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PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE MICROBIANO CON CAPACIDAD AMILOLITICA A PARTIR DE UN PROCESO DE
COMPOSTAJE DE RESIDUOS DE LECHUGA
Laura Carolina Barrera Beltrán Natalia Charry Uribe
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.
Febrero de 2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la
moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia”.
PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE MICROBIANO CON CAPACIDAD AMILOLITICA A PARTIR DE UN PROCESO DE
COMPOSTAJE DE RESIDUOS DE LECHUGA
Laura Carolina Barrera Beltrán Natalia Charry Uribe
APROBADO
_______________________________ ____________________________ María Mercedes Martínez Jaime Augusto Casas Microbióloga M. Sc Químico Directora Codirector _______________________________ Edna Viviana Gutiérrez Microbióloga Industrial Asesora _______________________________ _____________________________ Ivonne Gutiérrez Jacinto Rodríguez Jurado Jurado
PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE MICROBIANO CON CAPACIDAD AMILOLITICA A PARTIR DE UN PROCESO DE
COMPOSTAJE DE RESIDUOS DE LECHUGA
Laura Carolina Barrera Beltrán Natalia Charry Uribe
APROBADO
______________________________ _____________________________ Dra. Ángela Umaña Muñoz Dra. Janeth Arias Decana Académica Bacterióloga M. Sc Facultad de Ciencias Directora de Carrera
DEDICATORIA
Agradezco a Dios por permitirme llegar a este punto de mi vida, especialmente a mis padres por su esfuerzo para educarme, por su apoyo incondicional e incluso por su participación en este trabajo,
a mi hermano por su apoyo incondicional y por creer en mi.
A mi familia y amigos por su confianza y apoyo, pero sobre todo por estar ahí siempre en los momentos difíciles.
Laura Barrera
i
TABLA DE CONTENIDO
Número Título Página
Lista de tablas
Índice de figuras
Lista de anexos
Resumen
1 Introducción 1
2 Marco teórico 3
2.1 Lechuga (Lactuca sativa) 3
2.1.2 Ciclo de cultivo 3
2.1.3 Requerimientos Fisicoquímicos 4
2.1.4 Variedades 4
2.1.5 Aportes Nutricionales 5
2.2 Compost 6
2.2.1 Factores determinantes del compostaje 7
2.2.2 Características fisicoquímicas 12
2.2.3 Calidad del compost 13
2.3.1 Materia orgánica 14
2.3.2 Enzimas en procesos de compost 16
3 Justificación 18
4 Objetivos 19
4.1 Objetivo General 19
4.2 Objetivos específicos 19
5 Metodología 20
5.1 Recolección de las muestras 20
5.1.1 Sitio de muestreo 20
5.1.2 Recolección de muestras 20
5.2 Procesamiento de muestras 20
5.2.1 Fase I: Caracterización del proceso de compostaje 20
5.2.1.1 Temperatura y pH 21
5.2.1.2 Actividad enzimática del compost 21
5.2.1.3 Evaluación de dos métodos para extracción de amilasas 21
5.2.1.4 Cuantificación de azúcares reductores mediante la técnica de
ii
Somogyi- Nelson 22
5.2.1.5 Cuantificación de la biomasa microbiana presente en el compost 23
5.2.1.6 Determinación de materia orgánica 23
5.2.2 Producción del inoculante mixto 24
5.2.2.1 Aislamiento primario de cepas amilolíticas 24
5.2.2.2 Aislamiento secundario y selección 25
5.2.3 Conservación de cepas 25
5.2.4 Selección de cepas por antagonismo 26
5.2.5 Curvas de crecimiento 27
5.2.5.1 Elaboración de pre- inóculo 27
5.2.5.2 Fermentación discontinua 28
5.2.6 Curva de crecimiento del inoculante mixto 28
5.2.7 Producción del inoculante mixto 29
5.3 Evaluación del inoculante mixto en campo 29
5.3.1 Variables evaluadas 29
5.3.1.1 Determinación de materia orgánica 30
5.3.1.2 Caracterización microbiológica del compost 31
5.4 Análisis de la información 31
6 Resultados y discusión 34
6.1 Caracterización del proceso de compostaje 34
6.1.1 Temperatura y pH 34
6.1.2 Seguimiento de la actividad amilolítica y biomasa de
Microorganismos amilolíticos en la pila 2 36
6.1.3 Cuantificación de MOT y COT 39
6.2 Fase I: Producción del inoculante mixto 40
6.2.1 Aislamiento de microorganismos amilolíticos termófilos 40
6.2.2 Selección de las cepas por antagonismo 44
6.2.3 Curvas de crecimiento 44
6.2.4 Curva de crecimiento del inoculante mixto 47
6.2.5 Fase II: Evaluación del inoculante mixto en campo 48
6.2.5.1 Comparación entre los dos métodos de extracción de amilasas 49
6.2.5.2 Cuantificación de la actividad amilolítica de las pilas tratamiento y
Control 52
6.2.5.3 Cuantificación de la biomasa amilolítica en las pilas tratamiento y
iii
Control 54
6.2.5.4 Cuantificación de los porcentajes de MOT y COT 55
6.2.5.5 Análisis de la temperatura y el pH 58
6.2.5.6 Características Fisicoquímicas obtenidas en los tratamientos 60
6.2.5.7 Calidad microbiológica del compost obtenido 62
7 Conclusiones 65
8 Recomendaciones 66
9 Bibliografía 67
iv
ÍNDICE DE TABLAS
Número Título Página
1 Composición nutritiva de la lechuga 6
(100 g porción comestible)
2 Composición química de la cascarilla de arroz 9
3 Parámetros a caracterizar en el abono según NTC 5167/04 12
4 Parámetros que permiten determinar la calidad del compost 13
5 Características morfológicas de las cepas con actividad amilolítica
obtenidas durante el asilamiento primario 41
6 Determinación semicuantitativa de la actividad amilolítica de
las cepas aisladas y purificadas. 43
7 Resultados de las pruebas de antagonismo realizadas
con las 5 cepas aisladas 44
8 Resultados %MOT al cabo del segundo día de compostaje
por vía húmeda y seca. 56
9 Características fisicoquímicas del compost obtenido durante
la fase II 62
10 Caracterización microbiológica del compost 63
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Título Página
1 Comportamiento de la temperatura en las Pilas de
compostaje 1 y 2 35
2 Comportamiento del pH de las Pilas de compost 1 y 2 35
3 Actividad amilolítica y biomasa amilolítica de la pila de
compost 2 37
4 Determinación de la materia orgánica presente en la Pila de
Compost 2 39
5 Microscopía de la cepa AA5 42
6 Microorganismos amilolíticos aislados de muestras de
Compost 43
7 Cuantificación individual de la actividad amilolítica de los
microorganismos aislados 45
8 Curva de Crecimiento de los microorganismos aislados, en medio
Almidón 1% (p/v) 46
9 Cuantificación de la Actividad Amilolítica y la biomasa del
Inoculante mixto 47
10 Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la
Pila con Inoculante luego de utilizar dos métodos de extracción
de amilasas 49
11 Comparación de los métodos de extracción enzimática para
cada uno de los tratamientos 50
12 Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila
Control luego de emplear dos métodos de extracción de
amilasas 51
13 Comparación estadística de las actividades amilolíticas entre pilas
tratamiento y control 53
14 Recuento de biomasa amilolítica en las Pilas Control y con
Inoculante 54
15 Comportamiento la materia orgánica (% m/m) en las pilas
vi
tratamiento y control 56
16 Carbono Orgánico Total presente en las pilas tratamiento
y control 58
17 Temperaturas alcanzadas por las pilas tratamiento y control
durante la Fase 59
18 Comportamiento del pH en las pilas Control y con Inoculante 60
vii
ANEXOS
Número Título Página
1 Composición de buffers Sorensen y Citrato- Fosfato 79
2 Composición de agar almidón 1%, sal ferrosa y agua- melaza 80
3 Curva de calibración para Somogyi- Nelson 81
4 Actividad enzimática 82
5 Correlación entre la biomasa y UA 84
6 Comparación de MOT entre tratamientos 85
7 Comparación del pH y la temperatura en los tratamientos
evaluados 88
RESUMEN
La Lactuca sativa o lechuga es una hortaliza que se siembra en regiones templadas,
ocupa poco espacio y posee un ciclo de crecimiento muy corto. Acorde con el último
estudio realizado por el DANE en el año 2003 se produjeron 9968,4 toneladas de
lechuga en Cundinamarca, des las cuales 647,9 toneladas fueron consideradas como
material residual.
Por medio del compostaje se busca disminuir el impacto ambiental que tienen los
residuos agrícolas, dentro de los desechos provenientes del cultivo de lechuga. El objeto
del estudio fue producir y evaluar u inoculante microbiano con capacidad amilolítica a
partir de un procesos de compostaje de residuos de lechuga.
Se llevó a cabo el aislamiento de cinco cepas amilolíticas termofílicas (AA1, AA2,
AA3, AA4 y AA5) que fueron aisladas a partir de las materias primas y que
evidenciaron una alta actividad amilolítica (entre 25000 y 41509 UA). Con dichas cepas
se produjo un inoculante mixto, que fue aplicado a la pila tratamiento.
Se evaluó el proceso de degradación de la materia orgánica presente en las pilas de
compost tratamiento y control, a partir de parámetros como temperatura, pH, actividad
amilolítica, recuento en placa de biomasa amilolítica termofílica, cuantificación de
materia orgánica y características fisicoquímicas.
Para determinar la actividad amilolítica presente en las pilas, se evaluaron dos métodos
de extracción de amilasas, observándose que el método que logró extraer mayor
cantidad de dichas enzimas fue el que emplea buffer citrato con valor de p< 0.001.
Al comparar el proceso de degradación de los dos tratamientos, se encontró que no hubo
diferencias estadísticamente significativas al final del proceso, con valores de p > 0.79
para el contenido de materia orgánica, de p > 0.254 para la actividad amilolítica, de p>
0.92 para pH y p> 0.79 para temperatura.
Al final de los procesos tratamiento y control, se obtuvo un compost con presencia de
Salmonella (< 0.59 NMP/ 4g para el control y 1,01 NMP/ 4g para el tratamiento) y
Escherichia coli (>2400 NMP/g para el control y 480 NMP/ g para el tratamiento); y
con características fisicoquímicas aceptadas por la NTC 5167 de 2004, como C/N 12 y
11 para control y tratamiento respectivamente y nitrógeno, fosforo y potasio > 1% en
los dos casos.
1
1. INTRODUCCIÓN
La lechuga Lactuca sativa es una hortaliza que se puede sembrar en las regiones templadas,
ocupa poco espacio y el ciclo de crecimiento es muy corto. Aporta a la dieta minerales como el
calcio, hierro, potasio, magnesio, sodio, azufre, aluminio, cobre, cobalto, silicio, selenio, circonio
y estroncio, vitaminas A, C, E, B1, B2 y B3, betacaroteno, fibra, aminoácidos como alanina,
cistina, histidina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, serina, tirosina y valina, lactucina, pectinasas
y ácidos como el ascórbico, cítrico, aspártico, glutámico, linoléico, oleico, málico, oxálico,
palmítico, esteárico y alfa- linoléico. Su alto porcentaje de humedad (95%) la hace un alimento
fácil de digerir.
Según el último estudio realizado por el DANE en el año 2003, en Colombia se produjeron
14.261 toneladas de lechuga al año, de las cuales el 69,9% fueron cultivadas en Cundinamarca
(9968,4 toneladas); de este 69,9% se distribuyeron 9320,4 toneladas, originando una pérdida de
647,9 toneladas (DANE, 2003; Velásquez et al., 2003).
Los residuos agrícolas provenientes de cultivos de lechuga, son generalmente considerados
basura, la cual puede ser quemada, llevada a los rellenos sanitarios de las ciudades o apilada. Sin
embargo por sus características nutricionales podría ser empleada para la producción de abono
por medio del proceso conocido como compostaje, el cual se basa en el tratamiento de los
residuos orgánicos, a través de un proceso de transformación que permite convertirla en un
producto de características físicas y químicas estables y limpio desde el punto de vista higiénico
y sanitario.
La importancia agrícola del compost no radica en su contenido de nutrientes (0.65% de
nitrógeno, 0.3% de P2O5 y 0.25% de K2O sobre materia húmeda), sino en su alto contenido en
materia orgánica activa, que oscila alrededor del 28%, y sus sustancias húmicas, así como su
importante aporte de oligoelementos, tales como el cobalto, cobre, magnesio, zinc, boro,
molibdeno, cuya influencia en el desarrollo de los cultivos se pone cada vez más de manifiesto,
ya que son componentes indispensables de la mayoría de las enzimas (López, 2002).
2
Este producto mejora las condiciones fisicoquímicas del suelo y también aporta poblaciones
microbianas que por medio de sus sistemas enzimáticos, degradan materia orgánica y la
mineralizan de manera que se generan productos inorgánicos solubles, los cuales también son
aprovechados por las plantas, mejorando la calidad de los cultivos. Al agregar compost al suelo,
se estimulan considerablemente las poblaciones microbianas, especialmente bacterias y hongos,
lo cual es muy importante ya que se acelera el proceso (Lee et al., 2003; Saebo y Ferrini., 2006;
Granados et al., 2003; Páez et al., 2000).
Para poder determinar la eficiencia de la degradación de la materia orgánica por parte de los
microorganismos, se toman como referencia las enzimas extracelulares producidas durante el
proceso de degradación de materia orgánica como amilasas, celulasas, proteasas, lipasas, entre
otras; igualmente, concentración de materia orgánica y carbono orgánico oxidable. Por esta
razón, hacer un seguimiento de la actividad enzimática en el compost y del proceso de
humificación resultan útiles indicadores para evaluar algunos parámetros de la calidad del
proceso de degradación.
3
2. MARCO TEORICO
2.1. Lechuga (Lactuca sativa)
La lechuga pertenece a la familia de las compuestas, originaria de la cuenca del Mar
Mediterráneo. Algunos reportes históricos indican que esta hortaliza era utilizada por los
egipcios 3000 años A.C., para extraer aceites de la semilla y también como alimento diario.
Es una planta herbácea anual, tolerante a las heladas (excepto cuando está próxima a la cosecha),
que prefiere las temperaturas frescas (15 – 20 °C), prácticamente sin tallo, de consistencia
carnosa, que según las variedades va a formar, o no, una cabeza de repollo en la parte central, de
colores de hoja variable (verde en distintas tonalidades, rojos, morados), también de aspecto de
hoja variable (lisa, mantecosa, rizada, crespa). Las raíces son densas y superficiales, alcanzando
una profundidad máxima de 60 cm, teniendo capacidad de regeneración de nuevas raíces,
aspecto importante pues hace posible el transplante (<Romeo, 2005 online >).
2.1.2. Ciclo de cultivo
En el ciclo de crecimiento se distinguen 3 fases, plántula, roseta y formación de la cabeza.
• Plántula: desde la emergencia de la semilla hasta que la planta tiene 4 hojas. Esta fase
dura entre 30 y 40 días.
• Roseta: desde que tiene 4 hojas hasta que tiene 12 hojas. Esta fase dura 20 días.
• Formación de la cabeza: después de 12 hojas hasta cabeza bien formada. Esta fase dura
20 días.
La siembra se hace en semillero o por siembra directa. En el primer caso, se hace luego de 20
días de la germinación, cuando la planta cuenta con 8 cm de altura. La distancia de plantación
oscila entre 20 y 30 cm entre las filas, y otro tanto entre las plantas de la misma fila, dependiendo
del tamaño propio de la variedad (Block, 1998).
4
Antes de realizar la siembra, se adecúa el terreno removiendo parcial o totalmente el material
residual proveniente de la cosecha anterior. En el invernadero, se remueve totalmente la materia
orgánica (incluyendo raíces), mientras que en el terreno no cubierto sólo se remueven las hojas
residuales de lechuga. Luego de limpiar las camas, se aplica una capa de abono orgánico
proveniente de un proceso de compostaje de flores, además de una delgada capa de cascarilla de
arroz.
Debido a que la lechuga requiere una gran cantidad de agua, los cultivos deben regarse una vez
al día, sin embargo, en época de sequía o cuando la temperatura asciende demasiado, se hace
necesario hacer el riego dos veces (Block, 1998). En el caso de las lechugas conservadas en
invernadero, se cuenta también con riego por goteo, a través del cual se suministra agua varias
veces al día.
2.1. 3. Requerimientos fisicoquímicos
El agua es uno de los factores de crecimiento más importante de la lechuga ya que constituye el
95% de su peso, para un crecimiento continuo se debe proporcionar un contenido uniforme y alto
de humedad en el suelo durante todo el ciclo. Cuando se alcancen temperaturas altas, la
frecuencia de riego debe ser mayor (diaria) que el resto del año (una vez a la semana). La
deficiencia de humedad en el suelo, genera una detención en el crecimiento de la planta,
aumentando el contenido de fibras de las hojas, produciéndose plantas duras y de colores verde
oscuro (Romeo, 2005 <online >).
La producción de lechuga puede realizarse sobre una gran variedad de suelos, siendo preferidos
aquellos fértiles y ricos en nitrógeno, ligeros, con buen drenaje (que no presente
encharcamientos), con pH ideal entre 6.5 y 7.5 (Romeo, 2005 <online >).
2.1. 4. Variedades
Las variedades de la lechuga se pueden clasificar en diferentes grupos botánicos (Block, 1998).
5
• Romanas: No forman un verdadero cogollo, las hojas son alargadas, con bordes enteros
y nervio central ancho.
1. Romana: incluye la verde lisa, verde crespa, morada crespa y morada lisa; estas
variedades se siembran en el cultivo del cual se obtendrán los residuos para
realizar el compostaje. También se emplearán residuos de rúgula, romanesco,
colchina o col de bruselas, aunque en menores proporciones, debido a que la
cantidad producida de estos otros no es tan alta como la de lechuga.
2. Baby: en su inicio el tallo tiene forma de disco del que surgen las hojas formando
rosetas que posteriormente se acogollan. Esta variedad en especial forma cogollos
muy compactos. Su temperatura óptima de cultivo está entre los 15 y 25 °C. Su
ciclo de desarrollo dura 45 días; su estado óptimo de recolección es cuando el
cogollo está bien formado y compacto, si no se realiza el corte a tiempo tiende a
espigarse (Romeo, 2005 <online >).
• Acogolladas: Estas lechugas forman un cogollo apretado de hojas
1. Batavia
2. Mantecosa o Trocadero
3. Iceberg
(Romeo, 2005 <online >).
2.1. 5. Aportes nutricionales
La lechuga es un alimento que aporta muy pocas calorías, alto porcentaje de agua (90-95%),
folatos, vitaminas (cantidades apreciables de vitamina C), provitamina A o beta-caroteno (estas
dos últimas con acción antioxidante, relacionadas con la prevención de enfermedades
cardiovasculares e incluso ciertos tipos de cáncer), minerales (potasio, magnesio) y fibra
(necesaria para el buen funcionamiento intestinal) (tabla 1). Las hojas externas de color más
oscuro son más nutritivas que las blanquecinas del interior. La lechuga romana cultivada al aire
libre es la más rica en vitaminas (Woldford, 2003).
6
Tabla 1. Composición nutritiva de la lechuga (100g porción comestible).
Kcal H2O Carbohidratos
(g)
Fibra
(g)
Potasio
(mg)
Magnesio
(mg)
Carotenos
(mg)
Vit C
(mg)
Folatos
(mg)
14 1.4 1.5 240 12 59.17 12 34
Fuente: Block, 1998.
Su riqueza en minerales, especialmente potasio, que es necesario para mantener un nivel
adecuado de líquidos en el cuerpo, junto con el calcio y el fósforo la hace especialmente
adecuada para el correcto bienestar de los huesos. Presenta además una serie de oligoelementos
como el selenio, un antioxidante que tiene un papel fundamental en la prevención de cierto tipo
de cánceres, como el de colon, próstata o pulmones (Woldford, 2003).
Contiene muchos aminoácidos necesarios para la formación de las proteínas, algunas, como la
alanina, a veces necesarias para la construcción del tejido muscular y nervioso, otras, como la
glicina, para el correcto funcionamiento del sistema inmunológico. Posee vitaminas C y E, pero
sobre todo, es rica en betacaroteno, que el hígado trasforma en vitamina A (Drotleff, 2006)
2.2. Compost
El compostaje es un método utilizado para transformar los desechos biodegradables, incluyendo
plásticos biodegradables, residuos sólidos urbanos, alimentos para animales y residuos agrícolas
e industriales, en productos útiles para mejorar el suelo. El compostaje acelera la degradación de
materia orgánica heterogénea por la acción de diferentes poblaciones microbianas que trabajan
en conjunto y que se encuentran bajo condiciones controladas (Gangjyal et al., 2007).
Dentro del proceso de compostaje, los microorganismos primarios que intervienen son bacterias,
hongos y actinomycetes produciendo enzimas extracelulares, como amilasas, lipasas y proteasas
que en pequeñas cantidades promueven actividad química catalizando la descomposición de
materia orgánica. No obstante, existen ciertos factores que pueden afectar el proceso de
compostaje como los factores ambientales, los microorganismos involucrados, el tipo de residuos
y su manejo (Dávila et al., 2002).
7
La materia orgánica junto con el abono mineral son necesarios, además de complementarlo. Por
ello, se recomienda la mezcla del compost con el abono químico. El abono proporciona al suelo
del cultivo la fertilidad química y el compost la estructura física y biológica, necesaria para que
se consigan las condiciones idóneas para el crecimiento de las plantas (López, 2002).
Los factores más importantes que afectan el éxito de la aplicación del compost para los
propósitos de la agricultura son el grado de estabilidad y la madurez. La aplicación de un
compost inestable o inmaduro puede inhibir la germinación de las semillas, reducir el
crecimiento de la planta, causar daños en los cultivos como fitotoxicidad en las plantas, o una
competencia por el oxígeno (Wu et al., 2000).
La biodegradación de materia orgánica es el principal proceso que envuelve la bioestabilización
de los residuos orgánicos, y es usualmente expresada en función de la biodisponibilidad de
materia orgánica; se define en términos de tasa o grado de descomposición de materia orgánica,
estando fuertemente relacionada con la tasa de actividad microbiana en el proceso de compostaje
(Said-Pullicino et al., 2007). Autores como Iannotti et al., (1994) y Lasardi et al., (1998) han
reportado que existe una fuerte relación entre la estabilidad del compost y la concentración de
carbono orgánico disuelto. Durante el compostaje, procesos tales como la solubilización llevada
a cabo por la degradación microbiana de la materia orgánica, síntesis bioquímica de compuestos
de bajo peso molecular son los responsables de los cambios en la concentración y composición
química de la materia orgánica disuelta (Said-Pullicino et al., 2007).
2.2.1 Factores determinantes del compostaje
Los factores que influyen en un proceso de compostaje son muchos y de gran importancia ya que
si no se manejan adecuadamente, se genera un desequilibrio que puede afectar drásticamente el
proceso, lo que tiene graves consecuencias en la obtención del producto deseado. Dichos factores
incluyen temperatura, pH y relación C/N, entre otros.
8
• Relación Carbono Nitrógeno (C/N)
El carbono y el nitrógeno son nutrientes muy importantes para los microorganismos en el
proceso de compostaje. En primer lugar, el carbono provee energía y el nitrógeno es usado para
la reproducción y la síntesis de proteínas. En general cerca de 25 veces más de carbono es
necesitado por un organismo comparado con la necesidad de nitrógeno por lo cual es necesario
tener una proporción adecuada de ambos elementos (25:1 – 30:1) (Sherman., 1999).
Las pérdidas de nitrógeno por volatilización durante el compostaje reducen el valor del abono
orgánico y constituye una importante perdida económica. La disponibilidad de carbono, el
tamaño de la partícula, el contenido de humedad y la aireación son factores que afectan la
volatilización del nitrógeno en el compost, ya que una alteración en estas variables puede
impedir que el nitrógeno se inmovilice en las células microbianas (Barrington et al., 2001).
Estudios realizados por Beuning et al., (2007) demuestran que el pH es un factor determinante en
la volatilización del nitrógeno en el compost, ya que afecta la denitrificación de la cual se
obtienen gases (amonio y amoniaco) que serán liberados a la atmósfera, aunque esto también
está ligado a la presencia de oxígeno, ya que condiciones anaeróbicas favorecen la producción de
dichos gases. Por otra parte, según Van Der Selt et al., (2006) la temperatura también interviene
en la volatilización del nitrógeno ya que a medida que esta aumenta, también aumenta la pérdida
del elemento (Van Der Selt et al., 2006).
El carbono es el elemento que define a la materia orgánica ya que es su principal componente,
aunque también contiene nitrógeno en menor proporción. La relación C/N considerada como
óptima al principio del proceso es de 20 a 30; y a medida que la materia orgánica es atacada y
descompuesta por los microorganismos va descendiendo la relación C/N hasta acercarse al valor
del humus de alrededor de 10:1 (Zhu, 2006).
Teniendo en cuenta que la lechuga y en general los residuos vegetales poseen una baja cantidad
de carbono (la lechuga tiene 44% p/p de carbono), es necesario nivelar la relación C/N. Para ello
es posible realizar mezclas con materiales como la cascarilla de arroz, paja, aserrín, hojas secas,
entre otros (Foru, 2003) que permiten mejorar la del material a compostar.
9
La cascarilla de arroz no presenta propiedades nutritivas significativas, contiene un alto
porcentaje de dióxido de silicio (SiO2) y su humedad es del 10% debido a su carácter hidrofóbico
(tabla 2). (Salgado, 1999).
Tabla 2. Composición química de la cascarilla de arroz
Componente Valor (% m/m)
SiO2 42.16
K2O 0.472
MgO 0.053
CaO 0.127
Fuente: Treviño y Gómez, 2003.
• Temperatura
Debido a que todas las reacciones que se llevan a cabo dentro del proceso de compostaje son
exotérmicas la temperatura es un buen indicador del proceso. La temperatura aumenta
rápidamente luego de la formación de las pilas, disminuyendo gradualmente a la vez que el
proceso de descomposición va terminando. El amplio rango de temperaturas que se manejan
hace que se encuentren diferentes grupos de microorganismos lo que facilita y aumenta el
proceso de descomposición. El compostaje ha mostrado ser factible cuando la temperatura
ambiente oscila entre los 20 y 30ºC (Marguesin et al., 2006)
La temperatura durante el proceso de compostaje aumenta conforme los microorganismos
realizan las actividades metabólicas para degradar la materia orgánica. Las altas temperaturas
son necesarias para lograr un compostaje efectivo ya que contribuyen sustancialmente a los altos
índices de degradación alcanzados en el proceso, pero temperaturas por debajo de los 20ºC, han
demostrado que causan la inhibición del proceso. Por otra parte, cuando la temperatura excede
los 60ºC se reduce la actividad de las poblaciones microbianas, es por esta razón que se
recomienda que la temperatura máxima se encuentre entre los 52 y los 60ºC (Liang et al., 2002)
10
Las altas temperaturas alcanzadas durante el proceso de compostaje (especialmente durante la
fase termofílica), así como del proceso, son factores que causan la muerte de los patógenos
aerobios más comunes como Salmonella sp. y Escherichia coli (Turner et al., 2004). Por otra
parte, estudios realizados por Boulter – Bitzer et al 2005, mostraron que en las pilas de compost
que alcanzaron temperaturas mayores a los 55 ° C, los fitopatógenos murieron.
La fase termofílica durante la cual se alcanzan estas altas temperaturas, es fundamental para
lograr la estabilidad y madurez del compost el cual será utilizado para aumentar la actividad
microbiana en el suelo (Boulter – Bitzer et al., 2005).
• Oxígeno
El compostaje aeróbico es el proceso de degradación que ocurre en presencia de oxígeno; es la
forma más rápida para producir un compost de buena calidad. El compostaje aeróbico es
ampliamente aceptado como vía para lograr la estabilización de la materia orgánica proveniente
de los residuos agrícolas y convertirla en un producto que pueda ser usado como abono para el
suelo (Liang et al., 2002). Los mecanismos empleados para llevar a cabo la aireación del
compost pueden ser manuales, utilizando una pala para mover toda la pila de compost, o
mecánicos, utilizando un tractor que realice la homogenización.
• Humedad
El contenido de humedad es una variable ambiental de suma importancia en el compost, teniendo
en cuenta que es el agua la que provee el medio requerido para llevar a cabo el transporte y la
degradación de los nutrientes por parte de los microorganismos para que puedan realizar sus
actividades metabólicas y fisiológicas (Liang et al., 2002). Cuando el porcentaje de humedad
presenta valores muy bajos puede indicar la deshidratación del compost lo que tiene como
consecuencia la disminución de las actividades biológicas y la obtención de un compost inestable
(Bertoldi et al., 1985). Por otra parte, porcentajes de humedad muy altos (mayores al 65%)
pueden generar condiciones anaeróbicas lo cual disminuye la eficiencia del proceso, además de
producir malos olores (Tiquia et al, 1996).
11
La humedad óptima del compostaje se puede situar alrededor del 30 a 55% aunque varía
dependiendo del estado físico y tamaño de las partículas, así como del sistema empleado para
realizar el compostaje. El contenido de humedad ideal para el compostaje debe considerar una
adecuada humedad para las necesidades fisiológicas de los microorganismos y un adecuado flujo
de oxígeno para mantener las condiciones aeróbicas (Avendaño., 2003).
Cuando el porcentaje de humedad en el compost es muy alta, es porque no hay un equilibrio
entre los materiales húmedos (como los vegetales) y el material llenante o seco (como la paja)
(Foru, 2003). En un estudio realizado por Hanajima et al, 2005 donde la humedad del compost
hecho con gallinaza, residuos de champiñones, salvado de arroz y residuos de pollo crudo era del
84%, se agregó cascarilla de arroz para obtener una humedad entre el 50 y 60 %.
• pH
Esta variable es de gran importancia durante el compostaje, ya que está estrechamente
relacionada con las variaciones de la temperatura en el proceso, se ha encontrado que el cambio
de condiciones mesofílicas a termofílicas durante la fase inicial del compostaje, coincide con el
cambio de pH, de ácido (4.5 – 5.1) a alcalino (8 – 9), esto se debe a que cuando la temperatura se
encuentra por debajo de los 40 ° C ( fase mesofílica), se producen ácidos orgánicos como el
lactato y acetato que inicialmente disminuyen el pH del medio. Estos ácidos a su vez son
consumidos por los microorganismos durante la fase termofílica, generando un aumento en el pH
del compost. Para que el desarrollo del compost sea exitoso es necesario que el valor del pH se
encuentre entre 8 y 9 (Sundberg et al, 2004). Aunque según la NTC 5167 de 2004 el valor del
pH para los abonos orgánicos puede estar entre 4 y 9 (ICONTEC, 2004).
Un pH bajo (4.5 – 5.1) durante el proceso de compostaje puede resultar en corrosión, malos
olores, baja descomposición, mala calidad del compost y dificultad para alcanzar altas
temperaturas, apropiadas y requeridas para la sanitización (Sundberg y Jonsson, 2007).
12
• Tamaño de la partícula
La actividad microbiana está relacionada con la facilidad de acceso al sustrato. Las partículas
pequeñas tienen una mayor superficie específica, lo cual facilita el acceso al sustrato. Sin
embargo, las partículas demasiado finas crean poros pequeños restringiendo el paso del oxígeno
y por ende causando condiciones de anaerobiosis (Cooperband, 2000).
2.2.2 Características fisicoquímicas del compost
De acuerdo a la Norma Técnica Colombiana ICONTEC 5167 de 2004, el producto obtenido a
partir del proceso del compostaje de residuos de lechuga y cascarilla de arroz será un abono
orgánico, ya que como es definido en la norma, se trata de un producto sólido obtenido a partir
de la estabilización de residuos de vegetales que contiene porcentajes mínimos de materia
orgánica. Los parámetros a caracterizar en el abono orgánico como producto final de acuerdo a la
legislación colombiana se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Parámetros a caracterizar en el abono según la NTC 5167 de 2004
PARÁMETRO A CARACTERIZAR VALOR PERMITIDO
Contenido de cenizas Máximo 60 %
Contenido de humedad Máximo 35%
Contenido de carbono orgánico oxidable total Mínimo 15%
Nitrógeno, P2O5 y K2O Se declaran si cada uno es mayor al 1%
Relación carbono /nitrógeno Reportar
Capacidad de retención de humedad Mínimo su propio peso
Capacidad de intercambio catiónico Mínimo 30 cmol(+) Kg-1 (meq/100g)
pH Mayor a 4 y menor a 9
Densidad Máximo 0.6 g/cm 3
Materia prima del que procede Lechuga y cascarilla de arroz
Fuente: INCONTEC, 2004.
13
2.2.3 Calidad del compost
La calidad del compost está relacionada con su valor agronómico y comercial como un
acondicionador orgánico del suelo (Kapanen et al., 2001). En la tabla 4 se muestran algunos de
los parámetros que permiten determinar la calidad del compost.
Tabla 4. Parámetros que permiten determinar la calidad del compost.
Parámetro Rango
Estabilidad Puede determinarse por la tasa de toma de oxígeno, tasa de producción de CO2, o por la liberación de calor como resultado de la actividad de los microorganismos.
Porcentaje de materia orgánica entre el 35 y 40%, temperatura estable (10 a 20 °C), color marrón oscuro – negro, olor a tierra (no desagradable), relación C/N menor a 20, DQO menor a 7mg/g de peso seco, cantidad de polisacáridos menor a 30 – 50 mg glúcidos/g de peso seco, reducción de azúcares del 35%, ausencia de nemátodos y un incremento en la actividad de las enzimas hidrosolubles hasta observar la estabilidad (Bioagro, 2007 <online>).
Fitotoxicidad y compuestos inhibidores La lechuga es empleada como indicador biológico, de la presencia de compuestos tóxicos o inhibidores del crecimiento de las plantas.
Conductividad y contenido de nutrientes La conductividad debe ser monitoreada. Niveles inferiores a 3.5 mS/cm son necesarios en el compost aplicado.
La relación C/N debe estar entre 15 – 25.
pH Debe estar entre 5.5 y 8.0, un pH mayor puede indicar un alto contenido de calcio.
Tamaño de la partícula Depende del uso
Contenido de contaminantes El contenido de metales pesados o contaminantes orgánicos son regulados por normas nacionales
Fuente: Saebo et al, 2006.
14
2.2.3.1 Materia orgánica
La materia orgánica del suelo es el conjunto de residuos vegetales y animales de todas las clases,
más o menos descompuestos y transformados por la acción de los microorganismos. (Schjonning
et al., 2007):
La evolución de la materia orgánica en el suelo depende de factores tales como el clima
(temperatura y humedad), el tipo de suelo (textura, estructura, roca madre), la clase de residuos
más o menos fáciles de degradar y el tipo de microorganismos que intervienen en su
transformación (Schjonning et al., 2007).
En los suelos agrícolas, la materia orgánica procede prácticamente de los residuos de las
cosechas, aportes de estiércol o abonos orgánicos. La mayor parte de estos aportes (60-70%)
desaparece en una fase de mineralización activa que puede durar 2 años. El resto queda como
humus el cual se mineraliza lentamente en proporciones que varían según las condiciones del
clima y suelo (Schjonning et al., 2007).
Aumentando el contenido de carbono orgánico en el suelo, se realza la calidad del suelo, se
reduce la erosión, se mejora la calidad del agua, se aumenta la biomasa y la productividad
agronómica, además de mejorar la calidad ambiental por la adsorción de contaminantes de los
cuerpos de agua y se reduce la concentración atmosférica de dióxido de carbono (Pedra et al.,
2006). También, al añadir materia orgánica al suelo se estimula la población microbiana presente
y su actividad biológica (Brady & Weil, 1999).
Las sustancias húmicas que se encuentran en el medio natural son provenientes de residuos
orgánicos en degradación, unidos a los productos generados por los microorganismos propios de
la materia orgánica (Ayuso, 1995). Esta composición no es estable, por el contrario es bastante
dinámica, por lo que se habla más de un estado de la materia orgánica, en vez de referirse a
compuestos estables.
15
Para realizar un seguimiento del proceso de humificación, es indispensable la extracción de
sustancias húmicas formadas a partir de la degradación de la materia orgánica, ya sea en el suelo
o en compost. Con este objetivo, se han desarrollando métodos químicos que permiten extraer
una fracción de las sustancias húmicas haciendo uso de reactivos alcalinos, utilizando
preferiblemente la extracción directa con NaOH 0,1M, para luego realizar una cromatografía
fraccionada (Qualls et al., 2003).
Otras técnicas analíticas más modernas para la detección de ácidos húmicos y fúlvicos (presentes
en el humus), se fundamentan en una extracción inicial de dichas sustancias para su posterior
detección con polivinilo (Olk et al., 2000).
Existen otros métodos más sencillos como el de espectrofotometría de fluorescencia que logra
hacer la determinación de las mismas sustancias en solución acuosa, al igual que las
evaluaciones colorimétricas que hacen uso de diferentes reactivos. (Olk et al., 2000)
También se conocen metodologías más específicas que se realizan para determinar la
composición química de las sustancias húmicas. Para ello se emplean análisis cromatográficos,
espectroscopía infrarroja y densidad óptica, el RMN 13C, la resonancia del espín electrónico, la
pirólisis-espectrofotometría de masas y la extracción de gases súper crítica (Schnitzer et al.,
1995).
El método más utilizado y el que se empleará en el estudio, para la determinación de materia
orgánica total es el propuesto por Walkley y Black (1934) que se fundamenta en la oxidación de
la materia orgánica por el contacto con un oxidante fuerte como el dicromato (Cr2O7) en
presencia de ácido sulfúrico (H2SO4). El exceso del oxidante se cuantifica empleando una
solución de sal de Mohr (Sal ferrosa FeSO4 7H2O), y se emplean dos indicadores, la difenilamina
y el ácido fosfórico (H3PO4) que favorecen la unión del agente oxidante con la materia orgánica,
permitiendo determinar la cantidad de materia orgánica presente.
16
2.2.3.2. Enzimas en procesos de compost
Las enzimas son proteínas que funcionan como catalizadores biológicos que aumentan la
velocidad o rapidez de una reacción química, sin que ella cambie su estructura en el proceso
global. La sustancia sobre la cual actúa una enzima se denomina sustrato (Mathews et al., 2002).
Las enzimas pueden ser excretadas de la célula (extracelulares), que son liberadas por el
metabolismo o incluso por muerte celular, o pueden estar a nivel intracelular (Kalil et al., 2007).
Las amilasas tienen como sitio de acción los enlaces glicosídicos α 1-4 y α 1-6 del almidón.
Durante la degradación del almidón actúan diferentes enzimas como la α-amilasa que hidroliza
los enlaces α 1-4 de la amilosa. Las β amilasas, por su parte, actúan sobre los extremos no
reductores de la amilosa y la amilopectina, hidrolizando los enlaces glicosídicos alternantes. La
pululanasa o isoamilasa hidroliza los enlaces α-1-6 glicosídicos, liberando las ramificaciones de
la amilopectina. Durante el proceso de degradación del almidón se generan moléculas de
maltosa, que son hidrolizadas por la maltasa generando glucosa (Alexander, 1980)
En el compost se puede encontrar una gran variedad de enzimas, dependiendo del material que se
composte. En un estudio realizado por Cayuela et al., 2007 se encontró que en pilas de compost
elaboradas a partir de los lodos residuales de la extracción del aceite de oliva enzimas como la β-
glucosidasa, fosfatasa alcalina, ureasa, fosfatasa ácida y arilsulfatasa. Por otra parte, en un
estudio realizado por Mayende et al., 2006 se obtuvieron celulasas y polifenol oxidasas
producidas por Bacillus spp. encontrado en un compost elaborado con desechos de jardín; y
Peláez et al., se encontraron fosfatasas, invertasas, amilasas, proteasas y deshidrogensas en un
compost a base de aserrín y gallinaza.
La actividad enzimática de un inoculante para compost, es usualmente determinada por técnicas
colorimétricas, que miden la cantidad de azúcares reductores presente en una matriz. Dentro de
dichas técnicas la más empleada es la del ácido dinitrosalisílico (DNS), sin embargo, Deng y
Tabatabai (1994), afirman que este método no es lo suficientemente específico ni sensible, luego
de haberlo comparado con otros métodos colorimétricos como Azul de Prusia y Somogyi-
Nelson.
17
Si bien los tres métodos son específicos para determinar azúcares reductores, Deng y Tabatabai
(1994), encontraron que las técnicas de Azul de Prusia y de Somogyi- Nelson, resultaron ser la
más sensibles, logrando detectar 1µg y 5 µg, respectivamente, de azúcares reductores presentes
en la matriz de estudio. Sin embargo, también determinaron que el método de Somogyi- Nelson
era menos susceptible a los interferentes presentes en una matriz como suelo o compost, por lo
cual este método resulta ser el más apropiado dentro las técnicas colorimétricas, para determinar
la actividad enzimática presente en suelo o compost.
18
3. JUSTIFICACIÓN La lechuga es un vegetal que aporta una gran variedad de minerales, aminoácidos y ácidos
orgánicos, además, su alto porcentaje de humedad la convierte en un alimento de pocas calorías,
por lo que cada día aumenta considerablemente la cantidad de consumidores. Por estas razones,
es necesario mantener la demanda de dicho alimento en el mercado, pero esto conlleva un
aumento de los residuos generados en los cultivos, puesto que no todas las lechugas se
desarrollan adecuadamente y no cumplen los estándares de calidad necesarios para ser vendidas.
En los cultivos comerciales de lechuga, los residuos generados contienen un alto porcentaje de
humedad (95%) que hace necesario someterlos a un manejo adecuado para evitar malos olores y
la producción de lixiviados. Una solución a este problema, es utilizar los residuos para realizar
un proceso de compostaje, en el cual por medio de reacciones bioquímicas microbianas en
condiciones controladas, se obtiene abono orgánico que puede ser agregado al suelo y así
mejorar su estructura y propiedades tanto fisicoquímicas como microbiológicas.
Por todo lo anterior, el presente trabajo es de gran importancia ya que se implementará un
sistema de compostaje a partir de residuos de lechuga y además se desarrollará un inoculante
microbiano que aumente la velocidad de dicho proceso, permitiendo que en el cultivo siempre se
pueda disponer de abono de buena calidad. De esta forma los residuos representarán una
ganancia económica para el cultivo y para el medio ambiente.
De igual manera el proceso de compostaje se seguirá desde la actividad enzimática (amilolítica),
y del proceso de humificación de la materia orgánica presente en el compost, que servirán como
indicadores no directos de la eficiencia del proceso de compostaje.
19
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
• Producir y evaluar un inoculante microbiano con capacidad amilolítica, acelerador del
proceso de compostaje, a partir de residuos de lechuga.
4.2. Objetivos específicos
• Aislar y caracterizar microorganismos con actividad amilolítica, a partir del compostaje
de residuos de lechuga.
• Determinar cualitativa y cuantitativamente la actividad amilolítica de los
microorganismos aislados, y producir un inoculante mixto acelerador del proceso de
compostaje.
• Preparar pilas de compostaje utilizando cascarilla de arroz como material llenante y poda
de pasto kikuyo para incrementar la relación C/N.
• Evaluar dos métodos de extracción de amilasas a partir de muestras de compost.
• Realizar seguimiento del proceso mediante la cuantificación de la actividad amilolítica y
materia orgánica.
20
5. METODOLOGIA
El estudio se realizó en el laboratorio de Microbiología Ambiental y de Suelos de la Pontificia
Universidad Javeriana, y en su fase de campo en la “Hacienda Villa Amparo”, Funza –
Cundinamarca.
5.1.Recolección de las muestras
5.1.1. Sitio de Muestreo
El sitio de estudio comprendió la zona de compostaje de la “Hacienda Villa Amparo”, ubicada en
Funza- Cundinamarca, que cuenta con un área de 150 m2 y una capacidad para diez pilas de
compostaje.
5.1.2. Recolección de las muestras
De tres pilas de compost de 2 m de largo por 1.2 m de ancho y 1.2 m de alto, con una
temperatura promedio de 41ºC, se tomaron 5 muestras compuestas de 150 g por cada pila. Para
realizar el muestreo aleatorio simple, las pilas fueron divididas transversalmente en tres partes
(anterior, media y posterior) y las muestras fueron tomadas desde el interior de las pilas en cada
una de las secciones mencionadas. Las muestras se depositaron en bolsas de papel y estas a su
vez en bolsas plásticas autosellables rotuladas previamente, para su posterior transporte al
Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos, en donde fueron procesadas.
5.2. Procesamiento de muestras
5.2.1. Fase I: Caracterización del proceso de compostaje
Durante esta fase, se le hizo seguimiento a dos pilas de compost, a las que se les evaluaron
parámetros como temperatura con ayuda de un termómetro de punzón, pH y tiempo de duración
21
del proceso. Las pilas fueron identificadas como pilas 1 y 2, diferían en los tipos de lechuga que
poseían y también en el contenido de poda, puesto que la 2 no fue cubierta con esta.
Adicionalmente, a la pila 2 se le evaluaron otros parámetros como contenido de materia
orgánica, actividad amilolítica y biomasa de microorganismos amilolíticos en el Laboratorio de
Microbiología Ambiental y de Suelos; todo esto con el fin de caracterizar el proceso de
degradación que sufren las materias primas en dicho proceso. Para esta primera fase, los
muestreos se realizaron una vez por semana, hasta que la temperatura descendió a condición
ambiental. Posteriormente se realizaron análisis fisicoquímicos de la pila 2, que incluyeron % de
humedad, pH, C/N y composición nutricional. Se tomaron muestras en tiempo cero y al terminar
el proceso de degradación, que fueron analizadas en los laboratorios Agrilab y CIAA.
5.2.1.1.Temperatura y pH
La temperatura fue tomada una vez a la semana en cinco puntos diferentes de la pila, empleando
un termómetro de punzón. Se introdujo el termómetro en la pila hasta lograr que la punta
quedara en la parte central de la misma y se hizo la lectura una vez la aguja del termómetro
permanecía en el mismo valor (Coyne et al., 1999)
Para la medición de pH, se tomaron 25 g de muestra y se mezclaron con 25 mL de agua
desionizada. Se dejaron en reposo por una hora y luego se empleó un pHmetro para hacer la
medición (ICONTEC, 2004).
5.2.1.2. Actividad amilolítica del compost
5.2.1.3. Evaluación de dos métodos para la extracción de amilasas
Se evaluaron dos métodos de extracción de amilasas, uno con buffer citrato fosfato (Badiane et
al., 2007) y otro con el buffer Sorensen (Sharada y Sanjat, 2004). En los dos casos, inicialmente
se tomaron tres muestras de compost de las partes anterior, media y posterior de las pilas, para
22
así completar un total de nueve muestras por pila y a cada una de ellas se les realizó extracción
enzimática y posterior cuantificación de azúcares reductores por el método de Somogyi- Nelson.
Para el primer método, se tomaron 1.5 g de compost que fueron depositados en un tubo plástico
de centrifuga de 50 mL, posteriormente se le añadieron 3 mL de tolueno, 3 mL de buffer
Sorensen (Anexo 1) y 3 mL de solución almidón al 1% (p/v). Esta mezcla fue incubada por 24
horas a 55 ºC (Sharada y Sanjat, 2004).
Para el segundo método se tomaron 0.3 g de compost en un tubo plástico de centrífuga de 50 mL
y se le agregaron 2.5 mL de buffer Citrato- Fosfato (Anexo 1) y 2.5 mL de solución de almidón
al 1% (p/v). Se incubó a 55 ºC durante cuatro horas (Badiane et al., 2001).
Una vez finalizado el periodo de incubación, se procedió a centrifugar los tubos a 8000 r.p.m por
20 minutos y a una temperatura de 4 ºC. Posterior a la centrifugación, se hizo una filtración por
gravedad, empleando papel filtro, con el fin de separar partículas suspendidas en la fracción
líquida de interés (Gutiérrez et al., 2007).
5.2.1.4. Cuantificación de azúcares reductores en muestras de compost, mediante la técnica
de Somogyi- Nelson
Luego de realizar la extracción de amilasas por los dos métodos, se procedió a cuantificar los
azúcares reductores presentes en los tubos de centrífuga como consecuencia de la actividad
enzimática. Para ello se empleó la fase acuosa recuperada luego de la filtración por gravedad. A
partir de dicha fase, se tomaron 200 µL, los cuales fueron mezclados con 200 µL y 50 µL de los
reactivos de Somogyi I y Somogyi II respectivamente. La mezcla fue homogenizada con la
ayuda de un vortex, para luego introducirla en un baño termostatado a 90ºC durante 20 minutos,
transcurrido este tiempo, se introdujeron los tubos en un recipiente con agua fría por 10 minutos.
Luego se homogenizaron nuevamente con la ayuda del vortex y se les adicionó a cada uno 250
µL de reactivo de Nelson y 700 µL de agua desionizada. El blanco fue preparado de la misma
forma, pero se tomaron 200 µL de agua desionizada en vez de fase acuosa (Deng y Tabatabai,
1994; Gutiérrez et al., 2007).
23
Debido a la alta concentración de azúcares reductores de algunas muestras, fue necesario realizar
diluciones. Para ello se utilizó agua desionizada, haciendo la adición de la misma antes de
adicionar los reactivos.
La lectura se llevó acabo 24 horas después de realizada la técnica, en espectrofotómetro Genesys
UV/ Vis a una longitud de onda de 595 nm (Deng y Tabatabai, 1994; Gutiérrez et al., 2007;
Badiane et al., 2001)
5.2.1.5. Cuantificación de la biomasa amilolítica presente en el compost
Se tomó una cantidad cercana a 10 g exactamente medida de la muestra que se adicionaron a
90mL de agua peptonada al 0.1% (p/v), posteriormente se agitó la muestra a 120 r.p.m. por 5
minutos. Luego se efectuaron diluciones seriadas en base 10 por triplicado, en tubos de vidrio de
13*100 cada uno con 4.5 mL de agua peptonada 0.1% (p/v), a los cuales se les agregó 0.5 mL de
muestra a diluir. Posteriormente, se sembraron cada una de las diluciones en agar almidón 1%
(p/v) (Anexo 2) (Ayala et al., 2001).
5.2.1.6. Determinación de materia orgánica
En la fase I se realizó la determinación de la materia orgánica total (MOT) y carbono orgánico
total (COT) por vía húmeda utilizando el método descrito por Walkley y Black (1934). Para ello
se pesaron 10,000 g de compost de cada parte de la pila (anterior, media y posterior) en una
bandeja previamente tarada a 105 ºC, y se llevaron a la mufla cuya temperatura era también de
105 °C durante 2 horas (Swift, 1996). Pasado este tiempo se volvió a pesar la muestra con el fin
de determinar su porcentaje de humedad empleando la ecuación 1:
24
Luego, de la muestra seca se tomaron 50 mg en un beaker, se agregaron 10 mL de ácido
sulfúrico y 5 mL de dicromato de potasio y se llevó a la mufla a 150 °C por 15 minutos, después
se dejó enfriar y se transfirió todo el contenido del beaker a un balón aforado de 50 mL
completando a volumen con agua destilada. El balón se agitó para homogenizar la muestra, luego
se tomaron 10 mL y se añadieron a un erlenmeyer de 100 mL. Se agregaron 4 gotas de
difenilamina y 2 gotas de ácido fosfórico para titular la muestra con sal ferrosa al 0.022N (Anexo
2) hasta que se observó un viraje de color de azul – violeta a verde esmeralda. Finalmente se
determinó el porcentaje de MOT y COT por medio de las ecuaciones 2, 3 y 4:
% MOT= % COT x 1.724 (4)
Fuente: Kalil et al., 2007
5.2.2. Producción del inoculante mixto
5.2.2.1. Aislamiento primario de cepas amilolíticas (Priest y Ramos, 1994)
Se tomaron 10,000g de cada una de las muestras recogidas y se adicionaron a 90 mL de agua
peptonada al 0.1% (p/v), luego, a partir de esta mezcla se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a
10-12.
25
Posteriormente se sembraron cada una de las diluciones en superficie y por triplicado en agar
almidón al 1% (p/v) (Anexo 2) y se incubaron a 55 ºC durante 48 horas.
Una vez finalizado el periodo de incubación, se determinó cualitativamente la actividad
amilolítica, adicionando tres gotas de lugol sobre la caja. Los microorganismos con actividad
amilolítica fueron identificados por la aparición de halos de hidrólisis alrededor de las colonias,
luego de la adición del lugol.
Luego de identificar las colonias con actividad amilolítica, se les realizó coloración de Gram a
cada una de ellas, con el fin de observar sus características microscópicas. De igual forma se
hicieron observaciones para determinar las características macroscópicas de cada colonia.
5.2.2.2 Aislamiento secundario y selección
Con el fin de obtener microorganismos puros con capacidad amilolítica, se hicieron por
triplicado, repiques en agar almidón al 1% (p/v) de cada una de las colonias identificadas como
amilolíticas en el aislamiento primario, manteniendo las condiciones de incubación y
comprobación de la actividad amilolítica descritas anteriormente.
Una vez puras, se procedió a medir el halo de hidrólisis generado por cada una de las cepas
aisladas. Esto se hizo por triplicado para sacar una medida promedio del halo.
5.2.3. Conservación de Cepas
Para la conservación de los microorganismos aislados, se utilizó la técnica de criopreservación
en glicerol al 30% (v/v) (Poutou et al., 1994). Para ello, se tomaron colonias del aislamiento
secundario y se mezclaron con solución salina al 0.85% (p/v) hasta alcanzar la turbidez del tubo
número 2 de la escala nefelométrica de Mc Farland.
26
Una vez alcanzada esta concentración, se inocularon 5 mL de la suspensión celular en 50 mL de
caldo almidón al 1% (p/v), el cual se llevó a incubar a 55 ºC en agitación constante a 120 r.p.m.
durante 12 horas, hasta lograr una concentración celular de 105 y 106 (Alfaro et al., 2001)
Para los microorganismos que mostraron una microscopía filamentosa, no se empleó el patrón de
Mc Farland, sino que se hizo un raspado de toda la caja, para inocularlo directamente en el caldo.
Luego de alcanzar la concentración celular anterior, se adicionaron 50 mL de caldo almidón con
glicerol al 60% (v/v), para así obtener una concentración final de 30% (v/v) de glicerol. De esta
mezcla se tomaron volúmenes de 1 mL para depositarlos en tubos eppendorf estériles (Poutou et
al., 1994).
Posteriormente se tomaron 5 tubos de manera aleatoria para sembrarlos en agar almidón al 1%
(p/v) y comprobar pureza y viabilidad.
5.2.4. Selección de cepas por antagonismo
Se tomó un vial del banco, por cada una de las cepas y se reconstituyeron en caldo almidón al
1% (p/v), se incubó por 12 horas a 55 ºC y en agitación constante a 120 r.p.m. La concentración
celular final fue comprobada luego de hacer recuento en placa en agar almidón al 1% (p/v).
Luego de comprobar que la concentración celular de todos los microorganismos fuera la misma
(106 UFC/mL), se realizaron pruebas de antagonismo por triplicado siguiendo la técnica descrita
por Gauze (1965) en la cual, el efecto antagónico se determina midiendo los halos de inhibición.
Para ello, se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos a evaluar, en agar
almidón al 1% (p/v), y fueron enfrentados con los otros microorganismos que se habían
dispuesto en sensidiscos de papel filtro estéril con un volumen de 20 µL de suspensión celular
para cada uno de ellos (Alfaro et al., 2001).
27
5.2.5. Curvas de Crecimiento
Como parámetros de crecimiento de los microorganismos, se evaluaron la producción de
biomasa, por medio del recuento en placa en agar almidón 1% (p/v), así como la actividad
amilolítica, luego de efectuar una extracción de amilasas y medir la cantidad de azúcares
reductores presentes en la matriz por el método Somogyi- Nelson para la cual se utilizó la
ecuación (Y= 0.1133 X+ 0.0049, R2 = 0.998) obtenida a partir de la curva de calibración (Anexo
3). Posteriormente, se cuantificaron las unidades amilolíticas (UA), definidas como la cantidad
de enzima capaz de liberar 1µg de azúcares reductores/mL*h.
Se tomaron tres viales del banco para su recuperación y verificación de pureza, en agar almidón
al 1% (p/v). Luego de verificar pureza y recuento de colonias, se elaboró el pre- inóculo.
5.2.5.1. Elaboración del pre- inóculo (Wind et al., 1994)
Para cada microorganismo se prepararon dos pre- inóculos relación 1/2, en erlenmeyers de
500mL, con 127 mL de caldo almidón al 1% (p/v), cada uno. A estos se les adicionó el contenido
de tres viales. Se tomó como tiempo cero el momento de la adición de los microorganismos,
momento en el cual se determinó la actividad amilolítica.
Para la cuantificación de la biomasa, se realizaron diluciones seriadas en base 10. Para ello se
emplearon tubos khan, cada uno con 2.7 mL de agua peptonada, a los que se les adicionó 300 µL
de muestra a diluir. Para homogenizar la mezcla, se utilizó un agitador vortex, y luego de estar
homogéneas, se sembró en superficie 1 mL de las diferentes diluciones en agar almidón 1% (p/v)
para hacer el recuento. Las cajas fueron incubadas a 55 ºC durante 24 horas (Wind et al., 1994).
Adicionalmente, para los microorganismos no filamentosos, se realizaron lecturas de absorbancia
teniendo como blanco caldo almidón al 1% (p/v) estéril, con el fin de identificar rápidamente el
ingreso a la fase exponencial por parte de los microorganismos.
28
Para la extracción de amilasas, se tomaron 3mL del caldo de fermentación que fueron
centrifugados a 10 000 r.p.m. durante 20 minutos. Luego, se tomó 1 mL del sobrenadante, el
cual fue mezclado con 1 mL de buffer almidón al 1% (p/v) diluido en buffer fosfato 1M. Esta
mezcla fue llevada a incubar a 55 ºC durante una hora, luego se frenó la reacción introduciendo
los tubos en hielo y se dejaron allí por cinco minutos. Una vez frenada la reacción, se hizo otra
centrifugación a 10 000 r.p.m. durante 20 minutos. Se tomaron 200 µL del sobrenadante para
desarrollar el protocolo de Somogyi- Nelson descrito anteriormente, haciendo diluciones con
agua desionizada.
Los parámetros mencionados se evaluaron cada dos horas y una vez se evidenció el ingreso a la
fase exponencial de cada uno de los microorganismos, se transfirió una alícuota de 50 mL a los
erlenmeyers en donde se realizó la fermentación discontinua.
5.2.5.2. Fermentación Discontinua
Luego de identificar la fase exponencial de cada uno de los microorganismos en sus respectivos
pre-inóculos, en un erlenemyer de 1 L con 450 mL de caldo almidón al 1% (p/v) se transfirieron
50 mL de cada pre-inóculo, para completar un volumen efectivo de trabajo (VET) de 500 mL.
Cada fermentación se llevó a cabo por duplicado, se continuó midiendo actividad amilolítica y
biomasa, cada dos horas, hasta observar un descenso en la actividad amilolítica (Ayala et al.,
2001).
5.2.6. Curva de crecimiento del Inoculante mixto
Se hicieron pre- inóculos de cada uno de los microorganismos de la misma forma explicada
anteriormente y se dejaron incubando a 55ºC hasta que cada uno alcanzara una biomasa de 106
UFC/mL. Luego de tener todos los microorganismos en la misma concentración, en un
erlenmeyer de 1 L con 450 mL de caldo almidón 1% (p/v), se adicionaron 10 ml de cada uno de
los pre-inóculos, para completar un VET de 500 mL. Adicionalmente, se utilizó un sistema de
aireación, compuesto por mangueras de plástico unidas a un motor eléctrico que emitía el aire
suministrado al caldo, para incrementar la velocidad de crecimiento.
29
La fermentación se hizo por duplicado y se evaluaron los mismos parámetros (actividad
amilolítica y biomasa por recuento en placa) cada dos horas.
5.2.7. Producción del Inoculante mixto
Se llevó a cabo la fermentación discontinua bajo las mismas condiciones de operación descritas
en el numeral 5.2.6, en 10 erlenmeyers de 1 L para completar un volumen de inoculante mixto
final de 5 L. Se incubaron a 55 ºC por 24 horas, tiempo en que la biomasa era superior a 1026
UFC/mL.
Una vez finalizada la fermentación, se reenvasó todo el contenido de los 10 erlenmeyers en un
recipiente con capacidad de 5 L estéril y se mantuvo a -5 ºC por 24 horas hasta el día de su
aplicación.
5.3. Fase II: Evaluación del Inoculante Mixto en campo
Para hacer la evaluación en campo del inoculante, se hizo el montaje simultáneo de dos pilas de
compost exactamente iguales en composición y dimensiones. Cada pila contenía 500 kg de
lechuga, 226.5 Kg de cascarilla de arroz, 56.62 Kg de poda y 7 L de agua- melaza (Anexo 2) y
sus dimensiones fueron 2 m de largo por 1.2 m de ancho por 1.2 m de alto.
La pila sin inoculante fue denominada pila control y la otra fue inoculada con 5 L de inoculante
mixto sin diluir y fue denominada pila con inoculante.
5.3.1. Variables evaluadas
Las variables evaluadas fueron actividad amilolítica, biomasa, materia orgánica, pH y
temperatura. Todos los parámetros se evaluaron de la misma forma descrita en la fase I, aunque
los muestreos y mediciones se hicieron diariamente y no semanalmente, a excepción de la
biomasa, que fue determinada cada tercer día.
30
Durante la fase de evaluación del inoculante en las pilas, no se hicieron determinaciones de
actividad amilolítica para cada una de las partes de la pila, puesto que en la fase I no se
encontraron diferencias significativas en los valores de la actividad amilolítica hallada en cada
una de ellas, razón por la cual, en la fase II se tomaron las muestras de las diferentes secciones de
la pila y se hizo un pool con ellas, para determinarle la actividad amilolítica.
5.3.1.1. Determinación de la materia orgánica (IHSS, 1996)
En la fase II se decidió cambiar el método para la determinación de la materia orgánica, ya que
se encontró que por vía seca (calcinación) también se podían analizar las muestras de compost.
Antes de hacer el cambio definitivo de determinación por vía húmeda a vía seca, se tomó la
muestra del primer día del proceso y se determinó el porcentaje de MOT por los dos métodos.
Para llevar a cabo la determinación de la materia orgánica por vía seca se pesaron 10 g de
compost (a partir de un pool que reunía fracciones de toda la pila a analizar) y se secaron a
105°C durante 2 horas. Luego, se tomaron 1,500 g de muestra seca y molida depositándolas en
una bandeja de aluminio previamente tarada.
Se precalcinó la muestra a una temperatura baja, manteniéndola directamente en la mufla hasta
que dejó de humear. Luego se realizó la calcinación, con la mufla a 550 °C e introduciendo la
muestra por 5 horas. Pasado el tiempo, se transfirió el conjunto a un desecador y unas vez frías se
retiraron las bandejas con el fin de pesarlas nuevamente.
Finalmente se realizaron los cálculos aplicando las ecuaciones 5 y 6:
A: peso de la bandeja (g)
B: A + peso de la muestra seca (g)
C: A + peso de la muestra calcinada
100)()(% x
ABCBMOT
−−
= (5) %COT= %MOT / 1.72 (6)
31
5.3.1.2.Caracterización microbiológica del compost Se tomaron muestras de 30,000 g de compost, al inicio y al final del proceso, tanto para el
tratamiento como para el control. Dichas muestras, fueron enviadas al Centro de Servicios de la
Pontificia Universidad Javeriana, para la determinación de patógenos humanos como Salmonella
sp. y Escherichia coli.
5.4. Análisis de la información
Con el fin de determinar el grado de correlación entre la actividad amilolítica y la biomasa de
microorganismos amilolíticos presentes en las pilas tratamiento y control, se aplicó un test de
correlación, para el cual se plantearon las siguientes hipótesis:
Ho: No existe una relación directamente proporcional entre la biomasa amilolítica y la
actividad amilolítica presentes en las pilas control y tratamiento.
Hi: Existe una relación directamente proporcional entre la biomasa amilolítica y la
actividad amilolítica presentes en las pilas control y tratamiento.
Adicionalmente, se aplicó un t- student test, para determinar diferencias significativas entre los
métodos de extracción enzimática empleados en las pilas tratamiento y control:
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos de
extracción enzimática utilizados para extraer amilasas.
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos de
extracción enzimática utilizados para extraer amilasas.
Una vez determinado el mejor método de extracción enzimática, se empleó un test Chi cuadrado
para evidenciar diferencias significativas en la actividad amilolítica presente en el tratamiento y
control:
32
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre las actividades
amilolíticas cuantificadas para las pilas tratamiento y control.
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre las actividades amilolíticas
cuantificadas para las pilas tratamiento y control.
De igual forma, se aplicaron los test Kruskal Wallis y Chi cuadrado, para determinar diferencias
significativas entre la actividad amilolítica presente en los tratamientos empleados y el tiempo:
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en la actividad amilolítica
presente en cada uno de los tratamientos a través del tiempo.
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en la actividad amilolítica en cada
uno de los tratamientos a través del tiempo.
Posteriormente, con el objetivo de estimar diferencias en el contenido de materia orgánica
presente en el tratamiento y control, se aplicó un test t- student y se formularon las hipótesis
pertinentes:
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido de materia
orgánica entre las pilas tratamiento y control.
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido de materia
orgánica entre las pilas tratamiento y control.
Adicionalmente, se aplico el test Kruskal Wallis para determinar diferencias significativas entre
el contenido de materia orgánica en los tratamientos empleados y el tiempo:
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de materia
orgánica presente en cada uno de los tratamientos, a través del tiempo.
33
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de materia
orgánica presente en cada uno de los tratamientos, a través del tiempo.
Finalmente se aplicó un test t-student para determinar diferencias significativas entre los
tratamientos, de acuerdo a los parámetros de temperatura y pH, con relación al tiempo.
Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre temperaturas y pH en los
tratamientos evaluados.
Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre temperaturas y pH en los
tratamientos evaluados.
34
6. RESULTADOS Y DISCUSION
6.1. Fase I: Caracterización del proceso de Compostaje
6.1.1. Temperatura y pH
Al hacer el seguimiento de estas pilas preliminares, se buscaba conocer el tiempo de duración del
proceso de compostaje y observar parámetros como la temperatura y pH. La pila 1, fue la
primera en montarse, como parte de un sistema para organizar el material residual desarrollado
en diferentes etapas; presentó un exceso de humedad (80%) que condujo a procesos anaerobios y
por tanto mal olor, por esta razón sólo se hizo seguimiento de temperatura y pH.
La pila 2 fue organizada de la misma forma que la 1, excepto por la cubierta de poda que la
primera tenía y debido a que presentó una humedad inicial de 60%, a partir de esta pila se
determinaron la actividad amilolítica y el contenido de MOT y COT, además del seguimiento
que se hizo de la temperatura y el pH.
El ciclo completo de compostaje para las pilas 1 y 2 tuvo una duración de 5 semanas, tiempo en
el que las temperaturas más altas registradas fueron 44 ºC y 41 ºC respectivamente (Fig. 1). Si
bien el tiempo de duración del proceso, es bastante bueno comparado con otros reportados para
materiales similares como residuos de cocina y desechos de la jardinería, que pueden durar hasta
120 días (Adani et al., 2007), las temperaturas máximas no son lo suficientemente altas ni
duraderas para eliminar microorganismos patógenos. Nobel y Roberts (2004) afirman que para
eliminar microorganismos patógenos en compost, en general se requieren temperaturas
superiores a 40 ºC y que se mantenga por una semana como mínimo.
35
Fig. 1. Comportamiento de la temperatura en las Pilas de compostaje 1 y 2
Fig. 2. Comportamiento del pH de las Pilas de compost 1 y 2
Contrario a lo propuesto por Nobel y Roberts (2004), en campo se observó en términos generales
que en ninguno de los casos, se conserva la máxima temperatura por dos semanas. Este hecho
condujo a la suposición de que el proceso se realizaba mucho más rápido y que las mediciones
de este tipo debían hacerse en intervalos de días en vez de semanas.
Las variaciones en las temperaturas de las dos pilas se deben probablemente a los cambios de
temperatura ambiental, que tuvieron incidencia en las pilas, por el hecho de no existir paredes
que ayudaran a conservarla. Debido a esto, las pilas estuvieron muy expuestas a cambios
climáticos, que pudieron afectar la circulación del calor en ellas. Para el caso de la pila 2 que no
tenía cubierta de poda, la gráfica expresa muy bien la incapacidad de la pila para retener el calor,
mientras que la pila 1 logró retener un poco más, aunque no lo suficiente para mantener la misma
temperatura o incluso aumentarla. Por otro lado se puede argumentar respecto a la velocidad de
36
degradación, que pudo haber mantenido la temperatura por días consecutivos, en los cuales no se
efectuaron lecturas.
Las desviaciones estándar mostradas en la grafica 1 muestran también, que la temperatura no fue
la misma en los diferentes puntos de la pila, pero los valores no fueron muy disímiles,
evidenciando así una buena transferencia de calor dentro de la pila.
La pila 1 contenía residuos bastante degradados, razón por la cual el pH inicial fue ligeramente
ácido, comparado con el de la pila 2 (Fig. 2). La disminución en el pH de la pila 2 se debe a la
producción de sustancias ácidas, que son productos intermediarios de la degradación de la
materia orgánica, sin embargo, el pH incrementa nuevamente debido a la estabilización del
compost, etapa en la cual el pH se acerca a la neutralidad, luego de que los microorganismos
consumen los ácidos producidos y a la vez realizan procesos de amonificación (Beck- Friis et al.,
2003; Ayala et al., 2001).
La pila 2, a su vez reporta un incremento del pH durante la primera semana, que puede deberse a
una elevada tasa de amonificación causada por la relación C/N inicial (13.99 m/m), que según
Kirchmann y Witter (1989), al ser baja (< 20) aumenta la liberación del nitrógeno en forma de
NH3. Sin embargo, a partir de la semana 1 el pH desciende, a causa de la presencia de ácidos
orgánicos simples como el acético y el láctico, que se forman durante la degradación del material
orgánico; seguido de un nuevo ascenso en el pH, generado por el consumo de dichos ácidos por
parte de los microorganismos presentes en el material en descomposición (Sundberg, 2005).
Tanto el compost obtenido en la pila 1 como en la pila 2 reportaron valores finales de pH
aceptados por la norma 5167 de 2004, cuyo rango es entre 5 y 8.
6.1.2. Seguimiento de la Actividad Amilolítica y Biomasa de microorganismos amilolíticos
en la Pila 2
Por otra parte, se determinó la actividad amilolítica presente en la pila de compost 2 (Fig.3),
parámetro que fue correlacionado con la biomasa de microorganismos amilolíticos presentes en
37
la matriz de estudio (Fig. 4). Las unidades amilolíticas (UA) se definen como la cantidad de
enzima capaz de liberar 1 µg de azúcares reductores/ g de suelo* h (Sharada y Sanjat, 2004).
De acuerdo con Sharada y Sanjat (2004), los valores obtenidos para la actividad amilolítica en la
pila 2 resultaron muy bajos (< 4.22 UA con buffer Sorensen), comparados con el mínimo dato
reportado por dichos autores que fue de 8.4 UA. Pese a esto, el comportamiento descrito por la
pila, fue acelerado y con resultados finales satisfactorios como pH de 6, relación C/N de 15,
Norgánico de 1.2 % y % MOT de 55.49 %. Estas características finales, sugieren que hubo una
mayor actividad amilolítica, que no fue reportada debido a los tiempos de muestreo utilizados, o
también que el muestreo no coincidió con los días de mayor actividad.
Aún cuando la temperatura de la pila de compost 2 no fue satisfactoria, la actividad enzimática
presentó el comportamiento esperado (aunque con valores bajos), puesto que se incrementó de
2.9 UA a 4.22 UA (Fig.3), durante la primera semana de muestreo. Este incremento de la
actividad amilolítica coincide con cambios físicos de la pila, la cual al cabo de la primera semana
ya no contenía residuos de lechuga visibles.
Así mismo, dicho incremento de actividad amilolítica y por tanto de degradación aerobia del
material residual, conduce a un descenso gradual del pH en la pila. En la fig. 3, se observa
también una estabilización en la actividad que se ve reflejado en el comportamiento del pH, que
también tiende a mantenerse constante con valores cercanos a 6.
Fig.3. Actividad amilolítica y biomasa amilolítica de la pila de compost 2
38
Peláez et al., (2004), en un estudio sobre compostaje de estiércol de aves de corral y aserrín,
reportaron un comportamiento ascendente de la actividad amilolítica entre los días 9 y 43,
encontrándose valores desde 1.25 a 6.26 µmol/ min * g, respectivamente. Esto expresado en
µg/h*g, equivaldrían a 13500 y 67620 UA. Una vez más los valores obtenidos en el compost de
lechuga se encuentran muy distantes de otros valores reportados, aunque en este caso particular
se debe tener en cuenta que el estiércol puede contener una mayor carga de amilasas debido a su
contenido microbiano. Se debe resaltar también, que por las características de la matriz, el
tiempo de duración del proceso fue mayor a los 43 días, aunque no se menciona en el artículo,
como tampoco el comportamiento de la actividad amilolítica a lo largo de todo el proceso.
La tendencia de la actividad amilolítica a estabilizarse, tendría que haberse reflejado en una
estabilización de la temperatura de la pila. Sin embargo, este efecto no se presentó, debido a las
fluctuaciones de temperatura en la pila, producto del tamaño de la misma que redujo bastante sus
dimensiones al cabo de la primera semana y a la falta de paredes en el área de compostaje.
Debido a que el proceso de degradación se presentó en un tiempo menor al esperado
inicialmente, no se hicieron suficientes muestreos para caracterizar de una mejor manera la
actividad amilolítica presente en el proceso, puesto que pudo haber reportado valor mayores a los
mostrados en la fig. 3.
Con respecto a la biomasa de microorganismos amilolíticos cuantificada en la pila de compost
(fig. 3), se puede decir que la disminución de las UFC/g presentada en la primera semana (de 1*
105 a 1* 104 UFC/g) se generó como consecuencia de una posible adaptación de los
microorganismos.
Durante la semana 2, se evidencia un incremento en la biomasa que puede ser indicio del
consumo de otras fuentes de carbono diferentes al almidón, puesto que para el miso tiempo se
observó una disminución de las UA (Fig. 3).
39
6.1.3. Cuantificación de la Materia Orgánica Total (MOT) y del Carbono Orgánico Total
(COT)
En la fase I se realizó la cuantificación de la materia orgánica por vía húmeda, este método
consiste en hacer reaccionar la muestra de compost o suelo con un exceso de dicromato de
potasio en presencia de un ácido fuerte (ácido sulfúrico) y luego titular con sal ferrosa el
dicromato que no reaccionó (Chan et al., 1995; Norma Mexicana NMX-AA-021-1985).
En la fig. 4 se observa que la pila 2 empezó con un alto porcentaje de materia orgánica total y
que como es de esperarse a medida que avanza el proceso de compostaje dicho porcentaje
disminuye, en general esto es lo que ocurre en todos los procesos de compostaje elaborados
correctamente, puesto que la materia orgánica presente en la matriz es mineralizada
bioquímicamente, por los microorganismos presentes en la matriz (Hernández et al., 2005).
El valor de COT registrado fue menor que el de MOT, lo cual es de esperarse, debido a que la
determinación del % COT se hace con base en el % MOT aplicando un factor matemático (1.72,
ecuación 6), que supone la proporción de COT presente en MOT. Al aplicar dicho factor, se
establece una proporción directa entre MOT y COT, lo cual hace que las curvas presentadas por
cada uno de estos parámetros sigan siempre el mismo comportamiento.
Fig. 4: Determinación de la materia orgánica presente en la Pila de Compost 2.
40
Al cabo de la segunda semana, se observa un aumento del %COT que puede estar relacionado
con el aumento de la biomasa de microorganismos amilolíticos, que para esa semana reportó la
mayor cantidad de UFC/mL. De igual forma, se evidencia un aumento del % MOT, que puede
ser causado por la generación de sustancias húmicas como parte fundamental de la estabilización
del proceso de compostaje (Charest et al., 2003; Said- Pullicino et al., 2007).
Como se dijo anteriormente, el muestreo de la pila se realizó una vez a la semana, por lo tanto,
en esta etapa del experimento no fue posible conocer detalladamente el comportamiento de la
materia orgánica (degradación y formación de nuevos productos).
6.2. Fase I: Producción del Inoculante Mixto
6.2.1. Aislamiento de microorganismos amilolíticos termófilos
Luego de hacer el procesamiento 18 muestras provenientes de las pilas 1 y 2, se lograron aislar 8
microorganismos diferentes, que incluían bacterias filamentosas y no filamentosas. Todas ellas
con actividad amilolítica, en la tabla Nº 5 se describen las características micro y macroscópicas.
Las poblaciones predominantes fueron microorganismos Gram positivos con morfologías
bacilares y filamentosas, pertenecientes al grupo de los actinomycetes. Los actinomycetes han
sido descritos como microorganismos altamente facultados para sobrevivir en compost en
condiciones aerobias y en presencia de materia orgánica contenida en una gran variedad de
sustratos orgánicos. Su alta capacidad para habitar ambientes como el suelo o compost, está
relacionada con la producción de enzimas extracelulares, que le permiten utilizar una gran
variedad de sustratos como fuente energética (Ballows, 1991; Atlas y Bartha, 1987).
41
Tabla Nº 5: Características morfológicas de las cepas con actividad amilolítica obtenidas
durante el asilamiento primario.
Cepa Microscopía Macroscopía
AA1 Filamentos delgados Gram positivos Esporas
Colonias secas y pulverulentas de color
blanco. Envés de color café.
AA2 Bacilos cortos Gram positivos Colonia redondas, pequeñas, cremosas
con bordes traslúcidos
AA3 Bacilos delgados, medianos Gram
positivos
AA4 Filamentos delgados y esporas Gram positivos
Colonias blancas corrugadas con bordes
traslúcidas
AA5 Filamentos delgados Gram
positivos
Colonias secas, corrugadas, de color
blanco.
AA6 Filamentos delgados y cortos Gram
positivos
Colonias puntiformes, pulverulentas de
color blanco en el centro y borde
traslúcido.
AA7 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas cremosas, de color
crema en el centro y bordes traslúcidos
AA8 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas, cremosas de color
amarillo oscuro.
42
Fig. 5. Microscopía de la cepa AA5.
(Fuente: Autores)
Los otros microorganismos aislados, presentaron una morfología bacilar, correspondiente al
género Bacillus sp, reconocido por su capacidad de degradar múltiples sustratos dentro de los
que se encuentra el almidón, y varias especies, son a menudo encontradas durante procesos de
compostaje, debido a su tolerancia a altas temperaturas (Quinceno, 1989).
Luego de hacer los pases en agar almidón 1% (p/v) por triplicado, se obtuvieron tan solo 5
microorganismos puros, que conservaron sus características tanto microscópicas como
macroscópicas y la actividad amilolítica. Las cepas recuperadas fueron AA1, AA2, AA3, AA4 y
AA5.
Posteriormente se midieron los halos de hidrólisis de cada uno de los microorganismos aislados.
Los resultados se muestran en la Tabla Nº6 y en la Fig. 6 los halos de hidrólisis generados por las
cepas AA1 y AA2 respectivamente.
Debido a que tres de los microorganismos asilados en el aislamiento primario no se pudieron
recuperar, se dejaron las cinco cepas restantes para producir el inoculante mixto. Al hacer la
medición de los halos de hidrólisis de cada una de las cinco cepas, se encontró, que la mejor cepa
era la AA1.
43
Tabla Nº 6: Determinación semicuantitativa de la actividad amilolítica de las cepas aisladas
y purificadas.
Cepa Promedio Halo de Hidrólisis (cm)
AA1 2.5
AA2 1.2
AA3 1
AA4 0.5
AA5 0.5
Fig. 6: Microorganismos amilolíticos aislados de muestras de compost. a. Cepa AA1.
b. Cepa AA2.
a. b. (Fuente: Autores)
Koch et al., (1997) reportan que una cepa con actividad enzimática alta, es aquella que genera
halos de hidrólisis con diámetros superiores a 5 mm. Sin embargo, de las cinco cepas aisladas
ninguna presentó valores inferiores al parámetro mencionado.
Debido a que este es un método semicuantitativo, la actividad amilolítica de cada una las cepas,
fue evaluada posteriormente por un método cuantitativo.
44
6.2.2. Selección de cepas por antagonismo
No se presentó antagonismo ninguno entre las cinco cepas evaluadas (tabla Nº 7), por lo cual son
considerados aptos para su utilización en el inoculante mixto.
Tabla Nº 7: Resultados de las pruebas de antagonismo realizadas con las 5 cepas aisladas.
Cepa AA1 AA2 AA3 AA4 AA5
AA1 - - - - -
AA2 - - - - -
AA3 - - - - -
AA4 - - - - -
AA5 - - - - -
De manera simultánea, se hicieron controles de los microorganismos a evaluar como antagonista,
sembrándolos por separado en el mismo medio y bajo las mismas condiciones de incubación,
con el fin de garantizar su viabilidad y conservación de la actividad amilolítica.
6.2.3. Curvas de Crecimiento
La actividad amilolítica inicial de todas las cepas fue muy cercana, reportando valores desde
26137 UA y 26554 UA, para las cepas AA2 y AA4 respectivamente (Fig. 7). Valores altos,
comparados con lo reportado por Goya et al., (2005), de 9396 UA en la degradación de harina de
papa.
45
Fig. 7: Cuantificación individual de la actividad amilolítica de los microorganismos
aislados.
Todas las cepas excepto la AA5, mantuvieron la producción de enzimas del tiempo cero, durante
las primeras 2 horas, mientras que la cepa AA5 mostró un incremento de casi 1000 UA durante
el mismo periodo de tiempo, esto indica una fase de adaptación de todas las cepas excepto AA5.
Las cepas AA1 y AA5, luego de tener un aumento en la producción de amilasas, mostraron una
disminución de la misma al cabo de 8 horas y un posterior aumento de la actividad amilolítica.
En el primer caso (AA1), esta disminución en la actividad puede estar referida a una inhibición
por producto (Mathews et al., 2002), puesto que en la hora 6 se observó la máxima producción
de amilasas e inmediatamente después se produjo el descenso. Si bien para AA5 el descenso no
estuvo antecedido por la máxima producción, el valor inmediatamente anterior es muy cercano al
máximo y además alto (25000 UA), por lo cual también puede ser considerada una inhibición
por producto.
Las cepas que reportaron mayor actividad enzimática fueron AA1 y AA2, que fue lo estimado
previamente, al hacer la determinación semicuantitativa de la actividad enzimática. Seguidas por
las cepas AA3, AA4 y finalmente AA5 con la menor producción.
46
De manera simultánea a la cuantificación de la actividad enzimática, se determinó el crecimiento
en biomasa (Fig. 8) de los diferentes microorganismos aislados, por medio del recuento en placa
en agar almidón 1% (p/v).
Fig. 8: Curva de Crecimiento de los microorganismos aislados, en medio almidón 1% (p/v).
Al determinar el comportamiento de la biomasa para cada uno de los microorganismos, se halló
que las cepas AA1, AA2 y AA3, presentaron una fase de adaptación que tuvo una duración de 2
horas. Esta fase de adaptación coincide con el comportamiento constante que presentó la
actividad amilolítica para estos microorganismos, durante el mismo intervalo de tiempo. A partir
de la hora 2, estas cepas incrementaron la actividad amilolítica en 8000 UA, lo cual se vio
reflejado en un aumento repentino de la biomasa celular que incrementó en 2 unidades
exponenciales, para los dos microorganismos.
Por su parte, las cepas AA4 y AA5 no evidenciaron una fase de adaptación sino que presentaron
un aumento proporcional en las UFC/mL, que en el caso de la cepa AA5 coincide con el
incremento en la actividad amilolítica reportada desde el tiempo cero.
Las cepas que evidenciaron mayor aumento en su biomasa fueron AA1 y AA2, lo que era de
esperarse puesto que estas dos cepas fueron las que sintetizaron mayor cantidad de amilasas.
Además para las dos cepas la máxima biomasa reportada estuvo antecedida por el valor máximo
de actividad amilolítica.
47
6.2.4. Curva de Crecimiento del Inoculante Mixto
Una vez identificado el comportamiento cinético individual de las cinco cepas, se llevó a cabo la
determinación de los mismos parámetros cinéticos para el inoculante mixto. Para la cual, una
unidad amilolítica fue definida como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µg de azúcares
reductores/ mL* h.
El valor inicial de la actividad amilolítica fue 7546, 33 UA (Fig. 9), que si bien fue menor que
todos los valores reportados en las cinéticas individuales, no se presentó un valor constante de las
UA entre las horas 0 y 2, como sucedió con algunas cepas. Por el contrario, en las primeras dos
horas, se produjo un incremento de casi 31000 UA, este comportamiento era lo que se esperaba,
puesto que los microorganismos habían sido enriquecidos en el pre-inóculo y debían estar
activos metabólicamente.
Fig. 9: Cuantificación de la Actividad Amilolítica y la biomasa del Inoculante Mixto
Luego del incremento en la actividad enzimática, se produjo una estabilización de la misma, que
se mantuvo en un rango entre 40000 y 45000 UA, valores mayores a los demostrados por cada
cepa de manera individual, lo que indica una mayor degradación de sustrato por parte del
consorcio microbiano (Ayala et al, 2001). Así mismo, se observó un comportamiento bastante
estable de la actividad amilolítica entre las horas 4 y 14, lo que sugiere que el consorcio
microbiano adquiere una mayor estabilidad en la producción de amilasas.
48
Al analizar el recuento de las UFC/mL, tampoco se presentó una fase de adaptación (Fig. 9),
puesto que los microorganismos fueron mezclados cuando estaban todos en fase exponencial (1*
106). La tendencia del crecimiento exponencial, se mantuvo a lo largo de las 12 horas de
muestreo, durante las cuales se produjo incrementos de 1 unidad exponencial por hora de
muestreo. Los incrementos en la biomasa, no resultan muy distantes de aquellos obtenidos con
cada una las cepas de manera individual, debido a la estabilidad enzimática presente en el
inoculante mixto, no obstante, los recuentos de biomasa fueron mayores que en las cinéticas
particulares, debido a la actividad enzimática y también al suministro adicional de aire que se les
dio.
Se logró obtener una biomasa máxima de 2*1028 UFC/mL y una actividad amilolítica de 11020
UA en la hora 22. Si bien los microorganismos no presentaron de manera individual, aumentos
en la biomasa ni en la actividad amilolítica por periodos de tiempo tan prolongados, en el
inoculante mixto, se obtuvo tal diferencia, gracias a la cantidad adicional de oxigeno proveído.
Este inoculante se llevó a evaluación en campo durante la fase II.
6.2.5. Fase II: Evaluación del Inoculante Mixto en campo
Con el fin de controlar de una mejor manera los factores externos al proceso, para la fase II de
evaluación, el área de compostaje fue modificada. Se aumentaron sus dimensiones, se cambió el
plástico del techo por uno de mayor resistencia para proteger las pilas del agua lluvia y se
adicionaron paredes en plástico también, con el fin de conservar mejor la temperatura bajo el
techo.
Para la evaluación del inoculante mixto en campo, se determinaron parámetros como la biomasa
de microorganismos amilolíticos presentes en el compost, temperatura, pH, %MOT, %COT y
actividad amilolítica. La actividad amilolítica fue determinada, luego de ensayar dos métodos de
extracción de amilasas, uno con buffer citrato y el otro con buffer Sorensen.
49
6.2.5.1. Comparación entre los dos métodos de extracción de amilasas
Al determinar la actividad amilolítica presente en las pilas, por los dos métodos de extracción, se
encontraron grandes diferencias entre los datos obtenidos para una misma muestra. Las unidades
amilolíticas fueron definidas para los dos métodos de extracción, como la cantidad de enzima
capaz de liberar 1µg de azúcares reductores/ g*h.
Se encontró que el método que lograba extraer una cantidad mayor de amilasas fue el que emplea
buffer citrato, que para la pila con inoculante mixto en el tiempo cero indicó 41 UA, comparado
con 4.28 UA extraídas con el método del buffer Sorensen (Fig.10).
Sharada y Sanjat (2004) en su estudio, extrajeron amilasas con el fin de evaluar la actividad
amilolítica presente en una muestra de suelo. En ese estudio, se hallaron múltiples valores de
UA, desde 8.4 hasta 116 UA, encontrándose la mayoría de los valores alrededor de 60 UA. De
acuerdo a estos valores de referencia, es claro, que la cantidad de amilasas extraídas con este
método y bajo las condiciones de operación, no fue lo suficientemente eficaz. Aún más, cuando
se obtuvieron valores hasta diez veces más altos con el otro método.
Fig. 10: Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila con Inoculante luego
de utilizar dos métodos de extracción de amilasas.
Luego de realizar el análisis t- student para determinar las diferencias entre los métodos de
extracción enzimática, se rechazó la hipótesis nula (p < 0.0001) (Fig. 12) encontrándose que el
método de extracción con buffer citrato fue el que cuantificó más UA. A partir de este estudio, se
50
puede considerar un buen método porque presentó menor desviación en los datos y una mayor
extracción de amilasas, además de una mayor estabilidad en el color luego de realizar Somogyi-
Nelson.
En la pila Control no se presentaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la
cantidad de UA cuantificadas luego de realizar la extracción con los dos métodos, con p > 0.05
(Fig. 11). Aunque se reportan diferencias para el tiempo cero de 15.73 UA con buffer citrato
frente a 1.95 UA extraídas con el método del buffer Sorensen (Fig. 12 a.). Los métodos no
muestran una diferencia significativa entre si, debido a que las medias de cada técnica presentan
valores similares. Sin embargo, el método de extracción con el buffer citrato logra hacer una
mayor extracción de enzimas a partir del día ocho. Si bien el buffer citrato logra hacer una mayor
extracción de amilasas, la media de los datos obtenida, es similar a la del buffer Sorensen,
porque en el primer caso, se cuenta con valores muy distantes entre si, que hacen que la media
estadística se ubique en un valor muy cercano al del otro método (Fig. 11).
Fig. 11: Comparación de los métodos de extracción enzimática para cada uno de los tratamientos Pila con inoculante mixto Pila Control
UA
0,5
1
1,5
2
Citrato Sorensen
Buffer Extracción t-Test DF Prob> t 9.845 28 <.0001
UA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Citrato Sorensen
Buffer Extracción t-Test DF Prob> t 2.023 28 0.0527
51
Fig. 12: Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila Control luego de
emplear dos métodos de extracción de amilasas. a. Grafico integrado días 0- 7. b. Actividad
amilolítica con buffer citrato en los días 8- 15.
a.
b.
La diferencia entre los dos métodos de extracción radica en la presencia del tolueno en el método
del buffer Sorensen, puesto que con este método se formaba una solución bifásica, que por una
parte puede impedir la solubilidad de las enzimas extraídas (Peláez et al., 2004) y por otra parte,
es probable que por la temperatura y el tiempo de incubación empleados (55 ºC * 24 horas)
causaran alteraciones en su capacidad de extraer las enzimas. Mientras que el método del buffer
citrato solo formaba una fase acuosa, en la que la solubilización de las enzimas pudo haber sido
mayor.
52
Una vez establecido el método del buffer citrato como el que extrajó mayor cantidad de amilasas,
los valores de actividad amilolítica mencionados en adelante, hacen referencia a aquellos
cuantificados luego de la extracción con dicho método.
6.2.5.2.Cuantificación de la actividad amilolítica de pilas tratamiento y control
Con respecto a la actividad amilolítica para la pila con inoculante (Fig. 10), es evidente un
aumento en la UA entre los días 0 y 2, sin embargo, la actividad amilolítica no permaneció
constante a través del tiempo, puesto que presentó picos de ascenso y descenso de las UA. Esto
puede deberse a cortas inhibiciones en la producción de UA, por exceso de producto (Mathews et
al., 2002).
Si bien se muestran picos de ascenso y descenso en la cantidad de UA para la pila con inoculante
mixto, debe aclararse que la temperatura durante los primeros cinco días, se mantuvo muy
constante, comparado con lo observado en la fase I. Lo cual podría indicar que aún cuando las
UA disminuyen, la temperatura no varía, porque existen otro tipo de actividades enzimáticas
como la celulolítica, que la mantienen constante.
Al aplicar el análisis estadístico de Kruskal Wallis se encontró con p= 0.0001(Anexo 4) que
existen diferencias significativas en la actividad amilolítica presente en la pila tratamiento a
través del tiempo. Esto significa, que no hay un comportamiento estable o constante de la
actividad amilolítica en la pila, sino que la actividad amilolítica fluctúa todo el tiempo.
La actividad amilolítica inicial de la pila control, fue menor comparada con la del inoculante
mixto, reportando 15.7 UA frente a 41.7 UA de la pila tratamiento (Fig. 13 b.), sin embargo,
presentó el mismo comportamiento de picos de ascenso y descenso, guardando las proporciones
en la cantidad de UA de cada una.
No obstante, la pila control al cabo del día 7, presentó un incremento de la actividad amilolítica
de más de 6000 UA con el buffer citrato. Una posible razón de la mayor actividad en la pila
inoculada es la estimulación metabólica previa que tenían los microorganismos presentes en el
53
inoculante mixto, que por encontrarse en un caldo almidón 1% (p/v) en el momento de la
aplicación a la pila; la producción de amilasas era alta mientras que en la pila control los
microorganismos no estaban tan activos, y podría considerarse el intervalo entre los días 0 y 7
como una etapa de adaptación o estimulación de esos microorganismos nativos.
El comportamiento descrito por la pila control reportó también diferencias estadísticamente
significativas con respecto a la actividad amilolítica y el tiempo (p < 0.0001, Anexo 4),
presentando la mayor actividad en el día 7 y sugiriendo fluctuaciones de la actividad amilolítica,
que respalda el argumento de que la cantidad de UA es afectada negativamente por la
concentración de producto presente en la matriz (Mathews et al., 2002).
El análisis estadístico t- student aplicado para determinar diferencias significativas entre la
actividad amilolítica presente en cada uno de los tratamientos, arrojó un valor de p= 0.2540 (Fig.
13) por el cual se acepta la hipótesis nula que afirma que no existen diferencias entre los
tratamientos. Si bien durante los primeros 7 días las pilas mostraron diferencias grandes en los
valores obtenidos de UA, la pila control mostró un aumento significativo en las UA, logrando así
que el resultado final de los dos procesos fuera muy similar.
Fig.13: Comparación estadística de las actividades amilolíticas entre pilas tratamiento y
control
UA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Control Inóculo
TTO
1-way Test, ChiSquare Approximation
Prob>ChiSq 0.2540
54
Durante los primeros 4 días, las dos pilas redujeron sus dimensiones notablemente, situación
esperada como consecuencia del proceso de degradación y mineralización del material Ayala et
al (2001). Luego de emplear una cantidad cercana a 1000 Kg de lechuga se obtuvo 300 Kg de
compost maduro.
6.2.5.3. Cuantificación de la biomasa amilolítica presente en las pilas tratamiento y control
La pila con inoculante mixto mostró un recuento de biomasa amilolítica inicial mayor a los
observados en la fase I y en la pila control. Si bien este valor es alto, no corresponde a la biomasa
determinada en el inoculante mixto antes de la aspersión, debido a la disminución de los
microorganismos del inoculante por la presencia de otros microorganismos en la pila y por el
cambio de las condiciones en las que estaban.
Las dos pilas alcanzaron los recuentos máximos al cabo del tercer día, incremento que
corresponde a los picos de descenso de UA de las dos pilas, sustentando la afirmación que las
UA disminuyen por inhibición por producto.
Fig. 14: Recuento de biomasa amilolítica en las Pilas Control y con Inoculante.
Aún cuando se puede establecer una relación entre las UA y la biomasa amilolítica presente en
los dos tratamientos, estadísticamente no se encontró una dependencia entre ellos. Con valores
de p> 0.05 y r2 de 0.359 y 0.018 (Anexo 5) para la pila con inoculante mixto y la control
respectivamente. Lo cual indica una correlación del 35% y el 1.8 % para cada uno de ellos, es
55
decir, que la actividad amilolítica no depende directamente de la biomasa y por lo cual no se
puede establecer una proporcionalidad entre los valores de UA y biomasa amilolítica, para el
caso estudiado. O también que los microorganismos presentes en las pilas, cuentan con sistemas
enzimáticos muy eficientes, por lo que la biomasa presente es capaz de degradar el sustrato
presente en tan poco tiempo y con tal eficacia.
Al cabo del día 11, se evidencia un comportamiento de estabilización de la biomasa para las dos
pilas, como resultado de la disminución de la temperatura y el agotamiento del sustrato.
6.2.5.4. Cuantificación de los porcentajes de MOT y COT
En la fase II se decidió realizar la cuantificación de la materia orgánica por vía seca
(calcinación), ya que este método es más práctico y económico en relación con el de la fase I y
también es aplicable a muestras de compost (IHSS, 1996).
La determinación del contenido de materia orgánica en las muestras en el día 1 del proceso, se
llevó a cabo por vía húmeda y calcinación (tabla Nº 8), con el fin de comprobar la concordancia
entre las dos técnicas. Se evidenció que los dos métodos arrojan resultados similares para una
misma muestra, al menos para el caso estudiado, este resultado se puede deber a que la muestra
analizada estaba compuesta por sustratos de estructuras simples que son fácilmente oxidables,
por lo tanto es posible que el dicromato reaccionara con toda la materia orgánica presente.
Según Magdoff y Weil, 2004 cuando se realiza la determinación del % MOT por calcinación los
valores obtenidos son generalmente 25% más altos que aquellos reportados por vía húmeda
puesto que estima el total de MO presente en una muestra por la pérdida de peso al someterla a
una temperatura lo suficientemente alta como para volatilizar todo el material orgánico. Por otra
parte, el método de Walkley y Black muestra ciertas desventajas en comparación con la vía seca
como el gasto de reactivos, la oxidación de la sal ante la luz, las variaciones en los resultados del
blanco, el factor de corrección que se le debe realizar a los resultados debido a que según la
norma mexicana NMX-AA-021-1985 la reacción tiene una eficiencia del 72% y finalmente la
poca efectividad por parte del dicromato para oxidar compuestos aromáticos complejos como
56
sustancias húmicas presentes en la materia orgánica (Rumpel et al., 2007; Knicker et al., 2007).
Esta última razón indica que si se cuantifica % MOT por ambos métodos para una muestra de
compost en un estado más avanzado del proceso, los resultados seguramente no serían similares.
Tabla 8. Resultados %MOT al cabo del segundo día de compostaje por vía húmeda y seca.
Método % MOT pila control % MOT pila con
inoculante
Vía húmeda 63. 493 52.083
Vía seca 63.200 53,132
El % MOT inicial en la fase I fue mayor que el de la fase II (fig. 5 y 15), porque el material
empleado en la segunda fase se encontraba más degradado, a causa del tiempo de recolección del
material, que fue de 5 días, tiempo en el cual se inició el proceso de mineralización, que redujo la
cantidad de materia orgánica presente en la mezcla.
Fig. 15: Comportamiento la materia orgánica (% m/m) en las pilas tratamiento y control.
El porcentaje inicial de MOT depende directamente de los materiales a compostar, al igual que la
tasa de degradación (Bernal et al., 1998). El % MOT en una matriz de estudio, puede variar de
acuerdo a los materiales que contenga. En un estudio realizado por Huang et al., 2005 el
porcentaje de MOT inicial era del 64% a partir de heces de vaca y pollo, paja, residuos de
champiñones y salvado de arroz, mientras que en un estudio realizado por Sebastia et al., 2007
57
fue del 96.3% a partir de residuos de plantas coníferas, demostrando así que según el material
compostado se pueden encontrar diversos porcentajes de MOT inicial.
Como se observa en la fig. 16 a medida que transcurre el tiempo hay una disminución en el
porcentaje de materia orgánica total, lo cual se debe a la mineralización por parte de los
microorganismos presentes en el compost (Zbytniewski y Buszewski, 2005; Castaldi et al., 2005;
Zmora-Nahum et al., 2005). No obstante, las dos pilas reportaron incrementos en el % MOT en
diferentes momentos, comportamiento que puede deberse a que durante el proceso de
compostaje hay degradación del sustrato y síntesis de nuevos compuestos, como sustancias
húmicas responsables de la estabilidad del producto final (Charest et al., 2003; Said-Pullicino et
al., 2007). Hernández et al., 2005 reportaron que en un compost que contenía lodos residuales se
encontraban altas cantidades de ácido acético al final del proceso por la pirólisis de la formación
de nuevos carbohidratos. Por otra parte, el que este fenómeno ocurra primero en la pila con
inoculante hace pensar que el proceso estaba ocurriendo más rápido en dicha pila.
El test t-studient mostró un p= 0.796 lo que quiere decir que no hay diferencias significativas en
el contenido de MO en las dos pilas (Anexo 6). Al analizar el comportamiento de la MO frente al
tiempo, se encontraron valores de p= 0.0004 y p= 0.0005 para el tratamiento y el control,
respectivamente lo que indica que hay diferencias estadísticamente significativas en los dos
casos.
Existen diferentes teorías respecto a la cantidad de COT presente en la MO, Magdoff y Weil,
2004 establecen que el 77% de la MO es CO mientras que otros autores como Faithfull N, 2005
y Zmora-Nahum et al,2005 proponen que es solo del 58%. Al final del proceso el % COT para la
pila con inoculante y control fue 33,3% y 29,5% respectivamente (Fig. 16), lo cual según la NTC
5167 de 2004 para abonos orgánicos indica que el producto final es de buena calidad, ya que la
norma pide que el % COT se encuentre por encima del 15%. Este resultado coincide con el
obtenido por Huang et al., 2005 donde el porcentaje de COT al final del proceso de compostaje
(63 días) se encontraba alrededor del 33%.
58
Fig. 16: Carbono Orgánico Total presente en las pilas tratamiento y control
Las sustancias húmicas son resistentes a la degradación y la mayoría de sus componentes
contienen carbono orgánico en el compost maduro; por esta razón la disminución en el carbono
orgánico es un buen indicador de la madurez del producto final (García et al., 1991; Inbar et al.,
1991; Zmora-Nahum et al., 2005). Bernal et al., (1998) encontró que el carbono orgánico está
altamente correlacionado con la cantidad de carbono mineralizado, observando esto en siete
compost realizados a partir de desechos agrícolas y residuos municipales. Las altas tasas de
mineralización en un compost inmaduro pueden causar efectos perjudiciales sobre el crecimiento
de las plantas ya que generan la competencia por el nitrógeno y el oxígeno.
6.2.5.5. Análisis de la temperatura y el pH
La temperatura a lo largo del proceso se comportó de forma similar en ambas pilas (Figura 17),
demostrando que aunque la pila con inoculante poseía en teoría una mayor cantidad de
microorganismos termófilos, en realidad este hecho no sirvió para marcar una diferencia
estadísticamente significativa respecto a la pila control con un p = 0.796 (Anexo 7). Esto se
puede deber a varias razones; primero a que los microorganismos del inoculante demostraron
una actividad óptima en el laboratorio a los 55 ºC, temperatura que no se logró en campo, debido
la incapacidad de las pilas de mantener el calor o también a las dimensiones de las mismas.
Por otra parte, es bien conocido que después de agregar un inoculante, la biomasa de este
disminuye por el cambio drástico de ambiente representado en la interacción con otros
microorganismos y la presencia de otras fuentes nutricionales; y finalmente, a que los
59
microorganismos del inoculante fueron aislados de las pilas de compost elaboradas en la fase I,
por lo tanto la pila control también poseía las mismas poblaciones microbianas y al añadir el
agua melaza se estimuló el aumento de dichos microorganismos, quienes a su vez incrementaron
la actividad amilolítica luego de un periodo de 7 días (Fig. 12).
Fig. 17: Temperaturas alcanzadas por las pilas tratamiento y control.
En los primeros 6 días del proceso, la temperatura se mantuvo alrededor de los 40 ºC, que fue la
más alta alcanzada durante todo el proceso. En estos primeros días fue cuando ocurrió el mayor
cambio del material compostado, ya que la pila disminuye drásticamente de tamaño, y la lechuga
fue degradada casi por completo.
A partir del día 7 se observó un descenso constante en la temperatura hasta alcanzar su valor el
cual para la pila control fue de 20 ºC y para la pila con inoculante de 18 ºC (Fig. 17). Según
Saebo y Ferrini (2006), el pH y la temperatura son dos variables dependientes entre sí, de tal
manera que a medida que aumenta la temperatura del compost, se espera un descenso en el pH.
Esto ocurre debido a que los microorganismos mineralizan los sustratos presentes en las pilas
generando calor a partir de sus reacciones metabólicas (lo que explica el aumento de la
temperatura) y se generen ácidos orgánicos que bajan el pH (Avendaño, 2003).
Todo lo anterior concuerda con lo observado en la figura 18, ya que en los primeros días
mientras la temperatura incrementó, el pH disminuyó y alrededor del día 7 aumentó como
consecuencia de la formación de amoníaco y el consumo de los ácidos producidos en los
60
primeros días (Guerra et al., 2001), hasta neutralizarse al final del proceso debido a las
propiedades naturales de tampón de la materia orgánica (Graves, 2000). Finalmente se puede
decir que según los valores finales tanto de la temperatura como del pH en ambas pilas el
compost ya se encontraba maduro en el día 15 del proceso (Saebo y Ferrini., 2006).
Fig. 18. Comportamiento del pH en las pilas Control y con Inoculante
Finalmente, se encontró que en cuanto al pH tampoco se presentaron diferencias
estadísticamente significativas entre los tratamientos (p= 0.92, Anexo 7), lo que indica que en
términos generales los procesos de descomposición en las pilas fue muy similar.
6.2.5.6. Características Fisicoquímicas obtenidas en los tratamientos
Se determinaron las características fisicoquímicas de cada uno de los tratamientos y se
compararon con los valores de referencia exigidos por la NTC 5167/04. Los análisis fueron
llevados a cabo por Agrilab, laboratorio certificado por el ICA.
En la tabla Nº 9 se puede apreciar que los valores para la mayoría de los parámetros evaluados
no difieren mucho entre el tratamiento y el control, puntualmente en aspectos importantes como
C/N, pH y nitrógeno orgánico, cumpliendo con los parámetros fisicoquímicos exigidos por la
norma.
La caracterización fisicoquímica (tabla Nº 9) pone de manifiesto la excelente calidad del abono
orgánico obtenido en los dos casos. Una relación C/N de 11 y 12 para el tratamiento y control,
61
que según la NTC 5167 debe ser inferior a 25 y cercana a 15 según Ribeiro et al.,(2007). De
igual forma, Ballesteros (2001) propone que el carbono disminuye debido a que el carbono se
convierte en anhídro carbónico, por lo cual la relación C/N debe alcanzar un valor cercano a 10/1
al concluir el proceso; esto concuerda con los resultados obtenidos por Kalil et al (2007) donde
después de 75 días de compostaje de residuos de plaza, poda y contenido ruminal, obtuvo una
relación C/N final de 11.
Las diferencias en los valores de MOT y COT reportados por Agrilab (tabla Nº 9) y los
obtenidos en el Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Suelos, radica en los métodos
empleados, puesto que ellos utilizan Walkley y Black, mientras que para este caso se empleó
calcinación.
El pH es otro parámetro importante, puesto que la aplicación de un compost con pH muy ácidos
o alcalinos, puede afectar la estabilidad del suelo acidificándolo o alcalinizándolo. En los dos
casos, los valores fueron muy cercanos a 7, lo cual demuestra la estabilidad y madurez del
compost obtenido.
La humedad fue un parámetro que no cumplió ninguno de los dos productos finales, dado que
fue mayor a 35%, sin embargo, el compost puede ser sometido a un proceso de secado,
extendiéndolo en una superficie plana, de tal manera que logre secarse. La pila con inoculante
resultó tener un mayor porcentaje de humedad que la pila control, en parte debido a que los
microorganismos fueron adicionados en suspensión y esto puedo contribuir al aumento de la
humedad.
El contenido tanto de macro como de microelementos del compost, cumple con la normatividad
colombiana vigente, sugiriendo el alto valor nutricional que tiene el abono como tal y
respondiendo a la efectividad y calidad del proceso. Además, se puede establecer que aún cuando
el tiempo de compostaje fue reducido en más del 50 % con respecto a la fase I, se conservó la
calidad fisicoquímica del producto final.
62
Tabla Nº 9: Características fisicoquímicas del compost obtenido durante la fase II.
UNIDAD PILA CONTROL
PILA INOCULANTE
MIXTO
LIMITES PERMITIDOS (NTC 5167/04)
FISICOQUIMICA
pH 6.86 6.87 5-8
Densidad Aparente
g/mL 0.54 0.56 MENOR DE 0.6
Humedad % 46.6 53.5 MENOR DE 35
C.I.C meq/100g 55.6 59.2 MAYOR DE 30
C/N 12 11 MENOR DE 25
Carbono orgánico
Oxidable
% 19
17.8
MAYOR DE 15
Nitrógeno % 1.59 1.57 DECLARARLO SI SON MAYORES DE
1% Fósforo % 1.07 1.12
Potasio % 2.39 2.57
Calcio % 1.22 1.27
Magnesio % 0.49 0.54
Azufre % 0.21 0.21
Boro ppm 21 23
Cobre ppm 13 12
Manganeso ppm 245 213
Hierro % 0.47 0.50
Zinc % 115 109
Sodio % 1450 1400
(Fuente: Agrilab, 2007)
6.2.5.7. Calidad microbiológica del compost obtenido
Existe un importante aspecto de salud relacionado con la aplicación del compost, el cual está
dado por la incidencia de enfermedades producidas por los microorganismos patógenos durante
la disposición y utilización insalubre de estos productos. Buenas prácticas agrícolas y de higiene
63
son necesarias para proteger los cultivos de la contaminación con los patógenos presentes en
estos biofertilizantes, además de que se precisan de más investigaciones para determinar como se
propagan en el campo estos microorganismos (Gómez et al., 2004).
Los resultados obtenidos por el CIAA se muestran en la tabla 10, en la cual se observa la
presencia de Salmonella sp. y E. coli en el compost obtenido a partir de las dos pilas.
Tabla Nº 10: Caracterización microbiológica del compost
Tratamiento Análisis Resultado
Inoculante Mixto Recuento de E. coli por NMP 480 NMP/g
Recuento de Salmonella sp. Por NMP 1,01 NMP/4g
Control Recuento de E. coli por NMP >2400 NMP/g
Recuento de Salmonella sp. Por NMP < 0.59 NMP/4g
De acuerdo con la norma chilena 2880 de 2004, la cantidad de Salmonella sp debe ser < 3 NMP/
4g, indicando que con respecto a este microorganismo patógeno el compost obtenido por los dos
tratamientos cumplen con los requisitos sanitarios impuestos por la norma. Sin embargo, el valor
permisible para coliformes es < 1000 NMP/g, como se observa en la tabla 10, el compost
obtenido para el control reporta para E. coli un valor superior, por lo cual debe ser reportado
como no apto para su uso en cultivos. Mientras que para el compost obtenido por tratamiento con
inoculante mixto, se observa que para E.coli el valor es inferior al requerido por la norma, por lo
cual, podría utilizarse en los cultivos de lechuga.
E.coli no es considerado un microorganismo patógeno si no un indicador de contaminación fecal,
por lo tanto la presencia de esta bacteria en el compost puede estar dada por una mala higiene por
parte de lo trabajadores de la finca o el uso de pasto que tuvo contacto con los animales. Por otra
parte, este microorganismo es encontrado normalmente en el suelo, el problema consiste en que
cuando la temperatura alcanza los 37 °C su población aumenta pudiendo ser un riesgo para la
salud de las personas si se aplica el compost al cultivo.
La incidencia de Salmonella sp. y E.coli en primer lugar se debe a que la temperatura no fue lo
suficientemente alta y duradera como para eliminar estos microorganismos durante el proceso de
64
compostaje, que como Ribeiro et al, 2007 reportan, debe ser mayor a 40 ºC y con una duración
mayor a una semana. Dado que ninguno de los dos tratamientos logró este comportamiento, era
de esperarse que los microorganismos persistieran. Por otro lado, el tiempo y la temperatura
necesaria para eliminar o reducir los peligros microbianos en el compost u otras materias
orgánicas puede variar según el clima de la región y las prácticas concretas de gestión ambiental
aplicadas en cada caso (FAO, 2000).
Pietronave et al, 2004 afirman que una gran variedad de microorganismos patógenos pueden ser
encontrados en las materias primas empleadas en un proceso de compostaje, siendo la causa mas
frecuente de contaminación el contacto de los materiales con heces fecales. Sin embargo, Islam
et al., (2005) asegura que la contaminación puede provenir de otras fuentes como riego con agua
contaminada, contacto con compost no apto microbiológicamente, suelo, aire y manipulación
humana.
Una de las actividades incluidas en la siembra de lechuga en la “Hacienda Villa Amparo”
incluye la aplicación de compost proveniente del cultivo de flores. Debido a que no se tienen
datos de la calidad de dicho compost y que según Lyon, 2000 los microorganismos patógenos
pueden sobrevivir en el compost hasta 60 días, se podría pensar en este como una fuente de
contaminación.
Por otra parte, Islam et al., (2005) reporta que organismos como E.coli, pueden sobrevivir en el
suelo hasta por 196 días. Teniendo en cuenta lo anterior, se puede decir que el suelo fue un factor
importante de contaminación, puesto que en un principio el suelo estaba descubierto y propenso
al contacto con aire, lluvia y heces de animales, además del hecho de que la impermeabilización
del suelo era parcial, por lo que con los volteos las pilas en algún momento estuvieron en
contacto con el suelo.
65
7. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que:
1. Se logró aislar exitosamente cinco cepas de microorganismos amilolíticos, descritas
como AA1, AA2, AA3, AA4 y AA5. Reportándose AA1 y AA2 como las cepa con
mayor actividad amilolítica con valores máximos de 41509 UA y 40077 UA,
respectivamente.
2. Se logró obtener compost a partir de residuos de lechuga, cascarilla de arroz y poda de
pasto kikuyo, demostrando que con el uso en determinada proporción de estos
materiales se puede lograr la relación C/N optima para obtener un compost
fisicoquímicamente de buena calidad (nitrógeno, fósforo y potasio mayor a 1%, pH
neutro y relación C/N menor a 25) de acuerdo a la Norma Técnica Colombiana 5167 de
2004.
3. Se cuantificó la actividad amilolítica como indicador del progreso del proceso de
degradación de la materia orgánica, encontrándose una mayor producción de amilasas en
la pila tratamiento.
4. La evaluación del método de extracción enzimática, permitió demostrar estadísticamente
que la extracción con buffer citrato fosfato resulta mucho mejor en la recuperación de
amilasas a partir de muestras de compost.
5. El porcentaje de materia orgánica inicial para las pilas tratamiento y control se encontró
alrededor del 70%, aunque el tratamiento presentó una mayor degradación durante la
primera semana en comparación con la pila control. Sin embargo, al final del proceso las
dos pilas reportaron valores para MOT similares, permitiendo concluir que aunque el
inoculante mixto acelera el proceso en un principio, las características finales del
compost obtenido por los dos métodos son muy similares para los dos tratamientos.
66
8. RECOMENDACIONES
A partir de esta experiencia se sugiere:
Evaluar diferentes mezclas y materias primas manteniendo la relación C/N inicial de 25 a
30, para evaluar si dichas mezclas logran tener un efecto en la temperatura,
aumentándola y manteniéndola por más tiempo.
Asegurarse de que la zona de compostaje este totalmente aislada del medio exterior, con
el fin de reducir al máximo las fluctuaciones de temperatura en las pilas, debidas a los
impactos ambientales no controlados que varían el proceso.
Cuantificar el porcentaje de materia orgánica (MOT) por vía seca o calcinación, puesto
que este método muestra menos desventajas respecto a la vía húmeda.
Evaluar si bajo diferentes condiciones de temperatura y tiempo de incubación, la
eficiencia en la extracción de las amilasas mostrada en este estudio por el método del
buffer citrato, se mantiene con respecto al método del buffer Sorensen.
67
9. BIBLIOGRAFIA
Adani. F., Genevini. P., Ricca. G., Tambone. F y Montoneri. E. 2007. Modification of soil humic
matter after 4 years of compost application. Waste Management 27: 319 – 324.
Alexander, M. 1987. Introduction to Soil Microbiology. Segunda 67élulas. John Wiley Inc. New
York, Estados Unidos. 4, 196 – 201, 148 – 162 p.
Alexander. M. 1980. Introducción a la microbiología del suelo. México. 163-218, 270-291 p.
Alfaro I. y Pinzón M., 2001. Aislamiento y caracterización de bacterias mesofílicas aerobias con
actividad amilolítica y proteolítica a partir de compost elaborado con residuos de café. Pregrado.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá
93p
Avendaño D. 2003. El proceso de compostaje. Pontificia Diversidad Católica de Chile. Facultad
de Agronomía e Ingeniería Forestal. Departamento de Fruticultura y Enología. Director Claudia
Bonomelli de Pinaga. 1 – 38 p.
Atlas, R. Bartha, R. 1987. Microbial Ecology: Fundamentals and applications. Benjamin
Cummings Publishing Company. Segunda 67élulas. California, Estados Unidos. 37- 39 p.
Ayala. S., Sánchez. D., Martinez. M.M y Pedroza. A. M. 2001. Caracterización y 67élulas67io
de la actividad pectinolítica y celulolítica de mcroorganismos aislados a partir de deshechos
cítricos. Tesis de pregrado. Pontifica Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento
de Microbiologia. Bogotá. 32- 65 p.
Badiane. N., Chotte. J. L., Pate. E., Masse, D y Rouland. C. 2001. Use of soil enzyme activities
to monitor soil quality in natural and improved fallows in semi – arid tropiacal regions. Applied
soil ecology 18: 229 -238.
68
Ballesteros,M.2001.Caracterización química de procesos de compostaje, determinación de
parámetros de calidad de compost y evaluación del efecto sobre el aluminio en un oxisol. Tesis
de pregrado en Química. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias.
Departamento Química. Bogotá. 1-18p.
Ballows, A. 1991. The prokaryotes: a handbook of biology of bacteria: ecophisiology, isolation,
identification, application. Springer-Verlag. Segunda Edicion. Volumen 2. New York. Estados
Unidos. Capítulos 20 – 35 – 41.
Barrington S., Choiniere D., Trigui M y Knight W. 2001. Effect of carbon source on compost
nitrogen and carbon losses. Bioresource Technology 83: 189–194
Beck-Friis, B., Smårs, S., Jönsson, H., Eklind, Y y Kirchmann, H. 2003. Composting of source
separated household organics at different oxygen levels: Gaining an understanding of the
emission dynamics. Compost Science & Utilization 11: 41-50.
Bernal, M., Navarro, A.F., Sanchez-Monedero, M., Roig, A y Cegarra, J., 1998. Influence of
sewage sludge compost stability and maturity on carbon and nitrogen mineralization in soil. Soil
Biology & Biochemistry 30: 305–313 p.
Bertoldi M., Vallini G y Pera A. 1985. Technological aspects of composting including
68células68i and microbiology. In: Gasser, J.K.R. (Ed.), Composting of Agricultural and Other
Wastes Proc. Seminar Environ. Res. Prog. Elsevier Applied Science Publishers, New York. 27 –
40 p.
Beuning J., Pattey E., Edwards G y Van Heyst B. 2007. Improved temporal resolution in
process-based 68élulas68 of agricultural soil ammonia emissions. Atmospheric Environment: 1 –
13.
Block D. 1998. Composter teams up with lettuce grower. BioCycle Agriculture Journals 39: 4.
69
Brady. N y Weil. R. 1999. Soil organic matter. Upper Saddle River, New Jersey. The Nature and
Properties of Soils. 446–490 p.
Boulter-Bitzer. J., Trevors. J y Boland. G. 2005. A polyphasic approach for assessing maturity
and stability in compost intended for suppression of plant pathogens. Applied Soil Ecology 34:
65–81.
Calderón F. 2002. La cascarilla de arroz “caolinizada”; una alternativa para mejorar la retención
de humedad como sustrato para cultivos hidropónicos. Dr. Calderón Asistencia Técnica Agrícola
Ltda. Bogotá D.C., Colombia. 25 p.
Castaldi. P., Alberti. G., Merella. R y Melis. P. 2005. Study of the organic matter evolution
during municipal solid waste composting aimed at identifying suitable parameters for the
evaluation of compost maturity. Waste Management. 25: 209–213.
Cayuela M., Mondini C., Sánchez M., Roig A. 2007. Chemical properties and hydrolytic enzyme
activities for the characterisation of two-phase olive mill wastes composting. Bioresource
Technology. 1-8.
Cooperband L. 2000. Biología del compostaje. Universidad de Winsconsin – Madison.
Departamento de ciencias del suelo. 1 – 5 p.
Coyne, M. 1999. Los microorganismos del suelo y la calidad del ambiente: Un enfoque
exploratorio. ITP-Paraninfo. España. 10 p.
Chan, Y., Vowles,P. Mctainsh G., Simpson R.., Cohen, D y Bailey, G. 1995. Use of a modified
walkley-black method to determine the organic and elemental carbon content of urban aerosols
collected on glass fibre filters. Chemosphere 31: 4403-411,1
Charest, M.H., Antoun, H y Beauchamp, C.J., 2003. Dynamics of watersoluble carbon
substances and microbial populations during the composting of de-inking paper sludge. Biores.
Technology 91: 53–67.
70
Dávila, D. López y L.; Pedroza, A. 2002. Evaluación de diferentes soportes para la
preformulación de un producto termófilico acelerador del compostaje. Titulo Microbiólogo
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad De Ciencias Básicas, Departamento te
Microbiología. Bogotá.
Departamento administrativo nacional de estadística (DANE)., Ministerio de Agricultura y
desarrollo rural., Sistema de información del sector agropecuario y pesquero colombiano
(SISAC). 2003. Censo Hortícola de la Sabana de Bogotá 2002. Bogotá.
Deng, S y Tabatabai, M.A. 1994. Colorimetric determination of reducing sugars in soils. Soil
Biological Biochemestry 26: 4. 473- 477.
División de Normas del Instituto Nacional de Normalización. 2004. Compost- Clasificación y
Registros (NCh2880).
Drotleff. L. Lettuce Be Safe, Not Sorry. 2006. American Vegetable Grower; 54, 6; ProQuest
Agriculture Journals.
Faithfull N. 2005. Métodos de análisis químico agrícola: Manual práctico. Editorial Acribia.
Zaragoza-España. Págs. 75 – 87.
FAO. 2000. Inocuidad y calidad de los alimentos en relación con la agricultura orgánica. 22
Conferencia Regional de la FAO para Europa. Oporto, Portugal , 24-28 de julio 2000.
Foru. G. 2003. Manual para el compostaje individual. Diputación foral de Gipuzkoa.
Deapartamento para el desarrollo sostenible. 1 – 20 p.
Ganjyal. G; Weber. R y Hanna M. 2007. Laboratory composting of extruded starch acetate and
poly lactic acid blended foams. Bioresource Technology 98: 3176–3179
Garcia, C., Hernandez, T y Costa, F., 1991. Changes in carbon fractions during composting and
maturation of organic wastes. Environmental Management. 15: 433–439.
71
Gauze, G. 1965. Conferencia de antibióticos elaborados por hongos. La Habana – Cuba.
Editorial Universitaria La Habana. 25 p.
Goya. N., Gupta. J.K y Soni. S.K. 2005. A novel raw starch digesting termostable α- amylase
from Bacillus sp. I- 3 and its use in the direct hydrolysis of raw potato starch. Enzyme and
Microbial Technology 37: 723- 734.
Gómez, Y., Gonzalez, M., Chiroles, S. 2004. Microorganismos presentes en el compost.
Importancia de su control sanitario. Revista electrónica de la agencia del medio ambiente. Año 4
No 7:20 – 25.
Granados, J., Hurtado, C y Pedroza A. 2003. Estudio preliminar de preformulación de un inóculo
sólido termófilo. Tesis de Pregrado. Pontifica Universidad Javeriana.Facultad de Ciencias.
Departamento de Microbiología. Bogotá. 30 p.
Granados L., Valderrama J., Franco M y Pedroza A. 2003. Evaluación de la actividad
proteolítica y amilolítica de Actinomycetes termofílicos aislados a partir de pilas de compost.
Tesis de Pregrado. Pontifica Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de
Microbiología. Bogotá. 25 p.
Guerra, E., M. Vásquez y M. Díaz.2001. Dynamics of physicochemical and biological
parameters during the co-composting of chesnut burr/leaf litter with solid poultry
manure.J Science Food Agric 81:648-652.
Gutiérrez. E.V., Pinzón. A., Martínez. M.M y Casas. J. 2007. 71élulas71ion71n de actividad â –
glucosidasa en suelo proveniente de cultivos de Stevia rebaudiana Bertoni mediante el uso de
sustratos fluorogenicos. Tesis de pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de
Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá.32- 67 p.
72
Hanajima. D., Kuroda K., Fukumoto. Y y Haga. K. 2005. Effect of addition of organic waste on
reduction of Escherichia coli during cattle feces composting under high-moisture condition.
Bioresource Technology 97: 1626–1630
Hernández, T., Masciandaro G., Moreno J y García C. 2005. Changes in organic matter
composition during composting of two digested sewage sludges. Waste Management 26: 1370–
1376
Huang. G., Wu Q., Wong. J y Nagar. B. 2005. Transformation of organic matter during co-
composting of pig manure with sawdust. Bioresource Technology 97: 1834–1842
Iannotti. D., Grebus. E., Toth. B., Madden L y Hoitink. H. 1994. Oxygen respirometry to assess
stability and maturity of composted municipal solid waste. Journal Environmental Quality.
23:1177–1183.
ICONTEC . 2004. Norma Técnica Colombiana 5167.
Inbar, Y., Chen, Y y Hadar, Y., 1991. Carbon-13 CPMAS NMR and FTIR spectroscopic
analysis of organic matter transformations during composting of solid waste from wineries. Soil
Science. 152, 272–282.
Islam,M., Doyle,M., Phatak,S., Millner, P., Jiang,X.2005. Survival of Escherichia coli O157:H7
in soil and on carrots and onions grown in fields treated with contaminated manure composts or
irrigation water. Food Microbiology 22: 63–70
Kalil, S., Casas. J y Martínez. M.M. 2007. Seguimiento del proceso de humificación en compost
inoculado. Tesis de Pregrado. Pontifica Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de Microbiología. Bogotá. 32- 69 p.
Kapanen. A y Itavaara. M. 2001. Ecotoxicity test for compost 72élulas72ion. Ecotoxicol.
Environmental Safety. 49: 1-16.
73
Kirchmann, H. y Witter, E. 1989. Ammonia volatilization during aerobic and anaerobic manure
decomposition. Plant and Soil 115: 35-42.
Lacey,J. 1997. Actinomycetes in compost. Keynotes Reviews. Enviromental Management 4:
113– 121.
Lasardi. K y Stentiford. E. 1998. A simple respirometric technique for assessing compost
stability. Water Res. 32: 3717–3723.
Lee,J., Park,R., Kim Y., Shim, J., Chae, D., Rim, Y., Sohn, B., Kim, T., Kim, K. 2004. Effect of
food waste compost on microbial population, soil enzyme activity and lettuce growth.
Bioresource Technology 93: 21–28 .
Liang. C., Das. K y McClendon R. 2002. The influence of temperature and moisture contents
regimes on the aerobic microbial activity of a biosolids composting blend. Bioresource
Technology 86: 131–137
López P. 2002. Compostaje de residuos orgánicos. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería.
Santiago de Cali. Colombia. 7 – 29 p.
Magdoff, F y Weil. R. 2004. Soil organic matter in sustainable agriculture. CRC Press. Boca
Ratón, Florida.
Margesin. R., Cimadom. J; Schinner. F. Biological activity during composting of sewage sludge
at low temperaturas. 2006. International Biodeterioration & Biodegradation 57: 88–92.
Mathews. C., van Holde. K y Ahern. K. 2002. Bioquímica. Pearson Education. Madrid. 528- 529
p.
74
Mayende L., Wilhelmi B., Pletschke B.2006. Cellulases (CMCases) and polyphenol oxidases
from thermophilic Bacillus spp. isolated from compost. Soil Biology & Biochemistry 38: 2963–
2966.
Nobel. R y Roberts. S.J. 2004. Eradication of plant pathogensand nematodes during composting:
a review. Plant Pathology 53: 548- 568.
Olk. D., Brunetti. G y Senesi. N. 2000. Decrease in Humification of Organic Matter with
Intensified Lowland Rice Cropping: A Wet Chemical and Spectroscopic Investigation. Soil
Science Society American Journal. 64: 1337 – 1347.
Pedra. F., Polo. A., Ribeiro. A y Domingues H. 2006. Effects of municipal solid waste compost
and sewage sludge on mineralization of soil organic matter. Soil Biology & Biochemistry 39:
1375–1382
Pelaez. C., Mejía. A y Planas. A. 2004. Development of a solid phase kinetic assayfor
determination of enzyme activities during composting. Process Biochemestry 39: 971- 975.
Pietronave, S., Fracchia,L., Rinaldi, M., Martinotti,M.2004. Influence of biotic and abiotic
factors on human pathogens in a finished compost. Water Research 38: 1963–1970.
Poutou R.A., Amador E., Allmazán M., Quintana M y Candelario M. 1994. Estudio Preliminar
de la estabilidad de los bancos de células Primarios para la producción de interferón alfa
recombinante. Biotecnología Aplicada Internacional 11: 60 – 63.
Priest, F., Ramos, A. 1994. Tindall FEMS Symposium. Bacterial diversity and Systematics.
Plenum Press.New York. London. 75: 179- 187
Qualls. R., Takiyama. A y Wershaw. R. 2003. Formation and Loss of Humic Substances During
Decomposition in a Pine Forest Floor. Soil Science Society American Journal. 67: 899 – 909.
75
Ribeiro. H., Romero. A., Pereira. H., Borges. P., Cabral. F y Vasconcelos, E. 2007. Evaluation of
a compost obtained from forestry waistes and solid phase of pig slurry as a substrates for
seedlings production. Biosource Technology 98: 3294- 3297.
Rumpel, C., González J., Bardoux G., Largeau C., González F.,Valentin C. 2007. Composition
and reactivity of morphologically distinct charred materials left after slash-and-burn practices in
agricultural tropical soils. Organic Geochemistry 38 : 911–920
Ruzin,S. 1999. Plant Microtenchnique and microscopy. College of natural resources. University
of California, Belekeley. 50, 62 p.
Said-Pullicino, D y Gigliotti G. 2007. Oxidative biodegradation of dissolved organic matter
during composting. Chemosphere 68: 1030–1040
Saebo A; Ferrini, F. 2006. The use of compost in urban green areas – A review for practical
application. Urban Forestry & Urban Greening 4 :159–169
Salgado, R. 1999. La cascarilla de arroz. Instituto Tecnológico de Zacatepec. Departamento de
Ingeniería Química y Bioquímica. Mexico. Págs 1 – 12.
Schjønning, P; Munkholm, L; Elmholt ; Olesen, J. 2007. Organic matter and soil tilth in arable
farming: Management makes a difference within 5–6 years. Agriculture, Ecosystems and
Environment 122: 157–172
Schnitzer, M., y Schulten, H. R. 1995. Analysis of Organic Matter in Soil Extracts and Whole
Soils by Pyrolysis-Mass Spectrometry. Advances in Agronomy 55:167-217.
Sebastia, J., Labanowski,j., Lamy I. 2007.Changes in soil organic matter chemical properties
after organic amendments. Chemosphere 68:1245–1253.
76
Secretaría de comercio y fomento industrial. 1985. Norma Mexicana NMX- AA- 021-
1985.Protección al ambiente-contaminación del suelo residuos sólidos municipales-
determinación de materia orgánica.
Sharada,S. y Sanjat, K. 2004. CO2 evolution and enzymes activities (dehydrogenase, protease
and amylases) of fly ash amended soil in the presence and absence of earthworms (Drawida
Willsi Michaelsen) under laboratory conditions. Geoderma 118: 289 – 301.
Sherman, R. 1999. Large-scale organic materials composting. Biological & Agricultural
Engineering Department North Carolina State University. North Carolina Cooperative Extension
Service.
Solgaard. G; Standal. I y Draget K. 2007. Proteolytic activity and protease classes in the
zooplankton species Calanus finmarchicus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B
147: 475–481
Strom. P. 1985. Identification of Thermophilic Bacteria in Solid-Waste Composting. Applied and
environmental microbiology 50: 906 – 913.
Sundberg. C. 2005. Improving compost process efficiency by controlling aereation, temperature
and Ph. Doctoral thesis. Swedish University of Agricultural Science. Uppsala. 16, 17, 21- 24 p.
Sundberg. C; Jonsson H. 2007. Higher Ph and faster decomposition in biowaste composting by
increased aeration. Waste Management: 1- 9.
Sundberg. C; Smars S; Jonsson H. 2004. Low Ph as an inhibiting factor in the transition from
mesophilic to thermophilic phase in composting. Bioresource Technology 95:145–150.
Swift, R.S. 1996. Organic matter characterization (chap 35). In D.L. Sparks et al. (eds) Methods
of soil analysis. Part 3. Chemical methods. Soil Science Society American Journal.. Book Series:
5.
77
Tiquia S; Tam N; Hodgkiss J. 1996. Microbial activities during composting of spent pig-manure
sawdust litter at different moisture contents. Bioresource Technogy. 55: 201–206.
Tiquia S; Tam N; Hodgkiss J. 1998. Changes in chemical properties during composting of spent
pig litter at different moisture contents. Agric. Ecosys. Environmental. 67:79–89.
Treviño B; Gómez I. 2003. Obtención y caracterización de carburo y nitruro de silicio a partir de
cascarilla de arroz. Universidad autónoma de Puebla. Ingenierías VI 19: 21 -27
Turner. C; Williams. A; White. R y Tillett R. 2004. Inferring pathogen inactivation from the
surface temperatures of compost heaps. Bioresource Technology 96: 521–529
Van der Stelt B., Temminghoff E., Van Vliet P y Van Riemsdijk W. 2006. Volatilization of
ammonia from manure as affected by manure additives, temperature and mixing. Bioresource
Technology : 1 – 7.
Velásquez E., Arias C., Ruíz J.2003. Anuario estadístico de hortalizas. Frutas y hortalizas 2001 –
2003. República de Colombia, Ministerio de Agricultura y desarrollo rural dirección política
sectorial. Bogotá.
Walkley. A y Black IA. 1934. An examination of the Degtjareff method for determining soil
organic matter a proposed modification of the chromic acid tritation method. Soil Science 37: 29-
38.
Woldford R. 2003. Lechuga. Universidad de Illinois en Urbana Champaign. Págs 1 -3
Wu L; Ma L; Martinez G. 2000. Comparison of methods for evaluating stability and maturity of
biosolids compost. J. Environmental Qualty. 27:424–429.
78
Yun Y; Park J; Suh M; Park J. 2000. Treatment of food wastes using slurry-phase
decomposition. Bioresource Technology. 73: 21–27.
Zbytniewski, R., Buszewski, B., 2005. Characterization of natural organic matter (NOM) derived
from sewage sludge compost. Part 1: chemical and spectroscopic properties. Bioresource
Technolog. 96: 471–478
Zhu N. 2006. Effect of low initial C/N ratio on aerobic composting of swine manure with rice
straw. Bioresource Technology 98: 9–13
Zmora-Nahum,S., Markovitch, O., Tarchitzky, J., Chen Y. 2005. Dissolved organic carbon
(DOC) as a parameter of compost maturity. Soil Biology & Biochemistry 37: 2109–2116
Recursos electrónicos:
Bioagro Fertilizanes 100% orgánicos. Tratado S.A. Montevideo Uruguay.
http://www.bioagro.com.uy/compost.htm (consuta: Noviembre 18 de 2007)
Graves, R.E.2000. National Engineering Hangbook: Composting.
www.nrcs.usda.gov/technical/ENG/neh.html (Consulta: Noviembre 5 de 2007)
International Humic Substances Society. 1996. www.ihss.gatech.edu (consulta: Octubre 3 de
2007)
Romeo M., 2005. Fundación EROSKI.
http://verduras.consumer.es/documentos/hortalizas/lechuga/intro.php (consulta: Junio 21 de
2007)
79
ANEXO 1
COMPOSICIÓN DE BUFFERS SORENSEN Y CITRATO- FOSFATO
• BUFFER SORENSEN 0.5 M, pH 5.5 (Ruzin S., 1999).
Preparación para 2 L
NaH2PO4 117.676 g
Na2HPO4 2.715 g
Agua destilada 2 L
• BUFFER CITRATO FOSFATO 0.1 M pH 5.8 (Ruzin S., 1999).
1. Preparar una solución de fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4 * 12 H2O) al 0.2 M con un
volumen final de 557.5 mL. Para esto se debe agregar 15.833 g de fosfato dibásico de
sodio a 557.5 mL de agua destilada.
2. Preparar una solución de ácido cítrico al 0.1 M con un volumen final de 442.5mL. Para
esto se debe agregar 8.496 g de ácido cítrico a 442.5 mL de agua destilada.
3. Mezclar las dos soluciones realizadas anteriormente.
4. Medir el pH y ajustar con el ácido o la base según sea necesario para alcanzar un pH
final de 5.8.
80
ANEXO 2
• AGAR ALMIDÓN al 1% p/v (preparación para 1 L)
Almidón 10 g
Extracto de levadura 2.5 g
Peptona universal 2.5 g
Sulfato de amonio 0.5 g
Cloruro de calcio 0.5 g
Fosfato monobásico de potasio 0.1 g
Fosfato dibásico de potasio 0.1 g
Agar 15 g
(Esterilizar 7 minutos a 7 lb de presión). pH 7 +/- 0.2
• SAL FERROSA
1. Pesar 12,0432 g de FeSO4 7H2O y disolver en 4 L de agua destilada fría.
2. Almacenar en un frasco ámbar.
Recomendaciones
- Preparar el reactivo el mismo día en que se va a usar, de lo contrario las sales que lo componen
se precipitarán y el resultado no seria significativo.
- Adicionar el agua destilada fría, de lo contrario el hierro se oxidará.
• AGUA- MELAZA Agregar 25 Kg de melaza por cada 2 litros de agua.
81
ANEXO 3
• CURVA DE CALIBRACION PARA SOMOGYI- NELSON
82
ANEXO 4
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (CITRATO)
CONTROL Oneway Analysis of UA By Time
UA
0102030405060708090
100
0 1 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9
Time
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
0 3 33 11,0000 -1,616 1 3 110 36,6667 1,843
10 3 113 37,6667 1,980 11 3 87 29,0000 0,796 12 3 57 19,0000 -0,523 13 3 52 17,3333 -0,751 14 3 75 25,0000 0,250 2 3 132 44,0000 2,844 3 3 66 22,0000 -0,114 4 3 24 8,0000 -2,025 5 3 50 16,6667 -0,842 6 3 13 4,3333 -2,526 7 3 8 2,6667 -2,753 8 3 119 39,6667 2,253 9 3 96 32,0000 1,206
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
42,8248 14 <.0001
INOCULANTE MIXTO
UA
0102030405060708090
100110
0 1 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9
Time
83
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 56 18,6667 -0,569 1 3 112 37,3333 1,934 10 3 119 39,6667 2,252 11 3 85 28,3333 0,705 12 3 39 13,0000 -1,342 13 3 23 7,6667 -2,070 14 3 85 28,3333 0,705 2 3 131 43,6667 2,798 3 3 6 2,0000 -2,844 4 3 16 5,3333 -2,389 5 3 40 13,3333 -1,297 6 3 52 17,3333 -0,751 7 3 108 36,0000 1,752 8 3 81 27,0000 0,523 9 3 82 27,3333 0,569
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
41,8037 14 0,0001
BUFFER CITRATO COMPARANDO TTOS
UA
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Control Inóculo
TTO
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
1,3011 1 0,2540
84
ANEXO 5
CORRELACIÓN BIOMASA Vs UA INOCULANTE
(r25 = 0.359, p > 0.05) Independent: Biomasa
Dependent Mth Rsq d.f. F Sigf b0 b1 UA LIN ,359 5 2,80 ,155 102,259 -5,9950
BIOMASA Vs UA CONTROL
Independent: Biomasa Dependent Mth Rsq d.f. F Sigf b0 b1 UA LIN ,018 5 ,09 ,775 1033,85 128,115
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00
Biomasa
ObservedLinear
UA
0.00
1000.00
2000.00
3000.00
4000.00
5000.00
6000.00
7000.00
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Biomasa
ObservedLinear
UA
85
ANEXO 6
% MO EN LOS TRATAMIENTOS.
% M
OT
Inoc
ulo
40
45
50
55
60
65
70
75
Control Inoculo
TTO
t-Test
Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,7973 -0,261 24 0,7965 Std Error 3,0578
Lower 95% -7,1083 Upper 95% 5,5137
Assuming equal variances
86
INOCULANTE
% M
.O
40
45
50
55
60
65
70
0 1 10 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8
Time
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 114 38,0000 2,820 1 3 71 23,6667 0,553 10 3 16 5,3333 -2,293 13 3 10 3,3333 -2,609 14 3 67 22,3333 0,343 15 3 87 29,0000 1,397 2 3 55 18,3333 -0,237 3 3 102 34,0000 2,187 4 3 99 33,0000 2,029 5 3 63 21,0000 0,132 6 3 29,5 9,8333 -1,581 7 3 35,5 11,8333 -1,265 8 3 31 10,3333 -1,502
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
35,7511 12 0,0004
CONTROL
% M
.O
40
45
50
55
60
65
70
0 1 10 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8
Time
Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)
Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0
87
Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 110 36,6667 2,761 1 3 103 34,3333 2,382 10 3 34 11,3333 -1,299 13 3 6 2,0000 -2,815 14 3 22 7,3333 -1,949 15 3 62 20,6667 0,162 2 3 77 25,6667 0,974 3 3 80 26,6667 1,137 4 2 45 22,5000 0,360 5 3 93 31,0000 1,841 6 3 42,5 14,1667 -0,839 7 3 34,5 11,5000 -1,272 8 3 32 10,6667 -1,408
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
34,8662 12 0,0005
88
ANEXO 7
COMPARACION DEL pH EN LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS
pH
7
7,5
8
8,5
Control Inoculoante
TTo
t-Test Difference t-Test DF Prob > |t|
Estimate 0,01600 0,099 28 0,9221 Std Error 0,16220
Lower 95% -0,31626 Upper 95% 0,34826
Assuming equal variantes
1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq
14,0000 14 0,4497 COMPARACION DE LA TEMPERATURA EN LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS
T°
15
20
25
30
35
40
45
Control Inoculoante
TTO
t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,7100 -0,261 28 0,7960 Std Error 2,7209 Lower 95% -6,2836 Upper 95% 4,8636