 botrias

Romboidal

0,3 mm

4 ventosas acetabulares

Rostelo retráctil con corona

de ganchos simple

Características de las proglótidas

Rectangulares

1,5 - 2,2 cm x 1 cm

Útero recorre toda la

proglótida y tiene

más de 12

ramificaciones

primarias

Poro genital lateral, al

azar

Cuadrangulares

0,7 x 0,5 cm

Útero recorre toda la

proglótida y tiene

menos de 12

ramificaciones

primarias

Poro genital lateral,

al azar

Trapezoidales

10 - 15 mm x 2 - 5 mm

Útero central en roseta

Poro genital central

Trapezoidales

0,1 - 0,3 mm x 0,8 - 1 mm

Ovario bilobulado con 3

masas testiculares

Poro genital lateral, al

mismo lado

Nombre (s) estadio (s) larval (es)

Cisticercus bovis o

cisticerco de Taenia

saginata

Cisticercus

cellulosae

o

cisticerco de Taenia

solium (ver ciclo

Cisticercosis

humana)

Procercoide

y

Plerocercoide

Cisticercoide

Medida huevo 30 - 45 um 30 - 45 um 50 - 75um 30 - 50 um

Características del huevo

Esférico u ovoide

Gruesa corteza

radiada

Interior: oncósfera o

embrión hexacanto

Esférico u ovoide

Gruesa corteza

radiada

Interior con

oncósfera o embrión

hexacanto

Ovalado

Opérculo en un extremo

Esférico o elíptico

Gruesa corteza

Interior: oncósfera o

embrión hexacanto,

filamentos polares y

ganchos en paralelo

Método de diagnóstico

*Elemento diagnóstico

Identificación de

proglótidas

EPSD: (Ej.

Telemann)

*Huevo embrionado

de Taenia sp.

Identificación de

proglótidas

EPSD: (Ej.

Telemann)

*Huevo embrionado

de Taenia sp.

Identificación de

proglótidas

EPSD: (Ej. Telemann)

*Huevo embrionado

EPSD: (Ej. Telemann)

*Huevo embrionado

Forma infectante

Cisticercus bovis

o

cisticerco de Taenia

saginata

Cisticercus

cellulosae

o

cisticerco de Taenia

solium

Plerocercoide Huevo embrionado

Cisticercoide (artrópodo)

74

ANEXO

Morfología diferencial de tremátodos

Parásito Fasciola hepática Fasciolopsis buski Paragonimus Schistosoma

clasificacion Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo Helminto/tremátodo

Medidas

adultos

18-32 mm x 7-14 mm 2 to 7 cm long 7 - 13 x 5.5 - 7.5 mm

Características

adultos

cuerpo aplanado,

intestino lleno de

sangre contrasta por

tonalidad oscura .

Parte frontal,

proyección cónica

continúa con ”

hombro” ensanchado

estrechandose en

sentido posterior

hasta terminar en

punta; está cubierta de

espinas

Semejante a fasciola

, ausencia de

“hombro”

Cutícula espinosa ,

Utero en posición

media y lateral,

arrollado, en forma de

roseta, Ventosa oral

de igual tamaño que

la ventral, Testiculos

lobulados

gusano largo y

delgado. El macho

mide 10-12 mm de

longitud y solo 0,11

mm de anchura bordes

laterales incurvados,

considerablemente

más ancho que la

hembra que mide 12-

16 x 0,016 mm.1

Nombres

estadíos

larvales

Miracidio,

Redia,Cercaria

Tamaño y

características

del huevo

marrón amarillentos y

relativamente grandes

(130-150 x 60-90 1-t)

Presencia de cutícula

gruesa exterior

(opérculo)

120 - 197 micrones,

semejante a fasciola

50-125 micras por

35-70 m.

Amarillo-café,

ovoides o elongados ,

uno de los extremos

ligeramente achatado.

Operculo visible

son alargados, con

cubierta transparente,

de unos 114-180 μm x

45-73 μm, con un

característico espolón

lateral nítido cerca de

la extremidad posterior

y apuntando hacia

atrás. Cada huevo

contiene un miracidio.

75

CAPITULO IV MICOLOGIA

Introducción.- La micología, es la ciencia que se dedica al estudio de los hongos. Mas

allá que estos pertenecen a un reino propio (Reino Fungi), la micología es aún

considerada como un ramo de la botánica (ciencia que se dedica al estudio del reino

Plantae – de las plantas).

El conocimiento de los hongos, ha evolucionado profundamente en gran parte debido a

los desarrollos verificados a nivel de microscopía y de bioquímica, que permitieron una

más amplia caracterización estructural y funcional de los elementos de este reino.

Los hongos presentan una serie de características peculiares que hacen con que ellos

funcionen como eje de enlace de varias cadenas tróficas, presentando características

típicas de diferentes reinos (Animal, Vegetal y Protista): son seres vivos heterotróficos

(absorben sustancias orgánicas en solución), sin clorofila y pueden tener un

comportamiento saprobio, parásito o simbiótico. Se presentan formados por hifas, que se

agrupan en un tejido no verdadero (el micelio), excepción hecha a las levaduras, que son

unicelulares. Siendo delimitados exteriormente por una membrana rígida conteniendo

quitina y hemicelulosa, ellos se reproducen a enorme velocidad mediante una enorme

variedad de procesos sexuales, asexuales y parasexuales.

La micología aplicada es un área de investigación con profundo interés antropológico,

dada la diversidad de características que los elementos del reino Fungi presentan: desde

peligrosos (pudiendo hasta ser mortales), hasta indispensables para el combate de

enfermedades como infecciones bacterianas, ellos son una presencia omnipresente en el

día a día.

En la actualidad, la micología médica ha surgido como una de las ramas más importantes

de la medicina, abarca una gama muy extensa de patologías en el hombre y los animales

que son clasificadas en Alergias, Micotoxicosis, Micetismos, Micosis superficiales,

Micosis subcutáneas, Sistémicas y Oportunistas.

76

PRACTICA # 1

EUMYCETES (HONGOS VERDADEROS)

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Aprender a determinar las características macro y microscópicas más sobresalientes de algunos grupos de Eumicetos (mohos y levaduras), y comprobar su alta distribución en el ambiente.

INTRODUCCION

Los hongos son organismos eucariotes, unicelulares o pluricelulares y presentan una pared celular, de composición diferente a la de las plantas. No contienen clorofila ni sintetizan macromoléculas a partir del CO2 ni de la luz. Todos son heterotróficos. Se encuentran ampliamente distribuídos en la naturaleza y los de mayor interés son los ornamentales, los comestibles, los venenosos, los tóxicos, los alucinógenos, los medicinales, los patógenos (de humanos, animales, plantas), los degradadores de materia orgánica y los que descomponen los alimentos.

REINO FUNGAE:

Subdivisión Clase

Zygomycotina Zygomycetes

Ascomycotina Ascomycetes

Basidiomycotina Basidiomycetes

Deuteromycotina Deuteromycetes o Fungi Imperfecti (aquí se incluyen la mayoría de los hongos patógenos humanos.

El cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular.

a) Talo unicelular: de forma ovoide o redonda, como las levaduras b) Talo pluricelular: con aspecto filamentoso. A éstos se les conoce como mohos y

están formados por hifas microscópicas que consisten de filamentos tubulares ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocíticas (sin divisiones y multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de hifas constituye el micelio. En las hifas se producen diferentes clases de esporas reproductivas: esporas asexuales: talosporas, conidios, esporangiosporas.

esporas sexuales: ascosporas, basidiosporas.

- A los macromicetos carnosos se les denomina setas (champiñones).

77

Identificación:

Los hongos presentan requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo es más lento que el de las bacterias, necesitando varios días de incubación. Las características más empleadas para la identificación de los hongos filamentosos (mohos) son: el tipo de talo, la morfología macroscópica del micelio, micelio aéreo y profundo, es decir las características coloniales, tanto de frente como en el reverso. Las colonias de hifas son macroscópicas, de variados aspectos y colores (algodonoso, aterciopelado, polvoso. La morfología microscópica del micelio se refiere al tipo de hifas, estructura y modo de formación del cuerpo reproductivo sexual, tipo de esporas: forma, tamaño, aspecto externo, agrupacón, número de células, flagelos.

Las levaduras forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificación de levaduras se requiere conocer además de la morfología, la determinación de características fisiológicas y bioquímicas, especialmente su acción sobre azúcares.

MATERIALES Y METODOS

I. Aislamiento de hongos del ambiente

1. Abra una caja de Sabouraud-agar-penicilina en el jardín, en alguna habitación, o en cualquier cualquier otro lugar, durante 15 min. Después de este tiempo tápela e incúbela a 28 C por una semana, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos.

2. En otra caja espolvoree unas cuantas partículas de polvo del jardín e incube igual por una

semana.

3. Una vez desarrolladas las colonias de hongos, haga una descripción de las colonias y compárelas entre sí. Haga dibujos.

4. Guarde en una bolsa de papel una fruta o una verdura, durante una o dos semanas, a temperatura ambiente. Revise periódicamente, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos.

5. Observaciones Macroscópicas: Compare las colonias desarrolladas entre sí, tanto en los medios de cultivo como en los vegetales, notando las diferencias de color al frente y al reverso. Haga dibujos de las que sean diferentes.

6. Observaciones microscópicas de los hongos de las colonias desarrolladas: Coloque una gota lo más pequeña posible de lactofenol, en el centro de un portaobjetos. Enseguida corte un fragmento de cinta adhesiva transparente del largo de un portaobjetos y ayudándose con un lápiz, doble la cinta a la mitad con la parte adhesiva hacia afuera sujetando con los dedos los dos extremos. Adhiera la parte del doblez sobre la colonia del hongo y enseguida coloque la cinta sobre el portaobjetos, haciendo que coincida la muestra de la colonia del hongo con la gota de lactofenol, de tal forma que la cinta actúe como cubreobjetos. Observe al microscopio

78

a 10 y a 40 X. 7. Trate de identificar los hongos hasta género, mediante una comparación de las

hifas y esporas observadas al microscopio, con los dibujos mostrados en los libros. Haga

dibujos detallados, con los nombres de las estructuras del hongo y el nombre del género

identificado.

II. Levaduras.

A partir de levadura para pan o cerveza, haga observaciones entre porta y cubre

III. Hongos macromycetos.

Colecte hongos macroscópicos (en el mercado y en el campo) y haga observaciones al microscopio, a partir de un fragmento de unos 3 mm de diámetro, en una gota de lactofenol entre porta y cubre.

IV. Microcultivo de cepas puras de hongos:

1. Prepare unas cajas de Petri con un círculo de papel filtro en el fondo, una varilla doblada en V, un portaobjetos y un cubreobjetos. Esterilícelas. Acomode el portaobjetos y el cubreobjetos sobre la varilla.

2. Con un bisturí estéril, corte cuadros de agar-Sabouraud de aprox. 1 cm2 y acomode uno en el centro de cada portaobjetos, dentro de la caja.

3. Con un asa micológica obtenga fragmentos (aprox. 1 mm de diám.) de una colonia pura de un hongo y vaya inoculando el centro de cada lado del cuadro.

4. Enseguida cubra el cuadro de agar con el cubreobjetos, humedezca el papel filtro con agua-glicerinada estéril, y tape la caja. Incube una semana a temperatura ambiente.

5. Separe cuidadosamente el cubreobjetos y móntelo sobre un cubreobjetos conteniendo una gota de lactofenol-azul de algodón. Por otro lado, separe el portaobjetos y en su centro deposite una gota de lactofenol, montando con un cubreobjetos. Cuide que en ninguna preparación quede reactivo fuera del cubreobjetos. Selle los bordes de ambas preparaciones con barniz de uñas y deje secar.

6. Observe a 10 X y a 40 X.

79

l Aspergillus Penicillium

PENICILLIUM

80

PRACTICA # 2

MICOSIS SUPERFICIALES

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Que el alumno observe al microscopio las diferencias macro y microscópicas de los hongos

causantes de infecciones superficiales y que conozca las técnicas de diagnóstico.

INTRODUCCION

Las dermatofitosis o tiñas (Tinea) son micosis superficiales causadas por un grupo de hongos queratinofílicos estrechamente relacionados, denominados dermatofitos. Estos afectan la capa córnea de la piel, pelos y uñas. Los dermatofitos se dividen en tres géneros que se distinguen por las características morfológicas de sus macroconidios: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton. el género Trichophyton tiene macroconidios alargados cuya porción distal es redondeada, de pared delgada y lisa, miden de 8 a 50 µm, el número de septos va de 4 a 6. Los macroconidios del género Microsporum miden de 8 a 15 µm, son en forma de huso, de pared gruesa, rugosa, con hoyuelos o prominencias que semejan tubérculos denominados equínulas, multiseptados (5 a 15 septos). Finalmente, los macroconidios del género Epidermophyton son numerosos, miden de 7 a 12 µm, en forma de mazo o basto, redondeados en su polo distal, de pared gruesa y lisa, con 4 septos transversos.En la actualidad se consideran 40 las especies causantes de enfermedad, de las cuales cinco son las más frecuentes: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, E. floccosum. El dermatofito que causa el 80-90% de esta micosis es T. rubrum. La mayoría de los dermatofitos tienen una amplia distribución mundial, aunque algunos están geográficamente restringidos, como T. concentricum.

Las dermatofitos se clasifican en tres grupos ecológicos en base a su hábitat natural y su preferencia por el hospedero.

• Antropofílicos, grupo de dermatofitos que parasitan el tejido humano. Se ha descrito que estas especies evolucionaron de los hongos zoofílicos y que gradualmente perdieron su afinidad por la queratina del animal. Las especies más importantes son: T. rubrum, T. tonsurans, T. violaceum, T. schoenleinii, T. mentagrophytes var interdigitale, M. audouinii y E. floccosum. En casos excepcionales M. audouinii y T. rubrum han sido aislados de escamas y pelos de animales.

• Zoofílico, son dermatofitos que afectan a una gran variedad de aves y mamíferos que actúan como hospedero. Los principales son M. canis, T. equinum y T. gallinae.

• Geofílico, grupo de dermatofitos que viven en el suelo. La mayoría de las especies no son patógenas: M. gypseum, M. fulvum, T. terrestre.

81

Técnicas de diagnóstico de laboratorio para hongos Dermatofitos:

1) Toma de muestras:

Piel Cabelluda: se pueden recolectar los pelos cortos de las áreas lesionadas, escamas y/o

pus.

b) Piel: se recolectan escamas raspando con dos portaobjetos en el límite de la lesión.

c) Uñas: con un bisturí se toman fragmentos y polvo.

2) Examen directo de las muestras:

a) en el caso de pelos, éstos se colocan entre porta y cubre con una gota de KOH al 20 % y

la preparación se calienta ligeramente , o se deja 15-20 min sin calentar. Al observar al

microscopio se encuentran abundantes esporas y filamentos dentro del pelo o sobre él.

b) Las escamas de piel o uñas, se montan igual, con KOH entre porta y cubre, calentando

un poco. En el microscopio se encuentranlas células parasitadas por hifas. En las uñas se

pueden observar filamentos más abundantes, mezclados como una red, con muchas

artrosporas en cadenas.

3) Cultivo de las muestras:

Los medios rutinarios para el cultivo de escamas, pelos o uñas, son Sabouraud-dextrosa-

agar con o sin antibióticos y en Mycosel. Las muestras se siembran colocándolas

directamente sobre la superficie del medio y se incuban a 28 C una semana

aproximadamente, hasta observar colonias.

Existen otras clases de micosis superficiales causadas por hongos que se desarrollan

demasiado lejos del tejido vivo, esencialmente no hay patología por la presencia del hongo

y suele haber una falta de respuesta celular del huésped. En estos casos los pacientes pueden

no darse cuenta del trastorno. Aquí se incluyen:

- "Pitiriasis versicolor" causada por la levadura lipolítica Malassezia furfur, es una

infección crónica, asintomática, puede haber caspa en la cabeza o áreas cutáneas que

cambian de color, en tórax, espalda y miembros. En los recién nacidos causa las "costras de

leche" en el cuero cabelludo.

- "Piedra" es causada por Trichosporon beigelii y Piedra hortae. Es una infección

del talo piloso, con la presencia de nódulos firmes como costras arenosas blancas o negras.

- "Tiña negra" es causada por Exophiala wernekii. Es asintomática, con máculas pardas

o negras, no escamosas en la piel.

82

MATERIALES Y METODOS.

I. Aislamiento de hongos dermatofitos humanos, a partir del suelo.

1. Obtenga de sus compañeros fragmentos de uñas y cabellos. Entierre las puntas en la

tierra colocada en una caja de Petri. Riegue con agua la tierra hasta saturarla, es decir,

sin permitir que se encharque.

2. Incube a 30 C durante 1-4 semanas, vigilando que la tierra no se seque. Adicione agua

destilada cuando lo requiera.

3. Observe el desarrollo de hongos algodonoso blancos en las puntas de los pelos y uñas.

Con unas pinzas de disección desentierre los pelos y uñas y colóquelos sobre un

portaobjetos en una gota de agua. Con unas pinzas sujete la muestra y trate de enjuagar

en el agua con mucho cuidado, para eliminar la tierra adherida, permitiendo que

continúe el micelio en la muestra.

4. A continuación transfiera la muestra a un porta conteniendo una gota de KOH al. 20 %.

Deje actuar 2-5 min y monte con un cubreobjetos. Observe a 10 y a 40 X.

5. Identifique los géneros de los dermatofitos aislados, comparando con las claves de la

literatura..

II. Colecte muestras de enfermos con dermatofitos (puede conseguirlas en un hospital

o con personas conocidas, sobre todo uñas de ancianos)

1. Trate las muestras de pelos, escamas de piel o uñas en la misma forma con KOH

y observe al microscopio.

2. Determine si el micelio muestra esporas, y en qué forma se pueden identificar.

3. Siembre algunas muestras en placas de agar Sabouraud-penicilina. Incube a

temperatura ambiente hasta ver desarrollo de colonias fungosas.

III. Observación de cepas puras de hongos Dermatofitos:

6. Haga preparaciones o recíbalas ya hechas, de hongos dermatofitos entre porta y cubre en

una gota de lactofenol. (De preferencia, se recomienda que el alumno reciba del

profesor, preparaciones fijas de los hongos, para evitar el contacto con las esporas).

83

7. Note las diferencias morfológicas al microscopio entre las diferentes especies. Haga

dibujos detallados con sus colores correspondientes. Compare con las claves

taxonómicas para la identificación.

8. Haga una descripción de la morfología colonial de cada hongo, observada en los

medios de cultivo.

9. En base a las observaciones determine cuales fueron las diferencias fundamentales entre

los diferentes hongos dermatofitos observados en cepas puras.

T. rubrum M. canis

CUESTIONARIO

1.Haga un esquema de Malassezia furfur en su fase parásita y en su fase saprófita, y los

nombres de sus estructuras.

84

PRACTICA #3

MICOSIS OPORTUNISTAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA

Que el alumno se familiarice con los hongos oportunistas más comunes y con las técnicas de

laboratorio para su diagnóstico.

INTRODUCCION

En las micosis oportunistas no existe una lista precisa de hongos patógenos ni hay

especificidad de ninguno de ellos por lo que respecta a órganos o tejidos. Casi cualquier

hongo saprófito del suelo o de los que constituyen la flora normal de levaduras cutáneas,

puede transformarse en parásito en sujetos inmunocomprometidos total o parcialmente; en

base a ésto, los hongos oportunistas invadirán total o parcialmente.

Por lo tanto, son microorganismos con baja virulencia, y es necesario que las defensas del

huésped estén muy disminuídas antes de que se establezcan como patógenos. Las vías de

entrada también son varias: a través de piel intacta, heridas o inhalación. Antiguamente estas

enfermedades eran raras, pero en años recientes se han vuelto muy comunes y de gran

significación médica, en forma paralela al uso de antibióticos, citotoxinas,

inmunosupresores, esteroides y otros procedimientos que provocan disminución de la

resistencia del huésped. Por lo general estas micosis son insidiosas y no pueden ser

diagnosticadas sino hasta la necropsia.

En las micosis por hongos patógenos verdaderos, con frecuencia son importantes el sexo, la

edad y la raza del paciente, pero estos factores no influyen para nada en las micosis

oportunistas.

Cuatro especies constituyen la mayoría de estas infecciones: Candida albicans, Aspergillus

fumigata, Cryptococcus neoformans y Rhizopus arrhizus, aunque puede esperarse

parasitosis oportunista de cualquier género de hongo normal de vida libre. También pueden

incluirse algunas bacterias Actynomicetales oportunistas más comunes, como Nocardia

asteroides y Actinomyces israeli.

MATERIALES Y METODOS

I.- La candidosis o candidiasis es una micosis causada por diversas especies de levaduras del género Candida. Cualquier tejido puede ser afectado por lo que se

85

presentan diversos cuadros clínicos, cada uno de ellos asociado directamente al estado inmunológico del paciente. Las candidosis de mucosas y piel son las más frecuentes, mientras que las sistémicas son de evolución aguda o crónica y generalmente severas.

Agentes etiológicos.Los agentes patógenos son levaduras (el estado anamorfo) del género Candida pertenecientes al Phylum Ascomycotina. Muchas especies se han aislado de vegetales, suelo, agua, aire, alimentos y algunas de ellas forman parte de la biota normal de la piel y membranas mucosas (boca, vagina, vías respiratorias altas, tracto gastrointestinal) de mamíferos. Este género incluye aproximadamente 150 especies identificadas.

Procedimiento:

1. Obtenga una cepa de una levadura, haga un fresco entre portaobjeto y cubreobjeto, observe a 40X

2. Realice una tincion de Gram y observe a 100X

3. Haga dibujos de sus observaciones

La criptococosis es una micosis sistémica aguda, subaguda o crónica, inicialmente pulmonar causada principalmente por Cryptococcus neoformans (vars. neoformans y grubii) y Cryptococcus gattii. La forma pulmonar es generalmente transitoria, leve y no reconocida. Las lesiones cutáneas, óseas o viscerales pueden presentarse durante la diseminación de la enfermedad, pero la inclusión del sistema nervioso central con meningitis subaguda o crónica es la forma más familiar de la micosis. Aunque el hongo tiene una amplia distribución mundial y se encuentra de manera abundante en la naturaleza, solamente causa enfermedad grave en personas con resistencia inmunológica muy baja. En la actualidad, la incidencia de la criptococosis es paralela a la presentada por el SIDA.

Los criptococos en el suelo o en detritos vegetales son eliminados del ambiente por acción de la intemperie, especialmente los rayos solares y microorganismos como bacterias y amibas, pero los criptococos acumulados en cobertizos pueden permanecer viables durante varios años, permitiendo que estos hábitats actúen como fuentes importantes para la dispersión de levaduras desecadas, también infecciosas. C. neoformans var. grubii y C. neoformans var. neoformans se han aislado a partir de varias fuentes naturales (vegetales, frutas, jugos de frutas, madera, productos lácteos y suelo), pero es notoria su asociación con deshechos aviarios (pericos, loros, canarios) y especialmente con excrementos de palomas. Por otro lado, los aislamientos ambientales de C. gattii (serotipos B y C), han establecido que esta variedad tiene una asociación ecológica estrecha con algunas especies de árboles de eucalipto en Australia como Eucalyptus camaldulensis, E. tereticornis, E. rudis y E. gomphocephala, así como Terminalia catappa en Colombia y Moquilea tomentosa en Brasil.

86

Se ha apreciado una estrecha relación entre C. neoformans en pacientes con SIDA y C. gattii en pacientes inmunocompetentes. La criptococosis tiene una distribución geográfica amplia. Los casos causados por C. neoformans var. grubii predominan en lugares de clima templado, principalmente en EUA (excluyendo sur de California y Hawai) y Japón y C. neoformans var. neoformans (serotipo D) en Europa. Por otra parte, los casos provocados por C. gattii provienen principalmente de África, Latinoamérica, Sur de EUA (California), Australia y Canadá.

II.- Metodología para el Aislamiento de Criptococcus

1.- Recolectar muestras de heces secas de palomas

2.- Depositar 20 grs de heces en caldo peptonado

3.- Incubar a 37 ⁰C por 24 horas.

4.- Del sobrenadante se toma .1 ml y se esparce sobre agar saboraud

5.- Se deja incubar a temperatura ambiente por 3 o 4 días

6.- Tomar una muestra de una colonia sospechosa ( mucoide, convexa, de color blanco a

crema) y depositarla en una gota de solución salina sobre un portaobjetos, agregar un

cubreobjeto para su observación al microscopio, en 40X

7.- Si se observa una levadura grande, hacer observación con tinta china

8.- Nuevamente, se toma una muestra de la colonia sospechosa y se suspende en una gota

de tinta china, se cubre con cubreobjeto.

9.- Observar la cápsula refringente característica del criptococo a 40X .

87

Criptococo tinta china cultivo Criptococo

Candida Tincion Gram Cultivo Candida

88

PRACTICA #4

MICOSIS SUBCUTANEAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA.

Que el alumno compare las diferencias macro y microscópicas de los hongos y bacterias

causantes de micosis subcutáneas.

INTRODUCCION

En las micosis subcutáneas el agente causal penetra por heridas. Las micosis de este tipo

más conocidas en México son los micetomas, la esporotricosis y la cromomicosis.

Cuando el agente etiológico es una bacteria actinomicetal, se le denomina actinomicetoma,

por ejemplo: Nocardia brasiliensis, Nocardia asteroides, Actinomadura madurae,

Actinomadura pelletieri, Streptomyces somaliensis. En México la mayoría de los micetomas

son causados por bacterias, principalmente Nocardia. Cuando esta enfermedad es causada

por hongos, se le denomina eumicetoma, por ejemplo: Madurella mycetomatis, Madurella

grisea, Pyrenochaeta romeroi, Scedosporium apiospermum..

El Micetoma es un síndrome, que se caracteriza por localizarse inicialmente en el

tejido subcutáneo y de evolución crónica. Clínicamente, se observa un aumento de volumen

en la región afectada y la formación de fístulas, por las que drena un material seropurulento,

conteniendo los "granos". Estos, contienen en su interior conglomerados de hifas del

patógeno con aspecto de “bolas de estambre”.

Diagnóstico del micetoma:

- examen directo al microscopio de la secreción de una fístula que esté activa (la que cause

prurito). Si está cerrada se abre con ayuda de una aguja de disección; el exudado se recoge

con el asa para cultivo y para observación en un portaobjetos. Los “granos” fúngicos aunque

son muy pequeños, pueden distinguirse a simple vista, a diferencia de los de actinomycetos

que sólo se observarse bajo el microscopio.

- biopsia de las lesiones e histopatología

- cultivo de las lesiones o de un fragmento de biopsia

La Esporotricosis es producida por el hongo Sporothrix schenckii, un hongo

dimórfico, que afecta primordialmente la piel y los linfáticos, dando lesiones de aspecto

gomoso y que rara vez profundiza.

89

Diagnóstico de la esporotricosis:

El cultivo de la lesión es el mejor método de diagnóstico, aunque la intradermorreacción con

esporotricina es bastante específica.

La Cromomicosis es causada principalmente por hongos "dematiáceos" (negros).

En México son comunes Fonseca pedrosoi, Cladosporium y Phialophora verrucosa,

produciendo nódulos verrucosos localizados preferentemente en miembros inferiores,

expuestos a traumatismos.

Diagnóstico de la Cromomicosis:

- Examen directo al microscopio de escamas de las lesiones, entre porta y cubre con KOH,

dejando reposar 30 min.

- Cultivo de escamas en Sabouraud y micosel-agar, incubando 30-40 días a 28 C, hasta

observar el desarrollo de las colonias.

MATERIALES Y METODOS

1. Haga preparaciones entre porta y cubre con una gota de lactofenol, de los hongos

causantes de micosis subcutáneas, utilizando cepas puras. De preferencia, se recomienda

que el alumno reciba del profesor las preparaciones fijas de los hongos, para evitar el riesgo

de la manipulación por los alumnos y contacto con las esporas de los hongos. Haga dibujos

detallados del micelio y sus esporas observados al microscopio y compare con claves

taxonómicas para la identificación. Complemente con la descripción de la morfología

colonial de cada uno en el cultivo.

2. Tiña Actynomadura madurae y Nocardia brasiliensis con Gram y también con Ziehl-

Neelsen . De preferencia, también en estos casos reciba preparaciones fijas. Haga dibujos,

con sus colores correspondientes.

3. Compare la morfología colonial de las bacterias con la de los hongos. Describa las

diferencias. Haga dibujos.

4. Haga observaciones al microscopio, de laminillas conteniendo cortes histológicos de

tejidos infectados con estos hongos.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

90

Note las diferencias del micelio entre las bacterias actinomycetales y los hongos.

Qué dificultades tuvo en las observaciones de los patógenos al microscopio, al comparar con

los dibujos y fotografías de los libros de referencia.

CUESTIONARIO

1. Que zonas de México son epidémiológicas de micetoma y de esporotricosis.

2. Que núcleos de la población en México serían los más expuestos a las micosis

subcutáneas.

3. Cómo se caracterizan las células fumagoides en los hongos dematiáceos

91

PRACTICA # 5

MICOSIS SISTEMICAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA.

Determinar las diferencias macro y microscópicas de los hongos causantes de micosis

profundas y conocer las técnicas de diagnóstico.

INTRODUCCION.

Los hongos más comunes causantes de infecciones generalizadas o sistémicas son

Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis y

Paracoccidioides brasiliensis. Se desarrollan activamente en el suelo, donde producen

abundantes conidios; al madurar se desprenden y quedan libres en el aire. La entrada al

huésped es mediante la inhalación de dichos conidios. Este grupo de hongos muestra una

transición morfológica de la forma miceliar saprófita, a la parásita, que es la de levaduras

en la mayoría de ellos, como una respuesta a la adaptación. Este cambio es acompañado

por modificaciones metabólicas del hongo. Más del 90% de las infecciones son

asintomáticas o de breve duración, acompañadas de una fuerte resistencia específica a la

reinfección. En los pocos casos con infección residual o crónica, el proceso es semejante

a la tuberculosis. En el huésped hay factores individuales predisponentes a la enfermedad.

Presentan una distribución geográfica muy restringida. Estas infecciones han cobrado

nueva importancia en inmunodeprimidos, ya que en ellos la infección progresa

rápidamente con consecuencias fatales.

Histoplasma capsulatum es un hongo dimórfico, que en medio Sabouraud-dextrosa-agar

y a temperatura ambiente desarrolla una fase filamentosa asexual, con colonias

algodonosas, blancas a parduscas. El micelio da lugar a abundantes macroconidios típicos

redondos de doble membrana, espiculados (erizados) como “rondanas de reloj” de 8-18

um de diámetro. Los microconidios miden de 2-5 um. En gelosa sangre a 37C se obtiene

la fase parásita de la levadura. El estado sexual del hongo se forma en medio con extracto

de levadura, originando ascas y cleistotecios con características de los hongos

ascomycetos Gymnoascales. Crece naturalmente en suelos de espacios abiertos cerrados

o recintos como donde hay pájaros o murciélagos. Las epidemias con frecuencia están

asociadas con la presencia de excremento abundante de estos animales. Los

microconidios al ser inhalados, en el pulmón se transforman en levaduras dentro de los

espacios alveolares de e invaden las células del sistema fagocítico mononuclear.

Diagnóstico de laboratorio:

92

Examen directo: de frotis de sangre espesa o del material de punción esternal, para buscar

formas parasitarias.

Cultivo de esputo (menos efectivo que el anterior.)

Inmunología: IDR no tiene valor diagnóstico, sólo denota primocontacto.

Pruebas seriadas de fijación de complemento: son las más efectivas.

Coccidioides immitis es un hongo bifásico que presenta solo reproducción asexual. En

medio sabouraud- dextrosa- agar y a temperatura ambiente, desarrolla colonias blancas

algodonosas, cuyo micelio origina cadenas de artroconidios, que son liberados al

ambiente. En medio de Converse a 37C se produce la fase parásita de esférula. Se

desarrolla en suelos de clima desértico con suelos pobres. Los artroconidios libres son

inhalados y alcanzan los alveolos. En el tejido pulmonar toma lugar una morfogenesis

única entre los hongos sistémicos. El artroconidio se redondea y crece hasta formar un

cenocito llamado esférula de tamaño aproximado al de los neutrófilos. En su interior

ocurre una segmentación, dando lugar a una miriada de endosporas, que son liberadas al

romperse la pared. Cada endospora crece y forma una nueva esférula. Aún no se conoce

su etapa sexual, aunque existen evidencias genéticas de su sexualidad.

Diagnóstico de laboratorio: Examen directo: puede ser a partir de muestras de esputo,

lavados bronquiales, exudados de las lesiones secundarias, escamas, etc. Es posible

observar las esférulas de Coccidioides, o las levaduras correspondientes a la fase parásita

de otros hongos sistémicos.

Cultivo: De las mismas muestras tomadas para examen directo, se siembra una parte en

Sabouraud dextrosa agar, incubando a 28 C mas de una semana. El micelio desarrollara

los conidios correspondientes a cada género. Para Coccidioides no basta la observación

micróscopica, por la similitud de sus conidios con otros hongos, debiendo recurrir a

técnicas más exactas, como pruebas serológicas y estudios de DNA.

Pruebas inmunológicas:

IDR a la histoplasmina: solo tiene valor de primocontacto. Es positiva 4-8 semanas post-

infección.

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La fijación de complemento, la inmunodifusión en gel y la inmunofluorescencia, son

efectivas en el diagnóstico de Histoplasma y de Coccidioides, dando además información

del avance del padecimiento.

MATERIALES Y METODOS

1. Observe al microscopio preparaciones fijas de de hongos causantes de micosis

profundas. Haga dibujos detallados de las estructuras observadas. Diferencie las

formas saprófitas de las parásitas en cada caso.

2. En cada hongo anote la etapa observada de su desarrollo.

RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES.

Además de la observación de los hongos al microscopio, investigue el ciclo vital

completo, con los nombres de sus estructuras, para cada uno de los hongos observados y

relacione las fases observadas dentro de su ciclo correspondiente.

CUESTIONARIO:

1. En que áreas de México es endémica la coccidioidomicosis.

2. Relacione las condiciones climáticas de Cd. Juárez, con la posiblilidad de

endemicidad de Coccidioides en este lugar.

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