Production et extraction des molécules bioactives à partir ...

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique

Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi

Faculté Des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences de la Nature et de la Vie

N ° d’ordre…… N ° de série…...

Mémoire

Présenté pour l’obtention du diplôme de

MASTER

Filière : Biologie

OPTION : Microbiologie Appliquée

Thème

Présenté par:

M elle

SAOUDI Safa & M elle

LAIB Souheyr

Devant le jury

Présidente Mme CHETTIBI F. M.C.B. Université OEB Rapporteur Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB

Examinatrice Mr MEDJOUDJ H. M.A.B. Université OEB

Année universitaire: 2017-2018

Production et extraction des molécules bioactives à partir d’une

souche d’actinobactérie (Streptomyces SRO1)

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de La Recherche Scientifique

Université Larbi Ben M'hidi Oum El Bouaghi

Faculté Des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences de la Nature et de la Vie

N ° d’ordre…… N ° de série…...

Mémoire

Présenté pour l’obtention du diplôme de

MASTER

Filière : Biologie

OPTION : Microbiologie Appliquée

Thème

Présenté par:

&

Devant le jury

Présidente Mme CHETTIBI F. M.C.B. Université OEB Rapporteur Mme AOUAR L. M.C.A. Université OEB

Examinatrice Mr MEDJOUDJ H. M.A.B. Université OEB

Année universitaire: 2017-2018



Remerciements

En première lieu, je remercie tout puissant de m’avoir donné la sante, le

courage et la volante pour mener a bien ce modeste mémoire et pour le

terminer dans les Meilleurs conditions.

Mes remerciements chaleureux vont directement vers mon encadreur

Mr. AOUAR Lamia pour ses précieux conseils, ces orientations et

ses encouragements.

Mes plus vifs remerciements vont aussi aux nombres du jury pour

L’intérêt qu’ils ont Porté à mon travail.

Enfin, nous veux remercier tous ceux qui m’ont aidé de près ou de loin

dans l’élaboration et finalisation de ce travail.

Dédicaces

Je dédie ce modeste travail aux êtres qui me sont les plus chers,

À mon père « Boukhmis » et ma mère « Leila », pour tout l’amour

et le soutien qu’ils m’ont donne.

Aucune dédicace ne saurait exprimer ma reconnaissance, mon

respect, mon amour et ma considération pour les sacrifices que

vous avez consentis. Mon instruction et mon bien être. Puisse dieu

le tout puissant vous accorde sante et longue vie.

A ma très chère sœur «Marwa» et mon adorable petit

frère «Acheraf Zin Elaabidine» que j’aime tant. Je vous souhaite

une pleine de bonheur et de réussite que Dieu vous partage et vous

garde.

Aux grandes familles « SAOUDI & BOUROUBI » je dédie tout

mon amour.

A ma très chère amie «Souheyr» pour sa précieuse collaboration

et son soutien Permanent tout au long de l’élaboration de ce

mémoire.

Safa

Dédicaces

Avec jolie et plaisir, fierté et respect, je dédie ce mémoire

à la source de tendresse à la grande partie de ma vie, celle qui

m’a tout appris dans ce monde, qui m’a construit et qui ma

donner le courage d’étudier.

À ma très chère mère que j’aime,

A mon très chère père qui m’a apporté soutien, affection, qui

exauce mes désirs et qui à fait de moi, ce je suis maintenant.

À mes Frères «Youcef» et « Adam»,

À mon fiancé «Walid»,

À mes grandes- pères et mes grandes -mères,

À mes cousins et mes cousines,

À tous mes amies en particulier à « Nader» et « Safa»,

À tous ceux qui m’ont apporté leur aide et leurs conseils, à tous

ceux que j’aime.

Souheyr

Sommaire

Table des Matières

Liste des abréviations I

Liste des figures II

Liste des photographies III

Liste des tableaux IV

Introduction ................................................................................................................ 01

Revue bibliographique

1 Les actinobacteries .............................................................................................. 2

1.1 Généralités .......................................................................................................... 2

1.2 Classification des actinobacteries ....................................................................... 2

1.2.1 Classe "Actinobacteria" ................................................................................... 3

1.3 Importance des actinobacteries ........................................................................... 3

2 Genre Streptomyces ............................................................................................ 4

2.1 Cycle de développement ..................................................................................... 4

2.1.1 Germination ..................................................................................................... 5

2.1.2 Croissance végétative ...................................................................................... 5

2.1.3 Croissance aérienne ......................................................................................... 6

2.1.4 La sporulation .................................................................................................. 6

2.2 Génétique ............................................................................................................ 7

2.3 Ecologie .............................................................................................................. 7

2.4 Bioactivité ........................................................................................................... 8

3 Production des antibiotiques par les Streptomyces ............................................. 9

3.1 Généralités .......................................................................................................... 9

3.2 Classification des antibiotiques......................................................................... 10

3.3 Antibiotiques produits par les Streptomyces ..................................................... 11

4 Résistance aux antibiotiques ............................................................................. 12

4.1 Types de résistance ........................................................................................... 12

4.1.1 Résistance naturelle ....................................................................................... 12

4.1.2 Résistance acquise ......................................................................................... 13

4.2 Mécanismes biochimiques de résistance bactérienne aux agents antibactériens

13

4.3 Destruction ou l’inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes ..........

.......................................................................................................................... 13

Matériel et méthode

1. Matériel biologique .................................................................................................. 15

1.1 Souches des actinobactéries .............................................................................. 15

1.2 Souches test ....................................................................................................... 15

1.3 Champignons phytopathogènes ........................................................................ 15

2 Milieux de culture ............................................................................................. 16

3 Solvants d’extraction ........................................................................................ 16

1 Repiquage des souches ..................................................................................... 16

2 Activité antibactérienne .................................................................................... 16

2.1 Préparation des inocula des bactéries-test......................................................... 16

2.2 Mise en évidence des activités antibactériennes ............................................... 16

2.2.1 Technique des cylindres d’Agar .................................................................... 16

2.2.2 Inoculum fongique ........................................................................................ 17

2.2.3 Mise en évidence des activités antifongiques ............................................... 17

3 Production et préparation d’extraits riches en métabolites secondaires ........... 17

3.1 Fermentation liquide ......................................................................................... 17

3.2 Fermentation solide ........................................................................................... 17

4 Technique des disques de diffusion .................................................................. 18

Résultats et discutions

I. Résultats

1 Détermination de l’activité antimicrobienne .................................................... 19

2 Détermination de l’activité antifongique .......................................................... 19

3 Technique des cylindres d’agar ........................................................................ 20

3.1 Activité antibactérienne .................................................................................... 20

3.2 Activité antifongique ........................................................................................ 22

4 Activité antibactérienne par la méthode des disques de diffusions .................. 23

4.1 Activité antibactérienne des extrais obtenus sur ISP2 par fermentation liquide

et solide ........................................................................................................................ 23

4.2 L’activité antibactérienne des extrais obtenue d’AF par la fermentation liquide

et solide ........................................................................................................................ 26

5 L’activité antifongique par la méthode des disques de diffusion ..................... 29

5.1 L’activité antifongique des molécules obtenue à partir de milieu ISP2. .......... 30

5.2 L’activité antifongique des extraits obtenus par fermentation solide et liquide

sur milieu AF ............................................................................................................... 31

II. Discussion

Conclusion et perspectives ................................................................................................ 35

Références bibliographiques ........................................................................................... 37

Annexe

Résumé

Liste des abréviations

ADN : acide désoxyribonucléique.

ARN : acide ribonucléique.

BN : bouillon nutritif.

C : cytosine.

CaCO3 : carbonate de calcium.

G : guanine.

GN : gélose nutritive.

ISP : International Streptomyces Project.

rpm: rotations par minute.

Liste des figures

Figure 01 : cycle de développement des Streptomyces sur milieu solide (Hopwood et

al., 1985) ................................................................................................................................. 05

Liste des photographies

Photographies 01 : Les bactéries test sur différents milieux A) K. oxytoca ; B) E. coli ;

C) Enterobacter sp. ; D) P. aeruginosa ; E) S. aureus ; F) B. subtilis. .......................... 19

Photographies 02 : Les champignons test A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) B. cinerea ;

D) Trichoderma sp.; E) Fusarium oxysporum ; F) Penicillium sp. ................................ 20

Photographies 03 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches

test A) S. aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F)

P. aeruginosa par la technique des cylindre d’agar. ........................................................ 22

Photographies 04 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les

champignons phytopathogènes A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) Trichoderma sp. ;

D) F. oxysporum. ......................................................................................................... 22

Photographies 05 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches

test A) S. aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F)

P. aeruginosa, par la technique des disques de diffusion. ........................................... 29

Photographies 06 : L’activité antifongique contre les champignons phytopathogènes

A) Ascochyta rabiei ; B) Botrytis cinerea, par la technique des disques de diffusion

...................................................................................................................................... 33

Photographies 07 : L’activité antifongique de la souche SRO1 contre les

champignons phytopathogènes par la technique des disques de diffusions A)

Fusarium sp. ; B) Trichoderma sp. ; C) Alternaria alternata. .................................... 33

Liste des tableaux

Tableau 01 : Nombre approximatif de métabolites secondaires produits par différents

groupes d’organismes (Kieser et al., 2001)............................................................... 10

Tableau 02 : Antibiotiques de Streptomyces utilise (Kieser et al., 2000 ; Madigan et

Martinko, 2007) ............................................................................................................. 11-12

Tableau 03 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries test par la technique des

cylindres d’agar sur les deux milieux ISP2 et AF........................................................ 21

Tableau 04 : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des

disques de diffusions sur milieu ISP2 .......................................................................... 24-25

Tableau 05 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des

disques de diffusion sur milieu AF ........................................................................ 27-28

Tableau 06 : Résultats de l’activité contre les champignons par la technique des

disques de diffusion sur milieu ISP2. .......................................................................... 30

Tableau 07 : Résultats de l’activité contre les champignons test par la technique des

disques de diffusion sur milieu AF. ............................................................................. 32

Introduction

Introduction

1

Les antibiotiques sont des substances, naturelles ou synthétiques, détruisant les

microorganismes en ayant une action lytique ou en empêchant la prolifération du

microorganisme. Les antibiotiques antibactériens et antifongiques commercialisés sont

largement utilisés en médecine humaine ou vétérinaire et comme produits

phytopharmaceutiques (Smaoui, 2010).

La découverte de métabolites bioactifs d’origine microbienne a progressée de manière

exponentielle grâce aux progrès technologiques, malheureusement, parmi les molécules

découvertes, nombreuses sont des analogues des molécules déjà connues, des composés

n’ayant pas d’activités antibiotique encore des composés mineurs (Boughachiche, 2012).

L’émergence de la résistance des microorganismes pathogènes aux antibiotiques,

couramment utilisés en médecine, pose actuellement un sérieux problème. Pour combattre

cette situation alarmante, de nouveaux antibiotiques sont nécessaires. Ces derniers peuvent

être obtenus par voie naturelle à partir de nouvelles souches microbiennes notamment les

actinobactéries. Aussi, la lutte chimique contre les microorganismes phytopathogènes donne

de bons résultats à court terme mais à long terme, elle représente un danger pour

l’environnement. Ce problème agricole, économique et environnemental nécessite le

développement de produits de lutte biologique à base de microorganismes ou de leurs

métabolites (Joly, 2003 ; Sghairi, 2012).

Les actinobactéries sont bien connus pour leurs capacités métaboliques, en particulier

Streptomycessp. qui produisent des milliers d'antibiotiques (Berdy, 2005). Ce sont des

bactéries à Gram-positif, la plupart sont des saprophytes (Khamna et al, 2009) et sont

abondantes dans la rhizosphère (Sardi et al, 1992). Cet environnement a été jugé une source

riche pour l'isolement des agents producteurs de nouvelles molécules bioactives :

antibiotiques, agents de biocontrôle et des promoteurs de croissance des plantes(Jiménez-

Esquilin et Roane, 2005).

La présente étude, porte sur l’exploration d’une souche d’actinobactérie SO1

appartenant au genre Streptomyces à produire des molécules bioactifs.

Nous nous somme fixé comme objectifs:

La production de molécules bioactives sur deux milieux liquide et solides ISP2 et AF;

L’extraction des molécules par différents solvants organiques ;

La mise en évidence des activités antibactérienne et antifongique des extraits organiques

obtenus.


2

1 Les actinobactéries

1.1 Généralités

Les actinobactéries sont des bactéries à coloration de Gram positive, filamenteuses, ramifiées,

leur ADN contiennent un taux plus élevé de guanine – cytosine GC (plus de 55 pour 100).

Ces bactéries forment un vaste groupe de procaryotes appartenant à l’ordre des

Actinomycétales. Généralement ce sont des hétérotrophes, mais la majorité des espèces sont

capables aussi de croissance chimio-auto trophique. Des vitamines et des acides aminés sont

nécessaires à leur nutrition. Elles peuvent dégrader la cellulose, les protéines, et d’autres

matières organiques comme la paraffine et les résidus des plantes dans le sol (Ensigne et al.,

1993).

Les actinobactéries sont ubiquitaires, on les trouve dans tous les milieux naturels et on

été isolés à partir de différentes niches écologiques telles que : sols, aire, fumier, débris,

végétaux, lacs, sédiments marins, rivières, océans, déserts, sol polluée… (Williams et al.,

1983).

La morphologie des actinobactéries se caractérise par deux diversité importantes, on

distingue que la plupart des mycobactéries sont des simple bacilles, diphtérioides, et la forme

mycélienne comme le genre Streptomyces (Gottlieb, 1973). Les actinobactéries peuvent

présenter selon les conditions de leur culture en milieu liquide, deux catégories d’hyphes : les

hyphes en pellets et les hyphes dispersés. Dans la forme en pellets, il y’a limitation de la

diffusion d’O2 et de nutriments à travers les hyphes, ce qui fait une croissance limitée (Cox et

al, 1998).Les actinobactéries se développent à la fois à la surface du substrat, et à l’intérieur

de ce dernier, par la formation d’un réseau ramifié d’hyphes (Basilio, 2003).

Les actinobactéries jouent un rôle très considérable dans les phénomènes de

biodégradation permettant le recyclage de la matière première et empêchant l’accumulation

des déchets indésirables. Elles sont la plus importante source de production d’antibiotiques et

autres métabolites secondaires (Goodfellow et williams, 1983).

1.2 Classification des actinobacteries

Selon la classification du "Taxonomic Outline of The Procaryotes, Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology", Le Phylum Actinobacteria (bactéries à Gram positif et GC %

élevé) est constitué d'une seule classe dénommée également "Actinobacteria"

(Stackebrandtet al., 1997).


3

1.2.1 Classe "Actinobacteria"

Phylum Actinobacteria

Le phylum "Actinobacteria" est bien soutenu par des analyses des gènes 16S et 23S, présence

d’insertions et de suppressions conservées dans certaines protéines, et des réarrangements

caractéristique de gènes (Goodfellow et Fiedler, 2010). Cette modification rend la taxonomie

du phylum "Actinobacteria" plus conforme à celle des autres procaryotes et facilite ainsi les

comparaisons entre les embranchements et le développement d’une classification unifiée à

travers toutes les bactéries et les archées.

En outre, ce changement réduit le nombre de subdivisions dans les rangs supérieurs de

six (classe, sous-classe, ordre, sous ordre, famille et genre) à quatre. La classe

"Actinobacteria" exclut maintenant les sous-classes Acidimicrobium, Coriobacteriaceae,

Nitriliruptoridae et Rubrobacteridae, avec l’élévation de ces sous-classes aux classes. En

outre, avec l’élévation des sous-ordres aux ordres, l’ordre Actinomycétales est maintenant

réservé aux membres de la famille Actinomycetaceae. De nombreux sous-ordres qui sont bien

établis dans la littérature, tels que Micrococcineae and Pseudonocardineae, ne sont pas

utilisés.

Taxonomic Outline of the phylum Actinobacteria édité en deux parties (partie A et

partie B) a été publié en mai 2012. Sous la direction et l’organisation de Michael Goodfellow

le grand travail a été accompli succès en mai 2012. Le phylum Actinobacteria comprend 6

classes, 22 ordres, 53 familles, 222 genres et environ 3000 espèces (Ludwig et al., 2012).

1.3 Importance des actinobacteries

Les actinobacteries suscitent beaucoup d’intérêts, car c’est la plus importante source de

production d’antibiotiques et autres métabolites secondaires bioactifs ce qui fait d’eux des

producteurs intéressants en industrie pharmaceutique (Boucheffa, 2011). Ainsi, d’autres

métabolites sont également synthétisés. On estime que les deux tiers des quelques six mille

antibiotiques isolés jusqu’ici sont produits par les actinobacteries.

La richesse des actinobactéries dans ce domaine à été démontré par Selman

Waksman. Dans ses laboratoires il a isolées quatre premiers antibiotiques : l’actinomycine

(1940), la streptomycine (1944), la néomycine (1949) et la candicidine (1953). Ainsi que

d’autres molécules avec des propriétés pharmacologiques intéressantes en tant que ligand des

stérols (Melouah, 2015). En plus de la production des antibiotiques, les actinobactéries ont

d’autres applications industrielles comme la production d’enzymes, de nucléotides, de


4

certaines vitamines et les bioconversions. D’autre part, certains genres d’actinobactéries se

sont montrés efficaces dans la production de presque la totalité des aminoacides (Zouaghi,

2007).

2 Genre Streptomyces

Le genre Streptomyces c’est le genre le plus abondant d’actinobactéries et le plus performent

dans la production de métabolites secondaires importants. Les Streptomyces sont des

organismes aérobies, à coloration de Gram positive non acido-alcoolos résistants. Sont

capables d’utiliser de nombreux composés organiques comme seule source de carbone et

d’azote sous forme minérale. Se sont des bactéries filamenteuses, elles forment un mycélium

très ramifier qui se fragmente rarement, avec un diamètre qui varie de 0,5 à 2 µm c’est le

mycélium de substrat. Le mycélium aérien produit des chaines de spores de langueur variable

(Williams et al., 1989).

L’aspect des colonies est caractéristique, elles sont rondes, poudreuses, et légèrement

enfoncées dans la gélose : elles sont le plus souvent colorées, ces coloration sont très variées

et s’expliquent par la présence de pigments de nature très différentes. La pigmentation est le

plus souvent différente entre le mycélium substrat et les spores. De ce fait, la coloration est

rarement homogène au niveau da la colonie.

De plus, des pigments diffusibles peuvent être présents, dont la couleur est sensible ou

non au pH. Aussi, ces pigments peuvent être solubles dans le milieu ou précipitent ou

voisinage de la colonie. Selon la couleur des spores, il est possible de définir sept séries : gris

(de gris à brun), blanc, rouge (bronze, rose et rose pale), jaune (jaunâtre à jaune-verdâtre),

bleu (bleuâtre, à bleu-grisâtre pale), vert (verdâtre à gris-verdâtres pale) et le violet

(Stackebrandt et Schumann, 2006).

2.1 Cycle de développement

La synthèse des métabolites secondaires produits par les Streptomyces est régulée en

fonction de leur cycle de développement. Les Streptomyces se développent selon un cycle

complexe sur milieu solide qui débute par la germination d’une spore cette dernière donne

naissance à un mycélium primaire, ensuite la croissance aérienne et qui se termine par la

sporulation (Figure 1).


5

Figure 1: cycle de développement des Streptomyces sur milieu solide (Hopwood et al.,

1985).

2.1.1 Germination

La germination des spores se caractérise par l’activation, l’imitation et l’émergence du tube

germinatif et sa croissance, pour les quelles la présence dans un environnement humide (le

degré hygrométrique) est important. Un choc thermique peut déclencher l’activation de la

germination, par exemple pour les spores de Streptomyces viridochromogenes elles sont

traitées pondant 5 min à 50 °C.

2.1.2 Croissance végétative

Le tube germinatif croit et donne des hyphes, cette dernières se ramifient de manière apicale,

l’ensemble de la colonie se développe de manière radial. Le mycélium primaire est ancré dans

le support solide, il épuise les nutriments. Cette morphologie leur permettent l’utilisation des

substances solides dans les sols, ce qui permet aux Streptomyces la colonisation des

substances solides en comparaison avec les microorganismes unicellulaire et immobiles

(Miguelez et al., 2000).


6

2.1.3 Croissance aérienne

Lorsque les ressources nutritionnelles sont rares, ou il y’a un autre types de stress, le

mycélium végétatif va se différencier au niveau morphologique entrainant la formation du

mycélium aérien. Ce dernies se développe de façon perpendiculaire au milieu (dans l’air),

donc il ne puise pas les ressources nutritives dans le milieu. Pour pallier ce problème, le

mycélium aérien va utiliser le mycélium végétatif comme substrat. En effet, le mycélium

végétatif s’autolyse et les produits de la lyse sont cannibalisés par le mycélium aérien

(Miguélezet al., 2000).

La formation du mycélium aérien est influencée par plusieurs facteurs, notamment : la

composition du milieu de culture, la température d’incubation et la présence de composés

stimulants spécifiquement le mycélium aérien. Généralement, le mycélium aérien est plus

épais, et moins ramifié, que le mycélium de substrat, hydrophobe, et contenant des pigments

(Madigan et Martinko, 2007).

2.1.4 La sporulation

Les extrémités des hyphes aériens se cloisonnent et se différencient pour former des chaines

de spores uninuclés. Ces spores sont des agents de résistances et surtout de dissémination, ce

qui règle le problème de l’immobilité du mycélium de substrat. Les conidies peuvent suivant

les espèces, être produites en courtes ou longues chainettes qui peuvent êtres ramifiées ou

non, droites ou en spirales.

Elles contiennent la plupart des éléments du mycélium primaire : des ribosomes

dissociables en sous-unité 30 S et 50 S, un système membranaire intra-cytoplasmique, des

vacuoles, une membrane cytoplasmique, une paroi plus épaisse qui peut contenir jusqu’à trois

couches, mais leur contenu de génome est plus riche en ADN et moins en ARN que celui le

mycélium de substrat. Ces spores contiennent des quantités plus importantes de potassium, de

calcium, et de manganèse que dans le mycélium de substrat et englobent souvent des

pigments. Leur contenu en tréhalose, relativement abondant, aurait un rôle dans la dormance

et la résistance des spores (Mc Bride et Ensigne, 1986).

En milieu liquide, les cellules se développent uniquement sous forme de mycélium

primaire, même si certaines souches peuvent sporuler dans cet environnement (Madigan et

Martinko, 2007). En milieu solide, une différenciation morphologique et donc observée

tandis qu’en milieu liquide la différenciation et généralement physiologique par l’activation


7

d’un métabolisme secondaire dans le cas d’un stress nutritionnel ou environnemental

ralentissant significativement la croissance (Hodgson, 2000).

2.2 Génétique

Les génomes de plusieurs espèces se Streptomyces ont été séquencés et assemblés. C’est le

cas des génomes de S. coelicor, S. avermitilis, S. griseus (Ohnishiet al., 2008). Les génomes

de Streptomyces sont composés d’une molécule linéaire d’ADN de grande taille, allant de 8 à

10 MB y’a un haut taux de G + C « 70 % ». Ils possèdent également de plasmides linéaires de

très grandes tailles ainsi que des plasmides circulaires.

La densité génique est élevé avec environ 1 gène tous les 1200 paire de bases, c’est

notamment le premier exemple de bactéries contenant plus de gène dans sans génome que

l’eucaryote Saccharomyces cerevisiae (Bentley et al., 2002).

2.3 Ecologie

Le genre Streptomyces regroupe les bactéries filamenteuses à Gram positive du sol,

strictement aérobie, et possédant un cycle de vie inhabituel chez des organismes procaryotes.

Comme beaucoup de microorganismes du sol, la plupart des Streptomyces se comportent en

bactéries mésophiles (dans une température variant entre 25 C° et 30 C°) et neutrophile

(croissance entre pH 5 et 9 avec un maximum autour de la neutralité). Cependant quelque

Streptomyces sont acidophiles et croissent à des pH entre 3,5 et 6,5 colonisant ainsi les sols

acides, ils ont la particularité de produire des hydrolases et des chitinases acides.

En milieux naturel le mycélium sécrète de nombreuses enzymes. Ces enzymes sont

capables de dégrader de nombreux biomatériaux tels que des restes de végétaux ou la cuticule

des arthropodes afin de les transformer en nutriments assimilables par le mycélium. Les

Streptomyces sont des organismes saprophytes et jouent donc un rôle important dans la

minéralisation de la matière organique. Ils sont également capables de dégrader des composés

toxiques comme herbicides, et jouent un rôle dans la neutralisation de pH acide de centaines

sols (Sette et al., 2004).

Dans la rhizosphère, les Streptomyces jouent un rôle très important dans la protection

des racines des plantes par inhibition du développement des champignons potentiellement

pathogènes par leur sécrétion d’antifongiques (Doumbou et al., 2001).

Les Streptomyces sont capables de se développer sur une large gamme de substrats, ils

possèdent un grand pouvoir d’adaptation aux conditions de l’environnement et peuvent en


8

même temps l’influencer. Ainsi on les retrouve dans les eaux polaires gelées en permanence

tout comme dans les sols chauds et secs, dans le pétrole brut, les sols alcalins, les sols

hautement contaminés par les métaux lourds, les lacs extrêmement alcalins et les lacs salés

(Goodfellow et Williams, 1983).

Ils sont mêmes présents, comme espèces non pathogènes à la surface des feuilles

d’arbres fruitiers comme les feuilles de vigne et dans les racines de blé mais d’autres

provoquent des dégâts considérables sur la pomme de terre (S. scabies et S. acidiscabies

responsables de la gale de pomme de terre). Par contre, ils semblent être absents des eaux

minières très acides (pH<1) et des sources thermales très chaudes d’origine volcanique (Xu et

al., 1996).

Outre les sols, les Streptomyces sont capables de coloniser la rhizosphère où ils

apportent une résistance aux champignons pathogènes de par la production de molécules

antifongiques. Il a également été rapporté plusieurs cas de symbioses entre des bactéries du

genre Streptomyces et des insectes de la classe des hyménoptères. On peut notamment citer le

mutualisme avec les fourmis fongicultrices Acromyrmex octospinosus, où la bactérie prévient

le développement d’Escovopsis weberi, un champignon parasite des cultures (Seipke et al.,

2011) . Chez la guêpe européenne Philanthus triangulum, la présence de Streptomyces permet

aux larves de résister aux infections (Kroiss et al., 2010).

2.4 Bioactivité

Les Streptomyces produisent 70 à 80% des substances bioactives naturelles connues à

applications pharmaceutiques ou agrochimiques (Berdy, 2005). Continuellement de nouveaux

métabolites à différentes activités biologiques sont isolées de souches Streptomyces (Getha et

al.,2005). Le premier et le plus important produit des Streptomyces est les antibiotiques. A

partir de 1955 le genre Streptomyces devient, et va rester le grand fournisseur d’antibiotiques

nouveaux (Hwang et al., 2001 ; Marinelli, 2009). Ils constituent la source de substances

antibactériennes, antifongiques, antitumorales, antiparasitaires (Dietera et al.,2003),

antivirales, insecticides, pesticides et herbicides. Ils sont la source des substances

pharmacologiques comme les immuno-modulateurs (substances immunosuppressives et

immunostimulantes), les substances vaso-actives et les agents neurologiques (Sanglier et

Trujillo, 1997).


9

Les enzymes sont les plus importants produits des Streptomyces après les

antibiotiques, comme les protéases, les lipases, les cellulases, les amylases, les pectinases et

les xylanases (Vonothini et al.,2008).

3 Production des antibiotiques par les Streptomyces

3.1 Généralités

La synthèse des antibiotiques est largement répandue chez les microorganismes fongiques et

bactériennes, ils inhibent ou tuant à faible concentration spécifiques d’autres microorganismes

(Marinelli, 2009).Un grand nombre d’antibiotiques a été identifie en milieu naturel, mais

moins de 1% sont connus pour leur application médicales. Beaucoup d’antibiotiques naturels

ont été structuralement modifiés en laboratoire pour augmenter leur efficacité formant la

classe des antibiotiques semi-synthétiques (Madingan et Martinko, 2007). Les antibiotiques

présentent un intérêt significatif dans les domaines de la sante animale, de l’élevage et de

l’agriculture (Berdy, 2005).

L’histoire des antibiotiques a débuté avec la découverte de la pénicilline par Fleming

dans les années 40, de puis, les microorganismes ont été considérablement étudiés, les

recherches entreprises ont permis de compléter l’arsenal antibactérien mis à la disposition de

la médecine, de tétracycline et terramycine furent isolées des 1953 , la découverte des agents

chimio thérapeutiques et le développement de nouveaux médicaments ont fortement diminué

la souffrance humaine (Prescott et al., 2007).

La majorité des antibiotiques et des métabolites secondaires biologiquement actifs sont

produits par le genre Streptomyces. Prés de 50 % des espèces de Streptomyces isolées sont

reconnus comme productrices d’antibiotiques (Madigan et Martinko, 2007).D’après le

Tableau 1, il apparait clairement que les actinobactéries synthétisent les deux tiers des

antibiotiques microbiens dont environs 80% sont isolés du genre Streptomyces. Même si on

inclut les autres métabolites secondaires. Les actinobactéries restent le plus grand fournisseur

(Boughachiche, 2012).


10

Tableau 01 : Nombre approximatif de métabolites secondaires produits par différents groupes

d’organismes (Kieser et al., 2001).

Sources

Métabolites bioactifs

Antibiotiques Autres

Non-Actinobacteries 1400 (12%) 240 (9%)

Actinobacteries 7900 (66%) 1220 (40%)

Champignons 2600 (22%) 1540 (%)

Lichens 150 200-500

Algues 700 800-900

Plantes supérieures 5000 25000-35000

3.2 Classification des antibiotiques

Les antibiotiques peuvent être classés selon plusieurs critères :

Origine : élaboré par un organisme (naturel) ou produit par synthèse (synthétique ou

semi synthétique).

Mode d’action : paroi, membrane cytoplasmique, synthèse des protéines, synthèse

des acides nucléiques.

Modalité d’action : étude des interactions dans le temps enter des concentration

variables d’un antibiotique et bactérie.

Spectre d’activité : liste des espèces sur les quelles les antibiotiques sont actifs

(spectre étroite ou large).

Nature chimique : peuvent être classés selon leur composition chimique (Berdy,

2005).

Les aminoglycosides (streptomycine, néomycine, kanamycine, gentamycine).

Les macrolides (érythromycine).

Les anasamycine (rafamycine).

Les beta-lactames (thionamycine).

Les peptides (viomycine, théostrepton, actinomycin, pristinamycine).

Les tétracyclines (chloratetramycine, oxytetracycline).

Les nucleosides (puromycine).

Les polyènes (nystatine, candicidine, amphotoricine B).


11

3.3 Antibiotiques produits par les Streptomyces

Les antibiotiques synthétisés par les Streptomyces, leurs classes chimiques, ainsi que leurs

applications sont détaillés dans le Tableau 2.

Tableau 2 : Antibiotiques de Streptomyces utilise (Kieser et al., 2000 ; Madigan et

Martinko, 2007).

Antibiotiques Producteur Classe chimique Applications

Acide

clavulanique

S. clavuligerus Beta- lactamine Antibactérien

Actinomycine D Streptomyces sp Peptide Antitimoral

Antimycine A Streptomyces sp Macrolide Insecticide

Ivermectine S. avermitilis Macrolide Antihellminthe

Bambermycine S. bambergiensis Aminoglycoside Favorise la croissance des

plantes

Bialaphos S.hygroscopicus Peptide Herbicide

Bléomycine S .verticillus Glycopeptide Antitimoral

Candicidine S.griseus Macrolide Polyène Antifongique

Céphamycine Streptomyces sp Beta-lactamine Antibactérien

Chloramphénicol S.venezuelae N-

dichloracylphenylpropanoide

Antibactérien

Chlortétracycline S. aureofaciens Tétracycline Antibactérien

Cyclosérine

S. orchidaaceus

Peptide cyclique

Antibactérien

Daptomycine S. roseosporus Lipopeptide Antibactérien

Daunorubicine S. peucetius Anthracycline Antimoral

Desferrioxamine S. pilosus Peptide Régulateur des

concentrations de

fer

Doxorubicine S. peucetius Anthracycline Antitimoral

K 506 S. hygroscopicus Macrolide Immunosuppreur

Fosfomycine Streptomyces sp. Anticorps phosphonique Antibactérien

Hygromycine B S. hygroscopicus Aminoglycoside Antihellminthe

Kanamycine S. kanamyceticus Aminoglycoside Antibactérien

Lasalocide S. lasaliensis Polyéther Antibactérien

Lincomycine S. lincolnensis Aminoglycide Antibactérien

Milbemycine S. hygroscopicus Macrolide Antibactérien

Mithramycine S. argillaceus Anticorps auréolique Antitimoral

Mitomycine C S. caespitosus

S.verticillatus

Anthracycline Antitimoral

Monensin

S. cinnamomensis

Polyéther Antibactérien

Natamycine S. nataensis Polyènetetraène Antifongique

Néomycine S. fradiae Aminoglycoside Antibactérien

Nikkmycine S. tendae Nuléoside Antifongique


12

4 Résistance aux antibiotiques

La résistance aux antibiotiques est un phénomène aussi ancien que l’apparition des

antibiotiques. Les antibiotiques sont au départ des substances naturelles générées par des

champignons mais aussi par certaines bactéries pour se defender contre les autres bactéries.

(Loucif ; 2011).

4.1 Types de résistance

4.1.1 Résistance naturelle

est un caractère présent chez toutes les souches appartenant à la même espèce (Smaoui,

2010). Elle fait partie du patrimoine génétique normale du germe (Yala et al., 2001).

Insecticide

Nosiheptide S. actuosis Thiopeptide Favorise la

croissance des

plantes

Novodiocine S.wiveus Glycoside Antibactérien

Nystatine S. noursei Macrolide Polyène Antifongique

Oléandomycine S. antibioticus Macrolide Antibactérien

Oxytétracycline S. vimosus Tétracycline Antibactérien

Paromomycine S. vimosus Aminoglycide Antiparasitaire

Phléomycine S. verticillus Glycopeptide Antitimoral

Polyoxine S. cacaoui Nucléoside peptide Antifongique

Pristinamycine S. pristinaespiralis Peptide macrolatone Antibactérien

Puromycine S. alboniger Purine nucléoside Antitimoral

Rapamycine S. hygroscopicus Macrolide Immunosuppresseur

Salinomycine S. abus Polyéther Antibactérien

Spectinomycine S. spectabilis Aminocyclitol Antibactérien

Spiramycine S. anbofaciens Macrolide Antibactérien

Streptogramines S. graminofaciens Lactones macrocyclique Antibactérien

Streptomycine S.griseus Aminoglycosides Antibactérien

Streptothricine S. lauedulaae N- glycoside Antibactérien

Thiénamycine S. cattlaya Beta-Lactamine Antibactérien

Tétracycline S. aurreofaciens Tétracycline Antibactérien

Thiostrepton S. azureus Thiopeptide Favorise la croissance

des plantes

Tobramycine S.tenebrarius Aminoglycosides Favorise la croissance

des plantes

Tylosine S. fradiae Macrolide Antibactérien

Validamycine S.hygroscopicus Aminoglycosides Favorise la croissance

des plantes

Virginiamycine S.virginiae Lactone macrocyclique Favorise la croissance

des plantes


13

Klebsielle sp. produit naturellement des béta-Lactamase, et les bactéries anaérobies sont

naturellement résistances aux aminosides (Lozniewski et Rabaud, 2010).

4.1.2 Résistance acquise

à côte de la résistance naturelle, existe aussi des résistances acquises. C’est l’acquisition de

nouveaux gènes capables de rendre la bactérie insensible à un antibiotique ou a un groupe

d’antibiotiques. Ces nouveaux gènes peuvent être obtenus soit par mutation au niveau du

chromosome. Soit par transfert d’ADN des plasmides conjugatifs ou de transposons (Yala et

al., 2001).

4.2 Mécanismes biochimiques de résistance bactérienne aux agents antibactériens

Ils peuvent être regroupés en trois grands types de mécanismes diminution de la perméabilité

et efflux actif, modification de la cible des antibiotiques, production d’enzymes inactivant les

antibiotiques (Levry et Maishall, 2004)

Diminution de la perméabilité : par mutation affectant la structure des porines ou

diminuant leur synthèse, ainsi l’antibiotique ne peut pas pénétrer dans la bactérie

(Lozniewski et Rabaud, 2010).

Expulsion rapide de l’agent hors de la cellule avant qu’il puisse agir : un certain

nombre de bactéries possèdent une capacité intrinsèque de rejeter hors de la cellule la

substance qui vient d’y entrer. Cette propriété est très connue chez les bactéries à

Gram négatif (c’est le cas de Pseudomonas aerugenosa) qui possèdent dans leur

membrane des protéines, appelées pompes effluentes, qui expulsent les antibiotiques

(Jayaraman, 2009).

4.3 Destruction ou l’inactivation de l’antibiotique par production d’enzymes

Les antibiotiques sont susceptibles d’être dégradés par voie enzymatique. L’exemple le plus

connu est l’hydrolyse du noyau béta-lactame par des béta-lactamase dont certaines de ces

enzymes sont à spectre élargi (Braford, 2001). Le nombre de béta-lactamases plasmatiques

est très élevé et elles sont classées selon leurs vitesses d’hydrolyse, leurs constantes d’affinité

pour les béta-lactamine, leurs faculté à être inhibée par les inhibiteurs tels que l’acide

clavulanique (Lozniewski et Rabaud, 2010).

Les pénicillinases sensustricto : chez les espèces Staphylococcus aureus, elles

inactivent la pénicilline G, la pénicilline A, elles sont par contre sans action sur la

pénicilline M ainsi que sur les céphalosporines.


14

Les pénicillinases à spectre élargi : ces béta-lactamase entrainent une résistance (ou

une diminution d’activité) vis-à-vis des pénicillines G, des pénicillines M, des

carboxypénicillines, des uréidopénicillines, des céphalosporines de la 1ère

et de la 2ème

génération.

Les Béta-Lactamase à Spectre Etendu (BLSE) : ces béta-lactamase dérivent de la

mutation des gènes codant pour les béta-lactamase à spectre élargi. Le profil de

résistance conféré est identique à celui conféré par les béta-lactamase à spectre élargi

mais il s’étend aux céphalosporines de la 3ème

génération et à l’aztréonam. Les béta-

lactamase à spectre étendu sont sensibles aux carbapénèmes (Bonnet, 2004).

Les béta-lactamases résistantes aux inhibiteurs ; les béta-lactamases résistantes aux

inhibiteurs dérivent de certains béta-lactamases à spectre élargi par mutation

ponctuelle. Le profil conféré est identique à celui des béta-lactamases à spectre élargi

mais ces enzymes ne sont pas inhibées par l’acide clavulanique, le sulbactam ou le

tazobactam. D’autres enzymes hydrolysent de nombreux antibiotiques, tels

céphotaximases (Bonnet, 2004). Les enzymes inactivant les aminosides sont divisées

en trois classes: aminosides-phospho transférases, aminosides-nucléotidyl transférases,

aminoacétyltransférases(Doi et Arakawa, 2007). Les stréptogramines sont inhibés par

streptogramine A (O-) acétyltransférase (SB (CO-) lyase (Mukhtar et al.,2001).

Matériel et méthodes


15

Objectif de travail

L’objectif principal de la présente étude, consiste à la production et l’extraction des molécules

bioactives à partir d’une souche d’actinobactérie « Streptomyces », par fermentation solide et

liquide sur deux milieux différents AF et ISP2.

Ensuite tester leurs activités par la technique des disques de diffusion vis-à-vis des

souches d’importance clinique et des champignons phytopathogènes dans le but de

sélectionner les meilleurs : milieu, solvant et technique d’extraction.

I. Matériel

1. Matériel biologique

1.1. Souches des actinobactéries

La souche étudié d’actinobactérie, codée SRO1, à été obtenue à partir d’un sol saharien

(aride) lors des travaux menés par Mehda et Khanfar (2013). La souche SRO1 a été isolée à

partir du sol rhizosphérique du palier dattier, cultivé dans la localité Mihouansa (wilaya d’El

Oued).

NB : La signification du code est la suivante : (S) sol, (R) rhizosphère, (O) El-oued.

1.2. Souches test

L’activité antibactérienne a été testée contre des bactéries d’importance clinique :

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca, Enterobacter sp., Bacillus

subtilis, et Pseudomonas aeruginosa. Les souches cliniques sont fournies par Dr. Aouar

Lamia, enseignante à l’université Larbi Ben M’hidi, d’Oum El Bouaghi.

1.3. Champignons phytopathogènes

Six souches de champignons phytopathogènes, ont été utilisées comme des champignons test

pour la détermination de l’activité antifongique : Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata,

Botrytis cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp. Ces champignons

sont fournis par Dr. Aouar Lamia.


16

2. Milieux de culture

Pour réaliser la culture des bactéries, la production des molécules actives et la détection de

l’activité antimicrobienne, plusieurs milieux de culture de composition différente ont été

utilisés : ISP2+ CaCo3, AF, Hektoen, Chapman, Mueller Hinton, Bouillon Nutritif, gélose

nutritive.

3. Solvants d’extraction

Cinq solvants organiques non miscibles avec l’eau et de polarités différentes ont été utilisés à

fin de réaliser l’extraction de biomolécules : acétate d’éthyle, toluène, méthanol, butanol 1 et

hexane.

II. Méthodes

1. Repiquage des souches

Les actinobactéries sont repiquées, sur les milieux AF et ISP 2 + CaCo3. Cette dernière

opération est répétée jusqu’à l’obtention des souches pures et bonne sporulation.

2. Activité antibactérienne

2.1. Préparation des inocula des bactéries-test

Des cultures solides de 18 heures ont été obtenues sur milieu Chapman pour la souche de

Staphylococcus aureus, la gélose nutritive pour Bacillus subtilis et l’Hektoen pour les autres

souches. Une suspension de chaque bactérie-test est préparée dans l’eau physiologique. La

densité cellulaire de chaque suspension est ajustée par comparaison avec la solution 0,5 Mac

Farland de façon à obtenir une concentration d’environ 108 UFC/ml.

2.2. Mise en évidence des activités antibactériennes

2.2.1. Technique des cylindres d’Agar

La souche de Streptomyces est ensemencée en stries serrées à la surface des milieux AF et

ISP2. Après 7 jours d’incubation à 30 °C, Des cylindres de gélose de 6 mm de diamètre sont

prélèves et sont déposes à la surface des milieux ensemences avec les bactéries-test. Ces

dernières sont ensemencées à la surface par écouvillonnage sur milieu Mueller-Hinton Les

boites sont placées 18 heures à + 4°C pour permettre la diffusion des substances actives, les

boites sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures (Tortorano et al., 1979).


17

2.2.2. Inoculum fongique

Les champignons filamenteux sont repiqués sur milieu PDA et incubés à28 °C pendant 5 à 7

jours. Une suspension dense de spores et de fragments mycéliens est obtenue par raclage des

cultures après addition d’eau physiologique. La suspension est diluée jusqu'a atteindre une

absorbance de 0,20 à 650 nm. Cette suspension diluée au 1/10ème

servira d’inoculum calibré.

2.2.3. Mise en évidence des activités antifongiques

La production de métabolites antifongiques par les souches Streptomyces est mise en évidence

par la technique des cylindres d’Agar en utilisant le milieu PDA pour les champignons.

L’incubation se fait à 28 °C pendant 5 jours pour les champignons filamenteux

(Boughachiche, 2012).

3. Production et préparation d’extraits riches en métabolites secondaires

Cette étape a pour but de préparer des extraits à partir du milieu de culture des espèces

d’actinobactéries purifiées.

3.1. Fermentation liquide

À partir de la culture d’actinobactérie SRO1, des colonies sont ensemencées dans des Erlens

de 250 ml contenant 70 ml de milieu AF et ISP2 liquide. Ensuite les cultures sont incubées

pendant 3 à 4 jours à 30 °C sous agitation constante à 180 rpm. Après la durée d’incubation,

les cultures sont centrifugées pendant 20 min à 3000 g. Chaque 70 ml de surnageant est

mélange avec 70 ml de solvant. Les extraits obtenus sont concentrés par évaporation à l’aide

d’un évaporateur rotatif -55 °C. Les résidus secs de chaque solvant sont ensuite repris dans 1

ml de méthanol et sont transvasés dans des Eppendorfs.

3.2. Fermentation solide

La souche étudiée est ensemencée en stries serrée sur milieu AF et ISP2. Après incubation à

30 °C pendant 5 jours, la gélose est fragmentée puis reparti dans des erlens contenant 70 ml

des différents solvants : méthanol, butanol 1, acétate d’éthyle, toluène et hexane. Après

agitation vigoureuse, les extraits organiques sont récupérés par centrifugation à 3000 g

pendant 20 mn puis testées par la technique des disques de diffusions (Boughachiche, 2012).


18

4. Technique des disques de diffusion

Les extraits organiques obtenus à partir des cultures liquides et solides sont testés par cette la

technique des disques de diffusion. Des volumes de 50 μl sont déposes par fractions sur des

disques de papier Whatman N°3 (6 mm de diamètre) stériles qui sont séchés sous un courant

d’air froid. Les disques sont, ensuite, déposés sur gélose Mueller-Hinton pour les bactéries et

PDA pour les champignons, préalablement ensemencée avec un microorganisme-test. Les

boites sont incubées à 37 °C pour les bactéries et 28 °C pour les champignons. La mesure des

diamètres d’inhibition est effectuée après 24 à 48 heures d’incubation pour les bactéries et 3 à

5 jours pour les champignons (Barry et al., 1970).

Résultats et discussion


19

I. Résultats

1. Détermination de l’activité antimicrobienne

L’activité antimicrobienne de la souche SRO1 à été détectée suivant deux techniques : la

technique des cylindres d’agar et des disques de diffusion. Les souches test utilisées sont des

bactéries pathogènes à Gram négatif (Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Enterobacter sp.,

et Pseudomonas aeruginosa) et à Gram positif (Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis)

(Photographie 1).

Photographie 01 : Les bactéries test sur différents milieux A) K. oxytoca ; B) E. coli ; C)

Enterobacter sp. ; D) P. aeruginosa ; E) S. aureus ; F) B. subtilis.

2 .Détermination de l’activité antifongique

Deux techniques sont utilisées pour déterminer l’activité antifongique : la technique des

cylindres d’agar et la technique des disques de diffusions. Les champignons test utilisés sont

des champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea,

Trichoderma sp., Fusarium oxysporum, Penicillium sp.) Photographie 02.


20

Photographie 02 : Les champignons test A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) B. cinerea ; D)

Trichoderma sp. ; E)Fusarium oxysporum ; F) Penicillium sp.

3. Technique des cylindres d’agar

3.1. Activité antibactérienne

Les résultats de l’activité obtenus sont présentés dans le Tableau 03 et la Photographie 3, où

il apparait que la souche SRO1 a agi contre quatre bactéries test.

Les résultats montrent que les valeurs des diamètres d’inhibitions par rapport aux deux

milieux AF et ISP2 varies de (6,66 ± 2,08 mm) à (22± 2 mm). Le milieu ISP2 démontre la

plus forte activité que le milieu AF. Ainsi, les moyennes des diamètres d’inhibitions obtenues

par la souche SRO1 sur milieu ISP2 varient de (8,33 ± 2,08 mm) à (22±2 mm). Par contre,

sur le milieu AF, elles varient de (6,66 ±2,08 mm) à (19± 1,52 mm).

Parmi les souches test et selon la technique des cylindres d’agar, les entérobactéries

sont considérées comme les souches les plus sensibles vis-à-vis la souche antagoniste SRO1.

Les résultats obtenus par la souche SRO1 contre les Enterobacter avec les deux milieux ISP2

et AF d’une valeur (22,2 ± 2 mm) et (19,66 ± 1,52 mm), respectivement.


21

Par contre les deux souches K. oxytoca et B. subtilis sont moins sensibles que les

Enterobacter sp. et cela est du au résultat obtenue sur milieu ISP2 (14,2±2 mm) et

(11,66±1,52 mm) et sur milieu AF (13,33±1,52 mm), (11,33±1,52 mm), respectivement. La

souche SRO1 montre une très faible activité contre S. aureus sur les deux milieux ISP2 (8,33

± 2,08 mm) et AF (6,66±2,08 mm). Par contre les souches E. coli et P. aeruginosa sont

résistantes.

Tableau 03: Résultat de l’activité vis-à-vis les bactéries test par la technique des cylindres

d’agar sur les deux milieux ISP2 et AF.

Bact

érie

s

Milieu ISP2 Milieu AF

Diamètre de la

zone

d’inhibions mm

(répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

Diamètre de la

zone d’inhibition

mm (répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-

typ

e

S.

au

reu

s

06

09

10

08,33

2,08

05

06

09

06,66

2,08

K.

oxyt

oca

14

12

16

14

2

13

15

12

13,33

1,52

En

tero

bact

er

sp

22

20

24

22

2

18

20

21

19,66

1,52

B.

subti

lis

12

13

10

11,66

1,52

11

10

13

11,33

1,52

E. co

li

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

P.

aer

ugin

osa

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-


22

Photographie 03 : L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches test A) S.

aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F) P. aeruginosa par

la technique des cylindre d’agar.

3.2. Activité antifongique

Par rapport aux résultats de l’activité contre les champignons phytopathogènes par la

technique des cylindres d’agar, nous constatons que tous les champignons : Ascochyta rabiei,

Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Trichoderma sp., Fusaruim oxysporum et Penicillium

sp., sont résistants vis-à-vis la souche de Streptomyces SRO1 sur les deux milieux AF et ISP2

(Photographie 4).

Photographie 4: L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les champignons

phytopathogènes A) A. rabiei ; B) A. alternata ; C) Trichoderma sp. ; D) F. oxysporum.


23

4. Activité antibactérienne par la méthode des disques de diffusions

Au cours de la fermentation liquide, les cultures sont vérifiées pour leur pureté. Ensuite, les

surnageants obtenus après centrifugation, ont fait l’objet d’une extraction par les solvants

organiques : l’acétate d’éthyle, hexane, toluène, butanol 1. Pour la fermentation solide le

méthanol a été employé pour l’extraction. Les extraits sont concentrés et récupérés dans le

méthanol. Ensuite, les disques de papier sont chargés avec ces extraits organiques. Ces

disques ont été déposés sur la gélose Mueller Hinton déjà ensemencée avec les cultures jeunes

des bactéries-test : Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa et Bacillus subtilis et Enterobacter sp.

4.1. Activité antibactérienne des extrais obtenus sur ISP2 par fermentation liquide et

solide

Pour les extraits obtenus par la fermentation solide sur milieu ISP2, on constate l’absence

absolu de l’activité antibactérienne avec l’extrait de toluène et hexanoique, contre les

bactéries test : Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Bacillus subtilis. Aussi contre

Staphylococcus aureus aucune activité antibactérienne n’a été détectée avec l’extrait

butanolique, et même résultat négatif pour Escherichia coli avec l’extrait méthanolique.

En ce qui concerne, les autres tests d’antagonisme on enregistre une activité

antibactérienne, donc la souche SRO1 présente une activité inhibitrice contre différentes

souches test, avec différents solvants. Les résultats montrent que les valeurs des diamètres

d’inhibition obtenues sur le milieu ISP2 varient de (9 ± 1 mm) à (28,3 ±2,08 mm). Les plus

grands diamètres ont été obtenus par les disques imprégnés d’extrait de méthanol envers les

deux bactéries-test klebsiella oxytoca (28,3±2,08 mm) et Enterobacter sp. (26 ±2 mm) suivie

des disques chargés par l’extrait hexanoique contre la bactérie Enterobacter sp. (26,3± 1,52

mm) et aussi les disques contenant l’extrait de acétate d’éthyle (25,6 ±1,52 mm). Les résultats

enregistrés sont portées dans le Tableau 04 et la Photographie 05.

Par apport aux extraits obtenus par la fermentation liquide sur milieu ISP2, on

distingue qu’il n y’a aucune activité antibactérienne avec l’extrait de l’acétate d’éthyle vis-à-

vis la bactérie Staphylococcus aureus, et aussi avec l’extrait hexanoique contre la souche

Escherichia coli.


24

Les résultats révèlent l’activité antibactérienne de la souche SRO1, où certaines

souches test révèlent une sensibilité aux molécules bioactives produites, avec les différents

solvants. Les valeurs des diamètres d’inhibition varient entre (9 ± 1 mm) à (31 ± 2 mm), et les

grands diamètres ont été obtenus par les disques imbibés par l’extrait de toluène contre la

souche Bacillus subtilis (31 ± 2 mm), suivie des disques chargés par l’extrait butanolique vis-

à-vis la souche Enterobacter sp. (28,3 ± 1,52 mm). Pseudomonas aeruginosa est la seule

souche qui n’a exhibé aucune activité avec les différents solvants et par les deux techniques

de production solide et liquide. Ces résultats sont portés dans Tableau 04 et la Photographie

05.

Tableau 04 : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des disques de

diffusions sur milieu ISP2.

B

act

érie

s

Les

Solvants

Milieu ISP2

Solides Liquide

Diamètre de la

zone d’inhibition

par mm

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

Diamètre de la

zone d’inhibition

par mm

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

S

. au

reu

s

Hexane - - - - - 8 10 9 9 1

Toluène 9 11 10 10 1 9 9 11 9,99 1,15

Butanol-1- - - - - - 13 10 15 12,6 2,51

A. d’éthyle 24 24 26 24,6 1,15 - - - - -

Méthanol 20 22 19 20,3 1,52

K. oxyt

oca

Hexane 16 18 15 16,3 1,52 13 15 16 14,6 2,51

Toluène 16 16 18 16,6 1,15 23 20 24 22,3 1,52

Butanol-1- 15 17 18 16,6 1,52 24 26 27 25,6 2,08

A. d’éthyle 14 15 17 15.3 1,52 14 16 17 15,6 1,52

Méthanol 26 29 30 28,3 2,08


25

Tableau 4 (suite) : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des

disques de diffusions sur milieu ISP2.

Bact

érie

s

Solvants

Milieu ISP2

Solides Liquide

Diamètre de

la zone

d’inhibition

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e Diamètre de la

zone d’inhibition

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

En

tero

bact

er

sp.

Hexane 26 28 25 26,3 1,52 25 26 24 25 1

Toluène 16 18 20 18 2 21 20 21 20,6 0,57

Butanol-1- 18 20 21 19,6 1,52 27 30 28 28,3 1,52

A. d’éthyle 27 25 28 25,6 1,52 24 26 23 24,3 1,52

Méthanol 26 24 28 26 2

B. su

bli

lis

Hexane - - - - - 17 15 19 17 2

Toluène - - - - - 31 29 33 31 2

Butanol-1- 17 19 16 17,3 1,52 20 19 21 20 1

A. d’éthyle 14 12 16 14 2 13 15 11 13 2

Méthanol 21 22 20 21 1

E. co

li

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène - - - - - 10 09 11 10 1

Butanol-1- 07 10 08 8,33 1,52 11 10 13 11,3 1,52

A. d’éthyle 08 10 09 9 1 19 21 18 19,3 1,52

Méthanol - - - - -

P. aer

ugin

osa

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène - - - - - - - - - -

Butanol-1- - - - - - - - - - -

A. d’éthyle - - - - - - - - - -

Méthanol - - - - -


26

4.2 L’activité antibactérienne des extrais obtenue d’AF par la fermentation liquide et

solide

La souche SRO1 a été cultivée dans le milieu AF selon deux méthodes : solide et liquide. Les

résultats de la technique de la fermentation solide indiquent qu’il n y’ a aucune activité

antibactérienne contre la souche Bacillus subtilis avec l’extrait de toluène. Escherichia coli est

juste sensible avec l’extrait d’acétate d’éthyle, et elle résiste aux molécules bioactives

produites avec les autres solvants. Par apport à la souche Staphylococcus aureus, elle a

présentée des zones d’inhibition juste avec l’extrait méthanolique, et elle a résisté aux autres

extraits.

Les résultats montrent qu’il y’a un effet d’inhibition sur les souches test avec des

diamètres qui varient entre (29,3 ± 2,08 mm) pour Klebsiella oxytoca avec l’extrait de

méthanol et (9,33 ± 1,52 mm) pour E. coli avec l’extrait d’acétate d’éthyle. K. oxytoca et

Enterobacter sp. sont les souches les plus sensibles aux molécules bioactives obtenues. Les

diamètres les plus importants sont (29,3 ± 2,08 mm) pour Klebsiella et (28,6 ± 1,52 mm)

pour Enterobacter sp. avec l’extrait de toluène. Les résultats enregistrés sont portés dans le

Tableau 05 et la Photographie 05.

Pour la fermentation liquide, la souche Pseudomonas aeruginosa n’a aucune

sensibilité vis-à-vis les différents extraits, elle a résisté à toutes les molécules secrétées par la

souche SRO1. Les extraits du surnageant de la souche SRO1 par le solvant d’acétate d’éthyle

sont actif contre la majorité des souches. L’extrait d’hexane inhibe toutes les souches

bactériennes sauf E. coli. Les plus grands diamètres des zones d’inhibition ont été obtenus par

les disques chargés en extrait de butanol-1- (25,6 ± 1,52 mm) contre K. oxytoca, suivis des

disques chargés de l’extrait de toluène (23,3 ± 2,51 mm) contre Enterobacter sp. Les résultats

obtenus sont présentés dans le Tableau 5 et la Photographie 5.


27

Tableau 5 : Résultats de l’activité vis-à-vis les bactéries tests par la technique des disques de

diffusion sur milieu AF.

Bact

érie

s

Solvants

Milieu AF

Solide Liquide

Diamètre de

la zone

d’inhibition

(Répétitions) M

oyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e Diamètre de

la zone

d’inhibition

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

S .au

reu

s

Hexane - - - - - 7 9 10 8,66 1,52

Toluène - - - - - - - - - -

Butanol-1- - - - - - 11 13 10 11,3 1,52

A. d’éthyle - - - - - - - - - -

Méthanol 29 27 29 28,3 1,154

K. oxyt

oca

Hexane 14 16 15 15 1 15 17 18 16,6 1,52

Toluène 17 15 18 16,6 1,52 13 17 15 15 2

Butanol-1- 14 16 15 15 1 24 27 26 25,6 1,52

A. d’éthyle 15 17 19 17 2 20 23 19 20,6 2,08

Méthanol 27 31 30 29,3 2,08

En

tero

bact

er sp

.

Hexane 24 25 24 24,3 0,57 21 20 21 20,6 0,57

Toluène 27 30 29 28,6 1,52 23 26 21 23,3 2,51

Butanol-1- 20 19 21 20 1 18 19 16 17,6 1,52

A. d’éthyle 22 20 24 22 2 19 20 18 19 1

Méthanol 27 29 25 27 2


28

Tableau 5 (suite) : Résultats de l’activité contre les bactéries test par la technique des

disques de diffusion sur milieu AF.

Bact

érie

s

Solvants

Milieu AF

Solide Liquide

Diamètres

de la zone

d’inhibition

par mm

(Répétitions) Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e Diamètre

de la zone

d’inhibition

par mm

« Répétitions »

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

B

. su

bli

lis

Hexane 21 20 22 21 1 19 20 18 19 1

Toluène - - - -

- 19 20 18 19 1

Butanol-1- 14 16 12 14 2 19 17 21 19 2

A. d’éthyle 25 29 24 26 2,64 13 15 11 13 2

Méthanol 23 25 27 25 2

E

. co

li

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène - - - - - - - - - -

Butanol-1- - - - - - 07 09 11 9 2

A. d’éthyle 08 09 11 9,33 1,52 - - - - -

Méthanol - - - - -


29

Photographie 05: L’activité antibactérienne de la souche SRO1 contre les souches test A) S.

aureus ; B) K. oxytoca ; C) Enterobacter sp. ; D) B. subtilis ; E) E. coli ; F) P. aeruginosa, par

la technique des disques de diffusion.

5. L’activité antifongique par la méthode des disques de diffusion

Pour l’étude de l’activité antifongique de la souche SRO1, on a testé les extraits des

différents solvants sur des champignons phytopathogènes. Donc les disques de papier sont

chargés avec ces extraits organiques, ces disques ont été déposés sur la gélose PDA déjà

ensemencée avec les cultures sporulées des champignons phytopathogènes.


30

5.1. L’activité antifongique des molécules obtenue à partir de milieu ISP2

Les résultats de la fermentation solide indiquent que l’extrait organique méthanolique donne

un résultat contre Ascochyta rabiei (12,66 ±2,8 mm) et Botrytis cinerea (20,33 ± 1,25 mm).

Les deux extraits butanolique et de toluène n’inhibe que la souche B. cinerea, les zones

d’inhibition sont (34± 2 mm) et (23,33 ± 2,08 mm), respectivement. L’extrait de toluène n’a

inhibé que la souche Ascochyta rabiei avec un diamètre (15,33 ± 1,52 mm).

Avec la fermentation liquide on a obtenu que deux activités inhibitrices, celle de

l’extrait de toluène contre Ascochyta rabiei (30,66 ± 2,08 mm) et celui de l’extrait

butanolique contre Botrytis cinerea (26 ± 2 mm). Les résultats sont présentés dans le Tableau

06 et Photographie 06.

Tableau 6: Résultats de l’activité contre les champignons par la technique des disques de

diffusion sur milieu ISP2.

Ch

am

pig

non

s

Solvants

Milieu ISP2

Solides Liquide

Diamètre de

la zone

d’inhibition

par mm

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

Diamètre de la

zone

d’inhibition

par mm

(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

Asc

och

yta r

ab

iei

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène 15 17 14 15,33 1,52 30 33 29 30,66 2,08

Butanol-1- - - - - - - - - - -

A.

d’éthyle

- - - - - - - - - -

Méthanol 11 15 12 12,66 2,08

Botr

ytis

cin

erea

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène 24 25 21 23,33 2,08 - - - - -

Butanol-1- 34 36 32 34 2 26 28 24 26 2

A.

d’éthyle

- - - - - - - - - -

Méthanol 20 19 22 20,33 1,52


31

5.2. L’activité antifongique des extraits de la fermentation solide et liquide sur milieu AF

Les résultats des tests des extraits obtenus par fermentation solide sur milieu AF contre les

champignons montrent que l’hexane et le butanol-1- n’ont aucune activité sur tous les

champignons sauf le Botrytis cinerea avec le butanol-1-. Cependant, les extraits de toluène et

de méthanol donnent une bonne activité avec les deux souches A. rabiei et B. cinerea (16,3 ±

3,75 mm), (23 ± 2 mm) avec le toluène et (14,3 ± 2,08 mm), (20,6 ± 1.52 mm) avec le

méthanol, respectivement. Le grand diamètre des zones d’inhibitions à été obtenu par le

disque qui contient l’extrait butanolique (24,6 ± 2,8 mm) contre B. cinerea. Pour la

fermentation liquide le seul extrait qui a enregistré une activité antifongique c’est le toluène

avec un grand diamètre égale à (30,6 ± 2,08 mm) contre Ascochyta rabiei. Les résultats

obtenues sont portés dans le Tableau 07 et Photographie 07.

Tableau 7 : Résultat de l’activité contre les champignons test par la technique des disques de

diffusion sur milieu AF.

Ch

am

pig

non

s

Solvants

Milieu AF

Solides Liquide

Le diamètre de

la zone

d’inhibition Par

mm(Répétitions)

Moyen

ne

(mm

)

E

cart

-typ

e Le diamètre de la

zone d’inhibition

par mm

(Répétitions) M

oyen

ne

(mm

)

Eca

rt-t

yp

e

Asc

och

yta

rabie

i

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène 12 18 19 16,3 3,75 12 16 11 30,6 2,08

Butanol-1- - - - - - - - - - -

A. d’éthyle - - - - - - - - - -

Méthanol 12 16 15 14,3 2,08

Botr

ytis

ci

ner

ea

Hexane - - - - - - - - - -

Toluène 23 25 21 23 2 - - - - -

Butanol-1- 24 27 23 24,6 2,08 - - - - -

A. d’éthyle - - - - - - - - - -

Méthanol 19 21 22 20,6 1,52


32

Photographie 06: L’activité antifongique contre les champignons phytopathogènes A)

Ascochyta rabiei ; B) Botrytis cinerea, par la technique des disques de diffusion.

Par contre les autres champignons, Alternaria alternata, Trichoderma sp., Fusaruim

oxysporum et Penicillium sp., se sont avérés résistants (Photographie 7).

Photographie 7: L’activité antifongique de la souche SRO1 contre les champignons

phytopathogènes par la technique des disques de diffusions A) Fusarium sp. ; B) Trichoderma

sp. ; C) Alternaria alternata.

II. Discussion

Le but de notre étude est de détecter l’activité antagoniste de la souche actinobactérie SRO1.

On a réalisé le test d’antagonisme sur milieu solide en utilisant la technique des cylindres

d’agar contre six souches bactériennes d’importance clinique et six champignons

phytopathogènes. Avec la technique des cylindres d’agar, quatre souches bactériennes (S.

aureus, K. oxytoca, Enterobacter sp., B. subtilis) (66,66 %) étaient sensibles envers la souche

SRO1, par contre l’absence totale de l’activité antifongique contre les champignons test (0%).


33

L’activité de la souche SRO1 à été détecté aussi par la technique des disques de diffusion,

contre les bactéries test (83,33 %) et les champignons (33,33%).

D’après les diamètres d’inhibition, des bactéries test à Gram positif, à Gram négatif et

les champignons phytopathogènes semblent être sensible aux antibactériens et antifongiques

produits par la souche SRO1 étudiée, donc cette bactérie qualifié comme une souche à un

large spectre.

Il est à noter que la souche SRO1 n’exhibe aucune activité antibactérienne sur les deux

milieux solides et liquide, et par les deux techniques contre la bactérie test P. aeruginosa.

Certainement, elle a des mécanismes de lutte.

Les molécules bioactives qui inhibe la croissance de S. aureus sont des molécules

hydrophiles, solubles dans l’eau, car certaines zones d’inhibition ont été obtenues par la

méthode des cylindres d’agar. Aussi, elle est sensible aux molécules polaires et apolaires

produites par la souche SRO1, car des zones d’inhibition ont été obtenues par les extraits des

milieux AF et ISP2 selon la technique des disques de diffusion.

En ce qui concerne l’absence de l’activité antibactériens sur milieu AF par

fermentation solide. Il est possible que du à la méthode de production solide ou liquide. Dans

la fermentation liquide, les filaments de la culture bactérienne condensés entre eux et forme

une zone anaérobie, qui est une condition de stress respiratoire, ce qui favorise une production

élevée des molécules bioactive, donc le rendement des antibactériens est important que le

rendement dans la fermentation solide.

Les deux bactéries k. oxytoca et Enterobacter sp. Se sont avérées très sensibles envers

SRO1 et ceci sur les deux milieux et avec les différents solvants utilisés, donc ces deux

souches sont sensibles aux molécules hydrophiles polaire, apolaires et intermédiaires

produites par la souche SRO1.

En fonction de la nature des solvants et la composition des milieux, on a détecté une

activité antibactérienne de la souche SRO1 vis-à-vis la bactérie test B. subtilis. Cette dernière

est sensible aux différentes molécules hydrophiles, polaires, apolaires et intermédiaires

présentent dans les extraits de la souche SRO1. Par contre dans la fermentation solide, où les

molécules sont extraites par le toluène ne montre aucune activité contre la souche B. subtilis.


34

L’étude du spectre d’inhibition de la souche d’actinobactérie antagoniste à relevé

qu’elle présente en plus de l’activité antibactérienne une activité antifongique, cette dernière

à été vérifiée contre les champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea,

Alternaria alteranata, Trichoderma sp., Fusaruim oxysporum et Penicillium). Un résultat

similaire a été obtenu par Aouar (2012), où des souches d’actinobactéries antagonistes ont

présenté une double action antibactérienne et antifongique.

La comparaison entre les résultats de l’activité antifongique réalisée sur milieu solide

(technique des cylindre d’agar), et celle réalisée sur milieu liquide et solide (technique des

disques de diffusion), révèle que les champignons phytopathogènes (A. rabiei, A. alternata,

Trichoderma sp., F. oxysporum et penicillium) résistent au extraits des milieux solides,

contrairement au A. rabiei et B. cinerea qui se sont avérées sensibles aux extraits des

fermentations solides et liquides.

Conclusion générale et

perspectives

Conclusion et perspective

35

Notre travail a porté sur la production d’antibactériens et d’antifongiques par la

souche Streptomyces SRO1 sur milieux solide et liquide par deux techniques les

cylindres d’agar et les disques de diffusion.

L’antagonisme vis-à-vis les six bactéries d’importance clinique et les six

champignons phytopathogènes, a montré que quatre bactéries test (66,66%) se sont

avérées sensibles par la technique des cylindres d’agar, par contre aucune activité n’a

été détecté contre les champignons par cette technique. Les résultats enregistrés avec

la technique des disques de diffusion, montrent que 33,33% des champignons ont

présenté des zones d’inhibition, et 83,33% des bactéries se sont révélées sensibles aux

extraits testés.

Par apport aux bactéries, le solvant qui à présenté la meilleurs zones

d’inhibition c’est le toluène contre la bactérie B. subtilis dans le milieu ISP2 suite à

une fermentation liquide, comparativement à l’hexane qui a présenté la plus faible

activité et ceci contre Staphylococus aureus dans le milieu AF par fermentation

liquide.

Les extraits du méthanol et de l’acétate d’éthyle ont exhibé la plus forte

activité antibactérienne par apport le milieu AF. Cependant par rapport au milieu ISP

2 solide et AF liquide, le méthanol est le meilleur solvant.

En ce qui concerne l’antagoniste contre les champignons phytopathogènes, les

résultats enregistrés montre que le bon solvant d’extraction des molécules bioactives

par fermentation solide sur ISP2 et AF c’est le butanol-1- vis-à-vis le Botrytis

cinerea, et pour la fermentation liquide c’est le toluène contre Ascochyta rabiei.

Au terme de ce travail, on conclut que :

Le méthanol est le meilleur solvant pour l’extraction par la fermentation

solide.

Le butanol -1- et l’acétate d’éthyle sont les deux préférables solvants

d’extraction pour fermentation liquide.

Le mieux milieu qui donne un bon résultat et meilleur extraction c’est ISP 2.

La meilleure technique d’extraction des molécules bioactives est la

fermentation liquide.

Conclusion et perspective

36

En perspectives on propose de

Compléter l’identification physiologique, biochimique et moléculaire de la

souche SRO1

Purifier et caractériser les molécules bioactives intéressantes.

Références

bibliographiques

Références bibliographiques

37

A

Aouar L. (2012). Isolement et identification des actinomycètes antagonistes des

microorganismes phytopathogènes. Thèse de doctorat en Biochimie et Microbiologie

Appliquée. Université Mentouri-Constantine.

B

Barry A.L., Garcia F. and Thrupp L.D. (1970). An improves single disk method

for testing the antibiotic susceptibility of rapidly growing pathogens. Am J

ClinPathol.53: 149-158.

Basilio A. (2003). Patterns of antimicrobial from soil actinomycetes isolated under

different conditions of pH and salinity.J. Appl. Microbiol. 95: 814-823.

Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeno-Tarraga A.M., Challis G.l., Thomson N.R.,

James K.d., Harris D.E. et al. (2002).Complete genome sequence of the model

actinomyceteStreptomyces coelicolorA3 (2).Nature. 417:141-7.

Berdy J. (2005). Bioactive microbi0.al metabolites. J Antibiot. 58 :1-26.

Boucheffa k. (2011). Criblage des souches d’actinomycètes productrices

d’antifongiques non- polyéniques : identification des souches productrices et essai de

caractérisation des antifongiques produits. Mémoire de Magister. Université

Abderrahmane Mira Bejaia.

Boughachiche F. (2012).Etude de molécules antibiotiques secrétées par des souches

appartenant au genre Streptomyces, isolées de Sebkha. Doctorat en Sciences Option

Biotechnologies Microbiennes. Université Mentouri Constantine.

Bonnet R. (2004).Growing group of extended spectrum β-lactamases: the CTX-M-

enzymes. Antimicrobial Agents Chemotherapy.40: 1-14.

Bradfort P. A. (2001).Extended spectrum β-lactamases (ESBL) in the 21st .century:

Characterisation, epidemiology and detection of this important resistance threat.

Clinical Microbiology Reviews.48: 933-951.

C

Cox P.W., Paul G.C. and Thomas C.R. (1998). Image analysis of the morphology of

filamentous micro-organisms. Microbiol.144: 817–827.


38

D

Dietera A., Hamm A., Fiedler H.P., Goodfellow M., Muller W.E., Brun R. and

Bringmann G. (2003).Pyrocoll, an antibiotic, antiparasitic and antitumor compound

produced by a novel alkaliphilic Streptomyces strain. J Antibiot. 56: 639-46.

Doi.Y. and Arakawa.Y. (2007). 16S ribosomal rRNA methylation: emerging

resistance mechanism against aminoglycosides. Clinical Infection Diseases.45: 88-94.

Doumbou C.L., HambySalove M.K., Crawford D.L. and Beaulieu C. (2001).

Actinomycetes, promising tools to control plant diseases and to promote plant

growth.Phytoprotection.82(3): 85-102.

Sette L., Mendonca Alves Da Costa LA., Marsaioli AJ. and Manfio GP. (2004).

Biodegradation of alachlor by soil streptomycetes. App Microbiol Biotechnol.

64(5) :712-7.

E

Ensign J. C., Normand P., Burden J.P. and Yallop C; A., (1993).Physiology of

some actinomecete genera Res Microbiol.144:657-660.

G

Getha K., Vikineswary S., Wong W. H., Seki T., Ward A. and Goodfellow M.

(2005). Evaluation of Streptomyces sp. strain g10 for suppression of Fusariumwilt and

rhizosphere colonization in pot-grown banana plantlets. J IndMicrobiolBiotechnol.32:

24-32.

Goodfellow M. and Fiedler H.P. (2010). A guide to successful bioprospecting:

informed by actinobacterial systematics. Antonie van Leeuwenhoek 98 : 119-142.

Goodfellow M. and Williams S.T. (1983). Ecology of Actinomycetes.Ann Rev

Microbiol. 37: 189-216.

Gottlieb D. (1973).General consideration and implication of the actinomecetales. In:

Actinomycétales characterisatics and pratical importance. Edited by G. Sykes and F.AS

kinner Academic Press, London, New York.


39

H

Hodgson D.A. (2000).Primary metabolism and its control in Streptomycetes: most

unusual group of bacteria.AdvMicrob Physiol. 42:47 -238. Hopwood DA., Bibb MJ., Chater KF., Kieser T., Bruton CJ., Kieser HM., Lydiate

DJ Smith CP., Ward JM. and Schremph H. (1985).Genetic Manipulation of

Streptomyces: ALaboratory Manual. Norwich, UK: John Innes Foundation.

Hwang B.K., Lim S.W., Kim B.S., Lee J.Y. and Moon S.S. (2001).Isolation and in

vivo and in vitro antifungal activity of phenylacetic acid and sodium phenyl acetate

from Streptomyces humidus.Appl Environ Microbiol. 67: 3730-3745.

J

Jayaraman R. (2009). Antibiotic resistance: an overview of mechanisms and a

paradign shift. Current Science.96: 1475-1482.

JinenezJ. T., Sturdikova M. and Sturdik E. (2009).Natural products of marine origin

and their perspectives in the discovery of new anticancer drugs.ActachimicaSlovaca.2:

63-74.

K

Khamna S., Yokota A., Peberdy J. and Lumyong S. (2009).Antifungal activity of

Streptomyces spp. Isolated from rizosphere of Thai medicinal plants. Intern J Integr

Biol. (6) 3: 143-147.

Kieser T., Bibb M. J., Buttner M. J., Chater K F. and Hopwood D. A. (2000).

Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation, Norwich, UK: 613.

Kroiss J, Kaltenpoth M, Schneider B, Schwinger MG, Hertweck C, Maddula RK,

Strohm E and Svatos A. (2010). Symbiotic Streptomycetes provide antibiotic

combination prophylaxis for wasp offspring. Nat Chem Biol. 6(4):261-3.

L

Levy S. B. and Marshall B. (2004). Antibacterial resistance.Worldwide causes,

challenges and responses. NatureMedecine. 10: 122-129.

Loucif K. (2011). Recherche de substances antibactériennes à partir d’une collection

de souches d’actinomycètes. Caractérisation préliminaire des molécules bioactives.

Mémoire de Magister en Microbiologie. Université Mentouri-Constantine.


40

Lozniewski A. and Rabaud C. (2010). Résistance bactérienne aux antibiotiques.

Fiche conseil pour la prévention du risqué inféctieux. Centre de Coordination de lute

contre les infections Nosocomiales-Sud Est.

Ludwig W., Euzéby J. and Whitman W.B. (2012).Taxonomic outline of the phylum

actinobacteria.In Beregy’s Manual of Systematic Bacteriology.5 :29-31.

M

Madigan M. T and Martinko J.M. (2007). Biologie des microorganismes. Pearson

Education France, 11eédition: 331-423, 686-718.

Marinelli F. (2009). Antibiotics and Streptomyces: the futur and antibiotic discovery.

Microbiology today.2: 20-23.

Mc Bride M.J. and Ensign J.C. (1986) Effect of intracellular trehalose content on

Streptomyces griseus spores. J Bactriole. 169(11): 4995-5001.

Melouah O. (2015). Production et extraction de quelques principes actifs isolés à

partir des actinomycètes. Mémoire de Master Académique, Université Kasdi Merbah

Ouargla.

Miguelez, E.M., Hardisson, C., and Manzanal, M.B. (2000). Streptomycetes: a new

model to study cell death. IntMicrobiol 3: 153–158. Molle, V., and Buttn.

Mukhtar T. A., Koteva K. P., Hughes D. W., Wright G.D. (2001).Vgb from

Staphylococcus aureusi nactivates streptogramin B antibiotics by an elimination

mechanism, not hydrolysis. Biochemistry. 40: 8877-86.

O

Ohnishi Y., Ishikawa J., Hara H., Ikenoya M., Ikeda H., Yamashita A., Hattori

M., Horinouchi S. (2008).Genome sequence of the streptomycin-producing

microorganism Streptomyces griseus IFO 1350. J. Bacterial. 190 (11):4050-60.

P

Prescott L.M., Harley J.P. and Klein D.A. (2007). Microbiologie. De Boek &

Larcier, Bruxelle: 805-825.

S

Sanglier J.J. and TrujilloM. (1997). Substances bioactives produites par les

actinomycetes et stratégie de sélection de souches. Bull Soc Fr Microbiol. 12: 13.


41

Sardi P., Saracchi M., Petrolini B., Borgonovi G.E. and Merli S. (1992). Isolation

of endophitic Streptomyces strains from surface-sterilized roots. Appl. Env. Microbiol.

58(8), 2691-2693.

Smaoui S. (2010). Purification et caractérisation de biomolécules à partir de

microorganismes nouvellement isolés et identifiés. Thèse de Doctorat en Génie de

Procédés et Environnement Université de Toulouse. France. 251p.

Stackebrandt E. and Schumann P. (2006). Introduction to the Taxonomy of

Actinobacteria, dans: Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.,

Stackebrandt E. Prokaryotes. Springer Science, Business Media, LLC edition New

York, USA: 297-321.

T

Tortorano A. M., Cabrini E. and Viviani M. A. (1979). Sensibilité in vitro des

levures à cinq antifongiques. Comparaison de deux méthodes C. M. I en gélose et

méthode des disques. Bull. Soc. Fr. Myc. Med. 8: 69-74.

V

Vonothini G., Murugan M., Sivakumar K. and Sudha S. (2008).Optimization of

protease production by an actinomycete Strain, PS-18A isolated from an estuarine

shrimp pond. AfrJ Biotechnol. 7(18): 3225-3230.

W

Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H. Vickers J. C., Alderson G.,

Sneath P. H. A., Sackin M. J. et al. (1983b).A probability matrix for identification

ofsome streptomycetes.J Gen Microbiol.129: 1815-18.

Williams S.T., Goodfellow M. and Alderson G. (1989). Genus Streptomyces, dans:

Williams S.T., Sharpe M.E. et Holt J.H. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology

(volume 4). Willliams& Wilkins, USA: 2452-2492.

Williams S. T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E. M. H., Sneath P. H. A.

and Sackin M. J. (1983a) Numerical classification of Streptomyces and related

genera. J Gen Microbiol.129: 1743-1813.

Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H. Vickers J. C., Alderson G.,

Sneath P. H. A., Sackin M. J. et al. (1983).A probability matrix for identification of

some streptomycetes. J Gen Microbiol.129:1815-1830.


42

X

Xu LH., Li QR. and Jiang CL. (1996). Diversity of soil actinomycetes in yunnan,

China. Appl. Environ. Microbiol.62: 244-248.

Y

Yala D., Merad A. S., Mohamed D. and OuarKorich M. N. ( 2001).Classification

et mode d’action des antibiotiques. Medecine de Maghreb. N° 91.

Z

Zouaghi A. (2007). Optimisation de la production de l’Oxytétracycline par

Streptomyces rimosus. Mémoire d’Ingéniorat. Université 7 Novembre de Carthage.

Annexe

Annexe 1

1. Composition de milieux de cultures

ISP 2 + CaCo3

Extrait de levure…………………………… 4 g

Extrait de malt…………………………….. 10 g

Glucose…………………………………….. 4 g

CaCo3……………………………………… 1 g

Agar……………………………………….. 20 g

Eau distillée……………………………… 1000 ml

pH = 7,3

Milieu AF

Extrait de Malt…………………………… 10 g

Extrait de levure………………………….. 4 g

Glucose…………………………………… 2 g

NaCl……………………………………… 2,5 g

CaCO3……………………………………. 1 g

Agar……………………………………… 15 g

Eau distillée qsp……………………….. 1000 ml

pH = 7,0

Muller Hinton

Extrait de viande…………………………… 2 g

Hydrolysat acide de caséine………………. 17,5 g

Amidon…………………………………….. 1,5 g

Agar………………………………………… 10 g

Eau distillée…………………………… 1000 ml

pH = 7,5

Chapman

Tryptone……………………………………… 05 g

Extrait de levure……………………………… 03g

Extrait de viande……………………………... 03 g

Chlorure de sodium………………………….. 70 g

Peptone bactériologique……………………….10 g

Mannitol…………………………………….....10 g

Rouge phénol………………………………...0, 05g

Agar…………………………………………… 18 g

Eau distillée............................................….1000 ml

pH = 7,4

Hektoen

Protéose peptone……………………………… 12 g

Extrait de levure………………………………. 03 g

Chlorure de sodium…………………………… 05 g

Thiosulfate de sodium………………………… 05 g

Sels biliaires…………………………………… 09 g

Citrate de fer et d’ammonium……………….....1,5g

Salicine………………………………………... 02 g

Lactose………………………………………… 02 g

Saccharose……………………………………... 12 g

Eau distillée…………………………………. 1000ml

pH = 7,6

GN

Extrait de levure…………………………….. 2g

Extrait de viande……………………………. 1g

Peptone……………………………................ 5g

NaCl…………………………………………. 5g

Agar………………………………………….. 5g

Eau distillée……………………………….. 1000ml

pH = 7,4

PDA

Glucose……………………………………….20g

Pomme de terre………………………………200g

Eau distillée…………………………………1000ml

Annexe 2

1. Préparation de la solution 0,5 de Mc Farland

1.1. Préparation de la solution 0,5 de Mc Farland.

0,6 ml Solution de BaCl2 à 1 %.

99,4 ml Solution de H2SO4 à 1 %.

1.2 Conditions de conservation de la solution 0, 5 de Mc Farland.

l’obscurité

Température de conservation : 20-25 °C

Durée de conservation : 6 mois

2. Polarité des solvants utilise

Solvant Polarité

Acétate d’éthyle 4.4 Intermédiaire

Butanol 1 - Polaire

n-hexane 0.1 Apolaire

Méthanol 5.1 Polaire

Toluène 2.4 Apolaire

Résumé

Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la recherche de substances

antibactériennes à partir de la souche d’actinomycète SOR1. L’activité

antibactérienne des souches antagonistes a été mise en évidence envers deux bactéries

à coloration de Gram positive (S. aureus, B. subtilis), et quatre bactéries à coloration

de Gram négative (E. coli, P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter) et six

champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis

cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp). Elle a été réalisée par

deux techniques d’antagonisme (la technique des cylindres d’agar et celle des disques

de diffusion par fermentation liquide et solide). La souche SOR1 n’a pas d’activité

antibactérienne avec la bactérie P. aeruginosa, et a montré une activité sur les autres

bactéries-test soit par la technique des cylindres d’agar ou des disques de diffusion.

Les grandes zones d’inhibition sont enregistrées avec les bactéries B. subtilis (31±2

mm) avec l’extrait de toluène, Enterobacter (28,3± 1.52 mm) avec l’extrait

butanolique et K.oxytoca (29,3 ±2.08 mm) avec le méthanol. Par conter la souche

SOR1 a montré une activité antimicrobienne avec les champignons (Ascochyta rabiei,

Botrytis cinerea) par la technique des cylindres d’agar et la technique des disques de

diffusion. Les résultats obtenus ne détectent que la meilleure extraction des molécules

bioactives produite par la souche SOR1 c’est l’extraction par la technique des

disques de diffusion par fermentation liquide, le meilleure milieu est le ISP2 et le

butanol, acétate d’éthyle sont les meilleures solvants d’extraction.

Mots clés : Actinobactéries, antagonisme, solvants organiques, substances

antibactériennes.

: الملخص

خلال هذا العمل ، كنا مهتمين بالعثور على المواد المضادة للبكتيريا من سلالة

Actinobacteries SOR1 . اثنين وقد تجلى هذا النشاط المضاد للبكتيريا سلالات العدائية ضد

,E. coli)الجراثيم سلبية الغرام أربعةو، (S. aureus, B. subtilis )ماالبكتيريا إيجابية الجرمن

P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter ) وستة الفطريات الممرضة للنبات(Ascochyta

rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea, Trichoderma sp, Fusarium oxysporum,

Penicillium sp .) والأقراص انتشار عن أغارتقنية اسطوانة )عن طريق تقنيتين وقد نفذت

نشاط على عدم وجود أي .ليسا لها أي تأثير ما يدل غ SOR1(. طريق التخمير السائل والصلبة

و في كلتا البكتيريا مع باقي أظهرت النشاط و لكنها ، ,P. aeruginosa مضاد للجراثيم مع بكتيريا

ر كبيرآي ذات اكبر قط كبيرةالمناطق ال سجلت. "تقنية القرص نشر أجار أو اسطوانة" نالتقنيتي

Toluène التولوينو دلك مع المذيب العضوي ( مم 31 ±2) B. subtilis تثبيط البكتيريا معل

المذيب العضوي مع( ملم 2..3 ±1.52) Enterobacterالأمعائية و كذلك مع البكتيريا

SOR1أظهرت . مع الميثانول ملم ..2± 3..2ربقط K.oxytoca أيضاو . butanolلتا نوبي

بواسطة تقنية ( Ascochyta rabiei, , Botrytis cinerea)ط البكتيري مع الفطريات النشا

شاراسطوانات أجار والأقراص ت تقنية أقراص أن تالنتائج المتحصل عليها كشف. الان

SOR1ستخرا الجيياات الحيوية النشطة التي تنتجها سلالة الانتشار هي أفضل تقنية لا

أما بالنسبة الى كل من . ISP2هو أحسن وسط حيوي ئل، عن طريق التخمير السا يستخر

butanol ،acétate d’éthyle هي أفضل مذيبات الاستخلاص.

.الأكتينوميسيتات ، العداء ، المذيبات العضوية ، المواد المضادة للبكتيريا :الكلمات المفتاحية

Nom : SAOUDI

Prénom : Safa

Nom : LAIB

Prénom : Souheyr

Date de soutenance :

14 / 06 / 2016

Thème



Résumé

Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à la recherche de substances antibactériennes

à partir de la souche d’actinomycète SOR1. L’activité antibactérienne des souches antagonistes a

été mise en évidence envers deux bactéries à coloration de Gram positive (S. aureus, B. subtilis), et

quatre bactéries à coloration de Gram négative (E. coli, P. aeruginosa, et K.oxytoca, Enterobacter)

et six champignons phytopathogènes (Ascochyta rabiei, Alternaria alteranata, Botrytis cinerea,

Trichoderma sp, Fusarium oxysporum, Penicillium sp). Elle a été réalisée par deux techniques

d’antagonisme (la technique des cylindres d’agar et celle des disques de diffusion par fermentation

liquide et solide). La souche SOR1 n’a pas d’activité antibactérienne avec la bactérie P.

aeruginosa, et a montré une activité sur les autres bactéries-test soit par la technique des cylindres

d’agar ou des disques de diffusion. Les grandes zones d’inhibition sont enregistrées avec les

bactéries B. subtilis (31±2 mm) avec l’extrait de toluène, Enterobacter (28,3± 1,52 mm) avec

l’extrait butanolique et K. oxytoca (29,3 ±2,08 mm) avec le méthanol. Par conter la souche SOR1 a

montré une activité antimicrobienne avec les champignons (Ascochyta rabiei, Botrytis cinerea) par

la technique des cylindres d’agar et la technique des disques de diffusion. Les résultats obtenus ne

détectent que la meilleure extraction des molécules bioactives produite par la souche SOR1 c’est

l’extraction par la technique des disques de diffusion par fermentation liquide, le meilleure milieu

est le ISP2 et le butanol, acétate d’éthyle sont les meilleures solvants d’extraction.

Mots clés : Actinobactéries, antagonisme, solvants organiques, substances antibactériennes.

Laboratoire de recherche : Laboratoire de Microbiologie. Faculté des Sciences Exactes et

Sciences de la Nature et de la Vie. Université Larbi Ben M’hidi Oum-el- Bouaghi.

Devant le jury

Présidente : Mme CHETTIBI F M.C.B. Université OEB

Rapporteur : Mme AOUAR Lamia M.C.A. Université OEB

Examinateur : Mr MEDJOUDJ H. M.C.B. Université OEB

Production et extraction des molécules bioactives à partir ...

Documents

Transcript of Production et extraction des molécules bioactives à partir ...