producteurs de β-lactamase AmpC ou … · étape, la procédure pour l’isolement de ces E. coli....

Référence : ANSES/LSAL/MATBR/15-01 version02

Méthode d’analyse en sécurité sanitaire des aliments

RÉFÉRENCE : ANSES/LSAL/MATBR/15-01- Version 02 mois année : 10/2015

Recherche d’Escherichia coli

producteurs de β-lactamase AmpC

ou carbapénèmases dans les

viandes fraiches

Le présent document est, sous sa forme électronique, mis à la disposition des

utilisateurs en tant que méthode d’analyse. Ce document est la propriété de l’Anses.

Toute reproduction, qu’elle soit totale ou partielle, n’est autorisée qu’à la condition

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ANSES/PR3/7/01-05 [version a]

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© Anses – 14, rue Pierre et Marie Curie - 94701 Maisons-Alfort Cedex



Historique de la méthode

Une méthode peut être mise à jour afin de prendre en compte des modifications.

Une modification est considérée comme majeure dès lors qu’elle concerne des parties clés ou le fond même de la méthode, dont la prise en compte est susceptible d’améliorer significativement la portée ou le résultat de la méthode d’analyse. Une modification majeure induit en général des adaptations importantes. La méthode ainsi modifiée a fait l’objet d’une nouvelle validation.

Une modification est considérée comme mineure si elle apporte des précisions utiles ou pratiques, reformule les propos pour les rendre plus clairs ou plus précis, rectifie des erreurs bénignes. Les caractéristiques de performance de la méthode ainsi améliorée ne sont pas modifiées; elle n’a pas fait l’objet d’une nouvelle validation.

Le tableau ci-dessous récapitule l’historique des versions de la présente méthode.

Version Nature des

modifications Date Principales modifications

V01 14/09/2015 Version initiale

V02

Modifications

suites à

enquête

publique

Anses

12/10/2015 Incubation 44±0.5°C selon protocole LRUE-AR

Corrections erreurs listes des matériels et consommables

V03

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Avant-propos

La présente méthode a été développée par :

L’Anses - Laboratoire de Sécurité des Aliments, unités LCSV, SEL, MATBR.

Laboratoire National de Référence de la résistance aux antimicrobiens-site de Maisons-Alfort

Adresse : 14 rue Pierre et Marie Curie 94701 Maisons-Alfort Cedex

Contact : [email protected]

mailto:[email protected]

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Sommaire

Introduction ......................................................................................................................................................... 5

Avertissements et précautions de sécurité ..................................................................................................... 6

1 Objet et domaine d'application ............................................................................................................ 7

2 Documents de référence ...................................................................................................................... 7

3 Termes, sigles et définitions ................................................................................................................ 7

4 Principe de la méthode ......................................................................................................................... 8

5 Réactifs ................................................................................................................................................... 8 5.1 Eau…………………………………………………………………………………………………………………8

5.2 Consommables…………………………………………………………………………………………………..8

5.3 Souches contrôles………………………………………………………………………………………………9

6 Appareillage et matériels ...................................................................................................................... 9

7 Échantillons ......................................................................................................................................... 10 7.1 Critères d’acceptation des échantillons à réception……………………………………………...…10 7.2 Conditions d’acceptation pour la mise en analyse.. .................................................................. .... 10 7.3 Conservation des échantillons avant analyse……………………………………………………………10

8.1 Préparation des échantillons pour analyse ...................................................................................... 10 8.2 Étape 2 ................................................................................................................................................ 112

9 Résultats .............................................................................................................................................. 13 9.1 Contrôle qualité ................................................................................................................................... 13 9.2 Calculs et expression des résultats .................................................................................................. 14

10 Caractéristiques de performances de la méthode ........................................................................... 15

Annexe 1…………………………………………………………………………………………………………..16-18

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Introduction

Cette méthode a été développée et validée par le LRUE-RA (DTU, Danemark), assisté du Federal Institute for Risk Assessment (BfR) en Allemagne (1, 2). Elle a été transposée en France en 2015 par le LNR-RA. Elle est applicable dans le cadre des plans de surveillance de la résistance aux antibiotiques de certaines bactéries sentinelles et zoonotiques mis en place chaque année par la Direction Générale de l’Alimentation pour répondre à la décision européenne 2013/652/UE (4)

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Avertissements et précautions de sécurité

Il convient que l'utilisateur de la présente méthode connaisse bien les pratiques courantes d’un laboratoire de microbiologie. Il incombe à l'utilisateur d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de s'assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

Il est essentiel que les manipulations conduites conformément à la présente méthode soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation appropriée.

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1 Objet et domaine d'application

La nouvelle législation concernant la surveillance de la résistance aux antibiotiques des bactéries zoonotiques et commensales (décision 2013/652/UE) [4] impose depuis 2015 la recherche sélective dans les viandes prélevées à la distribution des E. coli producteurs de béta-lactamase à spectre étendu (BLSE) et de céphalosporinase (AmpC). Sur la base du volontariat, les états membres peuvent également rechercher les E. coli producteurs de carbapénèmase. Le laboratoire de référence de l’Union Européenne a développé et validé une méthode [1] qui détaille, étape par étape, la procédure pour l’isolement de ces E. coli.

Le protocole ci-dessous, décrit la méthodologie de détection des E. coli BLSE, AmpC et producteur de carbapénèmase dans les viandes prélevées à la distribution dans le cadre de la directive zoonose 2003/99/CE [5].

2 Documents de référence

[1] Méthode LRUE DTU FOOD – Isolation of ESBL, AmpC and carbapenemase producing E. coli from fresh meat – Version 2 – Décembre 2014. http://www.crl-ar.eu/233-protocols.htm

[2] Méthode LRUE DTU FOOD – Validation of selective MacConkey agar plates supplemented with 1 mg/L cefotaxime for monitoring of ESBL and AmpC producing E. coli in meat and animals – Version 1 – Novembre 2014. http://www.crl-ar.eu/233-protocols.htm

[3] Méthode LRUE DTU FOOD – Validation of selective and indicative agar plates for monitoring of carbapenemase-producing E. coli – Version 2 – Janvier 2015. http://www.crl-ar.eu/233-protocols.htm

[4] Décision d’exécution de la commission du 12 novembre 2013 concernant la surveillance et la présentation de rapports relatifs à la résistance aux antimicrobiens chez les bactéries zoonotiques et commensale (2013/652/EU) – L 303/26-L303/39

[5] Directive 2003/99/CE du parlement Européen et du Conseil du 17 novembre 2003 sur la surveillance des zoonoses et agents zoonotiques, modifiant la décision 90/424/CEE du conseil et abrogeant la directive 92/117/CEE du conseil – Journal officiel n° L 325 du 12/12/2033 p0031-0040.

3 Termes, sigles et définitions

- ESBL : Béta-Lactamase à Spectre Etendu. - AmpC : Céphalosporinase. - DLC : Date Limite de Consommation. - LNR-RA : Laboratoire National de référence de la résistance antimicrobienne (Anses) - LRUE-RA : Laboratoire de Référence de l’Union Européenne de la résistance

Antimicrobienne (DTU, Lyngby, Danemark, http://www.crl-ar.eu/143-introduction.htm).

http://www.crl-ar.eu/143-introduction.htm

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- MATBR ; Mission Antiobiorésistance, Anses-Laboratoire de sécurité des aliments, site de Maisons-Alfort.

4 Principe de la méthode

Cette méthode a pour objectif de détecter la présence d’E. coli producteur de BLSE, d’AmpC et/ou de carbapénèmases.

Plusieurs étapes sont nécessaires.

- Critères d’acceptation des échantillons à réception. - Enrichissement. - Isolement sur trois milieux sélectifs chromogéniques. - Etape de confirmation. - Deuxième étape de confirmation. - Transmission à l’ANSES Maisons-Alfort (MATBR) de la souche pour caractérisation.

5 Réactifs

Avertissement : Des appellations commerciales ou fournisseurs peuvent être mentionnés dans le

descriptif des produits nécessaires à la mise en œuvre de la présente méthode. Cette information est

donnée à l'intention des utilisateurs de la méthode et ne signifie nullement que l'Anses recommande

l'emploi exclusif de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré

qu'ils conduisent aux mêmes résultats.

5.1 Eau

Sans objet.

5.2 Consommables.

- Oeses stériles de 10 µL. - Pinces - Scalpels - Sachets stériles pour enrichissement et conservation des échantillons - Géloses en boite de pétri au sang frais. - Solution saline à 0,85%. - Témoin 0.5 de la gamme de Mac Farland. - Eau peptonnée tamponnée. - Milieu ChromidID CARBA en boite de pétri (commercialisé prêt à l’emploi par la société

Biomerieux). - Milieu ChromidID OXA-48 en boite de pétri (commercialisé prêt à l’emploi par la société

Biomerieux). - Milieu Mac Conkey + 1 mg/L de céfotaxime (CTX) en boite de pétri (commercialisé prêt à

l’emploi par la société Tritium). - Milieu TBX en boite de pétri. - Tubes de conservation et transport des bactéries

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5.3 Souches de contrôles

Les souches de contrôles positifs BLSE +, CARBA + et OXA 48 + seront fournies par le LNR-

RA.

La souche de contrôle négative a pour référence : E. coli ATCC 25922.

6 Appareillage et matériels

Avertissement : Des appellations commerciales ou fournisseurs peuvent être mentionnés dans le

descriptif des appareils et matériels nécessaires à la mise en œuvre de la présente méthode. Cette

information est donnée à l'intention des utilisateurs de la méthode et ne signifie nullement que

l'Anses recommande l'emploi exclusif de ces matériels. Des matériels équivalents peuvent être

utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.

- Balance. - Néphélomètre. - Stomacher - Etuve à 37°C +/- 1°C. - Etuve à 35°C +/- 1°C. - Etuve à 44°C +/- 0.5°C. - Réfrigérateur entre +2°C et 5°C pour la conservation des échantillons.

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7 Échantillons

7.3 Conservation des échantillons avant analyse

Avant mise en analyse, les échantillons doivent être conservés dans les conditions suivantes :

Réfrigération entre +2°C et +5°C.

8 Mode opératoire

8.1 Préparation des échantillons pour analyse (Voir diagramme des manipulations)

Réaliser les prises d’essai homogènes en surface, en périphérie et au cœur de la viande à analyser

Prendre garde au strict respect des durées d’incubation. En cas d’absolue nécessité, les enrichissements peuvent être laissés à température ambiante (dans la limite de quelques heures) et les isolements au réfrigérateur (plusieurs jours).

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8.2 Étape 2 (Voir diagramme des manipulations)

Isolement à l’aide d’une oese stérile de 10 µL à partir du milieu d’enrichissement sur trois milieux différents :

- Milieu ChromidID CARBA en boite de pétri. - Milieu ChromidID OXA-48 en boite de pétri. - Milieu Mac Conkey + 1 mg/L de céfotaxime (CTX) en boite de pétri.

Incuber selon les recommandations du fournisseur (température et temps d’incubation).


9 Résultats

9.1 Contrôle qualité

- Réaliser un blanc par jour d’analyse sur 225mL d’eau peptonée tamponnée.

- Contrôles des milieux de culture à l’aide des souches témoins, à faire à chaque analyse ou à chaque changement de lot de milieu sélectif (ChromID OXA-48, ChromID CARBA, Mac Conkey + céfotaxime)

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9.2 Calculs et expression des résultats

Les résultats doivent faire apparaître les éléments suivants :

- Présence ou absence d’E. coli producteur de BLSE/AmpC dans la prise d’essai. - Présence ou absence d’E. coli producteur de carbapénèmase-OXA-48 dans la prise

d’essai. - Présence ou absence d’E. coli producteur de carbapénèmase dans la prise d’essai.

BLSE/AmpC Carbapénèmase Oxa-48 Carbapénèmase

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10 Caractéristiques de performances de la méthode

Les caractéristiques des performances de la méthode ont été établies par le LRUE-RA.

La documentation est consultable sur le site internet du LRUE-AR :

http://www.crl-ar.eu/233-protocols.htm

http://eurl-ar.eu/data/images/tc_sept-2014/tc2014_w3_day%201%20introduction%20to%20validation.pdf

http://www.crl-ar.eu/233-protocols.htm



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Annexe 1

Compositions des milieux

La fiche de composition des milieux de culture est disponible auprès des fournisseurs.

La composition et la fabrication à partir de milieux déshydratés indiquée ci-dessous est un exemple.

Se conformer aux instructions des fournisseurs pour la fabrication de ces milieux.

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Milieu TBX Pour le dénombrement des Escherichia coli ß-D-glucuronidase positive dans les produits alimentaires.

Composition pouvant être modifiée pour 1 litre de milieu : Tryptone : 20,0 g Sels biliaires n°3 : 1,5 g BCIG : 0,075 g Agar agar: 9,0 g pH du milieu prêt à l'emploi à 25°C : 7,2 ± 0,2.

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