Profundizando en el riesgo (epi)genético a cáncer colorrectal: Nuevos genes responsables y marcadores moleculares para el cribado

Eva Hernández Illán

Profundizando en el riesgo (epi)genético a cáncer

colorrectal: Nuevos genes responsables y

marcadores moleculares para el cribado

EVA HERNÁNDEZ ILLÁN

TESIS DOCTORAL

Marzo 2016

Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología.

Facultad de Ciencias.

Fundación FISABIO-ISABIAL. Hospital General Universitario de Alicante.

Hospital General Universitario de Elche.

Profundizando en el riesgo (epi)genético a cáncer

colorrectal: Nuevos genes responsables y marcadores

moleculares para el cribado

EVA HERNÁNDEZ ILLÁN

Tesis presentada para aspirar al grado de DOCTORA POR LA

UNIVERSIDAD DE ALICANTE

MENCIÓN DE DOCTORA INTERNACIONAL

Programa de doctorado Biología Experimental y Aplicada.

Dirigida por:

Dra. Adela Castillejo Castillo Dr. Rodrigo Jover Martínez Dr. José Luis Soto Martínez

Marzo 2016

Departament of Physiology, Genetics and microbiology.

Faculty of Sciences.

FISABIO-ISABIAL Fundation. University General Hospital of Alicante.

University General Hospital of Elche.

Understanding further the (epi)genetic risk of colorectal

cancer: New candidate genes and molecular markers for

screening

EVA HERNÁNDEZ ILLÁN

DOCTORAL THESIS TO CONFER THE TITLE OF “INTERNATIONAL DOCTOR”

BY THE UNIVERSITY OF ALICANTE

PhD program of Experimental and Applied Biology

PhD Directors:

Dra. Adela Castillejo Castillo Dr. Rodrigo Jover Martínez Dr. José Luis Soto Martínez

Marzo 2016

Financiación

La doctoranda es beneficiaria de una Ayuda Predoctoral de Formación en

Salud (PFIS) del Instituto de Salud Carlos III en su convocatoria de 2012:

FI12/00233.

Proyectos de investigación que han financiado este trabajo de tesis doctoral:

Biomarcadores en la prevención del cáncer colorrectal (GCB13131592CAST).

Subproyecto 6: Desarrollo de biomarcadores genéticos y de metilación en

mucosa colorrectal sana.

IP. Antoni Castells; IP subproyecto 6: Rodrigo Jover Martínez.

Fundación Asociación Española Contra el Cáncer

2013-2018

1.200.000 €. Subproyecto 6: 224.880 €

Vía serrada de carcinogénesis en cáncer colorrectal: mecanismos y

marcadores moleculares. Implicaciones en el diagnóstico prevención y

tratamiento (PI11/02630).

Instituto de Salud Carlos III

IP: Rodrigo Jover Martínez.

2012-2014

171.325,11 €

Hipermetilación específica de los alelos mutados en tumores colorrectales con

inestabilidad de microsatélites (GV/2012/008).

Consellería Educación, Formación y Empleo Comunidad Valenciana.

IP: Adela Castillejo Castillo

2012-2013

12.000€

Caracterización clínica, histopatológica y molecula de los carcinomas

colorrectales con pérdida de expresión de MLH1, ausencia de hipermetilación

de su promotor y sin mutación en línea germinal (AP170/10).

Becas para el desarrollo de programas de investigación en materias sanitarias

para el año 2010. Consellería de Sanidad. Generalitat Valenciana.

IP: Artemio Payá Romá.

2010

8500€

Caracterización fenotípica y molecular de las poliposis colónicas atenuadas.

Papel de la actividad inflamatoria, resistencia insulínica y factores ambientales

(PI08/0726).

Instituto de Salud Carlos III

IP: Rodrigo Jover Martínez.

2009-2011

166.738€

A mi hermano

A mis padres

Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quiero agradecer haber llegado hasta aquí a mis directores de tesis,

por vuestra gran confianza depositada en mí desde el primer momento que pisé el

laboratorio. Rodrigo, gracias por dejarme formar parte de este maravilloso grupo. Por

transmitirme esa forma de ver la ciencia, en la que somos capaces de llegar mucho

más lejos de lo que creemos, y mostrarme el potencial clínico de nuestro trabajo. Por

tu capacidad de sacarnos una sonrisa en cualquier situación, tu optimismo y sosiego.

José Luis, gracias por transmitirme tu gran ilusión por la ciencia y por el permanente

aprendizaje que se consigue a tu lado. Por esa eterna disposición a ayudar y tu

asesoramiento 24h. Por abrirme la puerta a este mundo. Adela, eres mi mejor maestra

de la bancada. Gracias por tu paciencia, desde 3 columnas, 6 columnas hasta una

placa de PCR entera. Gracias por motivarme a superar los objetivos y por estar

siempre dispuesta a ayudarme.

Gracias al grupo EPICOLON, al grupo EPIPOLIP y al Programa de Cáncer Hereditario

de la Comunidad Valenciana, por su gran disposición y por permitirme sacar este

trabajo adelante. Gracias al equipo del laboratorio de Instituto Catalán de Oncología.

Sin vuestra colaboración esto no habría sido posible.

Gracias a los pacientes, porque todo esto es por y para ellos.

Porque esta aventura empezó en Elche mucho antes de mi matrícula en el doctorado,

así, tengo que agradecer en primer lugar a Isa la ayuda y paciencia desde el primer

día, te he dicho mil veces que eres incomparable profesional y personalmente. Eres el

motor del laboratorio. A Víctor, por enseñarme y ayudarme tanto en todo momento, por

ver siempre potencial en mi. A Espe, al final te adelantaste! Pero ahora volvemos a

empezar las dos, cada una una aventura diferente, en la que te deseo lo mejor! A los

demás compañeros del lab: Nati, Trini, Pilar y Miguel… A la mejor compañera de

comidas, Arantxa, por contagiarnos tu bonita sonrisa. A Vicky.

I would also like to thank all the colleagues at The Roslin Institute, during my time in

Edinburgh. Quería agradecer especialmente a Albert por acogerme y ayudarme en

todo momento. And also to Isobel, Suzanne and Amy, willing to help me whenever I

needed it. Thank you all for your patience with me. Enrique and Ricardo (English?

Spanish?) you were essential on that team too. Por otro lado, Zoe, Inga, Reyes y

Marta, fue maravilloso descubriros en aquella aventura, you are the reason why that

was one of the most exciting experiences of my life. Thank you for being part of it.

Agradecimientos

Y empieza la trayectoria en Alicante. Y tengo que empezar por ti Carla, que te conocí

mucho antes en Elche, cuando ya me impresionaste por el mero hecho de ser la

primera licenciada en Biotecnología que conocía, pero a partir de ahí has seguido

impresionándome, por todo lo que sabes, por tu gran capacidad de trabajo, tu enorme

compañerismo y como no, tu incansable espíritu de lucha. Gracias por hacerme parte

del grupo. Y las que también estáis en mi trayectoria a mitad camino entre Alicante y

Elche sois Ceci y Ana. Ceci, gracias por tu siempre desinteresada ayuda, por tu

templanza y por enseñarnos tanto, pero sobre todo a ser mejores personas. ¿Quién te

cantará que you are breaking my heart cuando nos separemos? Y Ana, desde aquel

verano de eternas sangres me llevas aguantando, y espero que muchos más, aunque

sea para ir a ver las pelis de Quim. Muchas gracias por enseñarme y apoyarme. Y

ahora sí, te toca Miri! ayyy cómo vamos a llorar cuando nos separemos, te grabaré

audios con sermones que ya te sabes de memoria. ¿Sabes que, aunque no te gusten

estas cosas, deberías compartir la autoría de la tesis conmigo no? Sin ti, esto no

podría haber sido posible. Eres una gran trabajadora y mejor persona; con un corazón

gigante que a lo mejor guardas en ese piso que no nos quieres enseñar. María,

demasiado poco tiempo coincidimos en el lab, pero el suficiente para descubrirte. Creo

que no soy la única que envidia tu determinación, tu seguridad en ti misma y tu

optimismo. Muchas gracias por tu gran ayuda y estar siempre disponible . Cristina

Alenda, muchas gracias por tu incondicional ayuda y tu capacidad de gestión y

solución de problemas, no sé qué sería del sector colon-UI sin ti. Gracias a Fany y el

resto del equipo de anatomía patológica del HGUA, imprescindibles en esta tesis. A

Lucía, que aunque casi no coincidiéramos, hiciste que “colon” pudiera ser un gran

grupo a día de hoy.

Y Araceli, aquí te ubico. Me encanta que formes parte del binomio colon-mama que

tenemos por despacho. Te deseo mucha suerte en tu futura etapa, porque te la

mereces. Laura, el diccionario de la UI con patas! Enhorabuena! El 2016 ahora sólo

puede ir a mejor, gracias por ser nuestra guía particular. También quiero agradecer al

resto de compañeros de la UI, por hacer el día a día más ameno: a Sandra, por

ayudarnos siempre; a Fer y a Reyes, que aunque os fuisteis muy pronto, sois un pilar

fundamental; a Elena y Eloy, también nos dejasteis muy pronto; a Bea y a Pura

(¿quién nos diría en el banquillo de las cadetes que aparecerías tú por aquí?); al

equipo micro –Antonio, Noemí e Inma- más vale tarde que nunca.

A los compañeros del Ciber, especialmente Paula, Alba, Bea y José Manuel, y a

Rubén, por facilitarnos siempre las cosas. A las chicas de la Fundación, especialmente

Agradecimientos

a Gema y Silvia, por su paciencia, disposición y encontrar siempre una solución a

todos nuestros problemas. Gema gracias por tus consejos.

Y como no, quiero dar las gracias a los compañeros del CEK de Barcelona por

acogerme: En primer lugar, a Jordi y a Francesc, para mi sois el cuarto y quinto

director de esta tesis. Muchas gracias por permitirme vivir esa experiencia y aceptarme

como una más. Y también especialmente a Jenny, Elena y Claudia, por su gran ayuda

y disponibilidad, y a Mini, por ser tan bonita. Pero también quiero dar las gracias a

Irene (qué penita haberte conocido tan tarde), Esther, Clara, Helena, Saray, Keyvan,

Sebas, Isa, Juanjo, y como no a Meritxell y a Sergi, por hacer de esa estancia una

etapa tan agradable.

Y siguiendo en Barcelona, en el Bar Camen and Co: Ana, Óscar, Carmen, Tania y

Gabri, sois muy bonicos, gracias por hacerme sentir como en casa. Ana, gracias por

estar ahí en tantos momentos de mi vida, las aventuras que hemos vivido son nada en

comparación con las que nos esperan! Y a Laura, el fondo norte de la calle Córcega.

Y bajando al sur tengo que parar por Valencia. Gracias a mis amores del poli y

especialmente a Eli, Carla y Mar, que con nuestros skypes a cuatro cada una en un

lado, sois parte imprescindible de esta historia.

Gracias a mis amigo/as de Ori que me hacen empezar todos los lunes con una

sonrisa. En especial a Nerea, te pongo aquí aunque eres parte de la familia. Gracias

por estar siempre a mi lado, desde antes del Gato con Botas hasta Bogotá y lo que

vendrá (RyM). A Emilio, por abrirme siempre la puerta con una sonrisa, eres un sol. A

Karlos, gracias por estar siempre, estando o sin estar, por confiar en mi más que yo

misma, por ser mi psicólogo particular y el mejor amigo. Gracias a María (por tu

felicidad, eterna comprensión y ánimo), Rocío (has llegado tarde pero pegando fuerte,

me encantas), Laura (siempre sacándonos sonrisas), y Arezu (por tu templanza, tu

alegría y tus reflexiones zen), sois imprescindibles y me encanta haberlo descubierto.

A Sito (por compartir esa forma de ver el mundo), a Marta G (por su energía y sus

martadas), a Taty y a Mari (por estar siempre ahí). Gracias a mis amores de Mar Azul,

especialmente a Paula y Andrea, por estar ahí contra viento y marea, creciendo juntas

como personas diferentes pero preciosas. Y a todos los demás, gracias.

A mi madre, a mi padre y a mi hermano (y a la otra rubia loca de la familia que me

alegra cada finde). Sin vosotros nada de esto sería posible, por creer en mí y guiarme

en esta aventura, gracias. Vicen gracias por sentarte conmigo y ayudarme a orientar

mi camino. A mi tía Nieves.

Abreviaturas

ABREVIATURAS

ACVR2A Activin A receptor type IIA

ADN Ácido desoxirribonucleico

APAF Poliposis Adenomatosa Familiar Atenuada

APC Adenomatous Polyposis Coli

ARNm Ácido ribonucleico mensajero

BAX BCL2-associated X protein

BMPR1A Bone morphogenetic protein receptor type IA

BRAF V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

BRCA2 Gen que codifica para el Breast Cancer 2

CCHNP Cáncer Colorrectal Hereditario No Polipósico

CCR Cáncer Colorrectal

CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CE Cáncer de Endometrio

CIMP CpG Island Methylator Phenotype (Fenotipo metilador en islas CpG)

CIN Chromosome Instability (Inestabilidad cromosómica)

DCC DCC netrin 1 receptor

Dx Diagnóstico

EPCAM Epithelial cell adhesion molecule

FAN1 FANCD2/FANCI-associated nuclease 1

FBXW7 F-box and WD repeat domain containing 7

FDA Food and Drugs Administration

GALNT12 Polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 12

GIST Gastrointestinal stromal tumor (Tumor gastrointestinal estromal)

GREM1 Gremlin 1, DAN family BMP antagonist

HGUA Hospital General Universitario de Alicante

HGUE Hospital General Universitario de Elche

Abreviaturas

HNRNPA0 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0

ICO Instituto Catalán de Oncología

IHQ Inmunohistoquímica

IMS Microsatellite Instability (Inestabilidad de microsatélites)

kDa kiloDalton

KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

LINE-1 Long interspersed nuclear element-1

LOH Loss of Heterozygosity (Pérdida de heterocigosidad)

LRRFIP2 Leucine rich repeat (in FLII) interacting protein 2

MAP MUTYH-associated polyposis (Poliposis asociada a MUTYH)

MGMT O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

MLH1 MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli)

MLH1 Gen que codifica para el MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis

type 2 (E. coli)

MLPA Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification

MMR Mismatch Repair (Sistema reparador de errores)

MSH2 MutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)

MSH2 Gen que codifica para el MutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis

type 1 (E. coli)

MSH6 MutS homolog 6, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli)

MSH6 Gen que codifica para el MutS homolog 6, colon cancer, nonpolyposis

type 1 (E. coli)

MS-MLPA Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification

MSS Microsatellite Stability (Estabilidad de microsatélites)

MUTYH MutY DNA glycosylase

NGS Next Generation Sequencing (secuenciación de nueva generación)

NRAS Neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog

NTHL1 Nth-like DNA glycosylase 1

OMS Organización Mundial de la Salud

PAF Poliposis Adenomatosa Familiar

Abreviaturas

pb Pares de bases

PCR Polymerase chain reaction (Reacción en cadena de la polimerasa)

PIK3CA Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha

PMS2 PMS2 postmeiotic segregation increased 2 (S. cerevisiae)

PMS2 Gen que codifica para el PMS2 postmeiotic segregation increased 2 (S.

cerevisiae)

POLD1 Polymerase (DNA directed), delta 1, catalytic subunit

POLE Polymerase (DNA directed), epsilon, catalytic subunit

PPAP Polymerase proof-reading asociated polyposis (Poliposis asociada a la

actividad correctora de errores de las polimerasas)

PTEN Phosphatase and tensin homolog

qPCR PCR cuantitativa

RPS20 Ribosomal protein S20

SEMA4A Sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain

(TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4A

SIR Standarized Incidence Ratio (Tasa de Incidencia Estandarizada)

SMAD2 SMAD family member 2

SMAD4 SMAD family member 4

SNC Sistema Nervioso Central

STK11 Serine/threonine kinase 11

TCGA The Cancer Genome Atlas Network

TGBR2 Transforming Growth Factor beta receptor 2

TGF-beta Transforming Growth Factor beta

TMA Tissue Microarray

TP53 Tumor protein p53

VSI Variante de Significado Incierto

WIF1 WNT inhibitory factor 1

Índice

INDICE

Resumen de la Tesis Doctoral i

Thesis Abstract iii

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1. El cáncer colorrectal 1

1.1.1. Epidemiología del CCR 1

1.1.2. Etiología del CCR 2

1.1.3. Estadiaje y tratamiento 5

1.1.3. Vías de carcinogénesis colorrectal 6

1.1.3.1. Vía de la Inestabilidad cromosómica (CIN) 7

1.1.3.2. Vía de la Inestabilidad de microsatélites (IMS) 8

1.1.3.3. Vía del fenotipo metilador (CIMP) o Vía Serrada 10

1.2. Cáncer colorrectal hereditario no polipósico 11

1.2.1. Síndrome de Lynch 11

1.2.1.1. Generalidades 11

1.2.1.2. Características clínicas y de vigilancia 13

1.2.1.3. Criterios diagnósticos 15

1.2.1.4. Algoritmo diagnóstico del SL 17

1.2.1.5. Tipo de mutaciones en el SL 19

1.2.1.5.1. Epimutaciones constitucionales en MLH1 20

1.2.2. CCR familiar tipo X 23

1.3. Síndromes de poliposis familiar 24

1.3.1. Poliposis adenomatosa familiar 25

1.3.2. Poliposis asociada a MUTYH 26

Indice

1.3.3. Otros síndromes polipósicos de predisposición a CCR 28

1.4. Poliposis asociada a la actividad correctora de errores de las

polimerasas (PPAP) 29

1.4.1. Función de POLE y POLD1 y su implicación en el proceso carcinogénico 30

1.4.2. Mutaciones de POLE y POLD1 descritas en cáncer 31

1.4.2.1. Mutaciones germinales en POLE y POLD1 31

1.4.2.2. Mutaciones somáticas en POLE y POLD1 33

2. HIPÓTESIS 39

3. OBJETIVOS 43

4. MATERIAL Y MÉTODOS 47

4.1. Artículo 1 47

4.1.1. Pacientes y muestras biológicas 47

4.1.2. Plan de trabajo 48

4.1.3. Cribado molecular de los tumores sospechosos de SL 49

4.1.3.1. Inmunohistoquímica de las proteínas MMR 49

4.1.3.2. Inestabilidad de microsatélites 49

4.1.3.3. Análisis de la metilación de MLH1 50

4.1.3.4. Análisis de la mutación de BRAF V600E 51

4.1.3.4.1. Genotipado por qPCR 51

4.1.3.4.2. Secuenciación Sanger 51

4.1.3.5. Análisis de mutaciones germinales en los genes MMR 52

4.1.3.6. Análisis de la secuencia de la región promotora de MLH1 53

4.1.4. Análisis estadístico 53

4.2. Artículo 2 55

4.2.1. Pacientes y muestras biológicas 55

Índice

4.2.2. Plan de trabajo 57

4.2.3. Estudio de las mutaciones germinales en POLE y POLD1 58

4.2.3.1. Serie 1 (Ensayos de genotipado KASPAR) 58

4.2.3.2. Serie 2 (Secuenciación Sanger) 59

4.2.4. Análisis de predicción in silico 59

4.2.5. Estudio de pérdida de heterocigosidad (LOH) en POLE 60

4.2.5.1. Mateo por microsatélites 60

4.2.5.2. SNAPshot para la mutación POLE_Leu424Val 60

4.2.6. Análisis de las mutaciones somáticas en BRAF, KRAS y NRAS 61

5. RESULTADOS 65

5.1. Artículo 1 67

5.2. Artículo 2 75

6. DISCUSIÓN 87

7. CONCLUSIONES 105

7. BIBLIOGRAFÍA 109

8. ANEXOS 125

ANEXO I. Algoritmo de estudio genético de SL siguiendo la Estrategia Universal 125

ANEXO II. Algoritmo de estudio genético de SL en pacientes que cumplen

criterios de Bethesda 127

ANEXO III. Algoritmo de estudio genético de poliposis adenomatosa familiar 129

ANEXO IV. Mutaciones en los dominios exonucleasa de POLE y POLD1

descritas en pacientes oncológicos previas a la publicación del Artículo 2 131

ANEXO V. Cebadores y condiciones empleados para la amplificación de

regiones de distintos genes 133

Indice

ANEXO VI. Árboles genealógicos de las cinco familias con epimutaciones

del artículo 1 135

ANEXO VII. Árboles genealógicos de las nuevas familias descritas en

nuestra serie con las mutaciones POLE_Leu424Val y POLD1_Leu474Pro

posteriores a la publicación del segundo artículo 137

ANEXO VIII. Identificación de las tres mutaciones recurrentes de POLE y POLD1 en las nuevas publicaciones posteriores al segundo artículo de esta tesis 139

ANEXO IX. Nuevas mutaciones germinales identificadas en los dominios

exonucleasa de POLE y POLD1 en pacientes con cáncer posteriores a la

publicación del segundo artículo de esta tesis. 141

ANEXO X. Propuesta de características clínicas para la sospecha de PPAP 143

ANEXO XI. Trabajo realizado por la doctoranda en esta tesis doctoral 145

ANEXO XII. Otras publicaciones en las que ha participado la doctoranda 147

Resumen de la Tesis Doctoral

i

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL

El cáncer colorrectal (CCR) constituye en la actualidad la neoplasia más frecuente en

España. Hasta un 30% de los casos de CCR se incluyen dentro del CCR familiar y

alrededor de un 3-5% se deben a mutaciones en genes de elevada penetrancia que

siguen una herencia mendeliana Éstos últimos incluyen al CCR hereditario no

polipósico: principalmente el Síndrome de Lynch (SL), debido a mutaciones germinales

en los genes de sistema reparador de errores (MMR) MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2; y

varios síndromes polipósicos, como la poliposis adenomatosa familiar, asociada al gen

APC y la poliposis asociada al gen MUTYH.

En aproximadamente un 70% de los casos analizados de pacientes con sospecha de

SL no se encuentran mutaciones germinales y en torno a un 10% de estos casos, con

pérdida de expresión de MLH1 e hipermetilación del promotor de dicho gen en su

tumor, se explican por epimutaciones constitucionales en MLH1. No obstante, la

prevalencia de este fenómeno en la población general es desconocida.

También existen casos de CCR con elevada carga familiar, pero sin alteración del

sistema MMR, de los que se desconoce su origen genético (CCR familiar tipo X). Lo

mismo ocurre para algunos casos de poliposis adenomatosa con agregación familiar,

que no se explican por mutaciones en los genes APC o MUTYH. Recientemente se

han descrito dos mutaciones recurrentes en los genes POLE y POLD1 (p.Leu424Val y

p.Ser478Asn respectivamente) como responsables de un pequeño porcentaje de estos

casos de CCR y poliposis no clasificados pero, debido a la escasez de casos descritos

hasta la fecha, fenotipo clínico exacto no se ha definido.

Así, los objetivos de este trabajo han sido: en primer lugar, determinar la prevalencia

de las epimutaciones constitucionales en MLH1 como una causa de SL en una serie

no seleccionada de CCR y compararla con la prevalencia de este fenómeno en una

serie seleccionada; y en segundo lugar, analizar la prevalencia de las mutaciones

recurrentes en los genes POLE y POLD1 en casos de CCR y poliposis familiar de

aparición temprana, sin mutación en los genes responsables de los síndromes de

sospecha, y así contribuir a definir el fenotipo clínico asociado a las mutaciones en

dichos genes.

Resumen de la Tesis Doctoral

ii

Se evaluó la prevalencia de epimutaciones constitucionales de MLH1 en una cohorte

de CCR no seleccionado, y se comparó con una cohorte de CCR familiar

seleccionado. Así, no se detectaron epimutaciones constitucionales en MLH1 en la

población no seleccionada. No obstante, el 15,6% de la serie seleccionada fueron

positivos para epimutaciones en MLH1. Por otro lado, se realizó la búsqueda de

mutaciones recurrentes en POLE y POLD1 en casos de CCR y/o poliposis familiar

mediante ensayos de genotipado KASPar y/o secuenciación Sanger. Se identificó la

mutación POLE_p.Leu424Val como mutación de novo, ningún caso presentó la

mutación POLD1_p.Ser478Asn, pero se identificó una nueva mutación en POLD1:

p.Leu474Pro, con patogenicidad sustentada mediante diversas aproximaciones, en

una familia de CCR familiar tipo X con también casos de cáncer de endometrio.

Así, estos resultados sugieren una prevalencia insignificante de epimutaciones

constitucionales en MLH1 en cohortes no seleccionadas de CCR. Así, el análisis de

epimutación constitucional en MLH1 debería dirigirse exclusivamente a pacientes que

cumplen los criterios revisados de Bethesda y cuyo tumor presente pérdida de

expresión y metilación de MLH1. Por otro lado, las mutaciones en POLE y POLD1

explican una pequeña proporción de casos de CCR y poliposis familiar. La

secuenciación de al menos estas mutaciones recurrentes debería considerarse en el

diagnóstico genético rutinario de los casos con sospecha de CCR o poliposis

hereditarios, sin mutaciones en los genes de sospecha clásicos.

Thesis Abstract

iii

THESIS ABSTRACT

Colorectal cancer (CRC) is the most common malignancy in Spain nowadays. Up to

30% of CRCs are included within the familial CRC and about 3-5% of them are caused

by mutations in high penetrance genes that follow a Mendelian inheritance The latter

include hereditary nonpolyposis CRC: mainly Lynch Syndrome (LS), caused by

germline mutations in the mismatch repair (MMR) genes: MLH1, MSH2, MSH6 and

PMS2; and various polyposis syndromes, such as familial adenomatous polyposis,

associated with the APC gene and MUTYH-associated polyposis.

in approximately 70% of the analyzed cases with suspected LS, no pathogenic

mutations are found. Around 10% of these non-informative cases that have tumor

MLH1 loss of expression and promoter hypermethylation of the gene are explained by

constitutional epimutations of MLH1. However, the prevalence of this phenomenon in

general population is unknown.

There are also cases of CRC with high family aggregation, but with proficient MMR

system, where the genetic origin is unknown (familial CRC type X). The same is shown

in some cases of familial adenomatous polyposis, that are not explained by APC either

MUTYH mutations. Recently, two recurrent mutations in the POLE and POLD1 genes

(p.Leu424Val and p.Ser478Asn respectively) has been described as responsible for a

small percentage of these unclassified cases of familiar CRC and polyposis, but due to

the scarcity of cases reported to date, its accurate clinical phenotype has not been

defined yet.

Thus, the aims of this work were: first, to determine the prevalence of constitutional

epimutations in MLH1 as a cause of SL in an unselected CRC series and compare it

with the prevalence of this phenomenon in a selected series; and secondly, to analyze

the prevalence of the two recurrent mutations in POLE and POLD1 in familial CRC and

polyposis cases with early age of onset and no mutation in the genes responsible for

the suspected syndromes, and so contribute to define the clinical phenotype

associated to the mutations in these genes.

We firstly evaluated the prevalence of MLH1 constitutional epimutations among in a

cohort unselected CRC, and compared it to a cohort of selected familial CRC. No

constitutional MLH1 epimutations were detected in the unselected population.

Thesis Abstract

iv

However, 15.6% of the selected series were positive for epimutations in MLH1.

Secondly we analyzed the recurrent mutations in POLE and POLD1 in familial CRC

cases and / or polyposis by Kaspar genotyping assays or Sanger sequencing. The

mutation POLE_p.Leu424Val was identified as de novo mutation in one patient, no

case harbored POLD1_p.Ser478Asn mutation, but a new mutation in POLD1 was

identified: p.Leu474Pro with supported pathogenicity by different approaches, in a

family of familial CRC type X with also cases of endometrial cancer.

Thus, our results suggest a negligible prevalence of MLH1 constitutional epimutations

in non-selected cohort of CRC. Therefore, the constitutional analysis in MLH1

epimutation should be exclusively directed to patients who meet revised Bethesda

criteria and whose tumors show MLH1 loss of expression and methylation. Besides,

mutations in POLE and POLD1 account for a small proportion of familial cases of

polyposis and CRC. Sequencing of at least these recurrent mutations should be

considered on the routine genetic diagnosis of cases with suspected hereditary CRC or

polyposis without mutations in the classical suspected genes.

INTRODUCCIÓN

Introducción

1

1.1. El cáncer colorrectal

1.1.1. Epidemiología del CCR

El cáncer es, junto con las enfermedades cardiovasculares, la principal causa de

morbi-mortalidad en los países desarrollados (1).

El cáncer colorrectal (CCR) representa un problema de salud pública importante y

global, tratándose del tercer cáncer más común en varones en todo el mundo y el

segundo en mujeres. A pesar de ello, es más frecuente en varones que en mujeres.

Datos de Globocan de 2012 reflejan una prevalencia global de CCR en 2012 de 1,59

millones de casos a los 5 años, con una incidencia de 1,36 millones de nuevos casos,

siendo más frecuente en los países desarrollados (2-3). Debido a la mejora en la

prevención, diagnóstico y tratamiento, la tasa de muerte por CCR ha disminuido,

siendo los datos mundiales para 2012 de 694.000 casos. La media de edad de

diagnóstico del CCR es 68 años para los hombres y 72 para las mujeres (4).

En España, en el año 2012 el CCR fue el tumor que presentó mayor incidencia y

mortalidad considerando ambos sexos (3) (Figura 1), siendo el tercero más prevalente,

por detrás del cáncer de mama y de próstata.

Figura 1. Incidencia y mortalidad para los distintos tipos de cáncer en España en 2012.

Extraído de (3).

Introducción

2

Las estimaciones de la Sociedad Española de Oncología Médica sugieren una

continuación de esta tendencia en la actualidad, diagnosticándose más de 220.000

nuevos casos en 2015, lo que supone un coste sanitario de 37.000€ por paciente

afecto. No obstante, sólo el 39% de los pacientes se diagnostican en estadios

precoces (4), por lo que la implantación de medidas de diagnóstico precoz son

requeridas para frenar el avance de estas cifras.

1.1.2. Etiología del CCR

El cáncer es un conjunto de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular

excesivo y una capacidad de invasión de otros tejidos u órganos. El epitelio colónico

se encuentra en renovación constante; para ello, las células madre de las criptas

migran a la superficie a medida que se van diferenciando. Durante este proceso, las

células pueden acumular alteraciones genéticas (mutaciones) en el ADN (ácido

desoxirribonucleico) y cambios epigenéticos que hacen que dejen de responder a los

mecanismos que regulan el crecimiento celular y controlan la homeostasis tisular.

Cuando este crecimiento excesivo se acompaña de la capacidad de invadir tejidos

circundantes, y diseminarse por todo el torrente sanguíneo o el sistema linfático para

colonizar otros órganos secundarios, aparece la enfermedad metastásica invasiva.

Así, estos hechos son el resultado de la sucesiva acumulación de alteraciones

genéticas y epigenéticas, que superan los umbrales de las tasas de mutación

normales, confiriéndole a la célula una mayor capacidad proliferativa, que sobrepasa

los mecanismos de control de la división celular (5). Por tanto, la inestabilidad genética

o genómica, que proporcione las herramientas celulares para superar las barreras de

homeostasis tisular y tener una ventaja en el crecimiento, es un requisito para el

desarrollo del cáncer.

De esta forma, en el caso del CCR, se pasa por varios estadios de desarrollo: las

células normales del epitelio colónico pasan a ser lesiones benignas o pólipos –

principalmente de histología adenomatosa o serrada-, éstas derivan a

adenocarcinomas totalmente desarrollados pero que no llegan a ser invasivos, y

finalmente aparece la enfermedad metastásica invasiva. No obstante, los adenomas

convencionales habitualmente no progresan, y los que progresan a una lesión maligna

suelen hacerlo de forma lenta. Por ello, las estrategias de cribado mediante

colonoscopias y resección de adenomas son de gran importancia.

Introducción

3

El origen de esta inestabilidad genética es multifactorial: puede ser adquirido por

alteraciones somáticas, como consecuencia de factores ambientales carcinogénicos; o

bien heredado por mutaciones en línea germinal, dando lugar a los cánceres de tipo

esporádico y familiar respectivamente.

La gran mayoría de casos de CCR se deben a alteraciones de tipo somático. Hasta un

30% se incluyen dentro del CCR familiar (aquellos que tienen uno o más familiares con

diagnóstico de CCR) y alrededor de un 3-5% de los casos de CCR se deben a

mutaciones en genes de elevada penetrancia que siguen una herencia mendeliana (6-

7) (Figura 2). Los casos de CCR hereditario pueden ser de tipo polipósico o no

polipósico, en función del número total de pólipos a lo largo del colon que tenga e l

paciente. Los primeros engloban los síndromes de poliposis adenomatosa (cuando el

individuo presenta más de 10 adenomas) y los síndromes hamartomatosos, donde se

incluyen la poliposis juvenil, el síndrome de Cowden y el síndrome de Peutz-Jeghers.

El síndrome de cáncer hereditario más prevalente es el Cáncer Colorrectal Hereditario

No Polipósico (CCHNP), que engloba al Síndrome de Lynch (SL) y al CCR familiar tipo

X, que representa en torno al 1-3% de todos los tumores colorrectales (8), seguido por

la poliposis adenomatosa familiar (PAF) (0,5% del total de CCR), la poliposis asociada

a MUTYH (MAP), y otros síndromes menos frecuentes. La prevalencia de estos

síndromes, los genes responsables, riesgo a CCR a lo largo de la vida y principales

características, se engloban en la tabla 1:

Introducción

4

Tabla 1. Principales características de los diferentes síndromes hereditarios de predisposición

a CCR.

D: dominante; R: recesivo; Dx: diagnóstico

Figura 2. Prevalencia de las distintas entidades de CCR.

Síndrome Prevalencia Gen Riesgo a

cáncer (%)

Edad

Dx

Heren

cia

Polipó

sico Fenotipo colónico

Lynch 1: 500

MLH1

MSH2

MSH6

PMS2

EPCAM

41

48

12

15-20

75

27-66 D No

CCR proximal,

pobremente diferenciado,

mucinoso, células en anillo

de sello, infiltrado

linfocitario

PAF 1:35.000 -

1:50.000 APC 68-100 38-58 D Sí

Múlt iples pólipos

adenomatosos (10-1000s)

MAP 1:20.000-

1:40.000(9)

MUTYH 43-100 48-50 R Sí

Pólipos adenomatosos o

CCR s in adenomas

Poliposis

Juvenil

1:16.000 –

1:100.000(10)

SMAD4

BMPR1A 9-50 34-44 D Sí Pólipos juveniles

Peutz-

Jeghers

1:50.000 -

1:200.000(6)

STK11 39 42-46 D Sí Hamartomas

Cowden 1:200.000(11)

PTEN 9 44-48 D Sí Hamartomas

PPAP Desconoc ida POLE

POLD1 Desconoc ido 20 D Sí

CCR y/o múltiples pólipos

adenomatosos

Introducción

5

1.1.3. Estadiaje y tratamiento

El estadio tumoral es el principal factor pronóstico del CCR, determinando la

supervivencia y el tratamiento de los pacientes.

La clasificación de los distintos estadios del CCR se basa en el sistema TNM, que se

definió en la International Union Against Cancer (12) y que considera la base

anatómica y la biología del tumor. Así, se definen los distintos estadios de CCR en

función del nivel de extensión del tumor primario en las paredes del intestino y la

invasión de los tejidos anexos (T), la presencia o no de afectación de los ganglios

linfáticos (N) y la presencia confirmada de metástasis a distancia (M). La supervivencia

de los pacientes con CCR se relaciona inversamente con estos estadios, según se

refleja en la tabla 2.

Tabla 2. Estadios del CCR y supervivencia. Adaptado de (4, 13-14).

ESTADIO DESCRIPCIÓN Correspondencia TNM Supervivencia

a 5 años (%)

0

Fase más temprana del CCR. Las

células tumorales están situadas en

la parte más superficial de la mucosa

sin traspasarla.

TisN0M0 >95%

I

El tumor afecta a la pared sin

traspasar la capa muscular. No existe

afectación de ganglios linfáticos.

T1N0M0

T2N0M0 74-93,2%

II

El tumor ha infiltrado todas las capas

de la pared. Puede invadir los

órganos de alrededor. No se aprecia

afectación ganglionar.

IIA: T3N0M0

IIB: T4aN0M0

IIC: T4bN0M0

64,5-84,7%

51,6-79,6%

32,3-58,8%

III

El tumor ha invadido los tejidos

anexos y afecta a los ganglios

linfáticos.

IIIA: T1-T2N1M0

IIIB: T3-T4N1M0

IIIC: T(cualquier)N2M0

73,1-83,4%

46,3-64,1%

8-44,3%

IV

El cáncer se ha diseminado

afectando a órganos alejados del

colon o recto como hígado, pulmón o

huesos.

T(cualquier)N(cualquier)

M1 5,7-8,1%

Tis: tumor “in situ”, confinado a la mucosa, que no traspasa las capas de la misma; T1: tumor que invade

la submucosa; T2: tumor que invade la muscularis propia; T3: tumor que llega hasta la subserosa o los

tejidos grasos perirectales; T4a: tumor que invade la superficie del peritoneo; T4b: tumor que invade

tejidos de órganos adyacentes; N0: ausencia de afectación ganglionar; N1: presencia de afectación

tumoral en 1 a 3 glánglios linfáticos perirectales; N2: afectación de 4 o más ganglios linfáticos; M0:

ausencia de metástasis; M1: presencia de metástasis a distancia.

Introducción

6

El tratamiento para los pacientes con cáncer de colon y recto varía según la

localización del tumor y el estadio al momento del diagnóstico. En estadios iniciales (I

y II) la cirugía normalmente es el único tratamiento necesario, siendo más común en

cáncer de colon (94%) que de recto (74%). Sin embargo, en estadios más avanzados

la quimioterapia sola o en combinación con radioterapia antes o después de la cirugía,

es más frecuente, especialmente en cáncer de recto (50-70%) (15).

1.1.3. Vías de carcinogénesis colorrectal

Como se ha comentado anteriormente, la carcinogénesis colorrectal implica varias

etapas secuenciales, en las que primero se forma la lesión benigna, y mediante la

acumulación de alteraciones genéticas y/o epigenéticas a nivel tisular se desarrolla

finalmente el carcinoma invasivo. Así, la inestabilidad genética y/o epigenética es

imprescindible para el desarrollo y avance del tumor; y además, el tipo de alteraciones

que se vayan acumulando va a condicionar en gran manera la historia natural del

tumor y el pronóstico del paciente.

En la actualidad se aceptan tres vías de carcinogénesis colorrectal desde el punto de

vista de las alteraciones moleculares subyacentes: vía de la inestabilidad cromosómica

(CIN), vía de la inestabilidad de microsatélites (IMS) y vía del fenotipo metilador de

islas CpG (CIMP) o vía serrada. Estas tres vías no son excluyentes y puede haber

interacciones entre ellas y tumores que presenten simultáneamente características de

más de una vía (Figura 3). Constantemente se están describiendo nuevos genes e

interacciones entre rutas, matizando la definición y características de cada una de las

vías. Además, en los últimos años se han establecido otros sistemas y vías

involucrados en la patogénesis del CCR, incluyendo aspectos relacionados con la

inflamación o los perfiles de microRNAs (16).

Introducción

7

CIN

IMS

CIMP

Célula madre colon normal

Célula madre colon normal

Célula madre colon normal

FCA displásicas

FCA displásicas

FCA displásicas

Adenoma temprano

Adenoma temprano

Lesión serrada

temprana

Adenoma avanzado

Adenoma avanzado

Adenoma serrado CCR

CCR

CCRCCR

metastásico

CCRmetastásico

CCRmetastásico

KRAS

APCVía señalización Wnt

TP53TGFBR2/SMAD4

PIK3CAKRAS

EMASTOtros factores

MLH1 BRAF

Acumulación de aneuploidía

Acumulación de mutaciones frameshift

Acumulación de genes metilados

Figura 3. Progresión de las distintas vías de carcinogénesis colorrectal e interacción entre las

mismas. Adaptado de (17).

FCA: Focos de criptas aberrantes. EMAST: Elevated microsatellite instability at selected

tetranucleotide repeats.

1.1.3.1. Vía de la Inestabilidad Cromosómica (CIN)

La gran mayoría de los CCR se originan por una inestabilidad generalizada de

tipo cromosómico. En población española representa en torno al 92% de los casos

(18). Estos tumores se desarrollan de acuerdo al modelo clásico de progresión

adenoma-carcinoma propuesto por Vogelstein y Fearon en 1990, produciéndose

numerosas alteraciones que implican la activación en determinados oncogenes

(KRAS) y la inhibición de genes supresores de tumores (APC, TP53, DCC, SMAD4)

(19). Estos tumores se vuelven aneuploides de manera temprana en la progresión,

presentando pérdidas de material genético por errores de recombinación mitótica

(pérdida de heterocigosidad o LOH), así como grandes reordenamientos

cromosómicos que llevan a la progresión tumoral.

Introducción

8

El factor iniciador de la vía es la inactivación del gen supresor de tumores APC (20), lo

que tiene lugar de manera temprana durante el desarrollo de pólipos. Posteriormente,

mutaciones en KRAS aparecen durante el estadio de adenoma, y por último, la

transición a la malignidad coincide con mutaciones en TP53, TGF-beta, PIK3CA y

deleciones del cromosoma 18q (21-24) (Figura 3). En esta vía, generalmente, las

aneuploidías y pérdida de genes supresores han sido asociadas a mal pronóstico (25).

1.1.3.2. Vía de la Inestibilidad de Microsatélites (IMS)

Los microsatélites son secuencias cortas (1-6 pares de bases) repetidas en tándem,

distribuidas por todo el genoma. Su estructura repetitiva las hace proclives a que se

produzca el deslizamiento de la polimerasa durante la replicación previa a la división

celular, produciendo errores de emparejamiento en las hembras de ADN y pequeños

bucles. En condiciones normales, estos errores serán reparados por el sistema de

reparación de ADN de los errores de la replicación (MMR). Este sistema está formado

principalmente por cuatro proteínas: MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2. Estas proteínas

forman dos complejos heterodiméricos que, en primer lugar reconocen el error (MSH2-

MSH6) y posteriormente se le une el segundo complejo (MLH1-PMS2) que coordina la

interacción con otras proteínas necesarias para la reparación del mismo en la hebra

recién sintetizada (26).

La pérdida de función de cualquiera de los elementos que intervienen en este

mecanismo produce la acumulación de errores de tipo inserción o deleción (frameshift)

a lo largo de todo el genoma tras la replicación del ADN. Si los microsatélites se

encuentran en la región codificante de los genes, estos errores pueden ocasionar

pérdida de función por generar frameshift, codones de stop prematuros y por

consiguiente, proteínas truncadas y defectuosas. Genes que codifican para procesos

como el control del ciclo celular, apoptosis o la reparación del ADN (oncogenes y

genes supresores de tumores) presentan microsatélites en su región codificante, y por

tanto, son diana de este tipo de mutaciones. Solamente si la pérdida de funcionalidad

de estas proteínas supone una ventaja en la progresión tumoral los clones mutados

serán seleccionados y contribuirán al fenotipo oncológico (26). De esta forma surgen

los tumores con fenotipo IMS, que tienen una elevada tasa de mutaciones puntuales –

fenotipo hipermutador- y pocas anomalías cromosómicas, siendo la gran mayoría de

ellos diploides (26), al contrario que los tumores que siguen la vía CIN (27).

Introducción

9

El principal gen diana de mutación en los tumores que presentan IMS es TGFBR2, que

aparece en el 80% de los casos en lesiones avanzadas como adenomas con displasia

de alto grado (28-29). Otros genes frecuentemente mutados son SMAD2 y SMAD4

(30), ACVR2A (31) y el gen supresor de tumores BAX (32).

Actualmente, el diagnóstico de IMS se realiza de modo consensuado analizando un

panel de cinco marcadores de microsatélites casi monomórficos que muestran una alta

sensibilidad y especificidad para su detección (BAT25, BAT26, NR21, NR24 y NR27).

Patrones alterados en al menos dos de los cinco marcadores evidencian fenotipo IMS-

alta, cuando un solo marcador está alterado se considera IMS-baja y la ausencia de

alteración en los cinco marcadores define un tumor estable (MSS) (33) (Figura 4). El

estudio de la actividad de las proteínas MMR mediante inmunohistoquímica (IHQ)

también se emplea activamente para la detección indirecta de la IMS, ya que evidencia

la pérdida de función del sistema MMR y muestra una correlación prácticamente

absoluta con la IMS.

Las revisiones realizadas en población general muestran que en torno al 12-17% de

todos los CCR se desarrollan a través de esta vía de carcinogénesis (26). En

población española, no obstante, este porcentaje no supera el 10% (18).

Aproximadamente el 80-85% de estos CCR IMS son casos esporádicos, donde el

fenotipo IMS se debe a la hipermetilación somática del promotor del gen MLH1 (34).

Pero hay un pequeño porcentaje de casos (15-20%) que son de origen hereditario: los

pacientes con SL, donde la alteración del sistema MMR ocurre a nivel germinal (26).

Los CCR que se desarrollan a través de la vía de la IMS, sean esporádicos o

hereditarios, comparten determinadas características:

- Se encuentran con más frecuencia en colon proximal y muestran crecimiento

tumoral de tipo expansivo (35).

- Su presentación histológica es frecuentemente de tipo mucinoso, medular, en

anillo de sello; siendo poco diferenciados y con frecuente infiltración linfocitaria

peri e intratumoral (36-39).

- En general tienen mejor pronóstico y supervivencia que el resto de los CCR

(40-41).

- No parecen responder a tratamientos quimioterápicos basados en 5-

fluorouracilo (42-43).

Introducción

10

1.1.3.3. Vía del fenotipo metilador (CIMP) o Vía Serrada

Las islas CpG son regiones que comprenden de 0,5 a 2 Kb, ricas en dinucleótidos

citosina-guanina que están presentes en la región promotora de aproximadamente el

50% de los genes humanos (44-45). La metilación de las mísmas puede producir el

silenciamiento transcripcional de aquellos genes que las contienen.

Recientemente se ha descrito la vía del fenotipo metilador de islas CpG (CIMP) o vía

serrada como vía iniciadora del CCR, la cual se caracteriza por la hipermetilación de

islas CpG en zonas promotoras de genes supresores de tumores. En este caso la

célula requiere de una inestabilidad epigenética para garantizar la progresión tumoral.

Se puede asumir que la metilación de estas regiones en la mayoría de los tumores se

origina de forma estocástica, pudiendo afectar a la expresión de genes importantes en

el desarrollo neoplásico, tales como CDKN2A, MGMT y MLH1 (46-48).

En esta vía, los llamados pólipos serrados, que han sido tradicionalmente

considerados como lesiones benignas sin capacidad de malignización, sustituyen al

adenoma clásico como lesión precursora al cáncer. Parece que entre el 15 y el 30%

de todos los CCR podrían estar asociados a esta vía (49).

El perfil mutacional de estos tumores difiere con respecto a aquellos que tienen el

adenoma como lesión precursora, aunque existe cierto solapamiento con los

subgrupos de tumores CIN e IMS, ya que la hipermetilación puede inactivar genes

requeridos para la inestabilidad cromosómica o la reparación de errores en el ADN

(Figura 3).

El CIMP normalmente es el primer evento de la acumulación de una serie de

alteraciones, que parecen tener la mutación activadora V600E del oncogén BRAF

como precursora. Esta mutación se considera un fuerte marcador de CCR de or igen

esporádico y de lesiones serradas. Existe una fuerte asociación entre el CIMP, la

mutación de BRAF y la IMS, probablemente debida ésta última a la hipermetilación

somática de MLH1 vinculada a este fenotipo metilador (50). Así, la mayoría de los

CCR esporádicos IMS son CIMP+. Sin embargo, los adenomas clásicos estarían

asociados a tumores MSS y, donde la presencia de mutaciones en BRAF y el fenotipo

CIMP son poco frecuentes (51).

Introducción

11

De forma similar a los tumores esporádicos IMS, los CCR CIMP+ parecen asociarse a

buen pronóstico (52) y no parecen responder a la quimioterapia basada en el 5-

fluoracilo (27, 53).

1.2. Cáncer colorrectal hereditario no polipósico (CCHNP)

Se estima en un 20-30% los casos de CCR en los que hay un componente hereditario,

bien sea de alta penetrancia (los síndromes de CCR hereditario típicos citados

anteriormente) o de penetrancia moderada o baja (54). Estos últimos son menos

evidentes y su componente genético es menos conocido. Los síndromes de CCR

familiar pueden ser polipósicos o no polipósicos, en función del número total de

pólipos. Los últimos son los más frecuentes e implican normalmente un número total

de pólipos adenomatosos a lo largo del colon inferior a 10. Dentro de los síndromes de

CCHNP cabe señalar el SL y el CCR familiar tipo X, cuyo origen genético es

desconocido.

1.2.1. Síndrome de Lynch

1.2.1.1. Generalidades

El SL es el síndrome de CCR hereditario más prevalente, representando

aproximadamente el 3% de todos los casos de CCR (26). En población española no

seleccionada se ha observado una frecuencia del 0,7% del total de casos de CCR

(18), en un estudio donde se analizaron únicamente los genes MLH1 y MSH2. El SL

sigue una herencia mendeliana de tipo autosómico dominante, debido a mutaciones

germinales en los genes del sistema MMR. Principalmente MLH1 y MSH2, que

explican un 70% de los casos, seguidos de MSH6 que explicaría un 15-20% de los

casos, y en menor medida PMS2 que explica menos del 5% de los casos (55-56).

Posteriormente se describieron deleciones en EPCAM, gen localizado aguas arriba de

MSH2, como responsables de alrededor del 1% de los casos de SL (8, 57-58).

EPCAM es un gen que codifica para una molécula de adhesión presente en todos los

tejidos epiteliales. Las deleciones en línea germinal del mismo provocan la

hipermetilación somática indirecta de MSH2 en aquellos tejidos donde EPCAM se

expresa. Por consiguiente, la deleción implica la hipermetilación de MSH2 del alelo

que la contiene en todo el epitelio del tracto digestivo.

Introducción

12

El mecanismo de actuación genético implica la alteración a nivel germinal de uno de

los alelos de estos genes, y posteriormente, en el colon o tejido correspondiente se

inactivaría a nivel somático el segundo alelo no afectado, según la teoría del segundo

hit. Esta inactivación se puede dar por una mutación puntual, LOH, o por

hipermetilación del alelo no afecto (59-60). Así, se da lugar a un CCR con fenotipo

hipermutador, cuyo sello molecular característico es la IMS, presente en más del 90%

de estos tumores (61).

Los pacientes con SL tienen un riesgo elevado de desarrollar CCR, pero también otros

tumores: principalmente endometrio, y menos frecuentemente ovario, tracto urinario

superior, gástrico, intestino delgado, sistema hepatobiliar, páncreas, de piel

(adenomas sebáceos y queratoacantomas) y cerebrales (62). Típicamente los tumores

y pólipos aparecen a edades tempranas, con un riesgo estimado de desarrollo de CCR

a lo largo de la vida de entre el 22-75% y entre un 32-45% para el desarrollo de cáncer

de endometrio (CE) (63-66). No obstante, la penetrancia de la enfermedad, edad de

aparición y riesgo de tumores extracolónicos varía en función del gen mutado y el tipo

de mutación: siendo más agresivo el comportamiento para los individuos portadores

de mutaciones en MLH1 o MSH2, con más riesgo de tumores extracolónicos estos

últimos, y menor para los portadores de mutaciones en MSH6 y PMS2; aunque parece

que el riesgo de CE es más elevado en los portadores de mutaciones en MSH6 (67-

70).

Tabla 3. Características epidemiológicas de los individuos portadores de mutaciones en los

distintos genes MMR.

MLH1 MSH2 MSH6 PMS2

Frecuencia (8) 50% 40% 7-10% <5%

Edad aparición (68) 43-46 43-46 51-57 61-66*

Riesgo a desarrollar CCR (70

años)(71) 40-70% 40-70% 10-22% 15-20%

Riesgo a desarrollar CE (70 años) (71) 35-40% 35-40% 17-44% 15%

* Para CCR

Introducción

13

También existen diferencias en la penetrancia de estas mutaciones asociadas a SL en

función del sexo del individuo, siendo tradicionalmente más frecuente en varones, y en

función del origen geográfico. Así, el riesgo de CCR a los 70 años es mayor en países

como Finlandia (52-82%) (66, 72) y Escocia, con diferencias más acentuadas en

función del sexo en este último (74% varones versus 30% mujeres) (73), y más bajo

en los Países Bajos, con pocas diferencias en los dos sexos (27% en varones versus

22% en mujeres) (63).

Como se ha explicado anteriormente, las características histológicas de los CCR de

los pacientes con SL coinciden con las características de los CCR esporádicos con

fenotipo IMS. Así, estos tumores se caracterizan por ser más frecuentemente

mucinosos, pobremente diferenciados, presentar linfocitosis intraepitelial y ser más

frecuentes en colon proximal.

Existen pacientes con mutaciones germinales en estos genes MMR que muestran

otros fenotipos diferentes al convencional. En estos casos, el síndrome adopta otra

nomenclatura (8):

Síndrome de Muir-Torre: cuando aparecen neoplasias sebáceas en la piel

(adenomas sebáceos, epiteliomas sebáceos, carcinomas sebáceos y

queratoacantomas) en combinación con los tumores típicos del SL.

Síndrome de Turcot: cuando aparece un CCR o adenomas colorrectales en

combinación con tumores del sistema nervioso central (a veces también puede

estar causado por mutaciones en APC).

Pacientes con deficiencia constitucional para los genes MMR: de forma

muy poco frecuente se han observado individuos con mutaciones germinales

bialélicas patogénicas en MMR. Estos individuos presentan CCR o cáncer de

intestino delgado a edades muy tempranas (<20 años), y suelen presentar

además un mayor número de pólipos, tumores cerebrales, neoplasias

hematológicas, y un fenotipo similar al de la neurofibromatosis tipo I.

1.2.1.2. Características clínicas y de vigilancia

La identificación de familias portadoras de mutaciones en los genes reparadores

responsables del SL es de vital importancia para la prevención del cáncer y su

Introducción

14

seguimiento, habiéndose demostrado el coste-efectividad del mismo (74-76). Tan

importante es la identificación y seguimiento del caso índice como el estudio genético

predictivo en familiares a riesgo, ya que el manejo y seguimiento de alto riesgo de los

portadores de mutación es lo que aporta el componente de eficiencia en la predicción-

prevención de la enfermedad. Además, la metodología para el estudio directo de la

mutación encontrada en el familiar de primer grado del caso índice a riesgo es rápida y

económica.

Se ha observado que el seguimiento de los pacientes portadores de mutaciones

germinales previene más del 60% de los tumores y de las muertes relacionadas con

cáncer (77). La realización de una colonoscopia cada tres años conduce a una

reducción de la mortalidad en un 65% (77), ya que permite extirpar pólipos y detectar

el CCR en estadios tempranos. La reducción del riesgo a CCR y la mortalidad se ve

aumentada cuando las colonoscopias se realizan cada 1-2 años (78). Así, en la

actualidad, se recomienda la realización de colonoscopias de control cada 1 -2 años,

iniciando el cribado a los 20-25 años o 10 años antes del diagnóstico más joven en la

familia, en función de lo que ocurra primero.

La prevalencia de CE en mujeres portadoras de mutaciones en los genes del SL es

muy elevada (30-45%) (79). Aunque el pronóstico no es malo, el 20% de estas

mujeres morirán debido a esta enfermedad. Sin embargo, el método de cribado de CE

en SL es controvertido. Actualmente, los consensos de expertos recomiendan la

realización de una ecografía transvaginal y biopsia endometrial de manera anual en

mujeres portadoras a partir de los 30-35 años de edad (80). El mismo seguimiento se

recomienda para cáncer de ovario (81).

La eficacia del cribado de otras neoplasias asociadas al SL no está validada y su

realización se basa en opiniones de expertos. Para cáncer gástrico se recomienda el

cribado inicial mediante endoscopia digestiva alta y biopsia en personas a riesgo a

partir de los 30-35 años cada 2-3 años, y tratamiento de la infección Helicobacter pylori

si se detecta, aunque no existe un consenso generalizado. Para otras neoplasias, o

bien no se recomienda cribado (páncreas, intestino delgado), o bien las

recomendaciones son las mismas que las de la población general (mama, próstata)

(81).

Una vez la mutación causante del SL es detectada, además del seguimiento

exhaustivo del paciente, otras medidas para la disminución del riesgo a desarrollar

Introducción

15

cáncer deben considerarse: El consumo de aspirina como estrategia de

quimioprevención, ya que se ha visto una reducción significativa de la incidencia de

cánceres en pacientes con SL. Así como cirugías reductoras del riesgo, como la

colectomía total con anastomosis ileorrectal para CCR, que ha demostrado la

reducción en el riesgo de aparición de lesiones colónicas metacronas; o la

histerectomía y salpingooforectomía bilateral profiláctica en tumores ginecológicos,

que se recomiendan después de que la paciente haya completado sus deseos de

descendencia (81).

1.2.1.3. Criterios diagnósticos

Se han establecido unos criterios clínicos consenso para el diagnóstico de SL, que

tienen como finalidad identificar pacientes con alto riesgo de SL y establecer

estrategias de vigilancia adecuadas en ellos y sus familiares para reducir el riesgo de

aparición de cáncer.

Los criterios de Amsterdam I fueron definidos en 1991 (82). Estos criterios consideran

la historia familiar de cáncer y la edad al diagnóstico de CCR y detectan familias con

un elevado riesgo de tener SL. Posteriormente en 1999 aparecieron los cr iterios de

Amsterdam II, que tienen en cuenta, además de los casos de CCR, otros tumores

extracolónicos (83) (Tabla 4). Sin embargo, estos criterios son muy estrictos,

presentan una elevada especificidad pero baja sensibilidad para la detección de

portadores de mutaciones germinales en MMR. Por ello, en la conferencia del National

Cancer Institute de 1997, se definieron los Criterios de Bethesda, que han sido

revisados posteriormente (84). Estos últimos criterios son menos estrictos que los

anteriores, aumentando la sensibilidad mediante la identificación de los tumores

extracolónicos, y la adición de características patológicas del tumor, que tienen en

cuenta el fenotipo inestable presente en la práctica totalidad de los tumores SL (Tabla

4).

Introducción

16

Tabla 4. Criterios clínicos para el diagnóstico del SL.

CRITERIOS DE AMSTERDAM II

Tres o más individuos afectados de CCR o neoplasia asociada al SL (CE, intestino

delgado, SNC, ovario, uréter o pelvis renal), uno de ellos familiar de primer grado de los

otros dos.

Afectación de 2 generaciones consecutivas.

Como mínimo un caso diagnosticado antes de los 50 años.

Exclusión del diagnóstico de poliposis adenomatosa familiar

Los tumores deben estar confirmados histopatológicamente.

CRITERIOS REVISADOS DE BETHESDA

CCR diagnosticado en paciente antes de los 50 años.

Presencia de CCR sincrónico o metacrónico u otra neoplasia asociada al SL (CE,

estomago, ovario, páncreas, vía biliar, urinario, cerebro, intestino delgado, adenomas

sebáceos o queratoancatomas), con independencia de la edad.

CCR con infiltración linfocitaria, células en anillo de sello o crecimiento medular

diagnosticado antes de los 60 años.

Paciente con CCR y uno o más familiares de 1er grado con CCR o neoplasia asociada a

SL diagnosticada antes de los 50 años.

Paciente con CCR y dos o más familiares de 1er o 2º grado con CCR o asociada a SL, con

independencia de la edad.

SNC: Sistema nervioso central

A pesar de ello, cuando la presentación clínica y la historia familiar son indicadoras de

SL, la probabilidad de encontrar mutación es tan sólo del 50% (85) y en el mejor de los

casos, cuando la familia cumple criterios de Amsterdam y los tumores son inestables,

esta probabilidad aumenta a un 70-80% (61, 86). Globalmente en aproximadamente el

40% de las familias que cumplen criterios de Amsterdam para el diagnóstico de SL, no

se encuentra defecto en el sistema MMR (87). Estos casos, conocidos como CCR

familiar tipo X no presentan, por tanto, IMS en sus tumores, ni alteraciones germinales

en los genes MMR.

Así, a pesar de la implementación de los criterios revisados de Bethesda, más de la

tercera parte de los portadores de mutaciones en el sistema MMR no son detectados

(88) y en ocasiones, estos criterios no son bien implementados en la práctica clínica, o

son criticados por su compleja aplicación. Por lo que se ha recomendado el estudio del

sistema MMR a todos los pacientes con CCR (o todos los individuos con CCR o CE

diagnosticado antes de los 70 años de edad), independientemente de los criterios

clínicos, para la detección de casos sospechosos de SL, lo que se conoce como la

Introducción

17

estrategia de cribado universal (Anexo I). Se han publicado diversos estudios en este

sentido que sostienen una mayor sensibilidad de esta estrategia de manera coste-

efectiva (89-90) respecto a la realización del cribado únicamente en los pacientes que

cumplen los criterios de revisados Bethesda (91-93).

El estudio de la alteración del sistema MMR se puede realizar mediante el análisis de

IMS o el análisis de expresión de las proteínas MMR mediante IHQ en tejido tumoral.

Así, esta estrategia universal permite identificar individuos con sospecha de SL y

alteración del sistema MMR, en los que en muchas ocasiones la causa genética

germinal subyacente es desconocida, por lo que puede contribuir a la acumulación de

casos sospechosos de SL no resueltos.

1.2.1.4. Algoritmo diagnóstico del SL

Actualmente en la mayoría de sistemas sanitarios la selección de pacientes para la

realización de pruebas genéticas para detectar SL se basa en el cumplimiento de al

menos uno de los criterios revisados de Bethesda o en alguna estrategia del análisis

del estado del sistema de reparación del ADN (MMR). Existen algoritmos diagnósticos

que se implementan en las unidades de Consejo Genético en Cáncer para la correcta

identificación de mutaciones germinales responsables del SL (Anexo II).

Así, el estudio genético del SL consta de dos etapas principales: en la primera se

realiza un cribado en el que se estudia la pérdida de actividad de las proteínas del

sistema MMR por IHQ y/o IMS; y en los casos en los que este cribado resulte positivo,

se procede a la segunda etapa de rastreo de mutaciones germinales en los genes

MMR.

El estudio de IMS se realiza sobre el ADN del tejido tumoral. Para ello se utilizan los

cinco marcadores quasi-monomórficos de mononucleótidos repetidos descritos (94),

que se analizan mediante PCR y electroforesis capilar (Figura 4).

Por su parte, el estudio de las proteínas reparadoras mediante IHQ se basa en la

tinción histológica con anticuerpos y determina si éstas están presentes o no en el

tumor, lo que supone un buen indicador de su inactivación como consecuencia de una

mutación germinal o un silenciamiento epigenético (Figura 4).

Introducción

18

Figura 4. Ejemplos del resultado del estudio de la inactivación del sistema MMR

mediante IHQ (a) o IMS (b).

a) Ejemplo de análisis IHQ de un tumor con pérdida de expresión de MLH1/PMS2 (tumor 1) y

de MSH2/MSH6 (tumor 2). b) Resultados del análisis de los 5 marcadores de IMS por análisis

de fragmentos.

Así, el resultado del estudio IHQ permite clasificar el tejido tumoral como con

expresión conservada, pérdida de expresión o expresión no valorable para cada

proteína; y crear un patrón de expresión del sistema MMR. A partir del mismo se

puede orientar el rastreo de mutaciones según se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Genes diana para el rastreo mutacional en función del patrón de expresión de las

proteínas MMR.

Genes diana

de

mutaciones

Patrón de pérdida IHQ

MLH1 MSH2 MSH6 PMS2

MLH1 - + + -

MSH2, MSH6 + - - +

MSH6 + + - +

PMS2 + + + -

MLH1, MSH2,

MSH6, PMS2 - - - -

Introducción

19

La correlación de resultados entre ambas metodologías es muy alta, pero pueden

emplearse de forma complementaria, sobre todo para resolver situaciones de falsos

negativos que, aunque son poco frecuentes, existen (18). La IHQ, además de ser más

asequible en la práctica clínica habitual, tiene como valor añadido que permite orientar

el estudio genético hacia el/los genes que muestran expresión alterada. La mayoría de

mutaciones en los genes MLH1 y MSH2 dan lugar a una expresión anormal de sus

proteínas correspondientes; en cambio las mutaciones en MSH6 pueden mostrar un

patrón IHQ normal. Lo mismo ocurre con el fenotipo IMS, habiéndose descrito tumores

estables con mutación germinal en MSH6 (95).

La presencia de IMS o la pérdida de expresión de proteínas MMR por IHQ no son

exclusivas de SL; como ya se ha comentado, la IMS se asocia fuertemente a la

mutación BRAF_V600E, exclusivamente en CCR esporádico (96). Por otro lado, la

pérdida de actividad en MLH1 puede estar debida a la inactivación somática del gen

por metilación de su promotor. Por ello, en aquellos estudios genéticos de SL en los

que hay sospecha del posible origen esporádico del tumor (casos Bethesda), conviene

descartar estos eventos –mutación en BRAF o metilación en MLH1- antes de orientar

el estudio genético de los genes MMR.

El algoritmo diagnóstico para el análisis genético del SL se muestra en el anexo II.

Finalmente, se realizará el estudio guiado de las mutaciones germinales, que implica,

por un lado, el estudio de mutaciones puntuales mediante secuenciación Sanger de la

región codificante completa y las uniones intrón-exón del gen en cuestión; y por otro

lado, el estudio de grandes reordenamientos genéticos en dichos genes mediante

MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification).

1.2.1.5. Tipos de mutaciones en el SL

Así, siguiendo el respectivo algoritmo diagnóstico de SL (Anexo I o II) se pueden

detectar diferentes tipos de mutaciones germinales en MMR:

Mutaciones puntuales: pueden ser mutaciones sin sentido (nonsense); de

desplazamiento del patrón de lectura (frameshift), mutaciones de sentido

erróneo (missense) y mutaciones de splicing. Las dos primeras generalmente

suelen tener efectos deletéreos, y las dos últimas en ocasiones pueden dar

lugar a variantes de significado incierto (VSI), en las que se desconoce su

patogenicidad. Las mutaciones missense son mucho más frecuentes en MLH1

Introducción

20

que en MSH2, ya que en éste último el 83% del total de mutaciones son sin

sentido o frameshift (97).

Grandes reordenamientos: se trata de deleciones o duplicaciones que afectan

a grandes regiones exónicas en alguno de los genes reparadores. Se detectan

fácilmente mediante la técnica MLPA. Las grandes deleciones explican un 22%

de las mutaciones en MLH1 y PMS2, un 26% de las mutaciones en MSH2 y un

7% de las mutaciones en MSH6 (54). Además, como ya se ha descrito, se han

observado deleciones en los últimos exones de EPCAM asociadas al

silenciamiento epigenético por metilación del gen MSH2 (57-58). Estos tumores

presentan pérdida de MSH2 en su análisis IHQ. Las duplicaciones en genes

reparadores en SL son menos frecuentes.

Inversiones: Se han identificado inversiones paracéntricas en MSH2 (98-101),

así como en el cromosoma 3p22.2, lo que crea dos nuevas fusiones de

transcritos entre MLH1 y LRRFIP2 (102-103), como causantes de SL. Estas

alteraciones no son detectables mediante la metodología de análisis

mutacional clásica empleada para el diagnóstico del SL (Anexos I y II).

1.2.1.5.1. Epimutaciones constitucionales en MLH1

Aún con todo, en un porcentaje elevado de casos con sospecha de SL no se detectan

mutaciones a nivel germinal de los genes del sistema MMR.

Recientemente se ha observado que algunos casos con fenotipo de SL son causados

por inactivación epigenética a nivel constitucional de MLH1 mediante metilación de su

promotor, lo que implica la inactivación transcripcional del mismo (104). En estos

casos se produce la metilación hemialélica en las citosinas seguidas de guaninas del

promotor MLH1 a nivel germinal, en tejidos normales y, al igual que ocurre cuando hay

una mutación, es la inactivación somática del segundo alelo la que desencadenaría el

desarrollo de cáncer.

En el promotor de MLH1 hay una isla CpG constituída por varias regiones. En las

regiones C y D (posiciones -248 a -178 y -109 a +15 respectivamente) se localiza el

core del promotor, responsable de la regulación transcripcional de MLH1, y cuya

metilación se asocia directamente con la pérdida de expresión del gen (104). Estas

regiones controlan la transcripción a través de la regulación de la unión de los factores

Introducción

21

de transcripción al promotor de MLH1 (105). La metilación interfiere en la unión de los

mismos e incrementa la afinidad de las proteínas de unión a grupos metilos y

desacetilasas de histonas, que conducen a configuraciones inactivas de la cromatina,

provocando el silenciamiento genético. Por lo tanto, los estudios de metilación deben

enfocarse en esta zona (104). La técnica MS-MLPA ha demostrado ser coste-efectiva

para la realización de este análisis (106).

Figura 5. Metilación en el promotor de MLH1, sondas del MS-MLPA. Adaptado de (107)

La región enmarcada es aquella cuya metilación está relacionada con la inactivación del gen.

La revisión del tema realizada por Hitchins en 2013 (108) recopila hasta la fecha 54

casos índice con tumor con fenotipo de SL, en los que la causa de la enfermedad es la

epimutación constitucional en MLH1. La mayoría de estos casos cumplen al menos un

criterio de Bethesda. No suelen cumplir criterios de Amsterdam, posiblemente debido a

la falta de patrón de herencia mendeliano. Presentan una edad de aparición temprana

(media 39 ± 11 años) y desarrollan frecuentemente tumores metacronos relacionados

con SL (108). Además, estos tumores presentan ausencia de la mutación V600E de

BRAF.

La frecuencia de las epimutaciones en MLH1 oscila entre el 0 y el 14% de los casos

analizados, en función de los criterios de selección de los mismos: si bien se han

descartado sólo las mutaciones germinales en los genes MMR, o, en cambio se ha

filtrado por edad joven, IMS, pérdida IHQ o metilación de MLH1 (108). Se ha calculado

que las epimutaciones en MLH1 explican en torno al 10% de los casos que cumplen

los siguientes criterios: 1) cumplimiento de al menos un criterio de Bethesda; 2) tumor

con pérdida de MLH1 e IMS; 3) no mutación patogénica encontrada mediante el

rastreo genético habitual (109).

Introducción

22

La mayoría de estos casos con epimutaciones constitucionales en MLH1 descritos

hasta la fecha no tienen una fuerte agregación familiar de cáncer. En los pocos casos

en los que se ha podido estudiar a la familia, se han descrito tres patrones diferentes

de herencia intergeneracional:

1) Aparición de la epimutación constitucional de MLH1 de novo y desaparición

en la descendencia. Esto se ha observado en tres familias en las que se han

estudiado tres generaciones de individuos, y se ha observado la herencia del

alelo materno que contiene la epimutación en las tres generaciones, pero esta

metilación está ausente en la generación ancestral y en la descendencia, así

como en los espermatozoides de los individuos portadores. Estos casos, por

tanto, no contribuyen a la heredabilidad del cáncer (108, 110).

2) Transmisión no mendeliana de la epimutación. Se ha observado en una

familia en la que la madre afecta, de los tres hijos a los que transmite el alelo

portador de la epimutación, sólo en un caso transmite la metilación. Además, al

igual que antes, este caso no muestra epimutación en sus espermatozoides

(108, 111).

3) Posible transmisión autosómica dominante de la epimutación ligada a una

alteración genética en cis o en trans: cabe destacar el caso de una familia de

tres generaciones en la que se observa el ligamiento de la epimutación en

MLH1 con el cambio c.-27C>A en el mismo gen, a pesar de que en uno de los

individuos se observa de nuevo la eliminación de esta metilación en sus células

germinales (108, 110).

Con todo ello, el mecanismo por el que aparecen estas epimutaciones constitucionales

en MLH1 y se transmiten a una proporción de la descendencia actualmente es

desconocido. Puede haber una herencia de base epigenética, aunque se sabe que

esto es muy lábil, debido a la reprogramación epigenética que tiene lugar en la

gametogénesis; o bien puede resultar de una predisposición genética (caso 3), como

ocurre en el caso de EPCAM y MSH2. Este mecanismo de inactivación ha sido

descrito únicamente en un individuo por el momento (112). No obstante, esta hipótesis

está en duda, dado que si así fuera, debería observarse una herencia mendeliana de

la enfermedad como ocurre con EPCAM, y no parece ser el caso.

Introducción

23

En definitiva, el carácter hereditario de estos casos es débil en comparación con las

mutaciones germinales, por lo que las epimutaciones deben sospecharse en

individuos jóvenes, sin historia familiar, que presentan tumores inestables con pérdida

de MLH1. En cualquier caso es imprescindible considerar el posible origen germinal de

estos casos con metilación en MLH1, ya que el fenotipo de los pacientes parece

agresivo, similar al de los pacientes con SL. Por ello, se considera necesario incluir el

análisis de epimutaciones constitucionales de MLH1 dentro del algoritmo diagnóstico

del SL, a pesar del desconocimiento del mecanismo subyacente de esta alteración.

Las estrategias, por tanto, de seguimiento de los individuos y los familiares deben ser

las mismas que las consideradas para los pacientes con SL.

1.2.2. CCR familiar tipo X

Lindor y colaboradores (113) describieron por primera vez en 2005 el CCR familiar tipo

X como aquellos individuos con CCR que cumplen los criterios de Amsterdam para el

diagnóstico de SL, pero sus tumores son MSS, y no presentan pérdida de expresión

de las proteínas reparadoras ni mutación germinal en los genes MMR. Estos casos

representan aproximadamente la mitad de los casos de CCHNP que cumplen los

criterios de Amsterdam (114) y sus familias presentan una tasa de incidencia

estandarizada de CCR del doble respecto a la población general (SIR: 2,3) (113).

En comparación con los pacientes con SL, los individuos con CCR familiar tipo X

tienen una incidencia más baja de CCR, menor riesgo de desarrollar tumores

extracolónicos, y presentan una edad al diagnóstico del CCR más avanzada, en torno

a 10 años superior (7, 87). Los tumores de estos pacientes, además de diferir con los

del fenotipo del SL en mantener el sistema MMR intacto, suelen presentar CIN y

ausencia de CIMP (87) a pesar de presentar metilación aberrante en LINE-1 (115); y

no predomina la localización proximal ni los tumores mucinosos (116).

Desde el punto de vista genético, parece tratarse de un grupo heterogéneo de

individuos, que abarca varios grupos con diversas etiologías que podrían explicar el

origen de la enfermedad: genes de elevada penetrancia; mecanismos alternativos de

silenciamiento génico como epimutaciones o microRNAs; alelos de baja penetrancia

en combinación con factores ambientales,etc. (7, 87).

Introducción

24

Los estudios enfocados en la búsqueda de genes candidatos hasta la fecha han sido

escasos y sólo se han encontrado mutaciones de forma aislada. Las nuevas

tecnologías de secuenciación masiva están permitiendo un abordaje más eficiente,

mediante la búsqueda de genes de forma no dirigida, aunque pocos son los resultados

descritos en este sentido. La siguiente tabla muestra un resumen de potenciales genes

causantes de CCR familiar tipo X identificados hasta la fecha, siguiendo tanto

metodologías clásicas de biología molecular como técnicas de análisis genético de

nueva generación:

Tabla 6. Genes mutados en familias con CCR familiar tipo X.

Gen Frecuencia

n (%) Referencia

BRCA2 4/48 (8,3) (117)

BMPR1A 2/18 (11,1) (118)

POLD1 ND (119)

POLE ND (119)

FAN1 5/176 (2,8) (120)

GALNT12 4/118 (3.4)*

(0/103) (121) (122)

HNRNPA0-WIF1 ND (123)

RPS20 1/26 (3,8) (124)

SEMA4A 1/54 (1,8) (125)

*En los casos analizados en este estudio se incluyen pacientes que cumplen criterios de

Bethesda.

ND: No hay datos.

Otros eventos genéticos germinales, como la elongación de los telómeros, también

han sido asociados a las familias con este síndrome (126).

1.3. Síndromes de poliposis familiar

El diagnóstico diferencial del SL debe excluir pacientes con CCR de aparición

temprana y riesgo familiar con otros síndromes de predisposición a cáncer, que se

caracterizan principalmente por la aparición de múltiples pólipos. Estos síndromes

Introducción

25

incluyen la PAF, MAP, los síndromes de poliposis hamartomatosa (poliposis juvenil,

síndrome de Cowden y Peutz-Jeghers) y la polipolis mixta hereditaria. La prevalencia

de los síndromes de poliposis hereditarios es muy baja (Tabla 1).

Cada síndrome de poliposis colorrectal presenta un patrón de herencia , unas

características fenotípicas y manifestaciones extracolónicas propias. No obstante, en

ocasiones existen problemas de asociación fenotipo-genotipo, debido al solapamiento

de los mismos o incluso, entre los síndromes polipósicos y no polipósicos, habiéndose

encontrado casos de síndrome de poliposis familiar que debutan directamente como

CCR.

Los pólipos se pueden clasificar en distintos tipos según su histología, principalmente:

adenomas, pólipos serrados, pólipos hamartomatosos y pólipos inflamatorios. Estas

lesiones son benignas pero un pequeño porcentaje de ellas puede llegar a malignizar,

dando lugar finalmente al CCR. La capacidad de malignización difiere en función de la

histología, tamaño, displasia y características intrínsecas del individuo. Por lo que,

además del problema de los fenotipos solapantes asociados a distintos defectos

germinales, la dificultad diagnóstica de estos síndromes se debe en muchas ocasiones

al difícil reconocimiento de los pólipos más pequeños o planos, a un desarrollo

incompleto del pólipo a la hora de la cirugía y a una difícil clasificación histológica.

1.3.1. Poliposis adenomatosa familiar

La PAF (OMIM #175100) se trata de una enfermedad con herencia autosómica

dominante responsable de alrededor de un 0,5% de los CCR (127). En el fenotipo

adulto clásico, el desarrollo de los adenomas colorrectales provoca la aparición de

CCR en prácticamente el 100% de los casos si no se actúa, por lo que es necesario el

tratamiento quirúrgico profiláctico. El riesgo de CCR en pacientes con PAF aumenta de

forma significativa después de la segunda década de vida y éste suele aparecer a

partir de la 4ª-5ª década.

No obstante, se trata de una enfermedad con fenotipo variable en la que se pueden

distinguir claramente dos fenotipos: la PAF clásica, caracterizada por la presencia de

cientos a miles de pólipos adenomatosos a lo largo del intestino, con mayor tendencia

en el colon distal; y la poliposis adenomatosa familiar atenuada (APAF), cuyos

Introducción

26

individuos desarrollan menos de 100 pólipos y lo hacen más frecuentemente en colon

proximal (128). Parece que el riesgo a CCR en estos pacientes con APAF (<70%) es

menor que en PAF y el CCR es de aparición más tardía (129).

Este síndrome tiene una expresividad variable, con la presencia frecuente de

manifestaciones extracolónicas: pólipos gástricos y duodenales, tumores desmoides,

tumores cerebrales y de tiroides, osteomas, hipertrofia congénita del epitelio retinoso

pigmentario, dientes supernumerarios y quistes epidermoides (129-130); aunque éstas

son menos comunes en los individuos con el fenotipo atenuado.

Mutaciones en línea germinal en el gen APC (5q21-q22), que codifica para una

proteína con función supresora de tumores, explican el 70-90% de los casos. Además,

aproximadamente un 20-25% de los casos de PAF son debidos a mutaciones de novo

(127). Las mutaciones descritas se distribuyen de forma homogénea a lo largo del gen,

exceptuando dos hot spots (codones 1061 y 1309) que representan el 30% de los

casos. El fenotipo expresado y las manifestaciones extracolónicas estarán

determinados por la región de APC afectada. No obstante, en casi un tercio de familias

con PAF y un 85% en el caso de pacientes con APAF, el resultado del estudio

genético para APC es negativo.

1.3.2. Poliposis asociada a MUTYH (MAP)

Hasta un 7,5% de los casos con un fenotipo de PAF y un 35% adicional en el caso de

APAF, pueden ser explicados por mutaciones bialélicas germinales en MUTYH (131).

Se calcula que la incidencia de este síndrome es de 1/10.000, representando el 0,5-

1% de todos los casos de CCR, siendo tan prevalente como los casos de PAF

asociados a mutaciones en APC. Los pacientes con MAP presentan un riesgo

acumulado de desarrollar CCR a los 70 años de aproximadamente el 80% en ausencia

de tratamiento, siendo la edad al diagnóstico de CCR de 45-50 años, con una

localización predominante en colon proximal (132).

El fenotipo clínico típico de MAP es de poliposis atenuada, aunque en ocasiones

puede mimetizar a la PAF (9). También es frecuente encontrar pacientes con pólipos

serrados en este síndrome, pudiendo algunos de ellos cumplir los criterios de la OMS

para el diagnóstico del Síndrome de Poliposis Serrada (133-134). No obstante, en un

25% de los casos MAP no se observan pólipos en el momento del diagnóstico del

Introducción

27

CCR (135), mostrando en algunos casos fenotipo clásico de SL (136-137) o incluso de

Muir-Torre (138). Existe, por tanto, un solapamiento fenotípico considerable con otros

síndromes de predisposición a CCR, tanto polipósicos como no polipósicos. Esto nos

lleva a pensar que se trata de un síndrome infradiagnosticado.

Aunque en menor frecuencia que los pacientes con PAF, los pacientes con MAP

también presentan riesgo de desarrollar distintos tumores extracolónicos, tales como

cáncer de mama, tiroides, gástrico, ovario, vejiga, piel (139). Incluso se ha descrito un

caso con cáncer de testículo (140).

MAP presenta herencia mendeliana de tipo autosómico recesiva, asociada a

mutaciones bialélicas en el gen MUTYH, localizado en 1p34.1. MUTYH codifica para

una ADN-glicosilasa que funciona en el mecanismo de reparación del ADN por

escisión de bases, reparando los errores de tipo transversión G>T. Por lo tanto,

individuos deficientes para MUTYH tienden a acumular mutaciones somáticas en

genes relacionados con la carcinogénesis colorrectal, como KRAS o APC (133), que

ocurren de manera temprana en la secuencia adenoma-carcinoma.

En población europea existen tres mutaciones recurrentes en MUTYH, localizadas en

los exones 7 y 13: c.536A>G p.Tyr179Cys; c.1187G>A p.Gly396Asp y

c.1227_1228dup p.Glu410GlyfX43 (141). En casos de sospecha de MAP (>10

adenomas), generalmente se sigue una estrategia diagnóstica en tres pasos, que

implica en primer lugar el análisis de estas mutaciones recurrentes, y en el caso de

que éste sea positivo, el estudio entonces del gen completo para el rastreo de la

segunda mutación. Siguiendo esta estrategia se consiguen diagnosticar más del 95%

de los casos MAP que cumplen los criterios establecidos (134).

Recientemente, se han identificado mutaciones homocigotas en el gen NTHL1, que

también es un gen reparador por escisión de bases, como responsables de un

pequeño porcentaje (6%, 3/48 familias analizadas) de poliposis adenomatosas, en

familias con herencia recesiva que no presentaban mutaciones en los genes APC ni

MUTYH (142).

Introducción

28

1.3.3. Otros síndromes polipósicos de predisposición a CCR

Existen otros síndromes polipósicos de predisposición a CCR que son menos

frecuentes. Entre ellos están los síndromes de poliposis hamartomatosa: poliposis

juvenil, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Cowden y el síndrome de Bannayan-

Riley-Rubalcaba; y la poliposis mixta hereditaria. Todos estos síndromes presentan

herencia mendeliana de tipo autosómico dominante.

La poliposis juvenil (MIM #174900) es el síndrome hamartomatoso más común (Tabla

1). Se diagnostica por el cumplimiento de uno de los siguientes criterios: 1) múltiples

(3-10) pólipos juveniles en el colorrecto; 2) cualquier número de pólipos juveniles en un

paciente con historia familiar de poliposis juvenil; 3) presencia de pólipos juveniles

extracolónicos. Los pólipos juveniles son hamartomas con un epitelio normal y un

denso estroma y glándulas císticas en la lámina propia. La mayoría de los pólipos son

benignos, pero en un pequeño porcentaje puede tener lugar la transformación maligna,

que ocurre principalmente en el colon, aunque también puede ocurrir en otros órganos

del tracto digestivo, como el estómago. En torno al 40% de estos pacientes presentan

mutaciones germinales en SMAD4 o en BMPR1A, genes que codifican para proteínas

implicadas en la vía de señalización del TGF-beta (87).

El síndrome de Peutz-Jeghers (MIM #175200) se caracteriza por la presencia de

múltiples pólipos hamartomatosos gastrointestinales (de epitelio elongado y dilatación

glandular), acompañado de una pigmentación mucocutánea, que puede afectar a

distintas partes de la cara y dedos. Los criterios de diagnóstico clínico son similares a

los de la poliposis juvenil, basados en la presentación fenotípica y los antecedentes

familiares. Tiene un riesgo elevado a desarrollar tumores intestinales y

extraintestinales. Entre el 91 y el 100% de los casos se deben a mutaciones en el gen

STK11, que codifica para una serina-treonina kinasa (87).

Otro síndrome más raro es el síndrome de Cowden, que se caracteriza por la aparición

de hamartomas gastrointestinales, orales y cutáneos, aunque también pueden

aparecer lesiones adenomatosas e inflamatorias. Los pacientes tienen un riesgo

incrementado de padecer cáncer de mama y tiroides, mientras que el riesgo a CCR es

mucho menor (~9%). Este síndrome se asocia a mutaciones germinales en PTEN,

aunque existe una elevada heterogeneidad genética en este gen, ya que también está

relacionado con otros síndromes, como el de Bannayan-Riley-Rubalcaba (87). Este

Introducción

29

síndrome, aunque similar fenotípicamente al de Cowden, aparece en la infancia y se

caracteriza por una pigmentación en forma de mancha en el pene.

Finalmente, la poliposis mixta hereditaria está caracterizada por la presencia de

múltiples lesiones colónicas de diferentes tipos (pólipos hamartomatosos, serrados,

adenomas, CCR) y la ausencia de manifestaciones extracolónicas. El gen GREM1 se

ha visto asociado a este síndrome, y duplicaciones de la región 15q13.3 que lo

contiene, que llegan hasta la región reguladora aguas arriba del gen GREM1,

cosegregan con la enfermedad (87).

1.4. Poliposis asociada a la actividad correctora de errores de las polimerasas

(PPAP)

Aproximadamente el 30% del total de CCR son casos familiares. Los síndromes con

herencia mendeliana descritos (SL, PAF, MAP, síndromes de poliposis

hamartomatosa, poliposis mixta hereditaria) explican un porcentaje de estos casos. No

obstante, la heredabilidad perdida de estos casos no es despreciable. El marco común

de estos síndromes es la predisposición al desarrollo de CCR y pólipos colónicos, con

riesgo familiar que normalmente sigue una herencia autosómica dominante (con

excepción de MUTYH). La aparición en los últimos años de las técnicas de

secuenciación de nueva generación está permitiendo avanzar en el conocimiento de la

etiología de los mismos.

En el año 2013, el equipo de Palles y colaboradores (119) mediante la combinación de

secuenciación del genoma completo y análisis de ligamiento, descubrieron mutaciones

germinales en los dominios de corrección de errores (proofreading) de las polimerasas

δ y ε (genes POLD1 y POLE) como causantes del cáncer en familias con elevada

agregación familiar de CCR y poliposis adenomatosas. Poco después, Briggs y

Tomlinson denominaron este síndrome como: poliposis asociada a la actividad

correctora de errores de las polimerasas (PPAP) (143).

Este síndrome, recientemente acuñado, parece presentar una herencia de tipo

autosómico dominante, una penetrancia elevada y una edad de aparición temprana

(119). Cuando las mutaciones germinales tienen lugar en POLD1 se asocia también

Introducción

30

fuertemente a CE (119). Otras manifestaciones extracolónicas se han observado de

manera menos frecuente.

La replicación del ADN previa a la división celular tiene una alta tasa de fidelidad, con

sólo 1 x 10-10 errores por base (144). Distintos mecanismos moleculares colaboran

secuencialmente durante la replicación para mantener este número mínimo de errores.

El alto grado de conservación de estos mecanismos entre especies subraya su

importancia biológica. En la corrección de errores en la replicación del ADN se

observan tres etapas (144): 1) correcta incorporación del nucleótido complementario

por las ADN polimerasas, 2) eliminación de los nuevos nucleótidos incorporados

incorrectamente previo a la extensión, por la actividad 3’ exonucleasa (proofreading)

asociada a algunas ADN polimerasas, 3) control post-replicativo de las bases mal

incorporadas, mediante el sistema reparador de errores (MMR) y la reparación del

ADN por escisión de bases. Como ya se ha explicado, está demostrado que la

inactivación a nivel germinal de cualquiera de estos dos últimos mecanismos se asocia

a síndromes de CCR hereditario o poliposis (SL o MAP respectivamente), que tienen

un perfil hipermutador a lo largo del genoma (145). El estudio realizado por Palles y

colaboradores (119) demuestra que mutaciones inactivantes en los dominios

exonucleasa de las polimerasas POLE y POLD1 provocan la acumulación de multitud

de mutaciones a lo largo del genoma, causando finalmente el desarrollo del cáncer.

1.4.1. Función de POLE y POLD1 y su implicación en el proceso carcinogénico

Pol ε y Pol δ son las únicas polimerasas en eucariotas con capacidad intrínseca

exonucleasa 3’-5’ de corrección de errores, mediante la cual se elimina el nucleótido

erróneamente incorporado, previo a la extensión de la hebra de ADN. Ambas

polimerasas son heterotetrámetros que actúan conjuntamente con Pol α en la horquilla

de replicación para garantizar la replicación del ADN previa a la división. Así, Pol α

prepara la síntesis de ambas hebras y hace pequeñas copias del ADN, mientras que

Pol ε y δ son las responsables de la elongación del ADN en la hebra principal y

complementaria, respectivamente (143, 146).

En humanos, las subunidades catalíticas de estas enzimas (Pol ε y Pol δ), están

codificadas por los genes POLE y POLD1, respectivamente, que pertenecen a la

familia B de las polimerasas (143). POLE es un gen localizado en 12q24.3 que

contiene 54 exones y codifica para la mayor de las cuatro subunidades de Pol ε, de

Introducción

31

140 kDa. Por otro lado, POLD1, localizado en el cromosoma 19 (19q13.3), contiene 29

exones, y codifica para una subunidad de 125 kDa. Ambos genes son parálogos,

presentando estructura y funciones homólogas, mostrando su mayor conservación y

homología (23% identidad, 37% similaridad) en los dominios exonucleasa (residuos

268–471 de POLE y 304–517 de POLD1) (143).

Estudios in vitro en levadura y Escherichia coli, que inducen mutaciones en los

dominios exonucleasa de Pol ε y Pol δ, causan un incremento del ratio de mutaciones

espontáneas de entre 10 y 1.000-10.000 veces para cada modelo, demostrando así la

implicación de estos dominios en la fidelidad en la replicación (144, 147-149). Al

parecer, la inactivación de Pol ε provocaría más frecuentemente mutaciones

puntuales, con respecto a Pol δ, que provocaría tanto mutaciones puntuales como

frameshift (150).

Las primeras evidencias de la implicación de estas polimerasas en cáncer vienen de

estudios en ratones. La pérdida de la funcionalidad del dominio exonucleasa en Pol ε

en ratones provoca la aparición de tumores intestinales, con respecto a la alteración

en el respectivo dominio en Pol δ, que provoca más frecuentemente linfomas y

neoplasia de células escamosas de la piel, con una peor tasa de supervivencia (146).

Estos fenotipos sólo se observaban cuando las mutaciones eran homocigotas, lo que

apoya la necesidad de un segundo hit. Las diferencias fenotípicas parecen sugerir que

ambas polimerasas participan en vías independientes de progresión tumoral. Así,

parece que POLD1 también participa en el sistema reparador de errores (MMR) y en la

reparación por escisión de bases.

1.4.2. Mutaciones de POLE y POLD1 descritas en cáncer

1.4.2.1. Mutaciones germinales en POLE y POLD1

Las mutaciones descritas por Palles y colaboradores (119) como causantes CCR y

adenomas en familias seleccionadas con elevada carga fueron dos cambios de

sentido erróneo (missense): p.Leu424Val (c.1270C>G) en el exón 13 de POLE y

p.Ser478Asn (c.1433G>A) en el exón 11 de POLD1.

En este estudio, la variante p.Leu424Val en POLE fue encontrada en una familia y

posteriormente en 12 familias independientes en una cohorte de validación. Todas las

Introducción

32

familias excepto una presentaban múltiples adenomas y CCR, sin claras

manifestaciones extracolónicas. Algunos de los tumores presentaban LOH en dicha

región de POLE como segundo hit. Todos los tumores eran MSS y dos de ellos

presentaban CIN. El rastreo de las mutaciones somáticas clásicas en la

carcinogénesis colorrectal mostró en algunos tumores la presencia de mutaciones en

APC (R1114X, Q1338X), mutaciones en KRAS (codones 12 y 146) en torno al 18% de

los casos y la ausencia de la mutación BRAF_V600E (119).

Al ser POLE y POLD1 genes parálogos, sus secuencias tienen un alto grado de

homología. De este modo, la variante p.Ser478Asn en POLD1, es prácticamente

equivalente a la encontrada en POLE, ya que el residuo 478 en POLD1 corresponde

con el residuo 428 en POLE, muy cercano a la alteración encontrada. La alteración

p.Ser478Asn fue encontrada en dos familias del estudio que posteriormente se

demostró que estaban relacionadas, y más tarde en otra familia aparentemente no

relacionada en la cohorte de validación. El fenotipo tumoral de los portadores de esta

mutación fue muy similar al encontrado para los portadores de la mutación en POLE.

No obstante, había una elevada prevalencia de CE de aparición temprana en las

mujeres de estas familias. El perfil mutacional de los tumores de los individuos

portadores de mutaciones en POLD1 resultó similar al de los portadores de la

mutación en POLE, con la excepción de que las mutaciones en KRAS aparecieron en

los codones 13 y 61, y algunos tumores presentaron mutación en BRAF (119).

En definitiva, los resultados obtenidos en el estudio de Palles y colaboradores,

muestran que el fenotipo del síndrome PPAP puede solapar con el de otros síndromes

de predisposición a CCR, como el SL o la MAP (119).

Las evidencias descritas por el equipo de Palles y colaboradores para considerar estas

mutaciones como patogénicas y causantes del síndrome en estas familias eran

considerables:

- Ninguna de estas dos mutaciones estaban presentes en una cohorte de

10.755 controles.

- Ambos residuos están altamente conservados entre especies.

- Se encuentran en el sitio activo del dominio exonucleasa (Leu424 en POLE) o

muy cercano al mismo (Ser474 en POLD1).

- Ambos residuos en la conformación de la T4 ADN polimerasa/exonucleasa se

encuentran localizados muy cercanos al ADN de cadena simple, por lo que

Introducción

33

estas mutaciones pueden alterar el empaquetado de las hélices, pudiendo

afectar la actividad exonucleasa (ver Figura 6).

- La alteración de dichos residuos en levaduras confiere un fenotipo mutador.

- Los programas de predicción bioinformáticos muestran severas

consecuencias funcionales en la actividad de la proteína.

- El alelo mutado se expresa de forma estable a nivel de ARNm.

En este estudio, se identificó además una tercera mutación probablemente patogénica

en POLD1: p.Pro327Leu (c.981C>G). Esta mutación, identificada en un individuo de

70 años con 10 adenomas, está muy conservada evolutivamente y está localizada en

la zona de interacción del dominio exonucleasa de POLD1 con el ADN (119).

Además de las tres variantes encontradas en este estudio, sólo se han identificado dos

mutaciones germinales más en los dominios exonucleasa de estos genes en pacientes

con fenotipos similares de cáncer (Anexo IV):

En el estudio realizado por Church y colaboradores (151) en pacientes con CE

identificaron una mutación germinal en POLE (c.1337G>A; p.Arg446Gln;

rs151273553) y otra en POLD1 (c.931C>T; p.Arg311Cys; rs201010746), previamente

descritas, que parece que por el momento su significado clínico es desconocido. La

primera está conservada en Saccharomyces cerevisiae pero no en Saccharomyces

pombe, las predicciones muestran que parece que la función proteica se ve afectada,

pero está bastante distante al dominio exonuclesasa. La segunda, p.Arg311Cys en

POLD1, no ha sido descrita en cáncer, pero flanquea la región exonucleasa y las

predicciones in silico muestran una afectación a nivel de proteína.

Por otro lado, en el estudio realizado por Smith y colaboradores identificaron una

mutación germinal tipo frameshift en POLE (c.5621_5622delGT) en un paciente con

diagnóstico de CCR a los 26 años, sin antecedentes familiares de cáncer (152). No

obstante, esta mutación, localizada en el exón 39, está muy alejada del dominio

exonucleasa del gen, por lo que su relación con cáncer está en duda.

1.4.2.2. Mutaciones somáticas en POLE y POLD1

Mutaciones somáticas en distintas regiones del gen POLE principalmente, y en menor

medida POLD1, también han sido descritas en pacientes con CCR o CE. La potencial

patogenicidad de las mismas ha sido especialmente considerada cuando las

Introducción

34

mutaciones tienen lugar en los dominios exonucleasa de estos genes, ya que afectan

a residuos altamente conservados y la predicción de la alteración de la proteína suele

ser patogénica (Anexo IV); en comparación con la predicción de las mutaciones que

tienen lugar en otras regiones, que es más variable y su patogenicidad está puesta en

duda.

En primer lugar, en el proyecto de secuenciación del exoma completo del TCGA (The

Genome Cancer Atlas Network ), se subrayó la presencia de mutaciones tipo missense

en POLE de forma muy representativa en tumores colorrectales con fenotipo

hipermutador (tasa de mutación >12/106 pb), en ausencia de IMS (153). En este

estudio se encontraron 18 mutaciones diferentes en POLE, 5 de ellas localizadas en el

dominio exonucleasa: p.Pro286His, p.Phe367Ser, p.Val411Leu, p.Pro436Arg y

p.Ser459Phe (119, 153). Las tres primeras han sido descritas a su vez en otros

trabajos: p.Pro286His y p.Phe367Ser, en tres individuos con CCR (144, 154); y la

tercera (p.Val411Leu) en CE en el estudio realizado por el TCGA para este tumor y por

Church y colaboradores (151, 155). Estos estudios realizados en CE detectaron

además otras cuatro mutaciones diferentes más en el dominio exonucleasa de POLE:

p.Asp275Val, p.Pro286Arg, p.Ser297Phe, p.Ala456Pro. Al igual que para CCR, casi

todas estas mutaciones en POLE en CE estaban presentes en tumores estables y

permitían definir un subgrupo de tumores hipermutados con características

moleculares concretas y mejor pronóstico, en comparación con el resto de subgrupos

(155).

Globalmente, los resultados de estas investigaciones en CE muestran una prevalencia

de mutaciones somáticas en POLE del 6,8-8,5%, siendo más recurrentes las

mutaciones p.Pro286Arg y p.Val411Leu (151, 155). Esta prevalencia es más baja en

el caso del CCR, de un 3,1% (153).

Según estos estudios, estos tumores con mutaciones en el dominio exonucleasa de

POLE muestran un fenotipo hipermutador, con ausencia de IMS (aunque no fue

determinada en la cohorte del TCGA de CE), un patrón atípico de mutaciones en los

genes típicos de cáncer, y una tendencia incrementada a acumular substituciones de

tipo G:C>T:A; en comparación con aquellos tumores sin mutación en estos dominios

(151, 153, 155).

En contraposición con estos resultados, las mutaciones somáticas en el dominio

exonucleasa de POLD1 son muy poco prevalentes, habiéndose encontrado

Introducción

35

únicamente en los tumores de dos pacientes hasta la fecha: un CCR, que mostraba

además IMS, y un CE; lo que equivale a una prevalencia de estas mutaciones de en

torno al 0,4% (151, 153).

Las razones de estas diferencias en la frecuencia de mutaciones somáticas en las

regiones exonucleasas de estos dos genes son desconocidas hasta la fecha.

Figura 6. Imagen generada por Pymol de las mutaciones en los dominios exonucleasa de

POLE y POLD1 en la estructura de Pol δ en levadura en el complejo ADN polimerasa T4.

Extraída de (143).

El ADN de simple cadena se muestra en amarillo. Los residuos mutados se muestran en rojo

(POLE) o azul (POLD1).

HIPÓTESIS

Hipótesis

39

Hay una proporción considerable de las familias, que cumpliendo criterios para el

estudio genético de síndromes hereditarios de CCR y/o poliposis colónica, no

presentan mutación germinal en los genes conocidos como responsables de dichos

síndromes.

Al menos una parte de estos casos, no explicados desde el punto de vista genético,

pueden ser consecuencia de otras alteraciones de tipo genético o epigenético que no

son analizados de rutina en los algoritmos diagnósticos establecidos. La identificación

y caracterización de las mismas puede contribuir a una mejora de la eficacia en el

diagnóstico genético en individuos y familias con alto riesgo de CCR.

OBJETIVOS

Objetivos

43

Objetivo general

Mejorar la eficacia del diagnóstico genético en individuos y familias con alto riesgo de

CCR.

Objetivos específicos

Artículo 1

1.1. Analizar la prevalencia de las epimutaciones constitucionales en MLH1 como una

causa de SL en casos no seleccionados de CCR.

1.2. Comparar los datos obtenidos en población no seleccionada con los datos de una

población seleccionada atendida en Unidades de Consejo Genético en Cáncer y que

cumplían los criterios revisados de Bethesda.

1.3. Proponer la adaptación del algoritmo diagnóstico del SL al cribado universal de los

CCR por inmunohistoquímica, en lo referente al estudio de epimutaciones en MLH1.

Artículo 2

2.1. Analizar la prevalencia de las mutaciones recurrentes en los genes POLE y

POLD1 en casos con sospecha de CCR familiar sin mutación en los genes

responsables de los síndromes de sospecha.

2.2. Contribuir a definir el fenotipo clínico asociado a las mutaciones en dichos genes.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y métodos

47

4.1.1. Pacientes y muestras biológicas

En este estudio se incluyeron un total de 2970 pacientes con diagnóstico de CCR que

se dividieron en dos grupos: el grupo no seleccionado y el grupo seleccionado.

En el grupo no seleccionado se incluyeron un total de 2123 pacientes diagnosticados

de CCR procedentes de dos cohortes: 671 pacientes del estudio multicéntrico nacional

EPICOLON II y 1452 pacientes que fueron diagnosticados y tratados de CCR en el

Hospital General Universitario de Alicante (HGUA) entre los años 1999-2011.

Por otra parte, el grupo seleccionado procedía del programa de Cáncer Hereditario de

la Comunidad Valenciana, y por lo tanto, son pacientes con agregación familiar de

cáncer y sospecha de síndrome hereditario, por lo que cumplen al menos alguno de

los criterios de Bethesda de riesgo familiar de CCR (Tabla 4).

Los tumores de todos los pacientes se encontraban fijados en formol e incluidos en

parafina. El tejido germinal correspondía a linfocitos de sangre periférica en el grupo

seleccionado y en la cohorte EPICOLON II del grupo no seleccionado; y a mucosa

colónica sana fijada en formol e incluida en parafina en la cohorte del HGUA.

Las muestras de tejido tumoral (cortes histológicos o punch en zona seleccionada del

tumor) fueron desparafinadas con aceite mineral o xilol. El ADN tumoral se extrajo

mediante un sistema automatizado (QiaCube, QIAGEN, Alemania) usando el kit

QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Alemania). Esta misma metodología se empleó para la

extracción de ADN de las muestras de mucosa intestinal sana y mucosa bucal, de los

casos del HGUA, de la cohorte no seleccionada y de los casos con epimutación

constitucional. De la misma manera se extrajo el ADN de sangre periférica de los

casos de la cohorte seleccionada previa lisis de eritrocitos. Finalmente, el ADN de

saliva de los pacientes con epimutación constitucional se extrajo usando el Oragene-

DNA kit (DNA Genotek, Canadá).

4.1. Artículo 1. Castillejo A et al. “Prevalence of MLH1 constitutional

epimutations as a cause of Lynch syndrome in unselected versus selected

consecutive series of patients with colorectal cancer”. J Med Genet. (2015)

Material y métodos

48

4.1.2. Plan de trabajo

Para la realización de este estudio se siguió el siguiente diagrama de flujo de trabajo

para las dos series. El diagrama está basado en al algoritmo diagnóstico del SL

explicado en el apartado 1.2.1.4 (Anexo II):

Figura 7. Plan de trabajo para la realización del estudio reflejado en el artículo 1.

*El análisis de IMS no se realizó en todos los casos. El resultado se empleó para apoyar el

resultado IHQ, según lo explicado en el siguiente apartado.

Material y métodos

49

4.1.3. Cribado molecular de los tumores sospechosos de SL

4.1.3.1. IHQ de las proteínas MMR

En primer lugar se realizó el análisis IHQ de las cuatro proteínas reparadoras: MLH1,

MSH2, MSH6 y PMS2 en tumores parafinados de los casos de CCR. Esto se hizo

disponiendo los tumores en TMAs (Tissue Microarrays), estudiando cada muestra por

duplicado, según lo descrito por Pérez-Carbonell y colaboradores (92).

El análisis de las muestras de la cohorte de Cáncer Hereditario (cohorte seleccionada)

se realizó en los respectivos hospitales de referencia según sectorización de la

Comunidad Valenciana (DOGV– Núm. 7559/29.06.2015). Por otro lado, el análisis de

las dos cohortes no seleccionadas, EPICOLON y HGUA, se realizó íntegramente en el

HGUA.

Se consideró que el tumor presentaba expresión normal para MLH1, MSH2, MSH6 y

PMS2 cuando se observaba tinción nuclear inequívoca en células neoplásicas

epiteliales. En los casos con pérdida de expresión se observó falta de tinción nuclear

en las células tumorales, en presencia de células normales del estroma con tinción

nuclear intacta (control positivo interno). Todos los casos donde los datos de IMS e

IHQ fueron discordantes fueron reevaluados.

4.1.3.2. Inestabilidad de microsatélites

El estudio de IMS se realizó en el ADN tumoral mediante análisis de microsatélites

(homopolímeros quasi-monomórficos) por PCR fluorescente, electroforesis capilar y

análisis de fragmentos. Para la cohorte de EPICOLON II se estudiaron los marcadores

BAT26 y NR24 como se ha descrito previamente (115), considerándose el caso IMS-

positivo cuando al menos uno de los dos marcadores presentó un patrón inestable.

Para el resto de cohortes la IMS se estudió mediante una única PCR pentaplex de los

cinco marcadores quasi-monomórficos considerados estándar (33): BAT25, BAT26,

NR21, NR24 y NR27 según se ha descrito (156). Se consideraron los tumores como

IMS-positivos cuando al menos dos de los cinco marcadores resultaron inestables. El

análisis e interpretación de los resultados se hizo según lo reflejado en la figura 4.

Material y métodos

50

4.1.3.3. Análisis de la metilación de MLH1

El análisis de la metilación somática de MLH1 se realizó en ADN de tejido parafinado

de todos los tumores que presentaban pérdida de la expresión proteica de MLH1 por

IHQ y había material tumoral disponible. En los casos que presentaban metilación en

el tumor, se realizó el estudio de la epimutación constitucional de MLH1 en sangre

(grupo seleccionado y cohorte EPICOLON II) o tejido sano (cohorte HGUA del grupo

no seleccionado) usando la misma metodología. En los casos con metilación MLH1 en

sangre, se analizaron otros tejidos sanos disponibles del mismo paciente (ver Tabla 1

del Artículo 1).

El análisis de la metilación en MLH1 se realizó mediante la técnica MS-MLPA

(Methylation-Sensitive Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification; MRC-Holland,

Amsterdam, Paises Bajos) y posterior análisis de fragmentos en el secuenciador 3500

Genetic Analyzer (Life Technologies), según se ha descrito en (106).

Se empleó el kit SALSA MS-MLPA ME011 Mismatch Repair Genes (MMR) que

interroga la metilación en las islas CpG de los promotores de los genes reparadores de

errores MLH1, MSH2, MLH3, PMS2, MSH3, MSH6 y MGMT. Para ello, este kit

contiene 22 sondas que hibridan en regiones de estos genes que contienen un sitio de

restricción para HhaI (enzima de restricción sensible a metilación), además de otras 16

sondas de referencia que hibridan en regiones que no contienen sitios de restricción

para esta enzima. Cuatro de estas sondas hibridan en las regiones A, B, C y D del

promotor de MLH1 respectivamente. Un ADN se considera que presenta metilación en

el promotor de MLH1 cuando tiene un patrón positivo para las sondas que interrogan

las regiones C (-246) y D (-13) (ver figura 5). Solamente la metilación en estas

regiones C y D se correlaciona con la pérdida de expresión de MLH1 (104).

Brevemente, la técnica de MS-MLPA consiste en lo siguiente: en primer lugar,

desnaturalización de la muestra de ADN tumoral, hibridación y ligación de las sondas

de forma específica. Posteriormente se hacen dos alícuotas de la muestra tratada, una

de ellas se digiere con HhaI (New Englands Biolabs) y luego ambas se amplifican por

PCR de forma paralela. Los fragmentos resultantes de esta PCR se separan y se

cuantifican mediante electroforesis capilar en un secuenciador 3500 Genetic Analyzer

(Life Technologies) y se analizan mediante el software Genemapper v 4.0 (Life

Technologies). Finalmente, estos resultados se procesan y se normalizan con los

Material y métodos

51

controles internos de referencia a través de unos algoritmos proporcionados por MRC-

Holland. Así, se obtiene un ratio de metilación de la muestra digerida con respecto a la

no digerida, considerándose como punto de corte para considerar que la región de

estudio está metilada un 25%.

4.1.3.4. Análisis de la mutación de BRAF_V600E

El estudio de la mutación somática BRAF_V600E (exón 15) se hizo de todos los

tumores que tenían pérdida de MLH1 por inmunohistoquímica y de los cuales había

ADN tumoral disponible. Esta determinación se realizó por genotipado por qPCR para

el grupo no seleccionado y por secuenciación Sanger en el grupo seleccionado.

Cuando el tumor resultaba mutado, el caso se consideraba esporádico.

4.1.3.4.1. Genotipado por qPCR

La determinación de la mutación BRAF_V600E mediante PCR en tiempo real (qPCR)

se llevó a cabo a partir de ADN de cada tumor parafinado empleando sondas TaqMan

MGB (Minor Grove Binding) para discriminación alélica. Los cebadores y sondas

fueron diseñados y descritos por Benlloch y colaboradores (157). Los resultados

fueron analizados en el sistema de detección ABI Prism 7500 (Life Technologies).

4.1.3.4.2. Secuenciación Sanger

La determinación de la mutación BRAF_V600E mediante secuenciación Sanger se

hizo amplificando por PCR el exón 15, que contiene dicho codón, con cebadores

específicos y posterior secuenciación y análisis en un secuenciador automático.

Para ello, se amplificó por PCR la región, utilizando AmpliTaq Gold MM 2X (Life

Technologies), usando una pareja de cebadores específicos extraídos de Nagasaka y

colaboradores (158) y las condiciones explicadas en el Anexo V. Posteriormente se

purificó el producto de amplificación mediante una reacción enzimática usando el kit

ExoSAp IT (USB Corporation), y seguidamente se llevó a cabo la reacción de

secuencia utilizando el kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life

Technologies). La purificación del producto de esta amplificación se realizó con las

columnas Performa DTR Gel Filtration Cartridges (Edge Biosystems). Finalmente, el

Material y métodos

52

producto de esta amplificación fue secuenciado en el secuenciador 3500 Genetic

Analyzer (Life Technologies) y analizado usando los programas Sequencing Analysis

v.5.1 y Variant Reporter v.1.1 (Life Technologies).

4.1.3.5. Análisis de mutaciones germinales en los genes MMR

Análisis de mutaciones puntuales por secuenciación Sanger

El análisis de mutaciones germinales se realizó en ADN genómico procedente de

leucocitos de sangre periférica (grupo seleccionado completo y cohorte EPICOLON II

del grupo no seleccionado) o de tejido no tumoral (cohorte HGUA del grupo no

seleccionado).

El estudio de mutaciones en los genes MMR se realizó basándose en los resultados

de IHQ, IMS, metilación de MLH1 y mutación BRAF_V600E, según lo descrito en

(106), utilizando el algoritmo diagnóstico descrito en el Anexo II.

La detección de mutaciones puntuales se analizó mediante amplificación por PCR y

secuenciación directa de la región codificante completa, así como de las zonas de

unión intrón-exón de cada gen, según lo que se ha explicado en el apartado anterior.

Las condiciones de PCR y los cebadores para cada gen y región han sido descritos

previamente (159-161).

Interpretación de resultados

Se utilizó la nomenclatura recomendada por Human Genome Variation Society para

la descripción de las variantes: http://www.hgvs.org/mutnomen/

Clasificación de las variantes genéticas: se utilizan los criterios establecidos en las

recomendaciones del Colegio Americano de Genética Médica (162) e InSiGHT

(163). Las variantes se clasifican en cinco clases: 1: No patogénicas; 2:

probablemente no patogénicas; 3: variantes de significado clínico

desconocido; 4: probablemente patogénicas y 5: patogénicas. Desde el punto

de vista clínico, las variantes de clase 1 y 2 son consideradas neutrales y no

confieren riesgo. Las variantes 4 y 5 son consideradas patogénicas y de alto riesgo,

mientras que las de clase 3 son de significado clínico desconocido y por

Material y métodos

53

consiguiente, en el momento actual, no se puede establecer su implicación con la

enfermedad.

Análisis de grandes reordenamientos por MLPA

Se estudiaron los grandes reordenamientos (deleciones/inserciones) en los genes

MMR mediante la técnica MLPA, usando los siguientes kits: P003 (MLH1-MSH2);

P248 (MLH1-MSH2 confirmación); P008 (PMS2-MSH6) y P072 (EPCAM), de acuerdo

con las instrucciones del fabricante (MRC-Holland).

4.1.3.6. Análisis de la secuencia de la región promotora de MLH1

En aquellos casos con epimutación constitucional en MLH1 se secuenció la región

promotora de dicho gen, con el fin de identificar variantes asociadas con dicho

fenotipo. La secuenciación se hizo según lo descrito en el apartado 4.1.3.4.2., usando

los cebadores y condiciones de PCR que figuran en el Anexo V.

4.1.4. Análisis estadístico

Para el análisis de los datos generados se empleó el paquete estadístico IBM SPSS

v.21.0. (Chicago, IL, Estados Unidos). Las variables categóricas se representaron

como frecuencias o porcentajes. Las variables cuantitativas (edad) se representaron

como mediana e intervalo intercuartílico, tras comprobar su distribución no normal

mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Para la comparación de las variables

categóricas se usó el test chi-cuadrado, y para las variables cuantitativas

independientes con distribución asimétrica se usó el test U de Mann-Whitney. Todos

los p-valores tienen dos colas y se consideraron como estadísticamente significativos

aquellos valores de p<0,05.

Material y métodos

55

En este artículo se recogen los resultados de dos estudios similares, realizados de

forma paralela, en dos series de casos seleccionados. La primera serie fue analizada

en el laboratorio del programa de Cáncer Hereditario del Instituto Catalán de

Oncología (ICO); y la segunda serie (Comunidad Valenciana) fue analizada por el

grupo de investigación al que pertenece la doctoranda (Unidad de Investigación del

HGUA y Genética Molecular del HGUE).

4.2.1. Pacientes y muestras biológicas

En este estudio se incluyeron un total de 858 pacientes diagnosticados de CCR y/o

poliposis provenientes de 840 familias de dos series diferentes (Figura 8). Se

seleccionaron casos con sospecha de origen hereditario en los que no se había

encontrado mutación. Estos casos no explicados desde el punto de vista genético

fueron analizados para los genes responsables, siguiendo los algoritmos diagnósticos

de los síndromes de sospecha en cada caso (SL (Anexos II) o síndromes de poliposis

colónica (MAP o PAF, Anexo III)).

En la serie 1 se incluyeron un total de 612 pacientes de CCR y/o poliposis familiar de

aparición temprana, correspondientes a 594 familias provenientes de las unidades de

consejo genético del ICO. Se seleccionaron 524 individuos de 506 familias de CCR no

polipósico que cumplían, al menos, los criterios revisados de Bethesda. Estos

pacientes habían sido previamente testados por IHQ de las proteínas MMR y/o IMS en

sus tumores, y no presentaban mutación germinal en estos genes MMR, ni metilación

en MLH1. Para el estudio de mutaciones germinales en los genes MMR de estos

casos, se siguió el algoritmo explicado en el apartado 1.2.1.4. (Anexo II).

Así mismo, se incluyeron 88 casos de poliposis que habían sido estudiados para

MUTYH siguiendo el esquema habitual, así como para APC cuando el número de

adenomas era superior a 20 (Anexo III). Para MUTYH se siguió la estrategia propuesta

Artículo 2. Valle L et al. “New insights into POLE and POLD1 germline

mutations in familial colorectal cancer and polyposis”. Hum Mol Genet. (2014)

Material y métodos

56

en (134): se estudiaron las tres variantes recurrentes en población española, mediante

secuenciación Sanger de los exones 7 y 13. En caso de detectar la presencia de

alguna variante en heterocigosis, se secuenciaba la región codificante completa y las

uniones intrón-exón correspondientes (ver apartado 1.3.2.). Además se realizaba

MLPA para el análisis de grandes reordenamientos en MUTYH (P378, MRC Holland).

Para APC se estudió toda la región codificante y las uniones intrón-exón por

secuenciación Sanger y se realizó el estudio de grandes reordenamientos por MLPA

(P043, MRC Holland).

El estudio de mutaciones germinales se realizó a partir de ADN extraído de sangre

periférica mediante el kit Flexigene DNA (QIAGEN, Alemania). Para la extracción de

ADN de muestras tumorales fijadas en formol e incluidas en parafina se utilizó el kit

DNA Mini (QIAGEN, Alemania).

Figura 8. Casos de CCR y poliposis estudiados.

En la serie 2 se incluyeron un total de 246 casos índice diagnosticados de CCR no

polipósico y/o poliposis. Los casos de CCR no polipósico procedían, al igual que el

grupo seccionado del primer artículo, del programa de Cáncer Hereditario de la

Comunidad Valenciana. Todos los casos presentaban agregación familiar de cáncer:

63 casos cumplían criterios de Amsterdam I o II y el resto (n=80) presentaban 2 o más

familiares de primer o segundo grado diagnosticados con un tumor relacionado con el

858 pacientes

Serie 1 (ICO)

n=612

CCR

n=524

MMR+

n=438

MMR–

n=86

Poliposis

n=88

Serie 2

(C. Valenciana)

n=246

CCR

n=143

MMR+

n=143

Poliposis

n=103

Material y métodos

57

SL (criterio 5 de Bethesda) (Tabla 4). Todos los casos eran MMR-positivos, lo que se

comprobó por IHQ y/o IMS y se siguió el algoritmo diagnóstico de mutaciones

germinales en MMR según lo explicado en el apartado 1.2.1.4.

Se incluyeron además 103 casos de poliposis atenuada (10-100 pólipos) provenientes

del proyecto multicéntrico nacional EPIPOLIP (164). Todos estos individuos tenían al

menos un familiar de primer grado afectado de CCR y todos habían sido interrogados

para MUTYH, y para APC cuando tenían más de 10 adenomas, según lo descrito para

la serie 1.

En ambos grupos de pacientes, tanto el ADN de tejido tumoral como el de sangre

periférica ya habían sido extraídos previamente en el proceso para el estudio de

mutaciones germinales en sus respectivas unidades. En el caso de la serie 2 esto se

hizo siguiendo la metodología previamente indicada en el artículo 1.

4.2.2. Plan de trabajo

El plan de trabajo para la realización del estudio reflejado en el segundo artículo se

muestra a continuación en la Figura 9:

Material y métodos

58

Figura 9. Plan de trabajo para la realización del estudio reflejado en el artículo 2.

*El resultado del análisis de IMS se empleó para apoyar el resultado IHQ, priorizando el

resultado de éste último.

4.2.3. Estudio de las mutaciones germinales en POLE y POLD1

El estudio de las mutaciones recurrentes en POLE y POLD1 se hizo por metodologías

diferentes en cada serie: en la serie 1 se estudiaron específicamente las mutaciones

POLE_Leu424Val y POLD1_Ser478Asn mediante ensayos KASPar, validando los

resultados encontrados por secuenciación directa; en la serie 2 se estudiaron por

secuenciación Sanger los exones 13 y 11 de POLE y POLD1 respectivamente, donde

se encuentran dichas mutaciones.

4.2.3.1. Serie 1 (Ensayos de genotipado KASPAR)

Ambas mutaciones se genotiparon mediante ensayos KASPar (KASP-By-Design

genotyping assays. LGC group, Teddington, Reino Unido), según se ha descrito (165),

usando cebadores específicos para la detección de estas variantes (Tabla

Material y métodos

59

Suplementaria 1 del Artículo 2). Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de

detección de PCR a tiempo real LightCycler 480 (Roche DiagnosticsGmbH, Alemania).

En cada carrera se introdujo un control positivo para cada una de las mutaciones

testadas.

La validación de estos resultados de genotipado, junto con el análisis de las muestras

que fallaron, así como los estudios de cosegregación se realizaron mediante

secuenciación directa, como se ha descrito en el apartado 4.1.3.4.2. Los cebadores y

condiciones empleados figuran en el anexo V.

4.2.3.2. Serie 2 (Secuenciación Sanger)

Se estudió el exón 13 de POLE y el exón 11 de POLD1, así como los sitios de unión

intrón-exón a partir de ADN de sangre periférica, mediante PCR y secuenciación,

según lo descrito en el apartado 4.1.3.4.2; usando los cebadores y condiciones citados

en el Anexo V.

4.2.4. Análisis de predicción in silico

Se usaron diferentes programas bioinformáticos para evaluar el potencial dañino de la

variante germinal de cambio de sentido (missense) p.Leu474Pro encontrada en

POLD1 a nivel de la afectación en la estructura y función de la proteína: SNPs3D,

PolyPhen-2, SIFT, CONDEL (166).

Estos programas se utilizan como método para predecir el posible impacto del cambio

de nucleótido en la funcionalidad de la proteína mutada que se genera: la

conservación del residuo en la evolución, la severidad de la substitución desde el

punto de vista bioquímico (polaridad, carga y tamaño), la localización en dominios

estructurales y funcionales y el potencial impacto estructural entre las proteínas salvaje

y mutada.

Material y métodos

60

Tabla 7. Programas de predicción in silico empleados.

Programa de predicción Página web

SNPs3D http://www.snps3d.org/

PolyPhen-2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

SIFT http://sift.jcvi.org/

CONDEL(166) http://bg.upf.edu/fannsdb/

4.2.5. Estudio de pérdida de heterocigosidad (LOH) en POLE

En el tumor de colon del individuo de la serie 1 portador de la mutación germinal

POLE_Leu424Val se realizó el estudio de LOH mediante dos metodologías distintas:

4.2.5.1. Mapeo por microsatélites

Se estudiaron dos microsatélites informativos (D12S1628 y D12S357) localizados en

una región cromosómica de 1.356 Mb circundante al codón POLE_Leu424. Esto se

realizó mediante PCR fluorescente y posterior análisis de fragmentos, de forma similar

al estudio de la IMS (apartado 4.1.3.2.), usando los cebadores e indicaciones

proporcionadas por el equipo de Palles y colaboradores (119).

4.2.5.2. SNaPshot para la mutación POLE_Leu424Val

Esta técnica permite estudiar la abundancia de cada alelo (mutado versus salvaje) del

codón Leu424. Consiste en la amplificación por PCR de la región de interés y posterior

extensión del cebador en un solo nucleótido marcado por fluorescencia, lo que se

detecta también por electroforesis capilar y análisis de fragmentos. Los cebadores y las

condiciones de PCR figuran en el anexo V.

Para ambas metodologías, se considera que hay LOH cuando la intensidad relativa de

cualquier alelo se reduce ≥50% con respecto al otro alelo, considerando la intensidad

alélica relativa en el ADN germinal.

Material y métodos

61

4.2.6. Análisis de las mutaciones somáticas en BRAF, KRAS y NRAS

Con el fin de definir la vía de carcinogénesis que siguen los tumores de los pacientes

portadores de la mutación germinal POLD1_Leu474Pro encontrados en la serie 1, se

realizó el análisis de las mutaciones somáticas en el ADN de los tumores disponibles

de los individuos portadores de la mutación: en el CCR del caso índice y en el CE de

la tía materna de éste. La siguiente tabla muestra las mutaciones estudiadas y la

metodología y condiciones empleadas para ello:

Tabla 8. Mutaciones somáticas analizadas en BRAF, KRAS y NRAS y metodología empleada.

GEN MUTACIÓN METODOLOGÍA CONDICIONES

BRAF V600E Secuenciación Sanger

(ver apartado 4.1.3.4.2)

Cebadores y

condiciones en Anexo V

KRAS

Codones 12 y 13 KRAS StripAssay

(ver siguiente párrafo)

Según instrucciones del

fabricante

Exón 3 (codones 59 y 61) Secuenciación Sanger

(ver apartado 4.1.3.4.2)

Cebadores y

condiciones en Anexo V Exón 4 (codones 117 y 146)

NRAS

Exón 2 (codones 12 y 13)

Secuenciación Sanger

(ver apartado 4.1.3.4.2)

Cebadores y

condiciones en Anexo V Exón 3 (codones 117)

Exón 4 (codón 146)

La determinación de las mutaciones en los codones 12 y 13 de KRAS mediante KRAS

StripAssay (VienaLab Diagnostics GmbH, Vienna Austria) permite la detección de las

10 mutaciones más frecuentes en esta localización. El método utilizado se ajusta a las

instrucciones del fabricante e implica las siguientes etapas: 1) amplificación por PCR

del ADN tumoral con cebadores específicos marcados con biotina; 2) hibridación y

lavado del producto de la amplificación en una tira de nitrocelulosa que contiene

sondas de oligonucleótido alelo-específico, fijadas en líneas paralelas de forma

automatizada en Auto-LiPA 48; 3) detección de las secuencias de cada codón

mediante revelado de color por estreptavidina-fosfatasa-alcalina y sustrato de color.

RESULTADOS

Resultados

65

En esta sección de resultados de esta Tesis Doctoral se presentan los dos artículos

que constituyen el trabajo desarrollado para la defensa de la misma. A continuación se

muestra el resumen de cada uno de ellos.

En el Anexo XII se incluyen otros trabajos publicados de los cuales la doctoranda es

coautora.

Resultados

67

Adela Castillejo*, Eva Hernández-Illán*, María Rodriguez-Soler, Lucía Pérez-

Carbonell, Cecilia Egoavil, Victor M Barberá, María–Isabel Castillejo, Carla Guarinos,

Eduardo Martínez-de-Dueñas, María-Jose Juan, Ana-Beatriz Sánchez-Heras, Zaida

García-Casado, Clara Ruiz-Ponte, Alejandro Brea-Fernández, Miriam Juárez, Luis

Bujanda, Juan Clofent, Xavier Llor, Montserrat Andreu, Antoni Castells, Angel

Carracedo, Cristina Alenda, Artemio Payá, Rodrigo Jover**, José-Luis Soto**.

*Adela Castillejo y Eva Hernández-Illán han contribuido igualmente a este trabajo y

comparten la primera autoría.

**Jose-Luis Soto y Rodrigo Jover han contribuido igualmente a este trabajo y

comparten la autoría sénior.

Journal of Medical Genetics. 2015 Jul;52(7):498-502.

Factor de impacto (2014): 6.335

Primer Cuartil (Genetics and Heredity 18/167; Q1)

Artículo 1. Castillejo A et al. “Prevalence of MLH1 constitutional epimutations

as a cause of Lynch syndrome in unselected versus selected consecutive

series of patients with colorectal cancer”. J Med Genet. (2015)

Resultados

68

RESUMEN

Introducción: La prevalencia de las epimutaciones constitucionales en MLH1 en la

población general es desconocida. Nuestro objetivo fue determinar la prevalencia de

las epimutaciones constitucionales en MLH1 en una serie no seleccionada de

pacientes con cáncer colorrectal, y compararla con la prevalencia de este mismo

fenómeno en una serie seleccionada.

Métodos: En el grupo no seleccionado se incluyeron pacientes con diagnóstico de

cáncer colorrectal (n=2123). Para comparar, se incluyó además un grupo seleccionado

de 847 pacientes con cáncer colorrectal que cumplían los criterios revisados de

Bethesda. En casos con ausencia de expresión de MLH1, se evaluó la metilación

somática y constitucional de MLH1 mediante amplificación multiplex de sondas

dependientes de ligación y específicas de metilación. Se evaluaron alteraciones

germinales en los genes reparadores de errores por secuenciación Sanger y

amplificación multiplex de sondas dependientes de ligación.

Resultados: El 5,5% de los casos de la serie no seleccionada y el 12,5% de la serie

selecccionada presentaban pérdida de expresión de MLH1 (p<0,0001). No se

detectaron epimutaciones constitucionales en MLH1 en la población no seleccionada

(0/62); cinco casos de la serie seleccionada fueron positivos para epimutaciones en

MLH1 (15,6%, 5/32; p=0,004).

Conclusiones: Nuestros resultados sugieren una prevalencia insignificante de

epimutaciones constitucionales en MLH1 en cohortes no seleccionadas de cáncer

colorrectal. Por tanto, el análisis de epimutación constitucional en MLH1 debería

dirigirse exclusivamente a pacientes que cumplen los criterios revisados de Bethesda y

cuyo tumor presente pérdida de expresión y metilación de MLH1.

Fd

Supplementary Table 1. Clinical and pathological characteristics of CRC patients.

UNSELECTED COHORT*

n (%)

SELECTED COHORT

n (%) Age, median (IQI) 71.5 (62.3-78) 49 (43-62)

Sex, males 1194 / 2073 (57.6) 285/574 (49.7) Amsterdam criteria 20/764 (2.6) 152/847 (17.9) Bethesda critera 377/2121 (17.8) 847/847 (100) Tumour pathologic features Location - Proximal - Distal (esplenic flexure included)

542/1696 (32) 1154/1696 (68)

NDA

Stage - I and II - III and IV

576/1141 (50.5) 565/1141 (49.5)

NDA

Grade - Low - High

1426/1596 (89.3) 170/1596 (10.7)

NDA

Histology (WHO) - Adenocarcinoma - Medullary carcinoma - Signet-ring cell carcinoma - Mucinous adenocarcinoma - Neuroendocrine carcinoma - Undifferentiated carcinoma - Other

1292/1449 (89.2) 25/1449 (1.7) 14/1449 (1) 90/1449 (6.2) 8/1449 (0.5) 6/1449 (0.4) 14/1449 (1)

NDA

Lymphocytic infiltration 416/2086 (19.9) NDA Molecular features MLH1 loss of expression 117/2123 (5.5) 106/847 (12.5) MSI 92/1179 (7.8) 183/840 (21.8) BRAF mutation 54/691 (7.8) 9/197 (4.6)

NDA: no data available.

* Frequency of patients fulfilling Bethesda criteria was 21.6% (158/669) for the Epicolon II

sub-cohort, versus 15.1% (219/1452) for the Hospital General Universitario de Alicante sub-

cohort (p<0.0001). This difference might be explained because only the Bethesda criterion

#1 (age at diagnosis of CRC <50y) was considered in the retrospective series from Hospital

General Universitario de Alicante, while the five canonical criteria for Bethesda classification

was used in Epicolon II sub-cohort.

No significant differences were found among the two sub-cohorts of the unselected series of

cases for the rest of variables.

Resultados

75

Laura Valle†, Eva Hernández-Illán†, Fernando Bellido, Gemma Aiza, Adela Castillejo,

María-Isabel Castillejo, Matilde Navarro, Nuria Seguí, Gardenia Vargas, Carla Guarinos,

Miriam Juarez, Xavier Sanjuán, Silvia Iglesias, Cristina Alenda, Cecilia Egoavil, Ángel

Segura, María-José Juan, María Rodriguez-Soler, Joan Brunet, Sara González, Rodrigo

Jover, Conxi Lázaro, Gabriel Capellá, Marta Pineda, José Luís Soto, Ignacio Blanco.

†Laura Valle y Eva Hernández-Illán han contribuido equitativamente a este trabajo.

Human Molecular Genetics. 2014 Jul 1;23(13):3506-12.

Factor de impacto (2014): 6.393

Primer Cuartil (Genetics and Heredity 17/167; Bioquemistry and Molecular Biology 32/290;

Q1)

Artículo 2. Valle L et al. “New insights into POLE and POLD1 germline

mutations in familial colorectal cancer and polyposis”. Hum Mol Genet. (2014)

Resultados

76

RESUMEN

Introducción: Se han identificado recientemente mutaciones germinales en las ADN

polimerasas ε (POLE) y δ (POLD1), en familias con múltiples adenomas colorrectales y con

CCR. Todos los casos descritos eran portadores de la mutación POLE c.1270C>G

(p.Leu424Val) o POLD1 c.1433G>A (p.Ser478Asn). Debido a la escasez de casos descritos

hasta la fecha, no se ha descrito un fenotipo clínico exacto. Nuestro objetivo fue evaluar la

presencia de estas mutaciones recurrentes en casos no explicados de CCR y poliposis

familiar de aparición temprana; y proporcionar información adicional para definir las

características clínicas de los casos con mutación.

Métodos: Se estudiaron un total de 858 pacientes de CCR y poliposis familiar de aparición

temprana: 581 casos de CCR familiar y de aparición temprana con el sistema reparador de

errores intacto (MMR), 86 casos con deficiencia en MMR, y 191 casos de poliposis. La

búsqueda de mutaciones se hizo mediante ensayos de genotipado KASPar y/o

secuenciación Sanger del respectivo exón.

Resultados: Se identificó la mutación POLE p.Leu424Val como mutación de novo en una

paciente de 28 años con CCR y poliposis. Ninguno de los 858 casos estudiados presentó la

mutación POLD1 p.Ser478Asn. Se identificó una nueva mutación POLD1 c.1421T>C

(p.Leu474Pro) en una familia Amsterdam II sin alteración del sistema reparador de errores.

La patogenicidad de esta variante se ve sustentada por la cosegregación genotipo-fenotipo

en la familia, las predicciones in silico, y ensayos funcionales en levaduras previamente

publicados.

Conclusiones: Las mutaciones en POLE y POLD1 explican un porcentaje de los casos de

CCR familiar y de poliposis. La secuenciación de los dominios de corrección de errores de

POLE y POLD1 se debería considerar en el diagnóstico genético rutinario. Hasta que no se

proporcione mayor evidencia, el estudio genético de POLE y POLD1 no se debería restringir

a los casos con poliposis y debería considerarse la presencia de mutaciones de novo.

SUPPLEMENTAL MATERIAL

Suppl. Table 1. Primers and PCR conditions.

Suppl. Figure 1. Absence of LOH at POLE in the colon tumor developed by the POLE L424V mutation

carrier. LOH results using two informative microsatelites, D12S1628 and D12S357, and the mutation,

assessed by SNaPshot, are shown.

Forward Primer (5’-3’) Rev erse Primer (5’-3’) Amplicon

size

Annealing

temperature Series

POLE_exon 13 CATCCTGGCTTCTGTTCTCA GTGGCCATCTGGATGTGTG 223 60ºC No.2

POLD1_exon 11 GTGTGTCCCTGTCCTTGGAA GTCAGAGGTTGGGGTGAGAG 217 60ºC No.2

POLE_L424V GGTGCCTGTTAGGAACTTGC CCGCACACACAGTAAGGAGA 449 57ºC No.1

POLD1_S478N GGAGTACAAGCTCCGCTCCT GAAAAAGTGGGCGTCAGGTA 250 57ºC No.1

SNaPshot

POLE_L424V_LOH TTACCTTCCTGTGGGCAGTC TAGCTCCACGGGATCATAGC 73 54ºC

SNaPshot extension TTCCTGTGGGCAGTCATAAT - - -

DISCUSIÓN

Discusión

87

En la oncogénesis y desarrollo del cáncer colorrectal intervienen una combinación de

factores fundamentalmente de tipo ambiental. No obstante, se estima que el

componente hereditario puede estar presente hasta en un 30% de los casos. En la

mayor parte de éstos se trata de variantes genéticas de penetrancia moderada o baja;

mientras que los casos donde se evidencia una alta penetrancia con herencia

mendeliana, y que configuran entidades clínicas sindrómicas identificables, suponen

entre un 3-5% del total de los CCR. Los principales genes implicados en cada uno de

los síndromes hereditarios de CCR son conocidos (a excepción de la Poliposis Mixta

Hereditaria) y se utilizan en el diagnóstico genético y predictivo de riesgo en las

familias que cumplen determinados criterios clínicos y patológicos.

En los últimos 25 años el avance en el conocimiento de estas patologías ha sido

meteórico y ha permitido una mejora sustancial en el manejo de las familias. No

obstante, la mayoría de estos síndromes hereditarios muestran un alto grado de

complejidad desde el punto de vista genético. La mayoría de estos síndromes tienen

una herencia autosómica dominante (excepto MAP con herencia recesiva), con

penetrancia incompleta y expresividad variable. Algunos de ellos presentan una

notable heterogeneidad de loci o de alelo, además de patrones de herencia atípicos,

con mutaciones de novo o mosaicismo somático. El rendimiento del diagnóstico

genético sigue siendo muy mejorable, ya que en la mayoría de los casos no se llega a

identificar la alteración genética responsable. Las causas pueden ser múltiples, desde

aspectos que tienen que ver con la estrategia o algoritmos diagnósticos, a los

puramente técnicos y de interpretación de resultados, como a la existencia de genes y

mecanismos moleculares responsables de los síndromes que son desconocidos en el

momento actual.

En este escenario, en los últimos años se están acumulando evidencias que muestran

un solapamiento significativo en el fenotipo clínico de diferentes síndromes, lo que

complica el diagnóstico genético y en consecuencia, el manejo de los pacientes y sus

familiares a riesgo. Se están describiendo un número creciente de casos en los que el

síndrome de sospecha inicial es diferente del que termina resultando tras un análisis

genético masivo, fundamentalmente utilizando amplios paneles de genes. Así pues,

casos con sospecha clínica de síndrome de mama-ovario hereditario terminan siendo

genéticamente un SL (167), o casos que cumpliendo criterios clínicos, patológicos y

moleculares somáticos de SL presentan mutación en MUTYH y son realmente MAP

(136-137) o incluso Li-Fraumeni (168).

Discusión

88

El SL es el paradigma de complejidad genética: es el síndrome de CCR hereditario

más prevalente y presenta una herencia autosómica dominante, heterogeneidad de

loci, penetrancia incompleta y variable según las poblaciones (18, 63, 66, 72-73) y con

expresividad también muy variable. Se han descrito casos con mutaciones de novo

(169) y fenómenos de anticipación (170), así como mutaciones en zonas intrónicas

(171), profundas traslocaciones e inversiones (98-101). Las mutaciones en

heterocigosis en PMS2 presentan una moderada penetrancia (15-20%) (71), pudiendo

pasar desapercibidas en la mayoría de los casos. Existen formas con mutación

bialélica y un fenotipo muy agresivo con cánceres en la infancia (8). Algunas familias

con SL presentan alteraciones epigenéticas (hipermetilación en el promotor de MSH2)

como causa directa, siendo ésta el resultado de una deleción que afecta a un gen

próximo (EPCAM) no relacionado funcionalmente con la reparación de errores de tipo

mismatch. Finalmente, en hasta un 10-15% de los casos con sospecha de SL (criterios

de Bethesda), que presentan pérdidas de expresión inmunohistoquímica de MLH1 y

metilación de su promotor en el tejido tumoral, la causa de la enfermedad es una

epimutación constitucional en dicho gen.

En el presente trabajo de Tesis Doctoral se ha pretendido aportar nuevo conocimiento

que ayude a mejorar la eficacia del diagnóstico genético en individuos y familias con

alto riesgo de CCR. El primero de los dos estudios que conforman la Tesis Doctoral se

enmarca precisamente en este último aspecto de las epimutaciones constitucionales

de MLH1. Se trata de un estudio colaborativo multidisciplinar con la participación del

grupo EPICOLON II y el Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad

Valenciana.

Hasta la fecha, y utilizando el algoritmo de análisis establecido para pacientes con

sospecha de SL (pacientes que cumplen criterios de Bethesda) , el estudio de la

metilación de MLH1 en sangre está indicado en todos aquellos casos con pérdida de

expresión de MLH1 y metilación de su promotor en tejido tumoral. El nuevo escenario

que se nos presenta con la incorporación del cribado universal, mediante el estudio

inmunohistoquímico de las proteínas MMR de todos los CCR y CE, o aquellos

diagnosticados antes de los 71 años, conlleva ineludiblemente la identificación de un

elevado número de casos con pérdida de expresión de MLH1 y metilación de su

promotor en el tumor. Se hacía necesario por tanto, establecer cuál es la prevalencia

real de epimutaciones constitucionales de MLH1 en población no seleccionada, con

objeto de precisar cuándo hacer el estudio de metilación en sangre en el algoritmo del

cribado universal.

Discusión

89

Para abordar esta cuestión se incluyeron dos cohortes de pacientes con CCR: una

serie de casos de CCR no seleccionados (n=2.123) y una serie seleccionada de casos

que cumplían al menos los criterios revisados de Bethesda (n=847). Ambas series

mostraron diferencias en variables demográficas y moleculares, relacionadas con los

criterios de selección. Así, la serie no seleccionada presentó una mayor proporción de

varones, de acuerdo con lo descrito para CCR no seleccionado (3) y mayor edad al

diagnóstico, tanto cuando se consideran las series completas, como entre los casos

que presentan metilación de MLH1 en el tumor. Esta metilación puede estar

relacionada con el fenotipo CIMP típico en estos tumores con IMS, que se caracteriza

por la hipermetilación somática de las regiones promotoras de los genes supresores

de tumores y que típicamente se asocia al envejecimiento, lo que podría explicar estas

diferencias de edad encontradas en los casos con metilación de MLH1 entre ambas

cohortes. Además, la serie no seleccionada presentó un menor porcentaje de tumores

con pérdida de expresión de MLH1; pero cuando se considera el subgrupo de estos

casos con pérdida de expresión de MLH1 se observa una mayor frecuencia de

metilación somática de MLH1 en estos casos no seleccionados. Esto puede responder

a una mayor representación de casos hereditarios en la serie seleccionada: mayor

frecuencia de mutaciones germinales en los genes MMR y epimutaciones

constitucionales en MLH1.

No se observaron epimutaciones constitucionales en el grupo no seleccionado. Sin

embargo, un 15,6% de los pacientes que acudían a las consultas de consejo genético

por sospecha clínica de SL (cumplimiento de los criterios revisados de Bethesda) que

presentaban pérdida de expresión de MLH1 y metilación somática de este gen en el

tumor, presentaron epimutación contitucional de MLH1. Ninguno de los casos

identificados presentaba mutaciones en línea germinal de MLH1. Estas epimutaciones

se han considerado como una causa poco frecuente de CCHNP. Nuestros resultados

confirman la frecuencia de las epimutaciones en MLH1 previamente descrita, en torno

al 10-15% de estos casos (109, 172-174), avalando así la incorporación de su estudio

en el algoritmo diagnóstico de SL.

El estudio de la epimutación de MLH1 hasta la fecha se ha restringido a pacientes

seleccionados de CCR con fenotipo de riesgo; ningún estudio había abordado el

análisis de la prevalencia de esta alteración en una gran serie de pacientes con CCR

de base poblacional. Los resultados de este estudio sugieren que la prevalencia de

esta alteración epigenética en población de CCR no seleccionada es insignificante.

Por el contrario, su prevalencia no es despreciable, como hemos podido confirmar, en

Discusión

90

pacientes que cumplen los criterios de Bethesda y presentan pérdida de expresión de

MLH1.

La historia familiar de cáncer en los cinco casos con epimutación constitucional es

ausente o escasa, mostrando únicamente uno de los cinco pacientes un familiar de

primer grado afecto de un cáncer relacionado con el SL (Anexo VI). Además, se

analizaron once familiares de tres casos índice con epimutación (Anexo VI) y ninguno

mostró metilación de MLH1 en sangre, lo que sugiere que este evento en nuestra serie

puede ser el resultado de una alteración de novo. No obstante, en dos casos índices

no se pudo estudiar la presencia de metilación constitucional de MLH1 en sus

familiares, por lo que no se puede descartar algún tipo de herencia de este evento en

los mismos. Las epimutaciones constitucionales son reversibles en la meiosis, por lo

que presentan una herencia no mendeliana atípica, a diferencia de la herencia

autosómica dominante asociada a las mutaciones en los genes del SL (109, 111). Se

han propuesto distintos mecanismos de herencia transgeneracional de estas

epimutaciones, aunque realmente han sido identificados en un escaso número de

familias (175). En los casos con epimutación de nuestra serie se secuenció el

promotor de MLH1 en busca de alteraciones genéticas en cis que pudieran explicar la

epimutación en estos casos, pero no se observó ninguna alteración significativa. El

único hallazgo fue en el caso #5, que resultó heterocigoto para el polimorfismo -

93G>A. Esta variante tiene una frecuencia del alelo menos frecuente de 31,5% (1000

genomas) y se ha asociado a CCR con IMS y CIMP (176), habiendo sido también

descrita anteriormente en otro caso con epimutación (172).

Atendiendo al ratio de metilación encontrado en la región activa del promotor de MLH1

(regiones C y D, Tabla 1 del Artículo 1) en estos cinco casos con epimutación,

podemos considerar que todos ellos presentan metilación constitucional monoalélica.

Hasta la fecha, sólo se ha descrito un caso con metilación constitucional bialélica

(174). En los tumores de tres de estos cinco casos la metilación en MLH1 resultó

bialélica (ratio de metilación >80%), mientras que en los tumores y demás tejidos

analizados de los otros dos casos, el ratio de metilación sugería un carácter

monoalélico, por lo que en estos casos la inactivación somática del segundo alelo

tendría lugar presumiblemente por otro tipo de alteraciones genéticas (mutaciones

puntuales, grandes reordenamientos, LOH…).

La mutación de BRAF_V600E se asocia fuertemente a la inactivación de MLH1 por

hipermetilación de su promotor (177-178) y este marcador ha sido ampliamente

Discusión

91

utilizado para la discriminación entre CCR del SL y CCR esporádico con IMS. Como

era previsible, en nuestro estudio las mutaciones de BRAF en los casos con metilación

en MLH1 fueron significativamente más frecuentes en la serie no seleccionada que en

la serie seleccionada. No obstante, ninguno de los cinco casos con metilación

constitucional en MLH1 presentó la mutación en BRAF, lo que podría sugerir que la

presencia de la mutación de BRAF también podría comportarse como un marcador

negativo para la presencia de epimutación en MLH1, como ya lo hace en los casos

con mutación de MLH1 en línea germinal. En los estudios realizados hasta la fecha,

sólo se han descrito tres casos con epimutación en MLH1 y mutación en BRAF (175,

179-180). Se precisaría disponer de la información referida a un tamaño muestral

suficientemente representativo para poder establecer la existencia de tal asociación y

su valor como marcador excluyente de epimutación constitucional de MLH1.

La inclusión del análisis de las epimutaciones constitucionales de MLH1 en el

algoritmo diagnóstico del SL, en casos que cumplen criterios de sospecha, está

ampliamente aceptada. No obstante, la realidad en nuestro entorno es que su análisis

rutinario no está implementado de forma generalizada en los laboratorios diagnósticos.

Aspectos como limitaciones de disponibilidad tecnológica, la baja prevalencia de estas

alteraciones o la incertidumbre respecto a su penetrancia y modo de herencia pueden

influir en su utilización. En cualquier caso, estos pacientes tienen un riesgo

incrementado de desarrollar tumores metacronos relacionados con el SL y un riesgo

desconocido de cáncer en sus familiares, por lo que consideramos que el análisis de

epimutación constitucional no se puede obviar, aunque solo sea para no interpretar

erróneamente que la metilación de MLH1 presente en el tumor del caso índice implica

un origen esporádico, sino que se trata realmente de una condición hereditaria de SL

atípica.

En conclusión, nuestros resultados confirmaron que alrededor de un 10-15% de los

casos con sospecha de SL, con pérdida de expresión e hipermetilación de MLH1 en el

tumor, presentan epimutación constitucional en dicho gen. En casos de CCR no

seleccionados no se detectó ningún caso con epimutación constitucional. En

consecuencia, dicho análisis se recomienda únicamente en casos con pérdida de

expresión e hipermetilación de MLH1 en tumor que cumplen criterios de Bethesda, ya

sean remitidos como tal (Anexo II) o que provengan de un cribado universal (Anexo I).

Los criterios de Bethesda aplicables en este último caso van a corresponder

fundamentalmente a lo concerniente a su historia personal de cáncer y sus

características clínicas y patológicas, más que a los criterios relacionados con los

Discusión

92

antecedentes familiares, que generalmente están ausentes o no recogidos con rigor en

la historia clínica del paciente.

Con el estudio presentado se añade una pequeña pieza al puzle que está permitiendo

gestionar adecuadamente el manejo de los casos con metilación de MLH1 en tumor

provenientes del cribado universal; que a su vez, aporta un incremento en la

sensibilidad en la detección del SL y una mejora en su diagnóstico. Como

consecuencia, se ofrece la posibilidad de un mejor manejo de la población a riesgo , de

una forma proactiva y eficiente.

Existen, no obstante, muchos otros ámbitos de mejora dentro del complejo contexto de

la identificación de formas de predisposición hereditaria a CCR e individuos a riesgo.

Con el conocimiento actual, todavía son muchas las familias con elevada carga de

cáncer y que cumplen criterios clínicos de cualquiera de los síndromes relacionados

con CCR hereditario, en las que no se llega a identificar la causa genética responsable

del alto riesgo patente en la familia. Las nuevas tecnologías de secuenciación masiva

aportan una herramienta muy eficaz en el descubrimiento de nuevos genes

responsables de formas hereditarias no explicadas. Un ejemplo reciente y notable de

esto mismo, ha sido la identificación de dos mutaciones recurrentes en dos genes que

codifican para las subunidades catalíticas de las polimerasas ε y δ (POLE y POLD1,

respectivamente) como responsables de casos de CCR y poliposis adenomatosas, y

CE con agregación familiar de cáncer (119). Este nuevo conocimiento nos ofreció la

posibilidad de reanalizar aquellos casos de familias con elevada carga de CCR o

poliposis en los que no se encontró mutación en los genes responsables de los

síndromes de sospecha, para así establecer la prevalencia de las mutaciones

recurrentes en POLE y POLD1 en nuestra población, y poder contribuir a una mejor

definición del fenotipo clínico asociado a estas mutaciones.

En este contexto se planteó el segundo estudio del presente trabajo de Tesis Doctoral.

El artículo publicado es fruto de una colaboración multicéntrica y multidisciplinar donde

se recogen los resultados obtenidos de tres series independientes de pacientes con

CCR y/o poliposis, con carga familiar de cáncer o poliposis provenientes de: i)

pacientes del Instituto Catalán de Oncología (pacientes con CCR y/o poliposis), ii)

Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad Valenciana (pacientes con CCR) y

iii) estudio multicéntrico nacional EPIPOLIP (pacientes con poliposis atenuadas: 10-

100 pólipos). Se realizó el cribado de las dos mutaciones recurrentes descritas

(POLE_p.Leu424Val y POLD1_p.Ser478Asn) en un total de 858 pacientes.

Discusión

93

Globalmente, en el estudio se identificó un individuo portador de la mutación

POLE_p.Leu424Val, que resultó ser de novo, y ningún caso portador de la mutación

POLD1_p.Ser478Asn; lo que pone de manifiesto la escasa prevalencia de esta

mutación en población española.

No obstante, se identificó una nueva mutación en POLD1 no descrita hasta la fecha:

p.Leu474Pro en una familia que cumple criterios de Amsterdam II, sin alteración del

sistema MMR detectada por IHQ ni IMS (CCR familiar tipo X). La Leu474 de POLD1

es el residuo parálogo de Leu424 en POLE, que es claramente patogénico; además,

está muy conservado en la evolución, los diferentes programas de predicción in silico

utilizados sugieren patogenicidad y los estudios funcionales in vitro (levaduras) indican

una pérdida de funcionalidad de la polimerasa con esta alteración, produciendo un

fenotipo mutador. La mutación encontrada cosegrega con la enfermedad en la familia,

estando presente en los individuos afectos. La sumatoria de todas estas evidencias

nos permite clasificarla como patogénica y responsable de la predisposición a cáncer

en los individuos portadores.

La mutación en esta familia se identificó en dos mujeres afectas de múltiples tumores:

el caso índice con un CCR y un tumor gastrointestinal estromal (GIST) sincronos

diagnosticados a los 36 años, y la tía materna con CCR y CE diagnosticados a los 33 y

56 años respectivamente. La madre del caso índice, con CE a los 52 años, era por

tanto portadora obligada de la mutación. Ninguna de estas tres mujeres ni ningún otro

miembro de la familia presentó pólipos en el colorrecto. Previamente ya se ha visto

una prevalencia elevada de CE en mujeres portadoras de mutaciones en POLD1,

concretamente de la mutación p.Ser478Asn (119). Esto pone de manifiesto la

importancia de las medidas de prevención para este tipo de tumor en las pacientes

portadoras de mutaciones en este gen.

Esta nueva mutación identificada en nuestra serie ha sido descrita posteriormente en

una familia en un estudio publicado por nuestros colaboradores del ICO en Cataluña

(181). Esta familia, aparentemente no relacionada con la anterior procede también del

Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad Valenciana. Se trata de una familia

que cumple criterios de Amsterdam I, con casos tanto MSS como IMS (pérdida de

MSH6), en la que se ha identificado la mutación en 7 individuos: dos sanos y 5

diagnosticados de CCR, pólipos colónicos y pólipos gástricos (Anexos: VII-A.1., VIII,

XII-C.1.). Más recientemente, nuestro grupo ha identificado también esta mutación en

una tercera familia del Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad Valenciana,

Discusión

94

aparentemente no relacionada con las dos anteriores. Se trata de una mujer que

desarrolló un CCR a los 51 años, sin antecedentes familiares de cáncer y que

provenía del cribado universal. Presentaba pérdida IHQ de MLH1 y PMS2, IMS, con

ausencia de metilación de MLH1 y mutación de BRAF en tumor y ausencia de

mutación de MLH1 en línea germinal (Anexos VII-A.2.; Anexo VIII) (datos no

publicados).

Por tanto, las tres familias identificadas con la mutación p.Leu474Pro en POLD1

proceden de la Comunidad Valenciana y aparentemente no están relacionadas.

Estudios posteriores de otros grupos que han analizado, o bien el exoma completo, o

bien el dominio exonucleasa de POLD1 en casos de CCR o poliposis familiar en busca

de mutaciones germinales, no han vuelto a identificar esta alteración (182-185). Esta

situación sugiere un posible efecto fundador de esta mutación en esta región. El

estudio de haplotipos en las tres familias para establecer el carácter fundador de esta

mutación está en desarrollo.

Algo similar podría suceder con la mutación POLD1_p.Ser478Asn, ya que el único

estudio realizado hasta la fecha en el que ésta se vuelve a encontrar, es en el llevado

a cabo por Chubb y colaboradores (185), en el que se observa esta mutación en una

familia con CCR y poliposis de una cohorte del Reino Unido (Anexo VIII), mismo origen

que el de las familias donde se describió esta mutación por primera vez (119).

Otras cinco mutaciones germinales nuevas en el dominio exonucleasa de POLD1 se

han descrito posteriormente a la publicación del segundo artículo de esta tesis y hasta

la fecha, en familias con CCR principalmente, pero también cáncer de mama y otros

tumores, en ausencia de pólipos y de IMS (Anexo IX) (181, 185). En estas cinco

familias descritas no se han encontrado casos con adenomas u otro tipo de pólipos

colónicos. No obstante, es necesario esperar a que se identifiquen más familias

portadoras de mutaciones para redefinir con mayor evidencia el espectro fenotípico

completo asociado a la pérdida de funcionalidad de estos genes.

Por otro lado, la mutación recurrente descrita en POLE (p.Leu424Val) en nuestro

estudio se identificó en un único individuo diagnosticado con poliposis adenomatosa y

CCR a los 28 años. Este individuo fue además diagnosticado de un oligodendroglioma

dos años más tarde (Dx: 30 años), lo que está descrito en el estudio realizado por

Bellido y colaboradores (181). El análisis realizado en los progenitores concluyó que la

mutación en esta familia tuvo lugar de novo, lo que supone el primer caso de mutación

Discusión

95

germinal de novo en los genes POLE/POLD1, y hasta la fecha sólo se ha descrito otro

caso, con mutación en el dominio exonucleasa de POLE (Anexo IX) (182). Este evento

sí que se produce de manera relativamente frecuente en otros genes de

predisposición a cáncer, como es el caso de APC en el 20-25% de casos (127). No

obstante, no se puede descartar que la aparición de novo pueda ser consecuencia de

un mosaicismo somático en alguno de los progenitores. La existencia de mutaciones

de novo en el codón Leu424 de POLE y su mayor prevalencia con respecto a POLD1

sugiere que se trate de un hotspot (punto caliente) que pueda generar casos mutados

de forma independiente y recurrente.

Esta mutación se ha identificado en estudios posteriores en 22 individuos

correspondientes a 10 familias aparentemente no relacionadas (182, 185-186), más

una familia extra en nuestra cohorte de Cáncer Hereditario de la Comunidad

Valenciana (Anexos VII-B; VIII; XII-C.1.). Esto, junto con los datos publicados

previamente y la familia identificada en el segundo artículo de esta tesis doctoral

hacen un total de 51 individuos portadores de la mutación POLE_p.Leu424Val,

pertenecientes a 24 familias aparentemente no relacionadas. El fenotípico típico de los

pacientes portadores es de CCR y/o poliposis colónicas, pero también se ha

observado la presencia de múltiples tipos de cáncer: carcinomas en otras partes del

tracto digestivo, pólipos gástricos y duodenales, otro tipo de cánceres como mama o

gliomas, etc; todos normalmente MSS (119, 182, 185-186) (Anexos IV y VIII).

Posteriormente a la publicación de nuestro artículo, se han descrito doce mutaciones

nuevas en el dominio exonucleasa de POLE, cada una detectada en una única familia,

con excepción de la mutación p.Lys425Arg, descrita en dos familias aparentemente no

relacionadas (Anexo IX). Estas trece familias presentan CCR, pólipos colorrectales y

una amplia gama de otros tipos tumorales, destacando la presencia de melanoma y

gliomas (182-185, 187).

En definitiva, los resultados obtenidos en nuestro estudio, junto con los obtenidos por

el resto de estudios realizados hasta la fecha, ponen de manifiesto la existencia de

mutaciones patogénicas en el dominio exonucleasa de las polimerasas en familias con

CCR, poliposis, CE y otra gran variedad de tumores diferentes que no presentaban

mutaciones en los genes responsables de los síndromes de sospecha.

Discusión

96

A modo de recapitulación, podemos concluir que las características de las familias con

mutaciones germinales en los genes POLE y POLD1 y por tanto, la propuesta de

criterios clínicos para la sospecha de PPAP serían las que se muestran en el Anexo X.

Globalmente, parece que el perfil fenotípico de las familias con mutaciones germinales

en POLE se asemeja más a aquellas familias con PAF o MAP y, por su parte, el perfil

de las familias con mutación en POLD1 es más similar al del SL, lo que vuelve a poner

de manifiesto el solapamiento fenotípico entre los distintos síndromes de

predisposición a CCR. No obstante, se requieren estudios adicionales que analicen

familias con mutaciones germinales en los dominios exonucleasa de estas

polimerasas para definir mejor los criterios clínicos, características y fenotipo de las

mismas.

Como ya se ha demostrado (153), los tumores con mutaciones en los dominios

exonucleasa de las polimerasas, ya sean éstas somáticas o germinales, muestran un

fenotipo hipermutador, que en ocasiones lleva a una tasa de mutaciones del orden de

106 sustituciones por tumor. En estos tumores, el espectro mutacional es diferente, con

una proporción incrementada de transversiones G:C a T:A y A:T a C:G. Por ello, se

esperaría encontrar una elevada cantidad de mutaciones en los genes comúnmente

implicados con CCR. Sin embargo, en nuestro estudio, en dos tumores de dos mujeres

portadoras de la variante POLD1_p.Leu474Pro (un CCR y un CE) de los que había

disponibilidad de material, no se encontraron mutaciones en los codones típicos de

KRAS, NRAS y BRAF, aun cuando muchas de estas mutaciones son transversiones

de este tipo. Además, estos tumores de nuestro estudio presentaban el sistema MMR

funcional e intacto. Esto concuerda con los resultados obtenidos en estudios previos

(119, 143), donde la tasa de mutaciones de genes típicamente implicados de forma

temprana en la carcinogénesis (incluyendo APC) es particularmente baja. En el

estudio realizado por el TGCA en CE se muestra un porcentaje elevado de mutaciones

en los genes PIK3CA y FBXW7 en los casos con mutaciones tipo missense en POLE

(155). No obstante, estos estudios están realizados en tumores con mutaciones

somáticas en POLE y no POLD1, ya que éstas últimas son mucho menos prevalentes.

En este estudio del TCGA se observó además que los tumores con mutaciones en

POLE parecían tener mejor pronóstico que el resto de tumores con otros perfiles

somáticos. No obstante, estudios posteriores no mostraron asociación de la presencia

de estas mutaciones con la supervivencia o variables patológicas (188-189).

Discusión

97

Incluso, en el estudio realizado por Billingsley y colaboradores se vio que la

distribución de las mutaciones de POLE era prácticamente equivalente entre tumores

estables e inestables (188). Otros estudios también han mostrado la presencia de

estas mutaciones a nivel somático en tumores con alteración de la vía reparadora

(155, 190). Estos casos serían los llamados “SL-like” (191), ya que muestran alteración

somática del sistema MMR, pero sin embargo no se encuentra mutación germinal en

estos genes, ni hipermetilación tumoral en MLH1 que la explique. Una posibilidad

sobre el origen del tumor en estos pacientes, ya postulada por algunos autores (167,

186), es que mutaciones germinales en otros genes distintos a los del sistema MMR

causen indirectamente la inactivación del mismo, posiblemente por alterar a nivel

somático los genes que lo codifican. Esto ya se ha visto en algunos pacientes con

deficiencia en MUTYH (136-137). Lo mismo podría suceder en casos con mutaciones

germinales en POLE/POLD1 que, por tener estos casos una tasa tan elevada de

mutaciones en sus tumores, podrían alterar indirectamente el sistema MMR, creando

un tumor con un fenotipo Lynch, lo que explicaría aquellos casos PPAP con alteración

del sistema MMR (186). De hecho, es probable que la paciente de la tercera familia

descrita anteriormente con la mutación p.Leu474Pro de POLD1 y CCR con pérdida de

MLH1, sin metilación ni BRAF mutado, ni mutación de MLH1 en línea germinal sea un

ejemplo de esto. Además, también podría ocurrir este efecto de deficiencia de MMR

indirecta a nivel somático, si se alteran los genes POLE y POLD1 en determinados

tejidos y estocásticamente alteran los genes MMR. En cualquier caso, se espera que

estudios futuros evalúen el espectro mutacional de los tumores con mutaciones

somáticas en POLE y POLD1, y proporcionen una imagen más clara del perfil

patológico molecular de los tumores de este síndrome.

En definitiva, los resultados descritos en el segundo artículo de esta tesis, junto con la

información publicada hasta la fecha por otros autores, avalan el estudio de la región

que codifica para el dominio exonucleasa de los genes POLE y POLD1 en todos los

casos de CCR y/o poliposis; y otros espectros tumorales resumidos en el Anexo X, con

agregación familiar de cáncer y sin mutación en los genes de predisposición

tradicionales. Dependiendo de la metodología de análisis, esto se puede realizar, bien

incluyendo dichos genes en los paneles diseñados para el análisis por secuenciación

masiva, o bien incorporando su estudio en el algoritmo secuencial de análisis, una vez

se hayan descartado alteraciones en otros genes que sean más prevalentes.

Los resultados derivados de los dos trabajos incluidos en el presente trabajo de Tesis

Doctoral ofrecen dos pequeñas mejoras en los algoritmos que siguen siendo utilizados

Discusión

98

de manera generalizada en nuestro entorno para el abordaje del diagnóstico genético

tanto de CCHNP, como de las poliposis atenuadas mediante secuenciación Sanger.

1. Cuando se observe alteración de la expresión de MLH1 en el tumor e

hipermetilación del promotor de MLH1 se debe analizar la presencia/ausencia de

epimutación constitucional en MLH1 en una muestra de sangre del paciente como

causa de SL, solamente si la familia cumple criterios de Bethesda.

2. Cuando no se encuentran alteraciones en el análisis de mutaciones germinales en

los genes de sospecha, según se trate de SL o poliposis, se deberá proceder al

cribado mutacional en los dominios exonucleasa de los genes POLE y POLD1,

independientemente de si el tumor tiene el sistema MMR alterado o no.

En cualquier caso, para ambas situaciones de CCHNP y poliposis debería

considerarse en estas familias la posibilidad de aparición de múltiples fenotipos

tumorales y de eventos mutacionales de novo. De hecho, el estudio de estos genes no

debería restringirse a casos índice con CCR o CE, sino que debería considerarse

también en presencia de otros tumores del tracto digestivo distintos y de tumores

extracolónicos fuera del espectro Lynch (como cáncer de mama, glioma, melanoma,

etc). Por ello, según los resultados del segundo trabajo de esta tesis y de otros

estudios publicados hasta la fecha, no basta con aplicar los criterios clínicos de

Bethesda para filtrar a las familias, sino que habría que estandarizar unos criterios en

base a los aquí propuestos en el Anexo X, y a los que se proponen en el estudio

realizado por el grupo de Bellido y colaboradores (181) para cribar a las familias

PPAP.

Los individuos de las familias de cáncer familiar en las que no se encuentran

alteraciones germinales en los genes de sospecha, reciben un seguimiento de alto

riesgo, por el desconocimiento del riesgo específico a desarrollar cáncer de cada uno

de los miembros. Esto conlleva una importante repercusión psicológica en la familia y

económica en el sistema sanitario. La identificación de alteraciones germinales permite

personalizar el riesgo de cáncer en las familias portadoras de las mismas,

identificando los individuos portadores y no portadores, y pudiendo así definir un

seguimiento específico para los individuos de alto riesgo, lo que supone una mejora

sustancial de la eficiencia del manejo clínico de estas familias.

Discusión

99

Basado en las evidencias proporcionadas hasta la fecha, se recomienda que tanto los

pacientes y familias con epimutaciones como con mutaciones germinales en los

dominios exonucleasa de las polimerasas, tengan un seguimiento equivalente al de los

pacientes con SL y poliposis; teniendo en cuenta la herencia no mendeliana de las

epimutaciones y el riesgo a desarrollar tumores fuera del espectro Lynch para los

pacientes PPAP. Para estos últimos, se han propuesto recientemente medidas de

seguimiento (181-182, 185), como son la realización de colonoscopias cada 1-2 años y

gastroduodenoscopias cada tres, empezando a los 20-25 años (181-182). Añadiendo

el cribado de CE a partir de los 40 años para las mujeres portadoras de mutaciones en

POLD1 (181), y la consideración de la cirugía profiláctica (185). Lógicamente, el nivel

de evidencia de estas recomendaciones es bajo (recomendaciones de expertos), pero

de momento es todo de lo que disponemos en este ámbito específico.

La implementación de estos análisis en el algoritmo genético para el diagnóstico de

síndromes de cáncer y poliposis hereditarios, contribuiría a reducir la heredabilidad

perdida que hay en estos síndromes que, a día de hoy, sigue siendo bastante elevada.

No obstante, la prevalencia de las epimutaciones en MLH1 y de las mutaciones en

POLE y POLD1 es baja, en comparación con los genes clásicos de CCR hereditario.

En nuestro estudio hemos visto que en casos que cumplen criterios de Bethesda para

el cribado del SL, la prevalencia de las epimutaciones constitucionales de MLH1 es del

0,6%; y para POLE y POLD1 del 0,23%, aunque nuestro estudio sólo interroga las dos

mutaciones recurrentes. En el estudio realizado por Chubb y colaboradores en 646

individuos con CCR de aparición temprana (<56 años) con al menos un familiar de

primer grado afecto de CCR, en el que analizan los genes de elevada penetrancia en

la susceptibilidad a CCR, observan una prevalencia de estas mutaciones del 0,5%

(0,3% para POLE y 0,2% para POLD1 respectivamente), en comparación con la

prevalencia más elevada de las mutaciones en los genes de Lynch, del 10,9%, y de

los genes de poliposis adenomatosas, que explican un 2,7% de los casos (185).

Globalmente, este estudio muestra que la heredabilidad perdida de los casos de CCR

familiar está en torno al 76%.

En familias de CCHNP, con elevada agregación de cáncer y con el sistema MMR

intacto (CCR familiar tipo X), estudios recientes han descrito mutaciones en otros

genes distintos a los clásicos de predisposición a CCR (como BMPR1A, FAN1,

GALNT12, HNRNPA0-WIF1, RPS20, SEMA4A; Tabla 6) de forma puntual (117-118,

120-121, 123-125). Lo mismo ha ocurrido para una serie de casos de poliposis

adenomatosa, donde se identificaron mutaciones en el gen NTHL1 (142).

Discusión

100

La mayoría de estos estudios han podido identificar estos nuevos genes candidatos

mediante el empleo de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva (NGS)

(análisis del exoma o genoma completos). El uso de NGS en la investigación en este

campo está permitiendo generar nueva evidencia científica para la creación de

paneles amplios de genes de cáncer para el diagnóstico en el ámbito asistencial, que

evalúen simultáneamente los genes candidatos clásicos de predisposición a cáncer; y

vayan incorporando aquellos genes nuevos que se van descubriendo. El uso de estos

paneles de genes por NGS a día de hoy ya es coste-efectivo, en comparación con los

algoritmos de diagnóstico genético clásicos, que dirigen el estudio genético en función

del fenotipo clínico de los pacientes (192). Su utilización permite además, solventar el

problema del solapamiento genotípico-fenotípico que empezamos a ver en un número

creciente de casos.

En estos momentos nos encontramos en un punto de inflexión, donde se está

produciendo precisamente la incorporación de la NGS al ámbito asistencial de una

forma generalizada. Y es importante tener en cuenta que la secuenciación Sanger

continúa siendo el gold standard para la secuenciación, y que, dado que son muy

pocos los paneles de genes de NGS que tienen aprobación para diagnóstico por la

FDA o “marcado CE” (de Conformidad Europea), éstos deben de ser validados frente

a Sanger antes de su uso; o bien, se debe realizar un cribado con NGS y confirmar los

resultados con Sanger.

El uso del estudio de paneles de genes por NGS en el ámbito clínico presenta algunas

limitaciones y/o complicaciones, tanto desde el punto de vista del asesoramiento

genético pre-test, como a nivel analítico y postanalítico que deben ser considerados:

- El abordaje de genes que tienen pseudogenes, como es el caso de PMS2, debe

seguir realizándose mediante el uso previo de PCR largas.

- Las alteraciones de tipo gran reordenamiento y otras alteraciones estructurales

como inversiones o traslocaciones no son, generalmente, abordables por NGS.

- Las mutaciones patogénicas en regiones reguladoras o en zonas intrónicas

profundas no están cubiertas.

- Las alteraciones epigenéticas constitucionales quedan fuera del alcance de los

paneles de genes.

Discusión

101

- Se genera un incremento en el número de variantes genéticas de significado

clínico desconocido directamente proporcional al número y tamaño de los genes

analizados.

- Detección de hallazgos incidentales: mutaciones patogénicas en genes

responsables de síndromes no sospechados que exceden del interés diagnóstico

motivo del estudio. Esto es especialmente problemático cuando se utilizan amplios

paneles que contienen genes responsables de diferentes tipos de patologías, más

allá del cáncer hereditario, o con el estudio de exomas.

- En el asesoramiento pre-test se debe informar al paciente sobre el alcance del

estudio genético a realizar, sus limitaciones y la posibilidad de encontrar hallazgos

inesperados. Así mismo, se debe informar adecuadamente sobre la alta

probabilidad de detección de variantes de significado clínico desconocido y cómo

se van a gestionar.

Como conclusión de todo lo expuesto en relación a la NGS, y teniendo en cuenta sus

beneficios y limitaciones, se considera que la implementación de estas metodologías

en la práctica clínica supone un gran avance, y contribuye a una mayor eficacia en el

rendimiento diagnóstico, con un ahorro de tiempo y costes económicos, lo que

repercute muy positivamente en el sistema sanitario y en la salud de las personas.

Los avances tecnológicos y la información acumulada en el ámbito del CCR

hereditario están favoreciendo una rápida evolución del conocimiento, que pone de

manifiesto, una vez más, la gran complejidad a nivel molecular de la biología y

genética del cáncer, y el gran reto que supone ofrecer a los pacientes y familias

mejoras en la predicción, la prevención y la personalización de sus tratamientos.

CONCLUSIONES

Conclusiones

105

1. La prevalencia de las epimutaciones constitucionales de MLH1 en casos no

seleccionados de CCR es insignificante. El análisis de las epimutaciones

constitucionales de MLH1 es innecesario en casos de CCR poblacional. Este

análisis sólo debería realizarse en aquellos pacientes que cumplan los criterios

revisados de Bethesda, presenten pérdida de expresión de MLH1 y tengan

hipermetilación de MLH1 en sus tumores.

2. Las mutaciones de POLE y POLD1 explican una pequeña proporción de casos

de CCR y poliposis familiar. La secuenciación de al menos las mutaciones

recurrentes de estos genes debería considerarse en el análisis genético

rutinario de los casos con sospecha de CCR o poliposis hereditarios sin

mutaciones en los genes de sospecha clásicos.

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ANEXOS

Anexos

125

ANEXO I: Algoritmo de estudio genético de SL siguiendo la Estrategia Universal

(pacientes con CCR o CE diagnosticado antes de los 70 años) (81).

Anexos

127

ANEXO II: Algoritmo de estudio genético de SL en pacientes que cumplen

criterios de Bethesda (81).

Anexos

129

ANEXO III: Algoritmo de estudio genético de poliposis adenomatosa familiar

131

ANEXO IV: Mutaciones en los dominios exonucleasa de POLE y POLD1

descritas en pacientes oncológicos previas a la publicación del Artículo 2.

G: germinal; S: somático; ND: No determinado o no disponible; L: low (baja); Neg: negativa; Pos: positiva; Pat: patogénica; Prob pat: probablemente patogénica 1número de familias aparentemente no relacionadas. 2Según la interpretación de los autores. 3Más un caso con pérdida IHQ de MLH1

Gen Mutación Origen Patología N fam1 IMS Predicción

3 Ref.

POLE p.Leu424Val G

CCR,

pólipos 13 Neg Pat (119)

S CE 2 ND ND (151, 155)

POLE p.Arg446Gln G CE 1 Neg VSI (151)

POLE p.Asp275Val S CE 1 ND Pat (151)

POLE p.Pro286His S CCR

CCR

1

2

Neg

Neg

ND

Prob pat

(153)

(154)

POLE p.Pro286Arg S CE

CE

6

8

Neg

Neg

Pat

ND

(151)

(155)

POLE p.Ser297Phe S CE

CE

2

1

Neg

ND

Prob pat

ND

(151)

(151)

POLE p.Phe367Ser S CCR

CCR

1

1

Neg

Pos

ND

Prob pat

(153)

(144)

POLE p.Val411Leu S

CCR

CE

CE

2

2

5

Neg; L

Neg

2: L3

ND

Prob pat

ND

(153)

(151)

(155)

POLE p.Ala428Thr S CE 1 ND ND (151, 155)

POLE p.Pro436Arg S CCR 1 L ND (153)

POLE p.Met444Lys S CE 1 ND ND (151, 155)

POLE p.Gln453Arg S CE 1 ND ND (151, 155)

POLE p.Ala456Pro S CE CE

1 1

Neg ND

Prob pat ND

(151) (155)

POLE p.Ser459Phe S CCR 2 Neg ND (153)

POLE p.Ala465Val S CE 1 ND ND (151)

POLD1 p.Pro327Leu G Adenomas 1 ND Prob pat (119)

POLD1 p.Ser478Asn G

CCR,

pólipos, CE, astrocitoma

2 Neg Pat (119)

POLD1 p.Arg311Cys G CE 1 Pos VSI (151)

POLD1 p.Val392Met S CE 1 ND ND (151)

POLD1 p.Arg423His S CCR 1 Pos ND (154)

POLD1 p.Gln461His S CCR 1 Pos ND (153)

ANEXO V: Cebadores y condiciones empleados para la amplificación de regiones de distintos genes

PCR Cebador Forward (5’-3’) Cebador Reverse (5’-3’) Tamaño

amplicón (pb) Ta

Promotor MLH1 PCR: AGAGGAGGAGCCTGAGAAGC PCR: CGCTGGATAACTTCCCCC

Sec: GTCCAGCCGCCGAATAACCC 500

- 60ºC

.

POLE-ex13 (serie 1) GGTGCCTGTTAGGAACTTGC CCGCACACACAGTAAGGAGA 449 57ºC

POLD1-ex11 (serie 1) GGAGTACAAGCTCCGCTCCT GAAAAAGTGGGCGTCAGGTA 250 57ºC

POLE-ex13 (serie 2) CATCCTGGCTTCTGTTCTCA GTGGCCATCTGGATGTGTG 223 60ºC

POLD1-ex11 (serie 2) GTGTGTCCCTGTCCTTGGAA GTCAGAGGTTGGGGTGAGAG 217 60ºC

POLE_Leu424Val_LOH (SNaPshot)

TTACCTTCCTGTGGGCAGTC Extensión: TTCCTGTGGGCAGTCATAAT

TAGCTCCACGGGATCATAGC -

73 -

54ºC -

KRAS-ex3 (codones 59/61) TGTGTTTCTCCCTTCTCAGGA AAAGAAAGCCCTCCCCAGT 146 60ºC

KRAS-ex4 (codones 117/146) CTCTGAAGATGTACCTATGGTCCT TCAGTGTTACTTACCTGTCTTGTCTT 150 60ºC

NRAS-ex2 (codones 12/13) CAGGTTCTTGCTGGTGTGAA CACTGGGCCTCACCTCTATG 144 60ºC

NRAS-ex3 (codón 117) CCCGTTTTTAGGGAGCAGAT TGGAATCCCGTAACTCTTGG 148 60ºC

NRAS-ex4 (codón 146) TTTGCCAACAAGGACAGTTG CTTGCACAAATGCTGAAAGC 124 60ºC

BRAF-ex15 (V600E)1 TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGA TGGATCCAGACAACTGTTCAAA 165 60ºC

Ta: Temperatura de annealling 1Extraidos de (158)

Anexos

135

ANEXO VI: Árboles genealógicos de las cinco familias con epimutaciones del

artículo 1.

Anexos

136

: caso índice; Met: metilación constitucional MLH1; no met: no metilación constitucional

MLH1; CCR: cáncer colorectal; CE: cáncer de endometrio; ca: cáncer; a: años.

Anexos

137

ANEXO VII: Árboles genealógicos de las nuevas familias descritas en nuestra

serie con las mutaciones POLE_Leu424Val y POLD1_Leu474Pro posteriores a la

publicación del segundo artículo.

Anexos

138

: caso índice; +: portador de la mutación; (+): portador obligado de la mutación; -: no portador de la mutación; CCR: cáncer colorectal; CE: cáncer de endometrio; TSNC: tumor del sistema nervioso central; ca: cáncer; a: años.

Anexos

139

ANEXO VIII: Identificación de las tres mutaciones recurrentes de POLE y POLD1

en las nuevas publicaciones posteriores al segundo artículo de esta tesis.

Mutación Fenotipo tumoral

N

individuos1;

familias

Criterios

clínicos IMS Estudio

POLE

p.Leu424Val

CCR, CE, poliposis, astrocitoma 4; 3 rBG Pos(2),

Neg(1) (186)

CCR, pólipos colónicos,

adenomas duodenales, pólipos

gástricos, neuroendocrino,

ovario

14; 4 ACII Neg (182)

CCR 2; 2 ACI, rBG ND (185)

CCR, pólipos colónicos 2; 1 ACI Neg Anexo XII.c.1;

Anexo VII-B

POLD1

p.Ser478Asn CCR, pólipos colónicos 1; 1 ACI ND (185)

POLD1

p.Leu474Pro

CCR, pólipos colónicos y

gástricos 3; 1 ACI

ND(2),

Pos(1) (181)

CCR 1; 1 rBG Pos No publicado

2

Anexo VII-A.2.

AC: Criterios de A msterdam ( I o II); r BG: criterios revisados de Bethesda; Pos : positivo; Neg: Negativo; 1Número de individuos portadores de la mutación enfermos.

2Familia de nuestra serie de Cáncer

Hereditario de la Comunidad Valenciana.

Anexos

141

ANEXO IX: Nuevas mutaciones germinales identificadas en los dominios

exonucleasa de POLE y POLD1 en pacientes con cáncer, posteriores a la

publicación del segundo artículo de esta tesis.

Gen Mutación Fenotipo tumoral IMS Predicción1 Referencia

POLE p.Pro282Ser Melanoma ND ND (183)

POLE p.Asp287Glu

Melanoma, mama3,

sarcoma de Ew ing3,

NHL3

ND ND (183)

POLE p.Trp347Cys Melanoma,

tumor renal, próstata ND

Prob.

patogénica (183)

POLE p.Gln352Pro

Melanoma,

astrocitoma3,

leucemia3

ND ND E (183)

POLE p.Asn363Lys

CCR, CE, ovario,

páncreas,

glioblastoma

Neg2 Patogénica (193)

POLE p.Asp368Val CCR Neg VSI (185)

POLE p.Lys425Arg CCR

Melanoma

Neg

ND

Prob. Patog

ND

(184)

(183)

POLE p.Pro436Ser

Poliposis atenuada,

CCR, adenomas

duodenales

Neg Patogénica (182)

POLE p.Arg446Gln Melanoma, pulmón3 ND ND (183)

POLE p.Tyr458Phe

CCR, adenomas

colorrectales, ovario,

páncreas, CID

ND Patogénica (187)

POLE p.Val460Met Melanoma, LMA

3,

esófago3, próstata

3

ND ND (183)

POLE p.Ile515Met Melanoma ND ND (183)

POLD1 p.Asp316His

CCR, mama,

angiomiolipoma, mesotelioma

Neg Patogénica (181)

POLD1 p.Asp316Gly CCR, CE, mama Neg Patogénica (181)

POLD1 p.Pro347Ser CCR ND ND (185)

POLD1 p.Arg409Trp CCR Neg Prob.

patogénica (181)

POLD1 p.Gly426Asp CCR ND ND (185)

Cada mutación se ha identif icado en una familia diferente , a excepción de POLE_ p.Lys425Arg.

CID: cáncer de intestino delgado. NHL: Linfoma no Hodking; LMA: leucemia mieloide aguda. ND: no

determinado o No definido. Neg: Negativo. 1Según la interpretación de los autores.

2No se ha analizado en todos los tumores.

3Familiares no

testados para la mutación.

Anexos

143

ANEXO X: Propuesta de características clínicas para la sospecha de PPAP

Propuesta de características clínicas para la sospecha de PPAP

Edad diagnóstico Diagnóstico del cáncer a edad temprana (<50 años).

Espectro tumoral

Pr incipales: CCR, poliposis colónicas, CE (POLD1).

Secundar ios: Pólipos duodenales (POLE), gliomas, melanoma (POLE),

cáncer de mama (POLD1), cáncer del tracto digestivo distinto al CCR, otros.

Agregación familiar Alta (criterios de A msterdam II principalmente, pero no excluir Bethesda).

Herencia dominante.

Estado sistema MM R Generalmente intacto, tumores MSS (no excluir casos IMS).

Anexos

145

ANEXO XI: Trabajo realizado por la doctoranda en esta tesis doctoral

La doctoranda ha participado en los siguientes aspectos de la concepción y diseño,

desarrollo de la metodología, adquisición de datos, análisis e interpretación de

resultados y elaboración y revisión de la comunicación de resultados del presente

trabajo de tesis doctoral:

Artículo 1:

- Realización del análisis de la metilación de MLH1 somática y germinal.

Interpretación de resultados.

- Análisis de la mutación de BRAF_V600E. Interpretación de resultados.

- Recopilación de la información clinicopatológica y la elaboración de la base de

datos.

- Análisis estadístico de los datos.

- Redacción y revisión del manuscrito.

Artículo 2:

- Selección de pacientes y muestras.

- Puesta a punto de la metodología y análisis de las mutaciones germinales en

POLE y POLD1. Interpretación de resultados.

- Análisis de predicción in silico.

- Análisis de las mutaciones somáticas en BRAF, KRAS y NRAS. Interpretación

de resultados.

- Recopilación de la información clinicopatológica y la elaboración de la base de

datos.

- Redacción y revisión del manuscrito.

Anexos

147

ANEXO XII: Otras publicaciones en las que ha participado la doctoranda.

A) Artículos científicos

A.1. Serrated colorectal cancer: molecular classification, prognosis, and

response to chemotherapy.

Óscar Murcia, Miriam Juárez, Eva Hernández-Illán, Cecilia Egoavil, Mar Giner, María

Rodriguez-Soler, Rodrigo Jover.

World J of Gastroenterol. Aceptado 2016.

Factor de Impacto: 2,369 (2014) (Q2).

ABSTRACT:

Molecular advances support the existence of an alternative pathway of colorectal

carcinogenesis that is based on the hypermethylation of specific DNA regions that

silences tumor suppressor genes. This alternative pathway has been called the

serrated pathway due to the serrated appearance of tumors in histological analysis.

New classifications for colorectal cancer (CRC) were proposed recently based on

genetic profiles that show four types of molecular alterations: BRAF gene mutations,

KRAS gene mutations, microsatellite instability, and hypermethylation of CpG islands.

This review summarizes what is known about the serrated pathway of CRC, including

CRC molecular and clinical features, prognosis, and response to chemotherapy.

A.2. Prevalence of germline MUTYH mutations among Lynch-like syndrome

patients.

Castillejo A, Vargas G, Castillejo MI, Navarro M, Barberá VM, González S, Hernández-

Illán E, Brunet J, Ramón y Cajal T, Balmaña J, Oltra S,Iglesias S, Velasco A, Solanes

A, Campos O, Sánchez Heras AB, Gallego J, Carrasco E, González Juan D, Segura

A, Chirivella I, Juan MJ,Tena I, Lázaro C, Blanco I, Pineda M, Capellá G, Soto JL.

Eur J Cancer. 2014 Sep;50(13):2241-50. doi: 10.1016/j.ejca.2014.05.022. Epub 2014

Jun 18.

Anexos

148

Factor de Impacto: 5,417 (Q1).

ABSTRACT:

Background and aims

Individuals with tumours showing mismatch repair (MMR) deficiency not linked to

germline mutations or somatic methylation of MMR genes have been recently referred

as having 'Lynch-like syndrome' (LLS). The genetic basis of these LLS cases is

unknown. MUTYH-associated polyposis patients show some phenotypic similarities to

Lynch syndrome patients. The aim of this study was to investigate the prevalence of

germline MUTYH mutations in a large series of LLS patients.

Methods

Two hundred and twenty-five probands fulfilling LLS criteria were included in this study.

Screening of MUTYH recurrent mutations, whole coding sequencing and a large

rearrangement analysis were undertaken. Age, sex, clinical, pathological and molecular

characteristics of tumours including KRAS mutations were assessed.

Results

We found a prevalence of 3.1% of MAP syndrome in the whole series of LLS (7/225)

and 3.9% when only cases fulfilling clinical criteria were considered (7/178). Patients

with MUTYH biallelic mutations had more adenomas than monoallelic (P=0.02) and

wildtype patients (P<0.0001). Six out of nine analysed tumours from six biallelic

MUTYH carriers harboured KRAS-p.G12C mutation. This mutation was found to be

associated with biallelic MUTYH germline mutation when compared with reported

series of unselected colorectal cancer cohorts (P<0.0001).

Conclusions

A proportion of unexplained LLS cases is caused by biallelic MUTYH mutations. The

obtained results further justify the inclusion of MUTYH in the diagnostic strategy for

Lynch syndrome-suspected patients.

A.3. TGFBR1 intralocus epistatic interaction as a risk factor for colorectal

cancer.

Martinez-Canto A, Castillejo A, Mata-Balaguer T, Castillejo MI, Hernandez-Illan E, Irles

E, Barbera VM, Egoavil C, Guarinos C, Alenda C, Ochoa E, Lazaro R,Fajardo

S, Lacueva J, Calpena R, Soto JL.

Anexos

149

PLoS One . 2012;7(1):e30812. doi: 10.1371/journal.pone.0030812. Epub 2012 Jan 23.

Factor de Impacto: 3,73 (Q1).

ABSTRACT:

In colorectal cancer (CRC), an inherited susceptibility risk affects about 35% of

patients, whereas high-penetrance germline mutations account for <6% of cases. A

considerable proportion of sporadic tumors could be explained by the coinheritance of

multiple low-penetrance variants, some of which are common. We assessed the

susceptibility to CRC conferred by genetic variants at the TGFBR1 locus. We analyzed

14 polymorphisms and the allele-specific expression (ASE) of TGFBR1 in 1025

individuals from the Spanish population. A case-control study was undertaken with 504

controls and 521 patients with sporadic CRC. Fourteen polymorphisms located at the

TGFBR1 locus were genotyped with the iPLEX Gold (MassARRAY-Sequenom)

technology. Descriptive analyses of the polymorphisms and haplotypes and association

studies were performed with the SNPator workpackage. No relevant associations were

detected between individual polymorphisms or haplotypes and the risk of CRC. The

TGFBR1*9A/6A polymorphism was used for the ASE analysis. Heterozygous

individuals were analyzed for ASE by fragment analysis using cDNA from normal

tissue. The relative level of allelic expression was extrapolated from a standard curve.

The cutoff value was calculated with Youden's index. ASE was found in 25.4% of

patients and 16.4% of controls. Considering both bimodal and continuous types of

distribution, no significant differences between the ASE values of patients and controls

were identified. Interestingly, a combined analysis of the polymorphisms and ASE for

the association with CRC occurrence revealed that ASE-positive individuals carrying

one of the most common haplotypes (H2: 20.7%) showed remarkable susceptibility to

CRC (RR: 5.25; 95% CI: 2.547-5.250; p<0.001) with a synergy factor of 3.7. In our

study, 54.1% of sporadic CRC cases were attributable to the coinheritance of the H2

haplotype and TGFBR1 ASE. These results support the hypothesis that the allelic

architecture of cancer genes, rather than individual polymorphisms, more accurately

defines the CRC risk.

Anexos

150

B) Capítulos de libro

B.1. Serrated Polyposis Syndrome.

Miriam Juárez, Eva Hernández-Illán, Oscar Murcia, María Rodriguez-Soler, Rodrigo

Jover.

LIBRO: Intestinal Polyposis Syndromes. Editorial Springer . 2016 En prensa

ABSTRACT:

Serrated polyposis syndrome (SPS), formerly known as Hyperplastic polyposis

syndrome, is an uncommon disease characterized by the presence of multiple serrated

polyps throughout the colorectum. Until now, its genetics, molecular and clinical

characteristics continue to be unknown. This syndrome could be considered as the

paradigm of the serrated pathway of carcinogenesis. Diagnosis is made by the

fulfilment of any of the WHO criteria, recently re-defined: 1) At least 5 serrated polyps

proximal to the sigmoid colon, with 2 or more of these being larger than 10mm; 2) Any

number of serrated polyps proximal to the sigmoid colon in an individual who has a first

degree relative with SPS and 3) More than 20 serrated polyps of any size, distributed

throughout the colon.

In this chapter we will review the clinical and epidemiological characteristics of the

syndrome, the main hallmarks of the serrated pathway of carcinogenesis and the risk

of cancer and recommendations for surveillance for patients and their relatives.

C) Comunicaciones a congresos relacionadas con la tesis doctoral

C.1. Prevalencia de mutaciones POLE/POLD1 en Cáncer Colorectal Familiar

tipo X

Castillejo A, Hernández-Illán E, Castillejo MI, Pena L, Urioste M, Soto JL en nombre

del Programa de Cáncer Hereditario de la Comunidad Valenciana.

XXVIII Congreso Nacional de Genética Humana – AEGH. Palma de Mallorca, 13-15

Mayo 2015.

Comunicación oral. C0029.

Anexos

151

ABSTRACT:

El Cancer Colorectal Familiar tipo X (fCRC-X) es un subtipo de cáncer colorrectal

hereditario no polipósico que no presenta deficiencia en el mecanismo de reparación

de DNA de tipo mismatch. Las bases genéticas del fCRC-X son desconocidas.

Recientemente se han descrito mutaciones en línea germinal en el dominio de

corrección de pruebas las subunidades de la DNA polimerasa ε (POLE) y δ (POLD1)

en familias con múltiples adenomas y cánceres colorrectales.

El objetivo del presente trabajo fue determinar la prevalencia de las mutaciones de

POLE y POLD1 en fCRC-X.

Se incluyeron 72 probandos de familias que cumplían criterios de Amsterdam II con

expresión normal de las proteínas reparadoras MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 y

ausencia de inestabilidad de microsatélites. Los pacientes fueron atendidos en las

Unidades de Consejo Genético en Cáncer de la Comunidad Valenciana (2005-2014).

Se analizaron mediante secuenciación Sanger los exones 13 de POLE y 11 de

POLD1, donde se localizan los puntos calientes de mutación descritos.

Se detectaron dos casos con una nueva mutación en POLD1: c.1421T>C;

p.(Leu474Pro) y un caso con mutación en POLE: c.1270C>G; p.(Leu424Val). La

prevalencia en nuestra serie es de un 4.2% (3/72). La mutación de POLD1

p.(Leu474Pro) ha sido recientemente descrita como patogénica en una de nuestras

familias (Valle et al, 2014). La descripción de la misma mutación en otra familia

aparentemente no relacionada indica el posible carácter fundador de dicha mutación.

Se han diagnosticado siete individuos portadores de mutación entre ambas familias

POLD1 con cinco CCR y dos cánceres de endometrio diagnosticados entre los 23 y 56

años. La familia con mutación en POLE presenta seis casos diagnosticados de CCR

con edades comprendidas entre los 11 y 46 años.

Nuestros resultados avalan la inclusión del estudio genético de POLE y POLD1 en

familias con Cáncer Colorectal Familiar tipo X.

Anexos

152

C.2. A new POLD1 germline mutation as cause of Familial Colorectal Cancer

Type X

Hernández-Illán E, Castillejo A, Castillejo MI, Segura A, Juan MJ, Jover R, Soto JL.

European Conference of Human Genetics – ESHG. Milán, May 31- June 3, 2014.

European Journal of Human Genetics. Vol 22. Suppl. 1. Mayo 2014. P12.116-M

ABSTRACT:

The genetic basis for Familial Colorectal Cancer Type-X (fCRC-X) is unknown.

Mutations at the proof-reading domains of DNA polymerase ε (POLE) and δ (POLD1)

have been recently identified in families with multiple colorectal adenomas and CRC.

We aimed to assess the prevalence of POLE and POLD1 mutations in fCRC-X.

A total of 63 index cases fulfilling Amsterdam II criteria with normal expression of

mismatch repair proteins and microsatellite stable tumors were included. Sanger

sequencing of POLE-exon13 and POLD1-exon11 was performed.

None of the cases carried mutations in POLE. We found one case with a new POLD1

variant in heterozygosis: c.1421T>C (p.Leu474Pro). The patient was a woman who

underwent a synchronous CRC and large bowel gastrointestinal stromal tumor at age

36. Her maternal aunt had metachronous CRC (dx33y) and endometrial cancer (dx56y)

and was a carrier of this variant. Therefore, the index case’s mother, who underwent

endometrial cancer (dx52y), was an obligate variant carrier. It has been described that

the homologous residue of POLD1 p.Leu479Pro mutation in S. cerevisiae causes a

mutator phenotype. Furthermore, this is the paralogous residue of the hot spot at POLE

(p.Leu424). In silico prediction analysis strongly suggests a pathogenic nature for this

variant. Integration of all these evidences drove us to classify this new variant as

probably damaging.

POLD1 mutations might explain about 1.6% of fCRC-X. POLD1 testing should be

included in the diagnostic strategy for unexplained familial CRC.