PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHEIN Pichia pastoris: i processi

Pichia pastoris: sviluppo processiaspetti generali

IN BIOREATTORE E’ MEGLIO!

Con P. pastoris spesso in fermentatore si ottengono livelli e rese di produzione superiori che in beuta. Si posso evidenziare almeno tre motivi:

-In bioreattore vi è un controllo preciso delle condizioni chimico-fisiche del processo ed è perciò possibile ottenere elevate biomasse (> 100 g/l in peso secco, > 500 OD600).Specialmente per le proteine secrete, la concentrazione di prodotto è, a grandi linee, proporzionale alla concentrazione delle cellule nella coltura.

-L’efficienza del promotore AOX1 è molto più elevata (3-5 volte) in bioreattore, dove il metanolo viene alimentato a concentrazioni limitanti la crescita, rispetto a colture in eccesso di metanolo (in beuta).Quindi anche per proteine ricombinanti prodotte intracellularmente, la resa del prodotto, come percentuale delle proteine totali, incrementa sensibilmente.

-Il metabolismo del metanolo richiede alti livelli di ossigenazione e spesso la produzione delle proteine di interesse è negativamente influenzata dalla limitazione di ossigeno.Solo nell’ambiente controllato del bioreattore si può misurare e controllare questo parametro

Pichia pastoris: sviluppo processiIl medium di coltivazione

Terreno minerale a composizione definita. Semplice ed economico

FONTE DI CARBONIOper la crescita nella fase di accumulo della biomassa: glicerolo (non fermentabile) meglio del glucosio. Entrambi reprimono l’espressione di AOX1. In glucosio si può formare etanoloPer la fase di induzione: metanolo a velocità di alimentazione e/o a concentrazione nel medium controllateFONTE DI AZOTOIdrossido di ammonio (NH4OH), aggiunto anche per controllare il pH

Pichia pastoris: sviluppo processistrategie di coltivazione in bioreattore

Tipicamente si utilizza un processo in fed-batch suddiviso in tre fasi distinte:- Una prima fase batch di accumulo della biomassa su una fonte di carbonio non fermentabile ma in grado di reprimere il promotore AOX1, come il glicerolo.

- Una seconda fase di transizione in fed-batch, in cui il glicerolo viene alimentato a velocità limitante la crescita. Si ottiene un ulteriore incremento della biomassa associato ad una derepressione del sistema di espressione. Le cellule vengono preparate per l’induzione.

-La terza fase, quella di induzione, inizia con una lenta alimentazione di metanolo per acclimatare la coltura e quindi la velocita di ”feeding” viene incrementata e regolata periodicamente sino al raggiungimento della velocità di crescita desiderata.

Spesso vengono utilizzati sensori per il metanolo, per avere un misura ed un controllo della concentrazione dell’alcool nel medium di crescita. In questo caso si può regolare la velocità di alimentazione in modo tale da mantenere ed, eventualmente, modificare la concentrazione di metanolo nel mezzo (tipicamente 1% o inferiore).

E’ stato anche studiato un regime di fed-batch misto glicerolo/metanolo in rapporti definiti.Lo scopo era quello di incrementare la vitalità della coltura, ridurre la fase di induzione e di innalzare la velocità di produzione della proteina di interesse. E’ stato utilizzato un sensore per mantenere la concentrazione di metanolo intorno allo 0.5% ed il flusso di glicerolo è stato variato durante la coltivazione. Anche un basso flusso di glicerolo reprime l’espressione della proteina eterologa studiata.

Pichia pastoris: sviluppo processiinstabilità della proteina eterologa

Alcune proteine eterologhe secrete risultano instabili nel medium e vengono rapidamente degradate. Le proteasi vacuolari di P. pastoris sembrano essere uno dei principali responsabili del fenomeno, in particolre nelle colture in bioreattore, a causa della combinazione di un’elevata densità della biomassa e della lisi una certa percentuale delle cellule.Diverse strategie vengono utilizzate per ovviare a questo problema.- Si può lavorare con ceppi difettivi in una o più di queste proteasi. I risultati non sono sempre soddisfacenti.-Si possono utilizzare dei medium di coltivazione con pH che sfavoriscono l’attività proteolitica (in genere superiori a 5.0).P. pastoris è in grado di crescere su uno spettro piuttosto ampio di pH (3.0-7.0).Diverse proteine ricombinanti risultano stabili a pH totalmente diversi. Un pH=6.0 risulta ottimale per la produzione di mEGF e hSA mentre un pH=3.0 è richiesto per produrre IGF-1.-Si possono aggiungere al medium idrolisati proteici (peptone o casamminoacidi) che possono fungere da substrato competitore per le proteasi. Queste sostanze però, arricchendo il terreno sintetico, possono interferire con il controllo in fed-batch del processo.- l’abbassamento della temperatura di coltivazione può portare ad un incremento della resa di produzione favorendo il corretto “folding” della proteina ricombinante ed una maggiore vitalità della coltura, riducendo la lisi cellulare ed il rilascio di proteasi. Due esempi:la proteina anticongelante di aringa (da 30°C a 23°C)la laccasi di Trametes versicolor (da 30°C a 20°C), in abbinamento con una riduzione della concentrazione di metanolo nel medium (da 1.0% a 0.5%).

Production of recombinant protein in Pichia pastoris by fermentation

Agitation and DO traces during glycerol to methanol conversion.

The glycerol in the medium is depleted after about 23 h. This is apparent by a rapid increase in DO level (spike) (a). At this point, a limited glycerol feed starts with stepwise lowering (at points b–f). Each successive lowering in glycerol flow rate will temporarily lower the agitation. After about 26 h, the glycerol flow rate is so low that the culture does not need oxygen supplementation, and the agitation, which is controlled by the DO probe, drops to 500 r.p.m. (e). As oxygen is consumed and the DO levels decrease, agitation is rapidly reinitiated (e). When the culture transfers to methanol, more oxygen is required (g), agitation increases until the maximum speed is reached (h) and oxygen supplementation starts (i).

Biomass (black), MeOH flow rate (red) and product formation (blue), during fermentation with 72 h EFT.

High level expression of a promising anti-idiotypic antibody fragment vaccine against HIV-1in Pichia pastoris.Journal of Biotechnology 128 (2007) 735–746Johannes S. Gacha, Michael Maurer a, Rainer Hahna, Brigitte Gasser a, Diethard Mattanovich a, Hermann Katinger a,b,1, Renate Kunert a,∗

Pichia pastoris, promotore AOX1: produzione di laccasieffetto temperatura, feed metanolo e pH (proteasi)

Pichia pastorisutilizzo del promotore GAP

L’utilizzo di metanolo in fermentazioni su larga scala richiede l’utilizzo di speciali strutture e procedure che permettano di maneggiare in sicurezza tale sostanza.Tali misure devono essere approvate dagli enti regolatori preposti.

Per evitare queste problematiche è stato sviluppato un processo di produzione di CHITINASI umana, utilizzando il promotore forte e costitutivo GAP.E’ stato messo a punto un processo in CONTINUO (scala 15 litri) che produce ad alta resa la proteina ricombinante (250 mg/l), evitando l’utilizzo della coltivazione tradizionale in fed-batch con metanolo.

Sempre utilizzando il promotore GAP, è stato inoltre sviluppato, su scala laboratorio, un processo di coltivazione in fed-batch ed in condizioni ipossiche per la produzione di proteine ricombinati. Tale strategia di coltivazione sembrerebbe incrementare la produttività specifica del ceppo, rispetto a quella ottenibile mediante un fed-batch convenzionale in regime completamente aerobico

Pichia pastorisutilizzo del promotore GAP in coltura continua

Comparison of 1.5-L continuous culture of P. pastoris (1.2 volume exchanges per day, sparged with molecular oxygen) with a cultivation at 15-L scale (1.0 volume exchange per day, sparged with conventional air).

Pichia pastorisutilizzo del promotore GAP in condizioni ipossiche

Esperimento preliminare: colture continua

Pichia pastorisutilizzo del promotore GAP in fed-batch ipossico

Le condizioni ipossiche vengono mantenute modulando: la velocità di agitazione del mezzo, il flusso d’aria in entrata e la velocità di alimentazione della fonte di carbonio (glucosio).Lo scopo è quello di mantenere un regime parzialmente fermentativo con un livello costante e non elevato di etanolo nel medium di crescita (circa 10% vv-1)

ATTENZIONE NON SIAMO IN ANAEROBIOSI!!!L’ossigeno, presente nell’aria in entrata, viene consumato ad una velocità tale da non essere rilevabile (0% di ossigeno disciolto, letto dall’apposito sensore)

Pichia pastoris: utilizzo del promotore GAPconfronto tra fed-batch standard (aerobico) ed ipossico

Pichia pastoris: utilizzo del promotore GAPproduzione di 3 proteine ricombinanti con fed-batch ipossico

CONCLUSIONI GENERALIRispetto al processo aerobico quello ipossico presenta alcuni vantaggi:- durata del processo sensibilmente inferiore: circa 30 ore contro circa 90- velocità di crescita simile tra le due strategie di coltivazione (nelle prime 30 ore)- qp (velocità specifica di produzione: mg proteina g-1 h-1) 4-5 volte superiore- Qp (produttività volumetrica: mg proteine L-1 h-1) circa 2 volte superiore- il metabolismo parzialmente fermentativo porta ad un accumulo di biomassa inferiore a quella ottenuta nel fed-batch standard (circa 70%).Questo potrebbe facilitare le operazioni di rimozione della biomassa in un processo industriale.- Le ridotte richieste di ossigenazione del mezzo (in termini di agitazione e flusso d’aria) sarebbero un vantaggio tecnologico in un processo industriale dove, usualmente, l’areazione del mezzo è un limite nelle coltivazioni su larga scala

Variety of metabolic and environmental stresses may have a strong impact on recombinant protein production. Both types of stress factors occurring during industrial production processes in yeasts.Among environmental factors that affect protein folding and secretion, especially temperature, low pH, high osmolarity and oxidative stress may play an important role.

There is evidence of a major bottleneck for heterologous protein secretion in protein folding and the cellular secretion machinery.While many studies have been performed on optimizing fermentation conditions for maximum specific productivity in yeasts, data correlating increased product yields to improved protein folding and secretion mechanisms are still missing.

Decreased growth temperature can lead to improved protein production in batch, fed-batch and chemostat culture systems. Concerning the positive effect of reduced growth temperature on specific productivity of heterologous proteins, the common opinion is that at least during cultivation on methanol a reduction of cell lysis and proteolytic activity is responsible for higher product yields at lower cultivation temperature.

During the development of P. pastoris strains secreting either the human serine protease trypsinogen [4], Rhizopus oryzae lipase, or the Fab fragments of the human monoclonal anti-HIV1 antibody 2F5 and its antiideoptype 3H6, limitations in folding and/or secretion became obvious. Using immunofluorescent staining and flow cytometry techniques we could detect intracellularly retained product, which was found to be located within the membrane fraction of cell lysates (containing compartments of the secretory pathway such as the ER and the Golgi), and a concomitant increase in the levels of intracellular BiP (binding protein), which is described as a signal molecule for unfolded protein response (UPR).

Stress e produzione di proteine eterologhe:cosa viene riportato nella letteratura scientifica

Comparison of the UPR response in P. pastoris and S. cerevisiae. A: genes induced in both yeasts; B: upregulated in P. pastoris,down-regulated in S. cerevisiae; C: down-regulated to unchanged in P. pastoris, upregulated in S. cerevisiae; D: reduced in both yeasts.

UPR in P. pastoris vs S. cerevisiae: transcriptomic analysis

Comparison of marker genes expression of 2F5 producing P. pastoris during steady state conditions.

Fab 2F5 production, chemostat cultures at different temperatures: physiological properties

Fab 2F5 production, chemostat cultures at different temperatures: transcriptomic analysis

Fab 3H6 production, chemostat cultures at different temperatures:physiological properties

Two representative gels from the production strain (A) and the control strain (B) experiments. Spots that are highlighted in white circles with corresponding master numbers were identifiedvia mass spectrometry. pI, isoelectric point; MW, molecular weight [kDa].

Fab 3H6 production, proteomic analysis: 2D-DIGE and Protein Identification

Central carbon fluxes of P. pastoris in aerobic chemostat cultures grown on glucose as sole carbon source at a dilution rateof D ) 0.1 h-1. The fluxes are given as percentage of the total glucose utilization for the antibody fragment producing strain (3H6) andthe control strain (C) at the three growth temperatures.

Main cellular changes in protein levels upon a temperature shift from 30 to 20 °C in chemostat cultures, as they were identified in the 3H6 Fab producing strain (first arrow next to protein short name) and the control strain (second arrow next to protein short name). Green downward arrows indicate reduced protein levels at 20 °C, red upward arrows indicate higher abundance at 20 °C, black blocks indicate no significant change in protein levels at different temperature setpoints and open blocks indicate missing data.

Chung et al. Microbial Cell Factories 2010, 9:50

Reconstruction of Pichia pastoris. A recently published genome of P. pastoris [35] and various online databases, including KEGG [71], Meta-Cyc [70], PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, BRENDA [68] and ExPASy ENZYME database [69], were used to reconstruct and manuallycurate the iPP668 metabolic model.